方法文章

抗分枝杆菌高通量药物筛选的检测方法开发

DOI：

10.3791/66860

⸱

2024年10月25日

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1i3S – Instituto de Investigação e Inovação em Saúde da Universidade do Porto, 2ICBAS – Instituto de Ciências Biomédicas Abel Salazar, Universidade do Porto, 3IBMC - Instituto de Biologia Molecular e Celular, Universidade do Porto, 4Programa Doutoral em Biologia Molecular e Celular (MCBiology), Instituto de Ciências Biomédicas Abel Salazar da Universidade do Porto, 5Laboratory for Microbiology, Parasitology and Hygiene (LMPH), 6Department of Infectious Diseases in Humans, Immune Response, Sciensano

本文内容

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

本研究建立了一种用于高通量筛选的检测方法 脓肿分枝杆菌 与一个 新近构建的双报告基因菌株，利用荧光和生物发光快速评估细菌活性。该实验方案适用于致力于筛选抗此类耐药细菌新药物的研究人员。

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

脓肿分枝杆菌 (Mab) 感染由于具有高度的内在耐药性，治疗难度较大，其耐药程度可与耐多药结核病相媲美。目前的治疗方案疗效极差，依赖多种药物联合使用，导致患者依从性低下。因此，科学界迫切需要发现新的有效药物以应对此类感染。其中一种策略是药物再利用——即发掘市场上已有药物的新治疗用途，从而规避新药所需耗时的药代动力学和安全性评估过程。由于大多数针对 Mab 的药物研发研究依赖传统且耗时的方法，研究人员已开发出一种针对分枝杆菌的高通量药物筛选检测方法 内部 开发了Mab的双报告基因菌株。结合液体处理机器人、自动化显微镜及分析技术， 内部 开发了双报告菌株后，可通过两种不同的检测方式——发光和荧光——快速测量细菌活力，且无需添加试剂或进行额外操作步骤。这减少了检测所需时间以及不同实验间的变异，对于高通量筛选具有显著优势。所述实验方案通过筛选一个包含1280种化合物的文库得以验证，所得结果与文献报道一致，能够有效检出活性化合物。因此，本研究实现了为领域提供一种新工具以应对这种高度耐药细菌的初衷。

引言

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mycobacterium abscessus（Mab）是一种机会性病原体，可导致肺部感染，尤其在囊性纤维化及其他肺部疾病患者中更为常见。由于Mab具有极强的内在耐药性，其感染治疗极为困难，耐药程度堪比耐多药结核病1。现有药物大多疗效不佳，原因在于分枝杆菌细胞包膜通透性极低，且其基因组编码多种可灭活抗生素的酶2。因此，治疗通常需要联合使用多种药物，疗程长达数月甚至数年。这种复杂的多药治疗方案加上患者依从性差，导致平均治愈率仅为30%至50%3。此外，在过去几十年中，由非结核分枝杆菌引起的肺部感染发病率持续上升，其中包括Mab所致感染1,4。因此，科学界正致力于加快研发治疗Mab感染的新化合物。

实现这一目标的策略之一是药物再利用——即为现有药物寻找新的治疗用途。这种方法规避了新药研发过程中最大的挑战——时间5。这一简单概念利用了多种药物已建立的药代动力学和安全性特征，从而降低研发成本，并缩短药物从实验室到临床应用所需的时间6。因此，研究人员已整合出包含数百至数千种此类化合物的化合物库，使科研人员能够快速测试将这些药物用于特定病原体治疗的可能性。

针对Mab药物开发的大多数研究都基于一种传统但被视为金标准的检测方法，该方法用于评估化合物的 体外 抗分枝杆菌活性——菌落形成单位计数7尽管该方法具有较高的准确性，但其耗时极长，当需要测试包含数千种化合物的化合物库时，迅速变得不可行。为此，高通量筛选（HTS）已被整合到药物研发中——这是一类稳健的检测方法，利用机器人技术和液体处理设备，可实现数千种化合物的并行快速筛选8通常通过初始测试单一浓度来完成，使用96、384、1536或3456孔微孔板作为筛选起点，以识别活性化合物，并在后续流程中进一步优化，最终用于临床。

基于报告基因的检测方法由于其相较于其他染料和吸光度检测方法具有更高的简便性和灵敏度，因此在高通量筛选（HTS）的稳健性方面具有显著优势7,9。然而，据我们所知，目前仅有少数研究对针对Mab的高通量筛选进行了优化9。

