实现骨组织空间转录组学的方法

Summary

在这里，我们描述了一种方法，该方法允许对新鲜获得的骨组织进行脱钙并保留高质量的RNA。还展示了一种方法，用于对非脱矿质骨骼的福尔马林固定石蜡包埋 （FFPE） 样品进行切片，以便在无法获得或无法收集新鲜组织的情况下获得高质量的结果。

Abstract

了解细胞之间的关系及其在每个组织中的位置对于揭示与正常发育和疾病病理学相关的生物学过程至关重要。空间转录组学是一种强大的方法，可以分析组织样本中的整个转录组，从而提供有关细胞基因表达和细胞所在的组织学背景的信息。虽然这种方法已被广泛用于许多软组织，但其在骨骼等硬组织分析中的应用一直具有挑战性。主要挑战在于在处理硬组织样品进行切片时无法保留高质量的 RNA 和组织形态。因此，本文描述了一种处理新鲜获得的骨组织样本以有效生成空间转录组学数据的方法。该方法允许对样品进行脱钙，从而成功获得组织切片，保留形态细节，同时避免 RNA 降解。此外，还为以前未进行脱矿质的石蜡包埋样品（例如从组织库收集的样品）提供了详细的指南。使用这些指南，显示了从原发肿瘤和骨肉瘤肺转移的组织库样本生成的高质量空间转录组学数据。

Introduction

骨骼是一种特殊的结缔组织，主要由 1 型胶原纤维和¹ 型无机盐组成。因此，骨骼非常坚固和坚硬，同时又具有轻便性和抗创伤性。骨骼的巨大强度源于其矿物质含量。事实上，矿物质含量百分比每增加一个百分点，刚度就会增加五倍²。因此，研究人员在通过组织学切片分析骨标本的生物学时面临重大问题。

未脱钙的骨组织学检查是可行的，有时是必需的，具体取决于检查的类型（例如，研究骨骼的微观结构）;然而，这是非常具有挑战性的，特别是如果标本很大。在这些情况下，用于组织学目的的组织处理需要对标准协议和技术进行多次修改³.一般来说，为了进行常见的组织学评估，骨组织在固定后立即脱钙，这一过程可能需要几天到几周的时间，具体取决于组织的大小和所使用的脱钙剂⁴.脱钙切片常用于骨髓的检查、肿瘤的诊断等。脱钙剂主要有三种类型:强酸（如硝酸、盐酸）、弱酸（如甲酸）和螯合剂（如乙二胺三链酸或EDTA）⁵。强酸可以非常迅速地使骨骼脱钙，但它们会损害组织;弱酸很常见，适用于诊断程序;螯合剂是迄今为止使用最多且适用于研究应用的，因为在这种情况下，脱矿质过程缓慢而温和，可以保留高质量的形态并保留基因和蛋白质信息，这是许多程序（例如， 原位 杂交、免疫染色）所要求的。然而，当需要保留整个转录组时，例如用于基因表达分析，即使是缓慢而温和的去矿质化也可能是有害的。因此，当组织的形态学分析需要与细胞的基因表达分析配对时，需要更好的方法和方法。

由于单细胞 RNA 测序 （scRNA-seq） 和空间转录组学的最新改进，现在甚至可以使用福尔马林固定石蜡包埋 （FFPE） 来储存组织样本 ^6,7,8。这个机会开启了对更多样本的访问，例如储存在全球组织库中的样本。如果要采用scRNA-seq，RNA完整性是最重要的要求;然而，在FFPE样品的空间转录组学中，高质量的组织切片和高质量的RNA对于在每个组织切片的组织学背景下可视化基因表达都是必需的。虽然这在软组织中很容易实现，但对于骨骼等硬组织来说却不能这样。事实上，据我们所知，从未对 FFPE 骨样本进行过使用空间转录组学的研究。这是因为缺乏能够有效处理FFPE骨组织同时保留其RNA含量的方案。本文首先提供了一种在避免RNA降解的同时对新鲜获得的骨组织样品进行处理和脱钙的方法。然后，认识到需要对全球组织库中收集的FFPE样本进行转录组学分析，并提出了制定的指南，以正确处理非脱矿质骨骼的FFPE样本。

