用于转化小鼠卒中研究的具有标准化神经学评分的小鼠卒中单元方案

摘要

本文提出了一种在大中风小鼠中执行高度转化和独立验证的小鼠卒中单元 （mSU） 概念的方案。它还提供了在小鼠中执行局灶性实验性卒中量表的标准化方案，该量表评估了即使是长期检测到的卒中局灶性缺陷。

摘要

中动脉闭塞的细丝模型 （fMCAo） 可能是最具转化性的小鼠卒中模型，允许通过血管内再灌注/再通来控制缺血。然而，它与当前卒中护理的临床进展（例如，卒中单位）缺乏一致性，通常在实验室中采用主观或模糊的神经学评分，并且表现出较高的急性期死亡率。在这里，我们通过经过验证的视频引导方案解决了这些限制。我们介绍了小鼠卒中单元 （mSU） 方案，其中包含教学视频和决策算法 （风险分层评分），弥合了临床和小鼠卒中建模之间的差距。为了提高中风神经评分的准确性和敏感性，我们首次提出了焦点实验性卒中量表 （fESS） 的视频标准化格式，并证明了其在中风后 6 个月内的价值。此外，还提出了小鼠 Ladder-trang 测试的方案，以及已知的 Cylinder 测试，用于对四肢运动功能进行无偏倚、定量评估。结果突出了 mSU 的翻译功效。局灶性 ESS （fESS） 在检测局灶性卒中缺陷、捕获恢复和在卒中后长达 6 个月内保持敏感性方面优于其他已知量表。梯级和圆柱体测试客观地量化和监测前肢和后肢运动缺陷，长期。总之，整合 mSU、fESS 和运动功能测试为临床相关的卒中调查提供了一个强大的框架。我们的实验方案提高了小鼠卒中研究的转化价值。

引言

大面积缺血性中风是全世界发病率和残疾的主要原因之一¹。尽管如此，到目前为止，小鼠中风研究在几乎所有临床前测试的治疗方法中都面临转化障碍²。此问题的多个原因和克服它的努力已在之前的出版物² 中进行了详细回顾。这些挑战是由于临床进展对相关动物模型的整合有限² 以及行为和神经学评分系统在准确和灵敏地检测中风后缺陷方面的弱点² 而产生。

最近的发现³ 支持小鼠中动脉闭塞 （fMCAo） 的细丝模型与其他开放性颅骨损伤和创伤模型相比具有显著的转化优势 ^2,4。最重要的是，这是唯一一个模拟临床卒中再灌注和机械血栓切除术的方法 ^5,6,7。然而，该模型在中风后 3-7 天之间面临较高的亚急性死亡率，这禁止了对大中风的长期研究，并且直到最近还被认为是该模型固有且无法克服的伪影。此外，由于小鼠的体型小，中风后神经功能缺损的检测相对困难且存在偏差，尤其是在非临床医生或缺乏经验的研究人员中 ^8,9。为了解决这个问题，不同的小组开发了各种量表来检测缺陷。最常用和已知的量表包括 3 点贝德森量表 （BS）¹⁰、5 点改良贝德森量表 （mBS）¹¹、5 点隆加评分 （LS）（类似于 mBS）⁶、改良神经卒中量表 （mNSS）^12,13、18 点加西亚量表 （GS）⁹ 和更详细的 DeSimoni¹⁴ 或不同称为"神经评分"（NS）^9，15 比例。不幸的是，其中一些量表要么过于粗糙，仅限于中风后的少数急性期天数（BS、mBS 和 LS）^8,9，^要么它们的解释因一般缺陷 （NS） 而模糊不清。

在此背景下，我们之前开发并验证了小鼠卒中单位 （mSU） 支持方案，以及小鼠的实验卒中量表 （ESS）¹³。mSU 的基本原理是将临床常规（即人类卒中单位）中的知识转化为卒中的临床前研究，而 ESS 将先前存在但"不敏感"或冗余的卒中量表批判性地整合为实用、精致、敏感和省时的量表。mSU 包括对小鼠基本临床参数的频繁和适应性监测，以及适应性动物支持的应用以提高生存率¹³。

