需要JoVE订阅才能观看此内容。 请登录或开始免费试用

方法文章

用于转化型小鼠脑卒中研究的标准化神经功能评分小鼠脑卒中单元方案

2.2K 次观看

⸱

DOI：

10.3791/66847

⸱

2025年2月7日

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Pharmacology Medical School of Athens, National and Kapodistrian University of Athens, 2Institute for Stroke and Dementia Research (ISD), University of Munich Medical Center, 3Department of Neurointensive Care, Schoen Clinic Bad Aibling

本文内容

摘要

本文介绍了一种在大卒中模型小鼠中实施高度可转化且经独立验证的小鼠卒中单元（mSU）概念的实验方案。同时提供了一种标准化的实验性局灶性卒中评分在小鼠中的操作流程，用于评估即使在长期阶段仍可检测到的卒中局灶性神经功能缺损。

摘要

大脑中动脉阻塞丝线模型（fMCAo）可能是最具转化价值的小鼠脑卒中模型，可实现可控的缺血及血管内再灌注/再通。然而，该模型与当前脑卒中临床诊疗进展（例如卒中单元）缺乏对应，各实验室通常采用主观或模糊的神经功能评分，且急性期死亡率较高。本文通过经过验证的视频引导方案解决了这些局限性。我们提出了小鼠卒中单元（mSU）方案，配有教学视频和决策算法（风险分层评分），弥合了临床实践与小鼠脑卒中建模之间的差距。为提高脑卒中神经功能评分的准确性与敏感性，我们首次提出一种视频标准化的局灶性实验性卒中量表（fESS），并证实其在脑卒中后长达6个月内的评估价值。此外，本文还提供了小鼠梯子攀爬测试以及已知的圆筒测试方案，用于对肢体运动功能进行无偏倚、定量的评估。结果突显了mSU的转化效能。局灶性ESS（fESS）在检测局灶性脑卒中缺陷、捕捉功能恢复过程以及在脑卒中后长达6个月内保持敏感性方面优于其他已知量表。梯子攀爬测试和圆筒测试可对前肢和后肢的运动功能障碍进行长期、客观的量化与监测。总之，整合mSU、fESS和运动功能测试为具有临床相关性的脑卒中研究提供了坚实的框架。我们的方案提升了小鼠脑卒中研究的转化价值。

引言

大面积缺血性卒中是全球范围内导致发病和残疾的主要原因之一1。然而，迄今为止，在几乎所有经过临床前测试的治疗方法中，小鼠卒中研究都面临着转化障碍2。这一问题的多种原因以及为克服该问题所做的努力已在先前的出版物中进行了详细综述2。这些挑战源于临床进展在相关动物模型中的整合有限2，以及行为学和神经功能评分系统在准确、敏感地检测卒中后功能缺损方面的不足2。

最近的研究发现3表明，小鼠大脑中动脉闭塞的丝线模型（fMCAo）相较于其他伴有开颅损伤和创伤的模型具有显著的转化优势2,4。此外，该模型是唯一能够模拟临床脑卒中情况下再灌注和机械取栓过程的动物模型5,6,7。然而，该模型在卒中后3至7天存在较高的亚急性期死亡率，这限制了对大面积卒中的长期研究，并且直到最近仍被认为是该模型固有且无法克服的技术假象。此外，由于小鼠体型较小，卒中后神经功能缺损的检测相对困难且易产生偏倚，尤其对于非临床医生或经验不足的研究人员而言更是如此8,9。为解决这一问题，不同研究团队已开发出多种用于检测神经功能缺损的评分量表。其中最常用且广为人知的包括：3分制Bederson评分（BS）10、5分制改良Bederson评分（mBS）11、5分制Longa评分（LS）（与mBS类似）6、改良神经功能缺损评分（mNSS）12,13、18分制Garcia评分（GS）9，以及更为详细的DeSimoni评分14，也被称为"Neuroscore"（NS）9,15。遗憾的是，其中一些量表要么过于粗略，仅适用于卒中急性期的少数几天内（如BS、mBS和LS）8,9，要么其解释因存在一般性功能障碍而变得模糊不清（如NS）。

基于这一背景，我们先前开发并验证了小鼠卒中单元（mSU）支持方案以及适用于小鼠的实验性卒中评分（ESS）13mSU 的提出旨在将临床常规（即人类卒中单元）中的知识应用于卒中领域的临床前研究，而 ESS 则对先前已存在但分散的 "不敏感" 或将冗余的卒中评分量表整合为一种实用、精炼、敏感且高效的评分方法。mSU 包括对小鼠基本临床参数进行频繁且适应性的监测，并采用适应性动物支持措施以提高存活率13.