Protocol

下面描述的所有动物程序均已根据匹兹堡大学牙科医学院的《实验动物护理和使用指南》获得批准。

1.一种需要脱矿质的骨组织样品FFPE块的制备方法

1. 试剂和材料的制备
   1. 制备EDTA 20%pH 8.0。对于1L，将200g EDTA溶解在800mL超纯水中，用氢氧化钠10N调节pH至8.0，最后用超纯水使体积达到1L。在室温下储存。
      注意:始终使用新鲜制备的 EDTA 20% pH 8.0。氢氧化钠 （NaOH） 10 N 是通过将 400 g NaOH 溶解在 1 L 超纯水中来制备的。
   2. 在通风橱中使用 1x PBS 制备 4% 多聚甲醛 （PFA） 不含钙和镁。
      注意:在通风橱中指定一个区域用于处理浓缩多聚甲醛溶液或多聚甲醛固体，并贴上标签。为避免暴露，请尽可能保持容器密闭。以正在进行的实验所需的最小实际量使用。如果称量多聚甲醛粉末和称重秤不能在通风橱中使用，请先拿一个容器，然后在通风橱和盖子中加入PFA粉，然后再返回秤称量粉末。始终使用新鲜制备的 4% PFA。
   3. 为每个标本使用合适的容器。
      注意:例如，对于 1 mg 骨组织，使用允许至少 1 mL 任何溶液与骨接触的容器。
   4. 对解剖所需的所有手术设备进行消毒。
   5. 用去污溶液清洁所有区域以去除 RNase。
   6. 收集剩余的实验材料，包括冰容器，70%乙醇喷雾剂，并可以使用轨道振荡器。
2. 从小鼠中分离骨组织样本
   1. 通过CO₂ 暴露对小鼠实施安乐死，然后进行颈椎脱位并将其放在背上。用70%乙醇喷洒小鼠皮肤。
   2. 使用无菌解剖剪刀，打开皮肤，露出腿部肌肉。切开腿部旁边的肌肉，以获得清晰的骨头位置视图，然后轻轻地分离骨头，以将其移除而不会损坏。
      注意:没有必要完全切除附着在骨头上的所有肌肉。尝试尽可能快地限制 RNA 降解。
   3. 立即将骨样本放入含有 4% PFA 的试管中，然后将试管放在冰上。
   4. 根据需要重复该过程以收集其他骨骼样本。
   5. 将含有4%PFA的样品在轨道振荡器上以140rpm，在4°C下搅拌至少24小时，以便正确固定。
3. 骨组织样品的脱钙
   1. 固定后从眼眶振荡器中取出骨组织。
   2. 在轨道振荡器上以140rpm的速度用1x PBS洗涤骨组织2次3分钟，以除去任何剩余的PFA。
   3. 使用无菌解剖剪刀，去除仍附着在骨头上的任何剩余肌肉。
   4. 用1x PBS再次洗涤骨组织3分钟。
   5. 将骨组织放入含有 20% EDTA pH 8.0 的新容器中。然后，将容器在室温（RT）下以140rpm的速度放在轨道振荡器上30分钟。
   6. 弃去溶液，在容器中加入新鲜的20%EDTA pH 8.0，并将其置于轨道振荡器上，在室温下以140rpm放置30分钟。
   7. 重复步骤 1.3.6 10 次。
   8. 弃去溶液，在容器中加入新鲜的20%EDTA pH 8.0，并将其置于4°C的冷藏室中，在轨道振荡器上以140rpm过夜。
4. 骨组织样本脱水
   1. 从容器中取出骨组织样本。
   2. 检查组织并通过轻轻转动和扭曲骨头来验证脱钙的效率。或者，使用 X 光机对骨骼进行 X 光检查。
      注意:如果试样容易弯曲，则已达到良好的脱钙等级。如果没有，应增加脱钙参数（时间、搅拌速度、20%EDTA pH 8.0的体积等）。
   3. 用 1x PBS 洗涤骨组织 2 次 3 分钟以去除 EDTA 残留物。
   4. 将骨组织放入新容器中，并用70%乙醇开始脱水。以 140 rpm 孵育 15 分钟。
   5. 弃去70%乙醇溶液，将样品放入90%乙醇溶液中，以140rpm孵育15分钟。
   6. 弃去90%乙醇溶液，将样品放入100%乙醇中，并以140rpm孵育15分钟。
   7. 丢弃100%乙醇，将样品放入新的100%乙醇中，并以140rpm孵育15分钟。
   8. 丢弃100%乙醇，将样品放入新的100%乙醇中，并以140rpm孵育15分钟。
   9. 丢弃100%乙醇，将样品放入新的100%乙醇中，并以140rpm孵育30分钟。
   10. 弃去100%乙醇，将样品放入新的100%乙醇中，并以140rpm孵育45分钟。
       注意:也可以使用自动处理器进行脱水。在这种情况下，请使用为手动脱水报告的相同条件设置程序。报告的条件适用于厚度不超过 4 毫米的标本（即从小鼠获得的骨组织样本）。对于厚度大于 4 mm 的试样，必须通过实验确定脱水时间。
5. 清除骨组织样本
   1. 将骨组织样本放入新容器中，并使用二甲苯开始透明化过程。以 140 rpm 孵育 20 分钟。
   2. 丢弃用过的二甲苯，加入新的二甲苯，并以 140 rpm 的速度再孵育 20 分钟。
   3. 丢弃用过的二甲苯，加入新的二甲苯，并以140rpm孵育45分钟。
      注意:也可以使用自动处理器执行清算。在这种情况下，请使用为手动清除报告的相同条件设置程序。报告的条件适用于厚度不超过 4 毫米的标本（即从小鼠获得的骨组织样本）。对于厚度大于 4 mm 的试样，必须通过实验确定时间。
6. 骨组织样本的浸润和包埋
   1. 清除后从轨道振荡器/自动处理器中取出骨组织样本。
   2. 将骨组织样品放入包埋盒中，并开始用蜡浸润（参见 材料表）。在60°C下孵育30分钟。
   3. 丢弃用过的蜡，加入新蜡，并在60°C下孵育30分钟。
   4. 丢弃用过的蜡，加入新蜡，并在60°C下孵育45分钟。
   5. 小心地将骨组织样本放入具有所需方向的模具中。
   6. 让试样块在冷表面上凝固。
   7. 将获得的FFPE储存在4°C，直到准备开始切片。
      注意:在进行切片之前，FFPE块可以存放多年。