近期，我们的实验室开发了能够同时发出生物发光和荧光的双报告菌株10。Mab operon_mScarlet 就是其中一种菌株。该菌株由于表达了 LuxABCDE 操纵子而具有自发光特性，该操纵子包含细菌荧光素酶（由 luxAB 基因表达）和长链醛底物（由 luxCDE 基因表达）。另一方面，荧光信号则通过表达一种新近开发的红色荧光蛋白 mScarlet 获得，其性能优于常用的 eGFP 和 mCherry 蛋白，可提供更强的信号11。使用该菌株可使我们通过微孔板检测仪测量发光信号来评估液体培养物中的细菌活力，无需添加试剂或进行额外操作步骤。在检测方面，其内在荧光特性使得在活细胞或固定细胞中无需使用染料或抗体即可通过显微镜进行观察。同一种菌株具备两种读出方式，为高通量筛选（HTS）实验的应用提供了显著优势——由于无需根据实验类型更换菌株，不同读出方式实验之间的变异性显著降低。

因此，本研究建立了一种针对Mab的高通量检测方法 自主研发 基因工程双报告菌株（图1）。这使得能够快速评估 体外 使用商业文库对1280种拟用于重新定位的药物进行活性检测（参见 材料表首先，通过使用发光检测的肉汤培养实验评估活性；其次，利用荧光信号检测分枝杆菌感染的巨噬细胞，更真实地模拟所见的感染过程 体内12.

M. abscessus drug screening pipeline diagram; luminescent, fluorescent readout; bacteria assay process.
图1：已建立方案的图形摘要。 该筛选中的关键角色是一种 自主研发 开发了双报告基因分枝杆菌菌株，并在所有实验中使用。首先，利用试剂分配器和浮游细菌，通过在单一浓度下测试化合物进行初步筛选。初步筛选得到的阳性结果进入验证实验，其中测试三种不同浓度。这两个实验均采用发光信号读出结果。验证后的阳性结果进入感染实验，同样测试三种不同浓度，并以感染复数（MOI）1感染骨髓来源的巨噬细胞。采用高内涵成像系统获取细菌的荧光信号，通过Mycoload公式利用分析软件评估细胞内菌荷。随着实验复杂性的增加，化合物数量逐步减少。图示使用BioRender.com制作。 请点击此处以查看此图的放大版本。

方案

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

所有动物实验均经i3S当地动物伦理委员会批准，并由葡萄牙食品与兽医总署（DGAV）许可，遵循欧洲理事会指令（2010/63/EU）及葡萄牙有关实验动物福利的法律（DL 113/2013）。

1. Z' 因子评估

注意：为评估高通量筛选（HTS）实验的性能，可测定多个参数。其中最常用的参数是Z'因子（Z prime factor）。该指标用于衡量给定实验的统计效应大小，反映阳性对照与阴性对照之间的分离程度。若Z'因子介于0.5至1之间，则表明两组群体的分离效果极佳，适合用于HTS实验。若Z' < 0.5，则分离效果仅为边缘水平，不建议进行筛选13。因此，设计了一个实验，使用半块板接种未经处理的细菌，另半块板接种阳性对照，以计算Z'因子（补充图1）。