事实上，我们实验室及其他实验室的数据均证实了这两种方法的价值。mSU 将临床基本支持性措施和人类医学进展7成功转化至小鼠模型，使小鼠fMCAo模型的死亡率从60–70%显著降低至10–15%13，从而使得对较大梗死性卒中进行研究成为可能，并且自那时起已在多个独立实验室中有效应用16,17,18,19。此外，ESS 能够区分卒中后的局灶性（ESS的局灶性成分，fESS）和一般性（ESS的一般性成分，gESS）功能缺损与症状，模拟人类临床评分体系（即对人类局灶性与一般性体征及症状的区分），其评分与脑梗死病灶大小呈线性关系，并对功能缺损具有长期敏感性13,20。然而，尽管 mSU 和 ESS 均已被证明具有重要价值和有效性，但由于缺乏清晰、可视化且标准化的操作指南，即使是经验不足的研究人员在应用 mSU 时仍存在诸多疑问，且在 fESS 评分中对局灶性缺损的评估仍存在显著的主观性。

因此，本文旨在提供视频辅助且清晰的mSU和fESS操作方案。我们坚信，这将有助于脑卒中研究人员提高其脑卒中研究的转化效率，显著减少脑卒中后最初3-10天内实验动物的死亡，降低实验成本，并最终实现脑卒中后数月内神经功能缺损的可重复性评估13。此外，梯子踏步实验与圆筒实验的联合应用可简便地量化因fMCAo所致的局灶性肢体轻瘫（前肢和后肢）。

为展示mSU和fESS的效率，我们提供了小鼠在fMCAo术后中期（14天）和长期（6个月）的数据。选用12周龄雄性C57Bl/6J小鼠（n=31），在受控温度（22 ± 2 °C）条件下饲养，保持12小时光照-黑暗循环，并可自由摄取颗粒饲料和饮水ad libitum。小鼠分为两个队列，分别随访14天（n=10，队列1）和6个月（n=15，队列2）。这些小鼠在异氟烷麻醉下，采用已明确描述的fMCAo13,20,21模型进行60分钟的脑缺血。假手术动物（n=6，手术操作同上述两个队列，但不诱导缺血）随访6个月，作为对照组。术前及术后3天使用布托啡诺作为镇痛剂。对于6个月队列，还进行了梯格行走试验和圆筒试验，作为神经功能评分的一部分。

所有动物在卒中后前14天内每日均接受安乐死终点的检查，定义为：1）严重低体温（<33 °C）和/或不动（例如，在 fESS 的测试 6 中评分为 4 分） "自发活动" gESS测试）未得到改善 "小鼠卒中单元" 处理（即被动加热和主动喂食，参见1.4、1.6、1.8）后一小时内，2）疼痛或焦虑行为迹象（例如评分 >2 in "焦虑／自动行为" 根据方案给予术后镇痛后，仍进行gESS测试。

在本方案中，小鼠在fMCAo手术后恢复即刻开始接受以mSU形式提供的卒中后支持。该支持包含3个阶段： A相 （再灌注后0-48小时）， 相B (>48 小时及以上 "所需主动支持的结束"，通常在第10至14天，具体取决于个体动物的B期）， 相 C （第14天及以后）。根据每个阶段（A、B或C）以及通过风险分层评分（RSS）评估的每日实际临床状况，针对每只动物实施五项重要干预措施（访视/风险分层评分、喂养、补液、体温管理及局部消毒；见下文1.1至1.8），参见 补充图1 和 表1 通过三个典型示例。mSU 所需的材料和工具如图所示 图1a 并描述于 材料表我们还提供了mSU期间动物监测的模板（参见 补充文件 1).