事实上，来自我们实验室和其他实验室的数据验证了这两种方法的价值。mSU 将临床基本支持措施转化为小鼠⁷ 从人类到小鼠，将小鼠 fMCAo 的死亡率从 60-70% 显着降低到 10-15%¹³，从而允许研究更大的中风，并且可以有效地应用于独立实验室 16,17,18,19.此外，ESS 可以区分局灶性（ESS 的局灶性成分、fESS）和一般（ESS 的一般成分、gESS）中风后缺陷和症状，模拟人类临床评分（区分人类局灶性和一般体征和症状），与中风病变大小线性相关，并且对缺陷长期敏感^13,20.尽管如此，尽管 mSU 和 ESS 的价值和功效都得到了证实，但即使是没有经验的研究人员也缺乏明确、可视化、标准化的指导，这给 mSU 应用留下了几个悬而未决的问题，并且对 fESS 的局灶性缺陷评分具有很大的主观性。

因此，我们在本文中旨在为 mSU 和 fESS 协议提供视频辅助和清晰的说明。我们坚信，它将支持中风研究人员提高中风研究的转化效率，显著减少中风后前 3-10 天内动物的损失，降低实验成本，并最终可重复地评估中风后数月的神经功能缺损¹³。此外，梯级测试和圆柱体测试的附加组合可以轻松量化由 fMCAo 引起的局灶性肢体麻痹（前肢和后肢）。

为了展示 mSU 和 fESS 效率，我们提供了 fMCAo 后小鼠的中期（14 天）和长期（6 个月）数据。使用 12 周龄雄性 C57Bl/6J 小鼠 （n= 31） 并在受控温度 （22 ± 2 °C） 下饲养，光暗循环期为 12 小时，可随意获得颗粒状食物和水。将小鼠分为两个队列，分别随访 14 天 （n=10，队列 1） 和 6 个月 （n=15，队列 2）。这些小鼠在异氟醚麻醉下使用描述良好的 fMCAo 13,20,21 模型进行 60 分钟的脑缺血。假手术动物 （n=6，作为上述两个队列作，但未诱导缺血） 作为对照 6 个月。丁丙诺啡用作术前和 3 天的镇痛药。作为神经学评分的一部分，还对 6 个月的队列进行了梯级和圆柱体测试。

在介入后的前 14 天内，每天检查所有动物的人道终点，定义为:1） 严重的体温过低 （<33 °C） 和/或不活动（例如，fESS 测试 6 评分 4 或 gESS 的"自发活动"测试）未通过"小鼠卒中单元"治疗（即被动加热和主动喂养，见 1.4， 1.6、1.8） 一小时内，2） 疼痛或焦虑行为的迹象（例如 gESS 的"焦虑/自动行为"测试评分 >2），即使在按照方案进行术后镇痛后也是如此。

在该方案中，小鼠从 fMCAo 手术中恢复后立即开始以 mSU 形式对小鼠的中风后支持。这有 3 个阶段: A 阶段 （再灌注后 0-48 小时）、 B 阶段 （>48 小时直至"所需主动支持结束"，通常在第 10-14 天，取决于个体动物的 B 阶段）和 C 阶段 （第 14 天开始）。它有五种重要的干预措施（访问/风险分层评分、喂养、液体、温度和局部消毒;见下文 1.1. 至 1.8.），根据每个阶段（A、B 或 C）及其每日实际临床状态由风险分层评分 （RSS） 评估，参见 补充图 1 和 表 1 的三个典型示例。mSU 所需的材料和工具如图 1a 所示，并在 材料表中描述。我们还提供了 mSU 期间动物监测的模板（参见 补充文件 1）。