2. 未脱矿质FFPE样品切片指南

注意:以下指南提供了宝贵的提示和说明，有助于大大提高组织切片的质量，同时避免 RNA 降解，尤其是在未脱钙的小骨标本的情况下。如果可用，这些指南也适用于脱钙骨标本。对于较大的骨组织样本，应进行脱矿质以获得更高质量的切片;在这种情况下，应遵循上述方法，并应相应调整参数（时间、溶液体积等）。当FFPE骨组织已经处理过（例如，从组织库或其他实验室收集的FFPE块）时，或者当收集的切片将用于执行需要高质量RNA、高质量组织切片或两者兼而有之的任何类型的分析时，以下指南都适用。

1. 设备准备
   1. 用去污溶液喷洒所有工作表面和仪器，以去除 RNase。
   2. 用双蒸水准备一个水浴，并将温度设置为42°C。
   3. 取切片机刀片，喷洒 70% 乙醇以去除油残留物，然后喷洒去污溶液以去除 RNase。
   4. 将刀片固定在切片机上。确保间隙角设置为 10°。
      注意: 始终使用新刀片进行切片。
   5. 准备两桶冰块。
   6. 拿来镊子、刷子和探针，用去污溶液喷洒它们以去除 RNase，然后将它们放入两个冰桶中的一个中。
   7. 通过向另一个冰桶中加入双蒸水来准备冰浴。
      注意: FFPE 块不应漂浮在添加的水中;因此，向冰桶中添加的水量必须刚好足以使样品湿润而不漂浮。
2. 切片
   1. 从4°C的储存中取出FFPE块，并将其放在切片机上。将命令设置为 修剪 或 14 μm 的涡旋厚度，然后开始修剪样品，直到组织暴露出来。
      注意:如果 FFPE 块已经被修剪并且组织已经暴露，请跳过步骤 2.2.1。确认块没有孔和裂纹。如果是这样，请直接执行步骤 2.2.2。如果没有，请切几段以平坦表面并避免孔洞和裂纹，然后继续执行步骤 2.2.2。
   2. 将FFPE块放在冰浴上以水合样品。水合作用的时间必须通过实验确定。
      1. 从 2 分钟开始，如果水合作用不足，则增加时间。不要超过 10 分钟。水合作用会扩大组织并减少"威尼斯百叶窗"和线条的形成。较长的水化时间可能会导致石蜡块出现裂纹，并可能导致组织脱落。
      2. 如果 10 分钟不足以水合样品，则执行不超过 10 分钟的水合循环并再次尝试切片。
      3. 如果块的表面由于裂纹或割伤而不光滑和清洁，请考虑重新嵌入样品。RNA质量不会受到重新包埋过程的影响。
   3. 将样品放入切片机的标本夹中，将其与刀片对齐，然后开始切片。将涡旋厚度设置为 5 μm。
   4. 收集切片并使用冷镊子和刷子将其置于42°C的水浴中。
      注:或者，如果要进行组织切片的 RNA 分离，请将切片收集在离心管中，并遵循 RNA 制备的生产规格（参见 材料表）。
   5. 将切片在水浴中孵育，以拉伸组织并消除任何残留的皱纹和褶皱。
      注意:每个部分在水浴中漂浮的时间必须通过实验确定。如果出现组织脱离问题，请考虑将骨骼部分多留一分钟。不要让该部分漂浮太久，因为长时间漂浮可能会损坏组织。
   6. 将切片放在载玻片上，然后在42°C下孵育3小时。
   7. 将载玻片放入干燥器或烤箱中，在室温下过夜以适当干燥。
   8. 在室温下将带有连接部分的载玻片存放在载玻片盒中。
      注意:载玻片在室温下可以存放多年。如果要进行空间转录组学，而不是载玻片，请将该部分放在制造商提供的空间基因表达载玻片上，并按照报告的建议进行操作（参见 材料表）。