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

方案

本文报道的实验遵循国家和欧洲关于实验动物使用的指南，并已获得希腊政府委员会（雅典，许可证编号 "843895_06-09-2022"）的批准。

1. 该 "小鼠卒中单元" （mSU）

  1. 每日评估动物的临床状况（"访问次数"）并计算其 RSS 评分
    1. 打印 补充文件 1，最好在动物手术前连接，用于数据记录和监测。
    2. 在标准时间点对每只动物进行临床评估（访问次数：清晨（约08:00）、中午（14:00至16:00之间）和深夜（约22:00至23:00）。
      注意：根据动物的随访阶段调整这些标准巡查次数：A 阶段每日巡查 2 次（早晨和夜间），B 阶段每日 3 次，C 阶段每日 1 次。并根据 RSS 评分进一步调整巡查频率（见 1.1.6）。建议优先 在一个团队中 >2人以减轻工作负担。早晨和夜间访视对于成功提供支持、监测以及降低死亡率至关重要，因为小鼠的夜间（活跃）阶段会增加其代谢和能量需求13,22,23 并与卒中后夜间死亡率升高相关。
    3. 使用灵敏的标准天平在上午访视期间称量小鼠体重。
    4. 使用非接触式体温计在上午访视期间测量小鼠腹部体中心的温度。固定并 immobilize 小鼠使其背部朝上，在 immobilize 后的最初几秒内完成读数（参见 图1f).
      注意：由于反复测量可能导致肠穿孔并伴随腹膜炎，因此请勿使用直肠温度计。
    5. 在所有阶段，每天上午查房时评估并记录小鼠的一般临床状况（活动能力、伤口、尿道帽、反应性、毛发、水合状态等），持续至第14天。
    6. 根据动物的体重、体温和 fESS 评分，按照所述方法在上午访视时计算 RSS 评分 补充图1. 为在电子表格中自动计算 RSS，使用并调整表格中提供的公式 表1若达到人道终点（见上文），应使用机构批准的方法对动物实施安乐死。
    7. 根据需要调整探访频率和支持强度，每日进行 根据RSS评分和动物卒中后的分期。
      注意：B 阶段是死亡率最关键的阶段。对于 RSS ≥3 的情况，应增加访视频率和支持强度（定义与操作说明见 表1）。如果动物持续表现出RSS >在C期，继续按照B期的方式进行访视并提供支持。使用RSS评分及一般性描述（如恢复中、病情稳定、轻/中度疾病、危重疾病）在支持团队中描述其临床状况。第14天后，将动物访视频率减少至仅保留实验方案所要求的访视（例如用于行为学/神经功能评估）。
  2. 营养支持用凝胶食物的制备
    1. 使用搅拌机将普通食物颗粒研磨成粉图1a).
    2. 添加5-10%的市售蔗糖以提高食物的热量含量。
    3. 加水以形成类似凝胶的液体质地（图1b).
    4. 使用这种凝胶食物进行被动和主动营养支持。
      注意：可选择使用现成的商用凝胶食物。制备好的食物可在冰箱中保存2-3天。
  3. 小鼠的被动营养支持
    1. 在培养皿中装满凝胶食物，并将其放置于笼底（通过提供易于获取的凝胶食物，实现被动营养支持）。在培养皿旁放置2-3粒食物颗粒。
    2. 每天用凝胶食物更换培养皿中的食物。在最初的几天里，小鼠可能会用笼内垫料填满或覆盖培养皿。部分小鼠会开始从中进食。图1c).
  4. 主动营养支持（主动喂养）
    注意：主动进食发生在 B 阶段。标准喂养频率为每日 3 次，可根据 RSS 评分调整为更频繁的喂养（例如每日 4–5 次）。对于 RSS 评分持续为 0–1 分（即轻度卒中）且能自主积极进食的小鼠，可将喂养频率减少至每日 1–2 次。
    1. 预先用凝胶食物填充1 mL注射器。
    2. 轻轻但牢固地抓住小鼠颈部的皮毛并握住，如图所示 图1d （红色箭头）
    3. 用中指固定小鼠的面颊，如红色箭头所示 图1d在牢固固定小鼠的同时，用手指沿其脸颊向小鼠鼻部方向横向滑动。保持该位置。
    4. 将注射器尖端置于小鼠牙齿之间的口腔内，并将尖端朝向其脸颊内侧（红色箭头， 图1e).
    5. 每次提供约 40–50 µL 的凝胶食物（一口量）。
    6. 轻轻地将小鼠放回笼具的格栅上。给予足够时间使其咀嚼。
    7. 等待1-2分钟后再次喂食，直至每只小鼠摄入1-1.5 mL凝胶食物。
      注意：每次实验喂食5-10只小鼠（1-2笼）；其余小鼠在每只小鼠被喂食一口时也会进食并吞咽凝胶食物。该过程不会对小鼠造成任何应激反应。还观察到部分动物最终会主动采取姿势以便被抓取和喂食。
  5. 生理盐水补充
    1. 在上午巡检时称量小鼠体重（参见 1.1.2 和 1.1.3）。
    2. 通过减去前后两次测量值，计算其相对于前次测量的重量损失或增加。
    3. 根据其体重不足量（单位：克），补充相应毫升数的生理盐水（皮下注射）。
      注意：务必避免液体超负荷和水肿。每次给药不超过1-2 mL，每日液体总量不超过3-4 mL。在fMCAo术后36小时开始给药。
  6. 葡萄糖补充
    1. 检查小鼠的计算 RSS 评分及其整体运动情况。
    2. 若出现低血糖症状（RSS），皮下注射 0.5 - 1 mL 的 5% 葡萄糖 >3，且小鼠同时出现低体温症状（<34°C）或强直/运动迟缓。最好仅在夜间访视时注射。
      ​注意：务必避免卒中后高血糖。卒中后高血糖具有毒性7因此，仅在主动进食后，或在病情严重的情况下，或为预防夜间活动时发生低血糖时补充葡萄糖。主动进食（见1.4）应作为主要的支持措施，因其可提供更平稳且持久的能量支持，并符合临床指南 7第3天之前不要补充葡萄糖。
  7. 温度管理（被动式）
    1. 在术前基线时和术后每次随访时测量动物的体表温度（图1a）。按图示进行测量 图1f 并记录下1.1.4中的描述。记下这些数值。
      注意：小鼠的低体温定义为体温低于35°C。 <35 °C 24,25. 以往数据13 表明卒中后任何低于34 °C的体温均为需要支持的警示信号（见下文）。
    2. 当观察到小鼠体温在33至34°C之间时，将其置于加热板（或其他被动加温装置）上的笼子中进行被动复温，直至其体温恢复至正常水平 >34 °C。主动喂食小鼠，以提供动物主动产热所需的能量（更持久的能量供应）。
      注意：让动物保持被动加热状态1小时或数小时。务必避免被动性高热。
    3. 当观察到低体温时， <33 °C时，通过皮下注射额外葡萄糖加强支持（快速但持续时间较短的能量供应；参见上述1.6）。
  8. 生殖器和/或颈部伤口的清洁（局部） "消毒")
    注意：偶尔可观察到伤口裂开或尿道堵塞。伤口裂开较为罕见。尿道堵塞表现为小鼠生殖器末端的硬质堵塞物。图1g）在卒中程度较重的动物中更为常见。当栓子阻塞尿道时，可能引发尿路梗阻综合征，进而导致发病甚至死亡26因此，应彻底清洗。
    1. 若有尿道栓，用生理盐水浸润以利于取出。
    2. 每次检查动物时，使用小棉签或简易镊子轻柔地移除尿道塞。用浸有消毒液的棉签或探针消毒尿道。
    3. 如果出现伤口裂开，应使用常见的外科消毒液（如 Octanisept）对局部进行消毒，并常规使用5/0丝线缝合伤口，优先选用5/0丝线。