方案

本文报道的实验是按照国家和欧洲实验动物使用指南进行的，并得到了希腊政府委员会的批准（雅典，许可证号"843895_06-09-2022"）。

1. "鼠标 Stroke-Unit" （mSU）

1. 每天评估动物的临床状态（"访问"）并计算其 RSS 评分
   1. 打印 补充文件 1，最好在动物手术前打印，用于记录数据和监测。
   2. 在标准时间点（访问）对每只动物进行临床评估:清晨（08:00 左右）、中午（14:00 至 16:00 之间）和深夜（22:00 - 23:00 左右）。
      注意:根据动物的随访阶段调整这些标准访问:A 阶段每天 2 次（早晚）检查动物的状态，B 阶段每天 3 次，C 阶段每天检查一次。根据 RSS 分数进一步调整访问频率（见 1.1.6）。最好在 >2 人的团队中工作，以减少工作量。早晚访问对于成功支持、监测和降低死亡率至关重要，因为小鼠的夜间（活跃）阶段会增加代谢和能量需求 13,22,23，并与夜间中风后死亡率增加有关。
   3. 在早晨访问期间使用敏感的标准秤称量小鼠。
   4. 在早晨访问期间，使用放置在其腹侧体中心上的非接触式温度计测量温度。用鼠标的背部握住鼠标并使其固定。在固定后的最初几秒钟内读取读数（见 图 1f）。
      注意:请勿使用直肠温度计，因为在重复测量并伴有腹膜炎后可能会发生肠道破裂。
   5. 在早晨访视中评估并记录小鼠的一般临床状况（活动能力、伤口、尿道帽、反应性、皮毛、水合状态等），每天直到第 14 天。
   6. 根据动物的体重、温度和 fESS 评分相加，计算早晨访问的 RSS 评分，如 补充图 1 中所述。要在电子表格表中自动计算 RSS，请使用并调整 表 1 中的公式。如果存在人道终点，请使用机构批准的方法对动物实施安乐死（见上文）。
   7. 根据 RSS 评分和动物中风后阶段，每天调整访问频率和支持强度。
      注:B 期对死亡率最关键。增加访问 RSS ≥3 的访问频率和支持强度（有关定义和说明，请参见 表 1）。如果动物在 C 阶段继续显示 RSS >3，请像 B 阶段一样访问和支持它。使用 RSS 和一般描述（例如恢复、稳定、低/中病和危重病）在支持团队中描述其临床状况。第 14 天后，将动物访问减少到仅实验方案所需的访问（例如，用于行为/神经学评估）。
2. 制备用于营养支持的凝胶食品
   1. 使用搅拌机粉碎常见的食物颗粒（图 1a）。
   2. 添加 5-10% 的商业糖以增加食物的热量。
   3. 加水以产生凝胶状液体质地（图 1b）。
   4. 使用这种凝胶食物进行被动和主动的营养支持。
      注:或者，使用即用型市售凝胶食品。准备好的食物可以在冰箱中放置 2-3 天。
3. 小鼠的被动营养支持
   1. 用凝胶食物填充培养皿并将其放在笼地板上（通过提供凝胶食物以方便小鼠接触来提供被动营养支持）。在培养皿旁边留下 2-3 个食物颗粒。
   2. 每天用凝胶食物刷新培养皿。在最初的几天里，小鼠可能会用笼子垫料填充或覆盖培养皿。有些人会开始吃它（图 1c）。
4. 积极的营养支持（积极喂养）
   注意:主动喂养发生在 B 阶段。标准喂养频率为 3 次/天，并根据 RSS 评分适应更多次（例如，甚至 4-5 次/天）。有时，对于持续 RSS 评分为 0-1（即小中风）并自行积极进食的小鼠，将频率降低到 1-2/天。
   1. 用凝胶食品预填充 1 mL 注射器。