  1. 在检测前 2-3 天，将 Mab 接种于液体培养基中（约 1 × 107 CFU/mL），置于锥形瓶中制备预培养物。将细菌置于 37 °C 摇床培养箱中培养（90 rpm）。
    注意：操作 Mab 培养物时必须使用生物安全柜。
  2. 使用分光光度计在 600 nm 处测定 Mab 预培养物的光密度，监测其生长情况。当培养物进入对数生长期时，进行步骤 1.3。
  3. 利用处于对数生长期的预培养物，在液体培养基中制备浓度约为 5 × 105 CFU/mL 的细菌悬液（与光密度值相关）14。
  4. 在液体培养基中配制细菌生长抑制的阳性对照溶液。本实验中，阳性对照为克拉霉素（DMSO 中 10 mg/mL），终浓度为 4 µg/mL。克拉霉素需配制成目标终浓度的 2 倍储备液。
  5. 使用配备小卡匣的微量板加样器，向黑色聚丙烯 384 孔板的空白孔和未处理孔中各加入 15 µL 液体培养基。对于空白列，额外再加入 15 µL 液体培养基。
    注：空白列可防止 37 °C 培养时内侧孔中的液体蒸发。
  6. 使用配备小卡匣的微量板加样器，将步骤 1.4 中配制的阳性对照溶液 15 µL 加入阳性对照孔中。
  7. 使用配备大卡匣的微量板加样器，将步骤 1.3 中制备的细菌悬液 15 µL 加入除空白孔外的所有孔中，使所有成分稀释至 1:2。最终每孔体积为 30 µL。
    注：微量板加样器可配备大或小卡匣，其区别在于管道尺寸（分别为 0.5 mm 和 0.22 mm）。建议使用较大的卡匣以防止细菌在管道系统中聚集，尽管会导致更多液体浪费。然而，整个检测过程中也可使用同一卡匣。
  8. 用允许持续气体交换的板封膜密封每块板，置于湿润环境中，在 37 °C 静置培养箱中孵育 48 小时。
  9. 48 小时后，使用积分时间为 1 秒的酶标仪读取每块板中细菌发出的发光信号。
  10. 为确定 Z' 因子，使用步骤 1.9 中获得的数值，计算阳性对照（AVGP 和 SDP）与阴性对照（AVGN 和 SDN）的平均值和标准差。随后应用以下公式：Z' 因子公式，用于检测质量控制的统计度量，公式图像。
    注：3 × SD 是常用的阈值；但可根据筛选需求进行调整，通过增加或减少乘以标准差的倍数来优化。

2. 筛选文库以获得阳性结果

注意：首次筛选针对在液体培养基中生长的细菌进行。实验设计采用384孔板，每孔终体积为30 µL。每块板包含空白孔（仅含液体培养基）、阴性对照（未处理细菌）和溶剂对照（细菌加化合物溶剂——本实验中为DMSO；补充图2）。将化合物或溶剂以目标终浓度的2倍浓度加入孔板中，随后等体积加入细菌，使所有成分稀释至一半。

  1. 按照步骤 1.1 至 1.3 所述方法制备细菌悬液。
    注意：操作 Mab 培养物时必须使用生物安全柜。
  2. 在液体培养基中配制溶剂溶液，溶剂的浓度应为所需最终浓度的 2 倍。
  3. 使用配备小型卡盒的微孔板加样器，向黑色聚丙烯 384 孔板的每一列加入 15 µL 液体培养基，溶剂对照孔列除外。对于空白孔列，额外再加入 15 µL 液体培养基。
  4. 使用配备小型卡盒的微孔板加样器，向溶剂对照孔列加入 15 µL 前述已配制的溶剂溶液。
  5. 使用液体处理设备，将化合物从储存用的 96 孔板（DMSO 中浓度为 1 mM）转移 200 nL 至 384 孔板中，空白孔、溶剂对照孔和未处理孔除外。此时化合物浓度为 13.3 µM。
  6. 使用配备大型卡盒的微孔板加样器，向除空白孔外的所有孔中加入 15 µL 步骤 2.1 中制备的细菌悬液，使所有成分稀释至 1:2。每个 384 孔板的最终体积为 30 µL，每种化合物浓度为 6.66 µM。
  7. 使用允许持续气体交换的板封膜对每块板进行密封。
    注意：该实验也可使用普通盖子进行，但边缘效应可能更显著。
  8. 将板置于加湿容器中，在 37 °C 培养箱内静置培养 48 小时。
  9. 48 小时后，使用积分时间为 1 秒的酶标仪检测每块板中细菌发出的发光信号。