2. 实验性卒中量表（fESS）的焦点组分

  1. 准备测试场地
    1. 使用70%酒精清洁实验台面，以去除外界刺激（光学或气味），并准备测试材料，如图2a所示。
    2. 打印作为补充文件2提供的ESS评分表，并逐一进行测试。
  2. 前肢轻瘫（测试1）
    1. 从尾根部轻轻提起并握住小鼠。
    2. 观察并目测小鼠移动时前肢是否对称前伸及活动是否对称（图2c）。
    3. 根据目测结果评分如下：0分表示前肢伸展和运动正常且对称；1分表示"轻微不对称"，定义为对侧肢体轻度屈曲和/或活动减少或肢体僵硬；2分表示对侧肢体出现"明显屈曲"；3分表示对侧肢体紧贴躯干；4分表示无身体或肢体运动。
      注：该测试用于检测对侧前肢的轻瘫，也是BS、LS、mNSS和NS量表的一部分。由于动物的逃避动作，1分可能较难界定。
  3. 后肢轻瘫（测试2）
    1. 继续如测试1所述，从尾根部握住小鼠。
    2. 目测观察后肢及脚趾的伸展和运动是否对称（图2c）。
    3. 根据结果评分如下：0分表示后肢和脚趾位置/伸展及运动正常且对称；1分表示明显不对称，即对侧（右侧）后肢活动显著减少且位置/伸展不对称（图2d）。
      注：该测试用于检测对侧后肢的轻瘫，也是mNSS量表的一部分。该测试可能较难准确评分。
  4. 躯干对称性（测试3）
    1. 继续从尾根部握住小鼠（接2.3步骤），评估其躯干运动。
    2. 根据结果评分如下：0分表示正常，无躯干屈曲，或双侧对称的轻度躯干屈曲/运动（作为"逃避"动作）；1分表示在提起后10秒内出现明显的（>30°）头/躯干屈曲，主要偏向对侧（向右）。
      注：该测试用于检测单侧运动损伤引起的不对称性，也是mNSS评分的一部分。
  5. 转圈行为（测试4）
    1. 将小鼠轻轻放置于平坦表面，使其自由活动至少1分钟，观察其运动模式。
    2. 根据结果评分如下：0分表示探索性强、活跃、直线运动，无转圈行为；1分表示有向一侧转弯的趋势，但未形成闭合转圈；2分表示不稳定地向一侧做闭合转圈运动；3分表示持续向一侧做闭合转圈运动；4分表示原地旋转、摇晃或完全无运动。
      注：该测试用于检测感觉运动和空间导航功能障碍，也是NS量表的一部分。
  6. 身体对称性（测试5）
    1. 接测试4，让小鼠在平坦表面上自由活动，观察其鼻尾轴线。
    2. 根据结果评分如下：0分表示正常姿势，躯干抬离台面，尾巴伸直；1分表示"轻微不对称"，即身体轻微向一侧弯曲，尾部远端弯曲；2分表示"中度不对称"，即身体明显向对侧弯曲或倾斜，尾部近端弯曲和/或肢体伸出体外；3分表示"显著不对称"，即身体明显弯曲，一侧不稳定地接触台面，尾部明显近端弯曲（比2分更严重）；4分表示"极度不对称"，即身体弯曲，一侧持续接触台面，尾部高度弯曲。
      注：该测试用于检测单侧感觉运动性躯干和尾部功能障碍，也是NS量表的一部分。
  7. 步态评估（测试6）
    1. 接测试5，让小鼠在平坦表面上自由活动，观察其步态，检查是否存在轻瘫、肢体僵硬、痉挛步态、跛行等运动缺陷。
    2. 根据结果评分如下：0分表示步态正常，探索性强、对称且快速，四肢灵活，运动时"隐藏"于身体下方；1分表示自由活动的小鼠步态僵硬、不灵活且较慢，但无跛行；2分表示明显跛行，左右运动不对称；3分表示轻推后出现颤抖、偏移或跌倒；4分表示无自发行走（轻推刺激下行走不超过3步）。
      注：该测试用于检测综合步态功能障碍，也是NS量表的一部分。
  8. 强制转圈（测试7）
    1. 从尾根部握住小鼠，将其抬离表面，仅让其前肢着地行走，观察其运动。
    2. 根据结果评分如下：0分表示正常直线运动；1分表示有向一侧转弯的趋势；2分表示向一侧做闭合转圈运动；3分表示向一侧原地旋转，动作笨拙或缓慢无法完成一圈；4分表示无前进运动，躯干前部接触台面。
      注：该测试补充了转圈行为测试（测试4，见2.5）。可能用于检测感觉运动和空间功能障碍，也是NS评分系统的一部分。
  9. 对抗侧向力的姿势（测试8）
    1. 将小鼠放置于手掌上，使其鼻尾轴（纵向）与手掌矢状轴平行。
    2. 以稳定速度将小鼠从前向后摆动，以产生垂直于其纵向轴的力。
      注：这迫使小鼠在摆动过程中保持直立姿势和平衡以对抗侧向力。正常情况下其身体不应接触手掌或手指。
    3. 观察并感受小鼠在平衡过程中左右两侧是否接触手掌，检查是否存在不对称跌倒、手掌接触或侧向无力迹象。
    4. 根据结果评分如下：0分表示小鼠保持正常直立姿势，背部与手掌平行，能对抗摆动保持平衡而不频繁接触手掌；1分表示小鼠在摆动过程中压低身体以增加稳定性；2分表示小鼠部分身体在摆动中短暂接触或躺在手掌上；3分表示小鼠向一侧倾倒，勉强能恢复直立姿势；4分表示小鼠呈俯卧位，无法恢复直立姿势。
      注：该测试用于检测对抗侧向加速度的姿势功能障碍，但评分可能具有主观性。它也是mNSS和NS量表的一部分。
  10. 前肢目标放置（测试9）
    1. 从背部或尾根部握住小鼠，将其垂直朝向横梁（作为"目标"）。观察其前肢是否对称"伸出"和抓握。
    2. 一旦其稳定抓握横梁，轻轻将其拉离，观察前肢是否对称"释放"。
    3. 根据结果评分如下：0分表示前肢"伸出"、抓握和"释放"均对称；1分表示"伸出"和/或"释放"存在任何不对称，提示对侧前肢无力。
  11. 前肢感觉运动功能障碍（测试10）
    1. 牢固握住小鼠背部，使其腹面朝下（见视频或图1e）。
    2. 使用细尖物体（如木制牙签）从盲角依次刺激前爪，观察前爪反应。
    3. 根据结果评分如下：0分表示双侧均出现正常、迅速的抓握动作；1分表示对侧抓握缺失或明显延迟。
      注：测试2.10和2.11均用于检测前肢精细感觉运动功能障碍，也是mNSS量表的一部分。
  12. 横梁行走（测试11）
    1. 将一根长1米的木制横梁（材料表）连接两个离地高度为1-1.5米的高台表面。固定横梁边缘以避免振动或不稳。
    2. 将小鼠置于横梁中点，使其鼻尾轴与横梁平行（图2e），允许其在横梁上保持平衡或自由行走。观察其平衡能力、肢体轻瘫及跌落情况。
      注：应在评分前确保小鼠已在横梁上获得平衡。在动物下方约15-20厘米处放置厚手套，以防跌落受伤。
    3. 根据结果评分如下：0分表示小鼠在横梁上保持稳定姿势并稳步行走至一端；1分表示其抓住横梁边缘但未在横梁上行走；2分表示一个肢体滑落横梁；3分表示两个肢体滑落横梁；4分表示小鼠试图在横梁上保持平衡但跌落（40秒后）；5分表示在20-40秒内跌落；6分表示未尝试保持平衡或抓握横梁即跌落（<20秒）。
      注：该测试用于检测前肢、后肢和躯干的综合运动功能障碍，也是mNSS量表的一部分。
  13. 胡须感觉（测试12）
    1. 将小鼠放置于开放台面（如测试4和5），给予一定适应时间。
    2. 使用细长棉签从"盲角"依次刺激其左右胡须，观察头部是否迅速转向刺激侧。
    3. 根据结果评分如下：0分表示双侧刺激均引起正常、快速的转头反应；1分表示对侧反应较慢；2分表示对侧无反应（无转头）；3分表示对侧无反应且同侧反应变慢；4分表示双侧均无反应。
      注：应避免小鼠视觉察觉棉签，否则会错误引起同侧转头。仅当小鼠被胡须刺激"惊到"时，测试才技术正确。该测试也是NS量表的一部分，用于检测胡须感觉运动功能障碍（桶状皮层）。
  14. 攀爬（测试13）
    1. 使用表面覆橡胶、倾斜45°的斜坡（图2a），将小鼠置于其中心，观察其攀爬努力程度。
    2. 根据结果评分如下：0分（正常）表示小鼠迅速且轻松地爬至顶端；1分表示其费力攀爬，伴有肢体无力；2分表示其抓住斜坡但未滑落或攀爬；3分表示尽管努力仍向下滑动；4分表示无努力防止滑落而直接滑下。
      注：该测试也是NS量表的一部分，用于检测总体运动力量。
  15. 通过累加测试1至13的所有得分计算fESS总分
    注：fESS得分为0表示小鼠正常，最高得分为42。伴有纹状体和皮层损伤的大梗死通常导致得分>7-9。在开始评估卒中小鼠前，应先检查并评分若干只正常小鼠，以熟悉正常行为变异，减少fESS假阳性评分。在整个实验过程中应持续使用提供的视频方案以确保评分标准化。