   2. 轻轻但牢固地从老鼠的脖子毛发上抓住并握住鼠标，如图 1d （红色箭头）所示。
   3. 用中指稳定鼠标的脸颊，如图 1d 中的红色箭头所示:在牢牢握住鼠标的同时，将手指向侧面滑向鼠标的鼻子，抵住它的脸颊。保持位置。
   4. 将注射器的尖端放在小鼠的嘴里，放在它的牙齿之间，并将尖端指向其脸颊的内侧（红色箭头， 图 1e）。
   5. 每次给大约 40-50 μL 凝胶食物（一口）。
   6. 轻轻地将鼠标放回笼式格栅上。留出时间咀嚼。
   7. 1-2 分钟后重复喂食，直到每只小鼠吃了 1-1.5 mL 的凝胶食物。
      注意:每次运行喂养 5-10 只小鼠（1-2 个笼）;其他老鼠吃掉并吞下凝胶食物，因为每只老鼠都吃了一口。该过程不会给小鼠带来压力。据观察，一些动物最终会把自己放在抓握和喂食的位置。
5. 生理盐水补充剂
   1. 在早晨访问期间称量鼠标（参见 1.1.2 和 1.1.3）。
   2. 通过减去值来计算与先前测量值相比的重量损失/增加。
   3. 用 mL 生理盐水（皮下注射）补充其体重不足（以克为单位）。
      注意:不惜一切代价避免液体超负荷和水肿。每次剂量不超过 1-2 mL，每天不超过 3-4 mL 液体。fMCAo 后 36 小时后开始。
6. 葡萄糖补充
   1. 检查计算出的鼠标 RSS 分数及其整体移动。
   2. 如果 RSS >3 并且小鼠出现体温过低 （<34°C） 或固定/运动迟缓的伴随迹象，则皮下注射 0.5 - 1 mL 5% 葡萄糖。最好只在夜间访问时注射。
      注意:不惜一切代价避免中风后高血糖。中风后高血糖症是有毒的⁷.因此，只有在积极进食后和临床状况严重的情况下，或为了防止夜间活动期间出现低血糖，才补充葡萄糖。主动喂养（见 1.4）应该是主要的支持测量，因为它提供更平稳和更持久的能量支持并翻译临床指南 ⁷。第 3 天之前不要补充葡萄糖。
7. 温度管理（被动）
   1. 在每次就诊时，在基线和术后测量动物的表面体温（图 1a）。如图 1f 所示和 1.1.4 中描述的测量。记下这些值。
      注意:小鼠体温过低定义为体温<35 °C ^24,25。之前的数据¹³ 表明，任何低于 34 °C 的温度都是卒中后支撑的警告信号（见下文）。
   2. 当观察到 33 至 34 °C 之间的体温过低时，在加热板（或任何其他被动加热装置）上的笼子中被动加热小鼠，直到达到体温 >34 °C。 主动喂养老鼠，为动物主动产生热量提供能量（更持久的能量供应）。
      注意:将动物置于被动加热状态 1 到几个小时。不惜一切代价避免被动热疗。
   3. 当观察到体温过低时，<33 °C，通过皮下额外给予葡萄糖来增加支持（快速但短暂的能量供应;见上文 1.6）。
8. 清洁生殖器和/或颈部伤口（局部"消毒"）
   注意:偶尔可以观察到伤口裂开或尿道栓。伤口裂开罕见。尿道塞是小鼠生殖器尖端的硬塞（图 1g），更常见，尤其是在中风严重程度较高的动物中。当塞子堵塞尿道时，可能会发生尿路阻塞综合征，并可能导致发病和死亡²⁶。因此，应将其清洁干净。
   1. 用生理盐水浸泡尿道塞（如果有）以方便其取出。
   2. 在每次动物检查/访问时，用小棉签或简单的镊子轻轻取下尿道塞。使用蘸有消毒液的量规或棉签对尿道进行消毒。
   3. 如果存在伤口裂开，请使用任何常见的手术消毒液（例如 Octanisept）进行局部消毒，并定期使用 5/0 丝缝合线缝合伤口。