3. 筛选命中结果的数据分析

注意：为了利用获得的发光数据确定阳性结果，必须将数值相对于化合物所溶解的溶剂进行归一化处理，并且如果存在，还需对在384微孔板上观察到的边缘效应进行校正。

  1. 对步骤 2.9 中获得的数据进行溶剂归一化处理，将每个孔的相对光单位（RLU）除以相应检测板中溶剂对照孔的平均 RLU。在本实验中，已证实筛选板的中间区域存在显著的边缘效应；因此，决定对所有数据进行该效应的校正。为此，采用以下所述的两步法进行处理。
    1. 通过将所有检测板（板 1 - P1，板 2 - P2，板 3 - P3，板 4 - P4）中对应位置在步骤 3.1 所得数值（排除阳性结果）进行平均，生成一个边缘效应校正掩码。例如，对于 A1 和 A2 位置，Mask_A1 = 平均值 (P1_A1; P2_A1; P3_A1; P4_A1)；Mask_A2 = 平均值 (P1_A2; P2_A2; P4_A2) [P3_A2 被排除，因其为阳性结果]。
    2. 将步骤 3.1 所得数值除以步骤 3.1.1 中获得的边缘效应掩码值。例如，归一化比率计算公式示意图；展示数据分析公式 P1_A1/Mask_A1。。随后，计算每块板的平均值（AVG）和标准差（SD），以确定每块板的阈值（AVG ± 3SD）。超出该阈值的任何化合物均被视为阳性结果，并进入后续的阳性验证实验。

4. 阳性结果验证实验

注意：在确定阳性结果后，需使用不同浓度进行验证。验证实验采用与之前相同的设置和对照，但每个阳性结果将进行1:2的系列稀释。本实验中使用了三个浓度——13.3 µM、6.66 µM 和 3.3 µM。溶剂对照组所含溶剂百分比与各化合物孔中的溶剂百分比相同（补充图3）。

  1. 按照步骤 1.1 至 1.3 所述方法制备细菌悬液。
    注意：操作 Mab 菌株时必须使用生物安全柜。
  2. 使用配备小型卡盒的微孔板试剂分配器，向黑色聚丙烯 384 孔板的每一列加入 15 µL 液体培养基。对于空白孔，在第一列和最后一列额外加入 15 µL 液体培养基。
  3. 使用微孔板试剂分配器，向含有每种化合物最高浓度 [µM] 的列中额外加入 15 µL 液体培养基。
  4. 从储存用的 96 孔板中，手动使用移液器将每种阳性化合物（DMSO 中 1 mM）各 0.8 µL 重复两份加入步骤 4.3 对应的孔中。此时化合物浓度为 26.6 µM。
  5. 手动使用移液器将 0.8 µL 溶剂重复两份加入对照孔中（与步骤 4.4 相同）。
  6. 使用多通道微量移液器，对每种化合物及溶剂对照进行两次 1:2 系列稀释。最后一次稀释后弃去多余的 15 µL。所有孔中液体体积现为 15 µL，化合物浓度分别为 26.6 µM、13.3 µM 和 6.66 µM。
  7. 使用配备大型卡盒的微孔板试剂分配器，向所有列（除空白孔外）加入 4.1 步骤制备的细菌悬液 15 µL，使化合物进一步稀释 1:2。所有孔的终体积为 30 µL，每种化合物浓度分别为 13.3 µM、6.66 µM 和 3.3 µM。
  8. 使用允许持续气体交换的微孔板密封膜密封微孔板。将微孔板置于湿润培养盒中，在 37 °C 恒温培养箱中静置培养 48 小时。
  9. 48 小时后，使用微孔板检测仪读取每块板中细菌发出的发光信号，积分时间为 1 秒。

5. 感染实验

注意：Mab 是一种胞内兼性致病菌，因此必须通过感染实验来确定候选化合物的抗菌活性和对宿主的毒性。为此，使用 Mab 感染骨髓来源的巨噬细胞（BMM），并用在步骤 4 中验证过的候选化合物以不同浓度进行处理。每次实验均包括空白对照（仅含水）、阴性对照（未处理的感染巨噬细胞）、阳性对照（经有效抗生素处理的感染巨噬细胞）、溶剂对照（本实验中为 DMSO），以及待测化合物的三个浓度（13.3 µM、6.66 µM 和 3.3 µM）（补充图 4）。