3. ESS 的通用组分 (gESS)

注意：通过评估 gESS 以检测相关迹象 "小鼠一般性病症"，例如炎症或感染，通常在fMCAo术后1-2周内出现。使用以下评分表 补充文件 2建议在完成 fESS 后评估 gESS。

  1. 将小鼠置于平坦的表面（实验台）上，使其自由活动，如2.5步骤所述。依次评估以下各项评分。
  2. 观察其毛发状况，根据gESS评分表进行评分（评分0–2，参见补充文件2）。
  3. 检查小鼠的惊跳反应：当小鼠处于放松状态时，从其视线盲区突然拍手使其受惊，观察并根据gESS评分表对小鼠耳朵的反应进行评分（评分0–2，参见补充文件2）。
  4. 目视评估放松状态下小鼠的眼睛情况：检查眼睛是否睁开/闭合，或是否存在黏液。根据gESS评分表进行评分（评分0–4，参见补充文件2）。
  5. 观察小鼠的一般自发活动及警觉程度，根据gESS评分表进行评分（评分0–4，参见补充文件2）。
  6. 观察小鼠在任何操作过程中是否存在焦虑、过度兴奋、攻击性或沿自身轴线旋转等一般自发行为异常，根据gESS评分表进行评分（评分0–4，参见补充文件2）。
  7. 通过累加上述所有步骤的评分（观察性评分，步骤3.2至3.6）计算gESS总分。
    注：如先前研究所示，gESS评分无法检测脑卒中损伤引起的局灶性神经功能缺损，也不受mSU的影响13。所有测试均改编自NS评分9,15。