2. 实验卒中量表 （fESS） 的焦点成分

1. 准备测试区域
   1. 用 70% 酒精清洁工作台以去除外部刺激（光学或气味）并准备测试材料，如图 2a 所示。
   2. 打印作为 补充文件 2 提供的 ESS 评分表，并逐个跟踪测试。
2. 前肢麻痹（测试 1）
   1. 从鼠标的尾部底部轻轻抬起并按住鼠标。
   2. 当鼠标移动时，目视检查和评估前肢的对称向前伸展和对称活动度（图 2c）。
   3. 根据视觉发现评分如下:前肢正常、对称的伸展和运动为 0;1 表示"轻微不对称"，定义为对侧肢体轻度屈曲和/或运动减少或肢体僵硬;2 例用于对侧肢体的"明显屈曲";3 用于将对侧肢体粘附在躯干上;没有身体或肢体运动得 4 分。
      注意:该测试检测对侧前肢麻痹。它也是 BS、LS、mNSS 和 NS 标度的一部分。由于动物的逃跑动作，分数 1 可能难以定义。
3. 后肢麻痹（测试 2）
   1. 继续握住鼠标的尾部底座，如测试 1 所述。
   2. 目视检查后肢和脚趾的对称伸展和运动（图 2c）。
   3. 根据结果评分如下:后肢和脚趾的正常、对称位置/伸展和运动为 0;1 表示明显的不对称，当对侧（右）后肢的运动和不对称位置/伸展显着减少时（图 2d）。
      注意:该测试检测对侧后肢麻痹。它也是 mNSS 量表的一部分。这个测试可能很难准确评分。
4. 躯干对称性（测试 3）
   1. 继续握住鼠标的尾部底部（遵循 2.3）并评估其躯干运动。
   2. 根据检查结果进行评分，如下所示:正常、无躯干屈曲或对称的躯干两侧轻度屈曲/移动（作为"逃脱"动作）为 0;1 表示在握持后的前 10 秒内，头部/躯干明显 （>30°） 主要向侧（向右）屈曲。
      注意:该测试通过单侧运动损伤检测不对称性。它也是 mNSS 评分的一部分。
5. 盘旋行为（测试 4）
   1. 将鼠标轻轻放在平坦的表面上，让它自由移动至少 1 分钟。观察其移动模式。
   2. 根据调查结果进行评分，如下所示:探索性、生动、线性运动，没有盘旋行为，得分为 0;1 表示倾向于转向一侧但不在封闭的圆圈中;2 表示在封闭的圆圈中向一侧不恒定地移动;3 用于在向一侧闭合的圆圈中不断移动;4 表示旋转、摇摆或完全不移动。
      注意:该测试检测感觉运动和空间导航缺陷。它也是 NS 的一部分。
6. 身体对称性（测试 5）
   1. 从测试 4 继续，让鼠标在平面上自由移动。观察它的 nose-to-tail 轴。
   2. 根据调查结果评分如下:0 表示正常姿势，躯干从长凳上抬高，尾巴笔直;1 表示"轻微不对称"，如果身体轻微向一侧弯曲，尾巴远端弯曲;如果明显的身体弯曲或向对侧倾斜，尾巴近端弯曲和/或四肢伸出身体，则为"中度不对称"2 分;3 分表示"明显的不对称"，如果明显的身体弯曲，一侧不停地躺在长凳上，尾巴明显近端弯曲（超过 2 分）;4 表示"极度不对称"，如果身体弯曲，一侧一直躺在长凳上，尾巴高度弯曲。
      注意:它检测感觉运动单侧躯干和尾部缺陷。它也是 NS 量表的一部分。
7. 步态评估（测试 6）
   1. 从测试 5 继续，让鼠标在平面上自由移动。现在观察它的步态并检查步态运动缺陷，例如麻痹、肢体僵硬、痉挛性步态、肢体。
   2. 根据研究结果评分如下: 如果探索性、对称和快速且肢体灵活，则正常步态为 0，这些肢体"隐藏"在身体下移动;1 代表自由移动的鼠标僵硬、不灵活和缓慢的步态，没有一瘸一拐;2 用于不对称（左右）运动的清晰跛行;3.用于颤抖、漂移或轻轻推摔倒;4 表示不自发行走（在轻轻推动的刺激下行走不超过 3 步）。
      注意:它检测组合步态缺陷。它也是 NS 的一部分。
8. 强制绕圈（测试 7）
   1. 握住鼠标的尾巴根部，将其从表面抬起，只让它用前肢行走。观察它的移动。
   2. 根据结果评分如下:正常线性运动为 0;1 代表倾向于转向一侧;2 用于在闭合圆圈中转向一侧;3 如果以笨拙的动作转向一侧或迟钝地未能完成一个圆圈;4 如果没有前进并且树干的前部位于长凳上。
      注意:该测试是对盘旋行为测试（测试 4，请参阅 2.5）的补充。它可能检测感觉运动和空间缺陷。它也是 NS 评分系统的一部分。
9. 对抗侧向力的姿势（测试 8）
   1. 将鼠标放在手掌上，其尾鼻轴（纵向）平行于矢状手掌轴。
   2. 以稳定的速度向前向后摆动鼠标，以产生垂直于其纵轴的力。