Results

本文介绍的方法描述了如何处理新鲜分离的骨头以获得脱矿质的FFPE样品，这些样品可以很容易地用切片机切片，同时保持RNA的完整性（图1）。该方法已成功用于小鼠股骨，但可以用于其他类似尺寸的骨组织样本，或者可以通过增加所有参数（时间、溶液体积等）来适应更大的骨样本（例如，人类样本）。

图 1:协议的示意图。 获得具有保留 RNA 完整性的脱钙骨组织 FFPE 块的方法示意图（点 1 和 2）。截面 FFPE 块的指南示意图（第 3 点）。 请点击这里查看此图的较大版本.

为了验证脱钙的正确时间，进行了一个时间过程，其中比较了未脱钙的股骨、脱钙 3 小时的股骨（EDTA 每 30 分钟更换一次，共 6 次）和脱钙 24 小时的股骨（其中 EDTA 每 30 分钟更换一次，总共 10 次，然后在 EDTA 中放置过夜）（图 2).然后根据上述指南对得到的FFPE块进行切片，并验证所得切片的组织学质量和RNA完整性。为此，通过苏木精和伊红（H&E）染色评估组织切片的结构完整性和形态，然后进行显微镜检查（图2A，C，E），同时通过评估大小大于200个核苷酸（200 nt）（称为DV200评分）⁴的RNA片段分布值来评估RNA质量（图2B，D，F）。H&E图像显示，未脱钙和3小时脱钙的股骨切片出现多个骨折，孔洞和损伤（图2A，C），而脱钙24小时的股骨切片显示出良好的组织学质量（图2E）。所有样本的 DV200 得分均高于 50%，这被认为是进行 scRNA-seq 或空间转录组学分析的最小值⁴。还测试了更长的孵育时间，在4°C下EDTA的每日变化，在较小的容器中进行较轻的搅拌，因此不推荐使用，因为使用这些条件，样品的RNA完整性会急剧下降（图2H）。因此，孵育时间减少到 24 小时，同时增加脱钙的频率、搅拌和体积以促进脱钙。

图2.8周龄小鼠股骨脱钙后的切片和RNA完整性质量控制（QC）。&E染色对获得的切片进行组织学QC&E&E&E&E&E

&E染色

&E

Discussion

本文提供了一种详细的方法来制备脱钙骨的FFPE块，并保持RNA的完整性，用于测序（即下一代测序（NGS））或其他RNA相关技术（即 原位 杂交、定量逆转录聚合酶链反应（qRT-PCR）等）。

该方法利用EDTA对骨组织样品进行脱钙;EDTA孵育允许样品进行缓慢而精细的脱矿质，从而保持组织的最佳组织学特征。通常，使用 10% EDTA pH 7.0 进行骨脱钙至少 2 周，每隔一天刷新一次溶液⁴.然而，长时间的脱钙会显着促进 RNA 降解 ^6,7,8。为了克服这个问题，EDTA浓度提高到20%，pH值提高到8.0，溶液更换频率提高到每30分钟一次。这些条件，再加上组织暴露的大量溶液、剧烈的搅拌和高容器/组织体积比，最大限度地提高了脱钙效果并缩短了治疗时间，从而实现了温和而快速的脱矿。值得注意的是，值得一提的是，当骨组织样本用于转录组测序时，可能没有必要完全脱钙。在这种情况下，需要找到足够的脱矿质和良好的RNA保存之间的最佳比例。另一个值得一提的重要事情是，无论样本如何处理，如果它们已被固定，它们的RNA都会被片段化。本文报道的方法允许保留大小大于 200 个核苷酸 （%DV200） 的 RNA 片段（图 2F），这表明 RNA 质量高 ^9,11。

