骨组织空间转录组学研究方法

摘要

本文介绍一种可对新鲜获取的骨组织进行脱钙并同时保存高质量RNA的方法。此外，还展示了一种对未经脱矿的福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）骨样本进行切片的方法，以便在无法获得或采集新鲜组织时仍能获得良好的实验结果。

摘要

了解细胞与其在每种组织内位置之间的关系，对于揭示与正常发育及疾病病理相关的生物学过程至关重要。空间转录组学是一种强大的方法，能够在组织样本中分析整个转录组，从而提供有关细胞基因表达及其所处组织学环境的信息。尽管该方法已被广泛应用于多种软组织，但其在骨等硬组织分析中的应用仍具挑战性。主要挑战在于处理硬组织样本以进行切片时，难以同时保持高质量的RNA和组织形态。因此，本文介绍了一种用于处理新鲜获取的骨组织样本的方法，以有效生成空间转录组学数据。该方法可实现样本的脱钙，从而成功获得组织切片，并在避免RNA降解的同时保留组织形态学细节。此外，还提供了针对未经脱矿处理、先前已包埋于石蜡中的样本（例如从组织库收集的样本）的详细操作指南。 利用这些指南，展示了从骨肉瘤原发肿瘤及肺转移的组织库样本中生成的高质量空间转录组学数据。

引言

骨是一种特化的结缔组织，主要由I型胶原纤维和无机盐组成¹。因此，骨具有极高的强度和刚性，同时又具备轻质和抗创伤的特性。骨的高强度来源于其矿物质含量。事实上，矿物质含量每增加一定百分比，骨的刚度便会提高五倍²。因此，研究者在通过组织学切片方法分析骨样本的生物学特性时，面临着显著的技术难题。

未脱钙骨组织学在某些情况下是可行且必需的，具体取决于研究类型（例如，用于研究骨的微结构）；然而，该技术极具挑战性，尤其是当样本体积较大时。在这种情况下，组织学用途的组织处理需要对标准方案和技术进行多项修改³。通常，为了进行常规组织学评估，骨组织在固定后会立即进行脱钙处理，该过程所需时间从数天到数周不等，具体取决于组织大小和所使用的脱钙剂⁴。脱钙切片常用于骨髓检查、肿瘤诊断等。脱钙剂主要有三种类型：强酸（如硝酸、盐酸）、弱酸（如甲酸）和螯合剂（如乙二胺四乙酸，即EDTA）⁵。强酸可快速脱钙，但可能损伤组织；弱酸应用广泛，适用于诊断性操作；螯合剂目前在研究应用中使用最为广泛且最为合适，因为其脱矿过程缓慢而温和，有利于保持高质量的形态结构，并保留基因和蛋白质信息，满足多种实验（如in situ杂交、免疫染色）的要求。然而，当需要完整保存整个转录....

方案

以下所述的所有动物实验程序均经匹兹堡大学牙医学院《实验动物护理与使用指南》合规批准。

1. 需要脱钙的骨组织样本福尔马林固定石蜡包埋块的制备方法

1. 试剂和材料的准备
   1. 配制 20% pH 8.0 的 EDTA 溶液。配制 1 L 溶液时，将 200 g EDTA 溶解于 800 mL 超纯水中，用 10 N 氢氧化钠调节 pH 至 8.0 ，最后用超纯水定容至 1 L。室温保存。
      注意：始终使用新鲜配制的 20% pH 8.0 EDTA 溶液。10 N 氢氧化钠（NaOH）通过将 400 g NaOH 溶解于 1 L 超纯水中配制而成。
   2. 在通风橱中使用不含钙和镁的 1× PBS 配制 4% 多聚甲醛（PFA）溶液。
      注意：在通风橱内指定一个区域专门用于处理高浓度多聚甲醛溶液或多聚甲醛固体，并明确标识。为避免暴露，应尽可能保持容器密闭。仅使用实验所需的最小实用量。若需称量多聚甲醛粉末而天平无法置于通风橱内，应先取一容器，在通风橱内加入 PFA 粉末并盖好，再返回天平进行称量。始终使用新鲜配制的 4% PFA 溶液。
   3. 为每个样本使用合适的容器。
      注意：例如，对于 1 mg 骨组织，应使用能容纳至少 1 mL 溶液与骨组织充分接触的容器。
   4. 对所有用于解剖的外科器械进行灭菌。
   ....