      注意:这会迫使鼠标在挥动过程中保持其直立位置并平衡横向力。它的身体通常不接触手掌或手指。
   3. 观察和感觉鼠标左右两侧的任何手掌接触，因为它与摆动保持平衡。检查是否有任何不对称的跌倒、触摸手掌或外侧无力的迹象。
   4. 根据调查结果得分，如下所示:如果鼠标以正常的直立姿势站立，背部与手掌平行，并且可以在不严重接触手掌的情况下保持平衡，则为 0;1 如果鼠标在摆动过程中将其身体变平以获得稳定性;2 如果鼠标的一部分在摆动过程中躺在或短暂接触手掌;3.如果鼠标侧卧，勉强能恢复直立位置;4.如果鼠标处于俯卧位置，则无法恢复直立位置。
      注意:该测试检测姿势对横向加速度的缺陷，但其评分可能是主观的。它也是 mNSS、NS 的一部分。
10. 前肢定向放置（测试 9）
    1. 从鼠标的背部或尾部底部握住鼠标。将其垂直于光束，光束起到"要到达的目标"的作用。观察对称的 "伸出 "和抓握。
    2. 一旦它稳定地抓住横梁，轻轻地将其拉开并观察前肢的对称"释放"。
    3. 根据调查结果进行评分，如下所示:对称的 "伸出 "、 抓握 和 "释放 "为 0;1 表示"伸出"和/或"释放"的任何不对称，表明前肢对侧无力。
11. 前肢感觉运动障碍（测试 10）
    1. 牢牢握住鼠标的背部并面向其腹侧（参见视频或 图 1e）。
    2. 用细尖（例如木制牙签）从死角连续刺激前爪。观察前爪的反应。
    3. 根据调查结果得分如下: 0 表示正常、迅速的两侧抓握运动;1 表示对侧抓握缺失或明显延迟。
       注意:2.10 和 2.11 都测试前肢精细感觉运动缺陷。它们也是 mNSS 的一部分。
12. 光束行走（测试 11）
    1. 放置一根 1 m 长的木梁（材料表），以连接离地面 1-1.5 m 高度的两个高架表面（例如长凳、桌子）。稳定梁的边缘以避免振动或不稳定。
    2. 将鼠标放在梁的中间，其鼻子-尾轴与梁平行（图 2e）。允许在横梁上保持平衡或自由行走。观察其平衡或肢体麻痹和脱落。
       注意:鼠标在对光束进行评分之前应在光束上获得平衡。在动物下方（距离约 15-20 厘米）戴上厚手套，以防止它掉落。
    3. 根据调查结果评分如下:如果小鼠保持平衡并以稳定的姿势向横梁的一侧行走，则为 0;如果它抓住横梁的侧面并且不在上面行走，则为 1;如果一条肢体从横梁上掉下来，则为 2 分;如果两条肢体从横梁上掉下来，则为 3 分;如果鼠标试图在横梁上保持平衡但脱落（40 秒后），则为 4 分;如果在 20-40 秒之间脱落，则为 5 分;如果它坠落时没有尝试平衡或挂在横梁上（<20 秒），则得 6 分。
       注意:该测试检测前肢、后肢和躯干的组合运动缺陷。它也是 mNSS 量表的一部分。
13. 胡须感（测试 12）
    1. 将鼠标放在打开的工作台上（如测试 4 和 5 所示）。留出一些时间进行住宿。
    2. 用细长尖棉签从"盲角"依次刺激它的左右胡须。观察头部对刺激的迅速转动反应。
    3. 根据结果评分如下:0 为双侧刺激时正常、快速转头;1 表示刺激时对侧反应较慢;2 无对侧反应（无转弯）;3 例用于无对侧病变和较慢的同侧反应;4 表示双侧缺失反应。
       注意:避免目视检测棉花，因为这会错误地导致同侧头部转动。只有当鼠标对胡须刺激感到"惊讶"时，该测试在技术上才是正确的。该测试也是 NS 的一部分，可检测胡须（桶状皮层）的感觉运动缺陷。
14. 攀岩（测试 13）
    1. 使用橡胶涂层的 45° 角倾斜表面（图 2a）并将鼠标置于其中心。观察鼠标的攀爬努力。
    2. 根据调查结果进行评分，如下所示:如果鼠标快速轻松地爬到表面顶部，则为 0（正常）;如果爬升时劳损，肢体无力，则为 1 分;如果它紧紧抓住斜坡而没有滑倒或爬升，则为 2 分;如果它尽管努力防止跌落，但仍从斜坡上滑下，则为 3 分;4 如果它滑动而不努力防止跌落。
       注意:该测试也是 NS 的一部分，可检测一般电机强度。
15. 通过将测试 1 到 13 的所有分数相加来计算 fESS 的分数
    注意:fESS 分数为 0 表示正常鼠标，最高分数为 42。伴有纹状体和皮质病变的大面积梗死通常可引起 >7-9 分的评分。在开始评估中风小鼠之前，对几只正常小鼠进行检查和评分，以适应正常行为的变化并减少假阳性 fESS 评分。不断使用提供的视频协议，以在整个实验中标准化评分。