4. 采用圆筒试验定量评估前肢功能缺陷

注意：圆筒实验此前已有详细描述9,15,27，此处不再详述。圆筒实验是一种独立的行为学测试，可无偏倚地量化前肢功能缺陷（见4.2节）。

  1. 按照此处提供的说明进行测试15。拍摄视频并按15中的方法进行分析。测量左右前肢首次接触筒壁的次数。图3a、b展示了实验装置的图像。
  2. 根据对侧（右侧）轻瘫情况，计算前肢使用偏侧化的百分比。使用以下公式：左侧行走偏好百分比 = [（左侧接触次数 - 右侧接触次数）/（右侧接触次数 + 左侧接触次数）] × 100。
    注意：在诱导脑卒中前，应对每只小鼠进行基线筒测试。根据各实验方案的时间点进行测试。

5. 使用梯状横杆实验定量评估前肢和后肢功能缺陷

注意：使用有机玻璃（见图3c）构建小鼠实验装置：一条长1米、两侧墙高20厘米的通道，通道底部每隔15毫米设置一根直径为3毫米的塑料横杆（见图3c1），并在远端设置一个"庇护"箱。在庇护箱内放置动物垫料以增加熟悉感，并放入少量食物颗粒或花生酱作为奖励。通道宽度应为10厘米，并离地面约30厘米高。

  1. 在实验基线测定前1-3天，使用仪器对小鼠进行训练。训练步骤参照5.1.1至5.1.4。
    注意：为了使动物适应以恒定速度在横杆通道中正常行走，且无停顿、转向或探索性行为，必须进行训练。训练需连续进行2天（共2个训练阶段），每个训练阶段包含3次跑行。运行 = 朝避难箱方向沿整个走廊行走一次）。收集基线数据对于后续跟踪是必要的。
    1. 每次运行前用70%酒精清洁横杆和墙壁，以避免气味干扰 "探索性" 小鼠的分心/停止行为
    2. 将小鼠置于梯子横档走廊的起始位置，使其朝向避难盒，以开始一次运行。让小鼠自由行走至走廊末端的避难盒，不要强迫动物行走。
      注意：训练期间的奔跑在持续时间和行走模式方面通常具有高度变异性。训练的目标是实现稳定地走向避难箱的行走，通常在 <10 秒内完成，期间无停顿或转向，通常在训练第二天结束时即可达到。操作动物时务必轻柔，避免引起应激反应，否则会影响正常训练。若动物停留在走廊内进行局部探索，应将其移出走廊并重新进行跑行。 >1 分钟，以避免习惯化。
    3. 执行第1步st 训练运行。在训练结束后，让动物在避难箱中休息5分钟st 运行。
      注意：这段较长的静息时间可使小鼠熟悉躲避箱，并将其视为安全区域 "静息/奖赏" 目标以达成。实现这一目标 "奖励感知" 避难箱的设置对实验的顺利进行至关重要。
    4. 将小鼠从躲避盒中取出，按照5.1.2步骤进行第二次和第三次训练运行。在这些训练结束后，缩短小鼠在躲避盒中的休息时间（30–60秒），以避免产生习惯化。
      注意：训练在第2天完成。到第2天时，几乎所有动物都能学会以稳定的速度穿过走廊。若动物未能学会，应考虑将其排除在后续实验之外。
  2. 在训练后的小鼠上进行实验。在实验的所有时间点及基线期，每次对小鼠测试2次运行。
    1. 按照步骤5.1.1和5.1.2所述进行实验运行，两次运行之间在避难箱中允许最长5分钟的休息时间。
    2. 使用智能手机（或同等摄像设备）和一个 "自拍杆" 以轻微腹侧角度拍摄动物的视频（数据） "盲法" 从一定距离观察角度（如图所示） 图3c2）。确保在动物穿过走廊时捕捉到其四肢的运动。在小鼠奔跑过程中不要对其造成视觉干扰，并持续跟踪其四肢的运动（图3c2).
    3. 记录两次运行，但使用并分析第二次运行的数据。
    4. 测量每侧肢体（左/右，前/后肢）在横档之间踩空的步数（跌落）图 3c3），使用具备慢放功能的媒体播放器软件回看视频。分别针对前肢和后肢，计算左右肢体故障步态的绝对差异或百分比差异。
      注意：第二次运行的结果更为可靠。健康的 小鼠 在第二次运行过程中，每侧肢体（右侧或左侧）通常出现 0-1 次任意的失误步态，差异范围通常为 0 ±1。脑卒中后的小鼠会使用其右侧（对侧）轻瘫肢体（前肢或后肢）产生失误步态，导致结果呈正值 "向右" 偏侧化。严重中风的动物在中风后的前7-10天内可能跑得较慢或无法完成跑程，但在之后能够完成正常的跑动，并表现出明显的功能缺陷。