这种方法存在一定的局限性。首先，由于小鼠是骨组织样本的唯一来源，因此该方法仅在相对较小的小鼠骨骼上进行了验证。此外，由于该方法仅在8周龄的小鼠上进行了测试，因此尚不清楚该方法是否可用于年龄大于8周的小鼠或小于8周的小鼠。我们选择了 8 周大的小鼠，因为它们的骨骼成熟。由于衰老会改变骨骼的矿物质含量，因此可能必须对这种方法进行更改。

此外，据报道，当使用未脱钙的小骨标本的FFPE样本时，指南有助于提高组织切片的质量，例如，当它们直接从组织库收集时。在这些情况下，如果RNA被降解，则无能为力，但切片质量可以提高。另一方面，对于具有良好 RNA 含量的样品，例如此处显示的样品，如果遵循提供的指南，则可以进行空间转录组学分析。值得注意的是，在原发性骨肉瘤标本中，肿瘤肿块的存在可能会改变骨骼结构，使实际样本更弱、更脆，这可能有利于切片。因此，Goldner 的三色染色用于评估是否是这种情况，因为可以使用这种染色技术识别矿化和非矿化区域（图 3C）。

总之，所报道的方法代表了一种易于适用的方法，可用于对骨组织样品进行脱钙并获得FFPE切片，该切片可有效用于NGS或其他需要RNA完整性的技术。此外，还提供了对在石蜡包埋之前可能尚未进行脱矿的样品进行切片的指南，例如从组织库获得的样品。鉴于空间转录组学分析的快速发展，所提出的方法和指南可能对一般的骨骼研究以及骨癌研究非常有帮助。

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
高级轨道摇床	VWR	76683-470	用于在孵育过程中保持组织处于搅拌状态，如方法说明中所述。
骆驼毛刷	Ted Pella	11859	用于处理指南中报告的 FFPE 部分。
双索引试剂盒 TS Set A 96 rxns	10X Genomics	PN-1000251	用于进行空间转录组学。
乙醇 200 Proof	Decon Labs Inc	2701	用于进行方法说明中报告的组织脱水。
乙二胺四乙酸，二钠盐二水合物 （EDTA）	Thermo Fisher Scientific	S312-500	用于制备 EDTA 20% pH 8.0。
Fisherbrand 弯曲中尖通用镊子	Fisher Scientific	16-100-110	用于处理指南中报告的 FFPE 切片。
Fisherbrand Fine Precision Probe	Fisher Scientific	12-000-153	用于处理指南中报告的 FFPE 切片。
费雪品牌 Superfrost Plus 显微镜载玻片	Fisher Scientific	12-550-15	用于连接指南中报告的分段卷轴。
高型金刚石切片机刀片	CL Sturkey	D554DD	用于指南中报告的 FFPE 块切片。
Novaseq 150PE	Novogene	N/A	测序仪。
多聚甲醛 （PFA） 32% 水溶液 EM 级	电子显微镜科学	15714-S	用 1x PBS 稀释至终浓度为 4%以进行组织固定。
磷酸盐缓冲盐水 （PBS）	Thermo Fisher Scientific	10010-049	即用型。用于稀释 PFA 并按照方法说明中的说明进行洗涤。
Premiere Tissue 漂浮浴	Fisher Scientific	A84600061	用于去除指南中报告的 FFPE 切片上的皱纹。
RNase AWAY 表面去污	Thermo Fisher Scientific	7002	用于清洁方法说明中报告的所有表面。
RNeasy DSP FFPE 试剂盒	Qiagen	73604	用于从 FFPE 切片中分离 RNA，如指南中所述。
半自动轮转切片机	Leica Biosystems	RM2245	用于指南中报告的 FFPE 块切片。
氢氧化钠	Millipore Sigma	S8045-500	将 400 g 缓慢溶解在 1 升 Milli-Q 水中，制备 10 N 溶液。
Space Ranger	10X Genomics	2.0.1	用于处理测序数据输出。
Surgipath Paraplast	Leica Biosystems	39601006	用于执行方法说明中报告的组织膨胀和包埋。
Visium 附件套件	10X Genomics	PN-1000194	用于进行空间转录组学实验。
Visium 人类转录组探针试剂盒小号	10X Genomics	PN-1000363	用于进行空间转录组学实验。
Visium 空间基因表达载玻片套装 4 rxns	10X Genomics	PN-1000188	用于进行空间转录组学实验时的切片。
二甲苯	Leica Biosystems	3803665	用于执行方法说明中报告的组织透明化。