3. ESS 的一般组成部分 （gESS）

注意:评估 gESS 以检测"一般小鼠疾病"的迹象，例如炎症或感染，通常在 fMCAo 后的前 1-2 周内出现。使用 补充文件 2 中的评分表。最好在完成 fESS 后评估 gESS。

1. 将鼠标放在平坦的表面（长凳）上，并像 2.5 中一样让它自由移动。按顺序评估以下分数。
2. 观察它的皮毛。根据 gESS 评分表评分（分数 0-2，见 补充文件 2）。
3. 检查鼠标的惊吓反应:当鼠标放松时，从盲角突然拍手，让老鼠大吃一惊。根据 gESS 评分表检查并评分小鼠耳朵的反应（分数 0-2，见 补充文件 2）。
4. 目视评估放松小鼠的眼睛:检查睁开/闭眼或粘液是否存在。根据 gESS 评分表进行评分（分数 0-4，见 补充文件 2）。
5. 观察老鼠的一般自发活动和警觉性。根据 gESS 评分表进行评分（分数 0-4，见 补充文件 2）。
6. 观察鼠标的一般自发行为，在任何作过程中是否存在焦虑、过度兴奋、攻击性或沿其轴旋转。根据 gESS 评分表进行评分（分数 0-4，见 补充文件 2）。
7. 通过将上述所有步骤的分数相加来计算 gESS 的分数（观察评分，步骤 3.2. 到 3.6）。
   注意:如前所述，gESS 评分不检测中风病变引起的局灶性缺损，也不受 mSU 的影响 ¹³。所有测试均改编自 NS 量表 ^9,15。

4. 用气瓶测试量化前肢缺损

注意:气缸测试之前已详细描述 ^9,15,27，此处不再详细描述。圆柱体测试是一种独立的行为测试，可无偏倚地量化前肢的缺陷（见 4.2）。

1. 按照此处提供的说明运行测试¹⁵.捕获视频并对其进行分析，如 ¹⁵ 中所示。测量左右第一肢体与墙壁的接触。 图 3a、b 显示了设置的图像。
2. 计算由于对侧（右）麻痹引起的肢体使用的偏侧化，以百分比表示。使用公式:左步进的 % 首选项 = [（左 - 右） 第一个触点 / （右 + 左） 触点] x 100。
   注意:在诱发中风之前，对每只鼠标运行基线圆柱体测试。根据每个实验计划在时间点运行测试。

5. 使用 Ladder-rung 测试量化前肢和后肢缺陷

注意:用Plexiglas构建小鼠装置（如图 3c所示）:一条1 m长的走廊，墙壁高20 cm，塑料横档（直径3mm）以15 mm的规则间隔放置（图3c1）和远端的"避难所"盒。将动物垫料放在避难箱中以熟悉，并放置一些食物颗粒或花生酱作为奖励。走廊的宽度应为 10 厘米，并应离地约 30 厘米。

1. 在实验基线前 1-3 天在设备上训练小鼠。按照步骤 5.1.1 到 5.1.4 运行训练。
   注意:为了让动物稳定、正常地穿过梯级走廊，没有停止、转弯或探索行为，训练是必要的。连续 2 天（2 节课）进行训练。每次训练包括 3 次跑步（跑步 = 穿过整个走廊向避难箱走一次）。收集基线数据对于随访是必要的。
   1. 每次运行前用 70% 的酒精清洁梯级和墙壁，以避免气味和鼠标的"探索性"干扰/停止。
   2. 将鼠标置于梯级走廊的起点，面向避难箱，以开始运行。让老鼠自由地走向走廊尽头的避难箱。不要强迫动物走路。
      注意:训练期间的跑步通常在持续时间和步行模式方面变化很大。训练的目标是稳定地走向避难箱，通常在 <10 秒内，没有停止/转弯，这通常在第二个训练日结束时实现。始终轻柔地处理动物，以避免诱发压力，从而分散适当的训练注意力。如果动物留在走廊上并在本地探索 >1 分钟，请将其从走廊中移走并重新进行跑步，以避免习惯化。
   3. 执行^{第 1 次} 训练运行。^{第 1 次} 运行后，让动物在避难箱中休息 5 分钟。
      注意:这种延长的休息时间使老鼠能够熟悉避难箱，并将其视为要达到的"休息/奖励"目标。实现对避难箱的"有益感知"对于成功运行至关重要。
   4. 将鼠标从避难箱中取出，然后执行第二次和第三次训练运行，如 5.1.2 中所示。在这些跑步结束时（30-60 秒），在避难箱中留出较短的休息时间，以避免习惯化。
      注意:培训在第 2 天完成。到第 2 天，几乎所有动物都学会了以稳定的速度穿过走廊。如果动物没有学习，请考虑将它们排除在进一步的实验之外。
2. 在经过训练的小鼠上运行实验。在实验和基线的所有时间点，每次测试小鼠 2 次。
   1. 按照步骤 5.1.1 和 5.1.2 中的说明执行运行。在避难箱中的 2 次运行之间最多留出 5 分钟的休息时间。
   2. 使用智能手机（或等效相机）和"自拍杆"从一定距离以轻微的腹侧和 "盲区" 角度捕捉动物的视频（数据）（如图 3c2 所示）。确保在动物在走廊中行走时捕捉到四肢。不要在鼠标跑步期间在视觉上分散鼠标的注意力，并在跑步过程中跟随它的四肢（图 3c2）。
   3. 记录两次运行，但使用和分析第二次运行中的数据。
   4. 通过使用任何具有慢动作选项的媒体播放器软件观看视频，测量每个肢体（左/右、前/后肢）的横档之间的断层台阶（跌倒）数量（图 3c3）。分别计算前肢和后肢断层阶梯之间的绝对或百分比差异。
      注意:第二次运行可提供更可靠的结果。健康的小鼠在第二次运行期间，每个肢体（右或左）通常有 0-1 个任意错误步骤，这通常给出 0 ±1 的差异范围。中风的小鼠会用其右侧（对侧）麻痹肢体（前肢或后肢）做出错误步骤，导致阳性的"向右"偏侧化。严重中风的动物在中风后的前 7-10 天内可能会较慢或无法完成奔跑，但是，它之后会达到适当的奔跑并表现出严重的缺陷。