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

结果

如上所述，mSU 在 fMCAo 手术后开始。我们在两组独立的小鼠队列（fMCAo 脑卒中组与假手术组）中的代表性结果（图4a）证实了 mSU 此前已被证实的价值，尤其是在第3至第10天的关键时期13。在我们的队列中，队列1（脑卒中组，随访6个月）15只动物中有3只死亡，队列2（脑卒中组，随访14天）10只动物中有2只死亡，假手术组6只动物均无死亡（图4a），死亡均属于脑卒中病理生理过程的一部分（均在早晨巡查时发现死亡），并被纳入评分系统。未因预设的人道终点对任何动物实施安乐死。这一在A期（fMCAo术后最初24-48小时）发生的急性死亡率（10-15%）（图4a）归因于大面积梗死引起的半球水肿和脑疝13，在转化型脑卒中模型中属于预期现象。B期的延迟死亡（队列1为1/15，队列2为1/10）在mSU方案下额外增加了最多5-10%的死亡率（

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

讨论

本方案是mSU支持方案的综合指南，旨在降低采用fMCAo模型建立大范围梗死性脑卒中的小鼠在术后第3至10天期间由实验因素导致的死亡率13。此外，本方案还包括一份标准化的视频指南，用于评估卒中后小鼠神经功能缺损评分量表（ESS）中的局灶性成分（fESS），以减少神经功能局灶性评分中存在的主观性和偏倚。同时，我们引入了梯子行走实验（Ladder-rung test），用于量化卒中后长期（长达6个月）对侧前肢和后肢的运动功能缺陷。

mSU 操作简便且高效。我们的视频辅助方案使 mSU 的应用清晰明了，即使无经验的研究人员也能轻松掌握。mSU 的三个阶段（即 A 阶段、B 阶段和 C 阶段，参见上述方案第 1 节） 图1h根据经验定义各项参数，以调整其评估方式并提供相应的支持措施。小鼠卒中监护室（mSU）根据每个阶段以及每只小鼠的风险分层评分（Risk Stratification Score, RSS）每日调整干预方案。该评分反映小鼠的临床严重程度，对其当前死亡风险进行评估，并指导...

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

披露

无任何披露事项需要报告。

致谢

我们感谢 Nikolaos Plakopitis 和 Ioannis Tatsidis 在本研究部分过程中提供的宝贵手术支持。

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
用于mSU的工具
5%葡萄糖溶液 VIOSER S.Ana (不适用)任何通用品牌
非接触式数字体温计AVRONYTC20095任何通用品牌
数字体重秤KERN & Sohn GmbhFCB6K1任何通用品牌
食物颗粒Mucedola srlna任何通用品牌，使用您动物设施的常规饲料
加热板PhotaxnaPhotax dishwarmer 2
液体消毒剂Schülke & Mayr GmbHnaOctenisept®
普通食物搅拌机na用于粉碎颗粒。任何通用品牌
生理盐水DEMO S.A.na氯化钠注射液 0.9%
别针和棉签na任何通用品牌
糖na任何通用品牌
带27号针头的1ml注射器na任何通用品牌。用于喂食（无需针头）和皮下输液（需针头）
用于ESS的工具
45°倾斜平面 自行制作na由有机玻璃或其他材料制成，表面带橡胶层，用于攀爬测试
棉签 任何通用品牌na市售耳用棉签，将其棉头拉长并变细
边缘锐化的木棒任何通用品牌na例如牙签
长梁 自行制作na尺寸：1 × 1 × 1 cm，长约100 cm，木质。测试时置于两张桌子边缘之间用于平衡木行走实验
厚手套 任何通用品牌na防止动物从梁上跌落时受伤