结果

本文所述方法介绍如何处理新鲜分离的骨骼，以获得脱矿质的石蜡包埋（FFPE）样本，这些样本可轻松使用切片机进行切片，同时保持RNA的完整性（图1）。该方法已成功应用于小鼠股骨，但也可用于其他尺寸相似的骨组织样本，或通过增加所有参数（时间、溶液体积等）调整适用于较大的骨样本（例如人源样本）。

图1：实验方案的示意图。 获得脱钙骨组织FFPE包埋块并保持RNA完整性的方法示意图（步骤1和2）。FFPE包埋块切片操作指南的示意图（步骤3）。

讨论

此处提供了一种详细的方法，用于制备脱钙骨组织的福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）切片，并在测序（即下一代测序，NGS）或其他RNA相关技术中保持RNA完整性（即 原位 杂交、定量反转录聚合酶链式反应（qRT-PCR）等。

该方法利用EDTA对骨组织样本进行脱钙；EDTA孵育可实现缓慢而精细的脱矿，从而最大程度地保存组织的组织学特征。通常，骨组织脱钙采用10% EDTA（pH 7.0）处理至少2周，并每隔一天更换一次溶液⁴。然而，长时间的脱钙过程会显著导致RNA降解^6,7,8。为解决这一问题，将EDTA浓度提高至20%，pH升至8.0，并将溶液更换频率增加至每30分钟一次。结合组织暴露于大量溶液、剧烈振荡以及高容器/组织体积比等条件，这些改进可最大化脱钙效率并缩短处理时间，实现温和而快速的脱矿。值得注意的是，当骨组织样本将用于转录组测序.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
高级轨道摇床	VWR	76683-470	根据方法说明，用于在孵育期间保持组织处于振荡状态。
骆驼毛刷	Ted Pella	11859	根据指南，用于操作FFPE切片。
双索引试剂盒 TS Set A 96次反应	10X Genomics	PN-1000251	用于进行空间转录组学实验。
200试验证乙醇	Decon Labs Inc	2701	根据方法说明，用于进行组织脱水。
乙二胺四乙酸二钠盐二水合物（EDTA）	Thermo Fisher Scientific	S312-500	用于配制20% EDTA溶液（pH 8.0）。
Fisherbrand 弯头中等尖头通用镊子	Fisher Scientific	16-100-110	根据指南，用于操作FFPE切片。
Fisherbrand 精细精密探针	Fisher Scientific	12-000-153	根据指南，用于操作FFPE切片。
Fisherbrand Superfrost Plus 显微镜载玻片	Fisher Scientific	12-550-15	根据指南，用于贴附卷曲的切片。
高轮廓金刚石切片刀	CL Sturkey	D554DD	根据指南，用于切取FFPE组织块。
Novaseq 150PE	Novogene	N/A	测序仪。
32% 电镜级甲醛（PFA）水溶液	Electron Microscopy Sciences	15714-S	用1×PBS 稀释至终浓度为4%，用于组织固定。
磷酸盐缓冲液（PBS）	Thermo Fisher Scientific	10010-049	即用型。根据方法说明，用于稀释PFA及进行洗涤步骤。
Premiere 组织漂浮浴	Fisher Scientific	A84600061	根据指南，用于去除FFPE切片上的皱褶。
RNase AWAY 表面去污剂	Thermo Fisher Scientific	7002	根据方法说明，用于清洁所有表面。
RNeasy DSP FFPE 试剂盒	Qiagen	73604	根据指南，在FFPE切片制备完成后，用于从中提取RNA。
半自动旋转式切片机	Leica Biosystems	RM2245	根据指南，用于切取FFPE组织块。
氢氧化钠	Millipore Sigma	S8045-500	将400 g缓慢溶解于1升Milli-Q水中，配制成10 N溶液。
Space Ranger	10X Genomics	2.0.1	用于处理测序数据输出。
Surgipath Paraplast 包埋剂	Leica Biosystems	39601006	根据方法说明，用于组织浸润和包埋。
Visium 附件试剂盒	10X Genomics	PN-1000194	用于进行空间转录组学实验。
Visium 人类转录组探针试剂盒 小号	10X Genomics	PN-1000363	用于进行空间转录组学实验。
Visium 空间基因表达载片试剂盒 4次反应	10X Genomics	PN-1000188	若进行空间转录组学实验，用于放置组织切片。
二甲苯	Leica Biosystems	3803665	根据方法说明，用于进行组织透明化处理。