结果

如上所述，mSU 在 fMCAo作后开始。我们在 fMCAo 卒中和假小鼠的两个独立小鼠队列中的代表性结果（图 4a）证实了先前证明的 mSU 的价值，尤其是在第 3 天和第 10 天之间的关键时期¹³。在我们的队列中，队列 1 的 3/15 动物（中风，随访 6 个月），队列 2 的 2/10 动物（中风，随访 14 天）和 0/6 的假手术动物（图 4a）作为中风病理生理学的一部分（在早晨就诊时均发现死亡），并被纳入评分。没有动物按照预定义的人道终点被安乐死。A 期（fMCAo 后最初 24-48 小时）的急性死亡率 （10-15%） （图 4a） 归因于大面积中风引起的半球水肿和脑疝¹³，并有望作为翻译中风建模的一部分。在 mSU 方案下，B 阶段的延迟死亡率（队列 1 为 1/15，队列 2 为 1/10）最多增加了 5-10%（

讨论

本方案是 mSU 支持方案的综合指南，旨在降低 fMCAo 模型¹³ 遭受大区域卒中的小鼠第 3-10 天的人为死亡率。此外，本方案包括 ESS 量表 （fESS） 焦点分量的标准化视频指南，以减少中风后小鼠神经学局灶评分的扩展主观性和偏倚。此外，我们还引入了 Ladder-rung 测试，用于量化长期（长达 6 个月）对侧前肢和后肢运动缺陷。

mSU 用户友好且有效。我们的视频辅助方案使 mSU 易于应用，即使对于没有经验的研究人员也是如此。mSU 的 3 个阶段（即 A、B 和 C 阶段，参见上文协议第 1 节和图 1h）是根据经验定义的，以定制其评估和支持措施。mSU 根据每个阶段和每只小鼠的风险分层评分 （RSS） 评分每天定制其干预措施。该评分反映了其临床严重程度，对其实际死亡风险进行了估计，并指导其为每只小鼠量身定制的支持。与此相辅相成的是，仅对动物的临床观察应始终为量身定制的 mSU 支持添加信...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
mSU
5% 葡萄糖溶液的工具	VIOSER S.A	na （不适用）	任何通用
非接触式数字温度计	AVRON	YTC20095	任何通用
数字体重秤	KERN &Sohn Gmbh	FCB6K1	任何通用
食品颗粒	Mucedola srl	na	任何通用，使用您的动物设施的普通食物
加热板	Photax	na	Photax 餐具加热器 2
液体防腐剂	SchüLKE 和Mayr GmbH	na	Octenisept®
普通食品搅拌机		na	用于颗粒粉碎。任何仿制药
生理盐水	DEMO S.A.	na	氯化钠注射液 0.9%
Pinsetter 和棉签		na	任何仿制药
糖		na	任何仿
注射器 （1ml） 带 27 号针头		na	任何仿制药。用于食品给药（无针头）和皮下液体给药（带针头）
ESS工具
45° 斜面	构造它由		Plexiglas或其他材料制成，表面有橡胶，用于攀岩测试
棉签	任何通用	na	商业耳棉签，使其棉尖长而细
的边缘磨尖木棒	任何通用	na	例如牙签
长梁	建造它	尺寸	：1 x 1 x1 厘米，约 100 厘米长，木制。放置在两个桌面边缘之间进行光束行走测试
厚手套	任何通用	na	以防止动物从横梁上坠落时受到创伤