参考文献

  1. Donnan, G. A., Fisher, M., Macleod, M., Davis, S. M. Stroke. Lancet. 371 (9624), 1612-1623 (2008).
  2. Lourbopoulos, A., et al. Translational block in stroke: A constructive and "out-of-the-box" reappraisal. Front Neurosci. 15, 652403(2021).
  3. Cai, R., et al. Panoptic imaging of transparent mice reveals whole-body neuronal projections and skull-meninges connections. Nat Neurosci. 22 (2), 317-327 (2019).
  4. Fluri, F., Schuhmann, M. K., Kleinschnitz, C. Animal models of ischemic stroke and their application in clinical research. Drug Des Devel Ther. 9, 3445-3454 (2015).
  5. Clark, W. M., Lessov, N. S., Dixon, M. P., Eckenstein, F. Monofilament intraluminal middle cerebral artery occlusion in the mouse. Neurol Res. 19 (6), 641-648 (1997).
  6. Longa, E. Z., Weinstein, P. R., Carlson, S., Cummins, R. Reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats. Stroke. 20 (1), 84-91 (1989).
  7. Powers, W. J., et al. Guidelines for the early management of patients with acute ischemic stroke: 2019 update to the 2018 guidelines for the early management of acute ischemic stroke: A guideline for healthcare professionals from the american heart association/american stroke association. Stroke. 50 (12), e344-e418 (2019).
  8. Schaar, K. L., Brenneman, M. M., Savitz, S. I. Functional assessments in the rodent stroke model. Exp Transl Stroke Med. 2 (1), 13(2010).
  9. Ruan, J., Yao, Y. Behavioral tests in rodent models of stroke. Brain Hemorrhages. 1 (4), 171-184 (2020).
  10. Bederson, J. B., et al. Rat middle cerebral artery occlusion: Evaluation of the model and development of a neurologic examination. Stroke. 17 (3), 472-476 (1986).
  11. Bieber, M., et al. Validity and reliability of neurological scores in mice exposed to middle cerebral artery occlusion. Stroke. 50 (10), 2875-2882 (2019).
  12. Lourbopoulos, A., Karacostas, D., Artemis, N., Milonas, I., Grigoriadis, N. Effectiveness of a new modified intraluminal suture for temporary middle cerebral artery occlusion in rats of various weight. J Neurosci Methods. 173 (2), 225-234 (2008).
  13. Lourbopoulos, A., et al. Inadequate food and water intake determine mortality following stroke in mice. J Cereb Blood Flow Metab. 37 (6), 2084-2097 (2017).
  14. De Simoni, M. G., et al. Neuroprotection by complement (c1) inhibitor in mouse transient brain ischemia. J Cereb Blood Flow Metab. 23 (2), 232-239 (2003).
  15. Llovera, G., Roth, S., Plesnila, N., Veltkamp, R., Liesz, A. Modeling stroke in mice: Permanent coagulation of the distal middle cerebral artery. J Vis Exp. (89), e51729(2014).
  16. Dzirkale, Z., et al. Long-term behavioural alterations in mice following transient cerebral ischemia. Behav Brain Res. 452, 114589(2023).
  17. Kolabas, Z. I., et al. Distinct molecular profiles of skull bone marrow in health and neurological disorders. Cell. 186 (17), 3706-3725.e29 (2023).
  18. Kestner, R. I., et al. Gene expression dynamics at the neurovascular unit during early regeneration after cerebral ischemia/reperfusion injury in mice. Front Neurosci. 14, 280(2020).
  19. Pinto, R., et al. Bridging the transient intraluminal stroke preclinical model to clinical practice: From improved surgical procedures to a workflow of functional tests. Front Neurol. 13, 846735(2022).
  20. Damigos, G., et al. Machine learning based analysis of stroke lesions on mouse tissue sections. J Cereb Blood Flow Metab. 42 (8), 1463-1477 (2022).
  21. Engel, O., Kolodziej, S., Dirnagl, U., Prinz, V. Modeling stroke in mice - middle cerebral artery occlusion with the filament model. J Vis Exp. (47), (2011).
  22. Bowman, T. A., et al. Acyl coa synthetase 5 (acsl5) ablation in mice increases energy expenditure and insulin sensitivity and delays fat absorption. Mol Metab. 5 (3), 210-220 (2016).
  23. John, L. M., et al. Housing-temperature reveals energy intake counter-balances energy expenditure in normal-weight, but not diet-induced obese, male mice. Commun Biol. 5 (1), 946(2022).
  24. Tashiro, M., Hosokawa, Y., Amao, H., Tohei, A. Duration of thermal support for preventing hypothermia induced by anesthesia with medetomidine-midazolam-butorphanol in mice. J Vet Med Sci. 82 (12), 1757-1762 (2020).
  25. Taylor, D. K. Study of two devices used to maintain normothermia in rats and mice during general anesthesia. J Am Assoc Lab Anim Sci. 46 (5), 37-41 (2007).
  26. Bendele, A. M. Urinary system. Jones, T. C., Hard, G. C., Mohr, U. , Springer Berlin Heidelberg. Berlin, Heidelberg. 456-462 (1998).
  27. Schallert, T., Fleming, S. M., Leasure, J. L., Tillerson, J. L., Bland, S. T. Cns plasticity and assessment of forelimb sensorimotor outcome in unilateral rat models of stroke, cortical ablation, parkinsonism and spinal cord injury. Neuropharmacology. 39 (5), 777-787 (2000).
  28. Mathis, A., et al. Deeplabcut: Markerless pose estimation of user-defined body parts with deep learning. Nat Neurosci. 21 (9), 1281-1289 (2018).
  29. Fonarow, G. C., et al. Relationship of national institutes of health stroke scale to 30-day mortality in medicare beneficiaries with acute ischemic stroke. J Am Heart Assoc. 1 (1), 42-50 (2012).
  30. Allen reference atlas - adult mouse brain coronal. Available from atlas.Brain-map.Org. , Allen Institute for Brain Science. (2011).
  31. Groger, M., et al. Release of bradykinin and expression of kinin b2 receptors in the brain: Role for cell death and brain edema formation after focal cerebral ischemia in mice. J Cereb Blood Flow Metab. 25 (8), 978-989 (2005).
  32. Kolbinger, A., et al. Behind the wall-compartment-specific neovascularisation during post-stroke recovery in mice. Cells. 11 (10), (2022).
  33. Merino-Serrais, P., et al. Microanatomical study of pyramidal neurons in the contralesional somatosensory cortex after experimental ischemic stroke. Cereb Cortex. 33 (4), 1074-1089 (2023).
  34. Metz, G. A., Whishaw, I. Q. The ladder rung walking task: A scoring system and its practical application. J Vis Exp. (28), (2009).
  35. Metz, G. A., Whishaw, I. Q. Cortical and subcortical lesions impair skilled walking in the ladder rung walking test: A new task to evaluate fore- and hindlimb stepping, placing, and co-ordination. J Neurosci Methods. 115 (2), 169-179 (2002).

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

重印与许可

标签

大脑中动脉闭塞实验性卒中评分梯子行走测试圆筒实验运动功能评估风险分层评分局灶性卒中缺陷转化卒中模型
用于转化型小鼠脑卒中研究的标准化神经功能评分小鼠脑卒中单元方案
联系我们
向图书馆推荐

隐私政策

使用条款

政策

版权所有 © 2026 MyJoVE Corporation。保留所有权利。