  1. 按照先前所述方法，从野生型成年小鼠（BALB/c 或 C57BL/6）的骨髓中分离巨噬细胞15。将细胞以每毫升 2 × 105 个细胞、每孔 200 µL 的密度接种于 96 孔黑色光学平底板中。在 37 °C、7% CO2 条件下培养 10 天完成分化后15，细胞即可用于感染并进行后续处理。
    注意：骨髓来源巨噬细胞的制备方案已较为成熟15；但本筛选方案也可适用于其他细胞类型，例如 RAW 264.7、THP-1 和外周血单个核细胞（PBMC）来源的巨噬细胞。
  2. 按照步骤 1.1 至 1.3 所述方法制备细菌悬液，并用细胞培养基调整细菌浓度，使感染时的感染复数（MOI）为 1。
    注意：操作 Mab 培养物时必须在生物安全柜中进行。
  3. 使用连接玻璃移液管的真空泵，小心吸除各孔中的含补充剂细胞培养基。此步骤需缓慢轻柔操作，以防细胞脱落。
  4. 手动向每孔加入 75 µL 步骤 5.2 中制备的细菌悬液。将培养板置于细胞培养箱中，在 37 °C、7% CO2 条件下孵育 4 小时。
  5. 准备用于细胞处理的化合物。使用配备小型储液槽的微孔板加样器，向聚丙烯圆底 96 孔板中各列（将加入化合物或溶剂对照的列）加入 110 µL 含补充剂的细胞培养基（补充图 4）。
  6. 使用微孔板加样器，向化合物或溶剂最高浓度所在的各列额外加入 104 µL 含补充剂的细胞培养基。
  7. 手动向指定孔（即步骤 5.6 中的各列）加入 5.9 µL 化合物（1 mM 溶于 DMSO）或溶剂。此时化合物浓度为 26.6 µM。
  8. 使用多通道微量移液器，对每种化合物和溶剂进行两轮 1:2 的连续稀释。最后一次稀释后，弃去多余的 110 µL 液体。此时所有孔体积均为 110 µL，化合物浓度分别为 26.6 µM、13.3 µM 和 6.66 µM。
  9. 使用微孔板加样器，向所有列（空白孔除外）加入 110 µL 含补充剂的细胞培养基。此时所有孔体积均为 220 µL，化合物浓度分别为 13.3 µM、6.66 µM 和 3.3 µM。
  10. 在含补充剂的细胞培养基中配制克拉霉素溶液（阳性对照），浓度为 2 µg/mL。
  11. 在步骤 5.4 完成 4 小时后，使用微孔板洗板机，用感染洗涤液以每孔 200 µL 洗涤感染后的 96 孔板 3 次。洗涤过程中吸液和加液速度应尽可能缓慢，以避免细胞脱落。
  12. 最后一次吸液后，将步骤 5.5–5.9 中制备的化合物溶液各 200 µL 转移至含有感染巨噬细胞的 96 孔板中。
  13. 向未处理孔中加入 200 µL 含补充剂的细胞培养基。向相应孔中加入 200 µL 步骤 5.10 中制备的克拉霉素溶液。
  14. 将培养板置于细胞培养箱中，在 37 °C、7% CO2 条件下孵育 48 小时。
  15. 孵育 48 小时后，使用微孔板洗板机，以化合物洗涤液（每孔 200 µL，洗 3 次）洗涤感染的 96 孔板。
  16. 使用多通道微量移液器，向所有孔中加入 200 µL 固定液，作用 10 分钟。
  17. 固定完成后，使用微孔板洗板机，以化合物洗涤液洗涤细胞（每孔 200 µL，洗 3 次）。
    注意：本步骤可暂停。若能防止污染和细胞干燥，细胞可在化合物洗涤液中于 4 °C 保存数天至数周。但在进行步骤 5.18 前必须吸除洗涤液。
  18. 使用多通道微量移液器，向所有孔中加入 200 µL 通透液，作用 15 分钟。随后使用微孔板洗板机吸除通透液。
  19. 使用多通道微量移液器，手动向每孔加入 100 µL 染色液，并在室温下孵育 30 分钟。
  20. 使用微孔板洗板机，以化合物洗涤液洗涤培养板（每孔 200 µL，洗 3 次）。最后将染色后的细胞保留在化合物洗涤液中。
  21. 使用高内涵成像系统对培养板进行扫描，设置如下：
    物镜：20x 空气/0.4NA（每张 96 孔板取 1 孔，共 57 个视野）
    模式：共聚焦
    405 nm 激光用于 DAPI（细胞核）
    561 nm 激光用于 mScarlet（细菌）
    640 nm 激光用于 HCS Cell Mask Deep Red（细胞质）
    不进行 z 轴层扫
    注意：也可使用宽场成像系统进行成像，但分辨率会有所降低。
  22. 设置自动化设备操作机器人以实现夜间图像采集。该机械臂可在无人干预的情况下在高内涵成像系统中更换培养板。
    注意：此步骤非必需；也可手动更换培养板。

6. 图像分析

注意：图像分析使用与获取图像所用的高内涵成像系统相同的分析软件进行。必须使用样本图像创建分析流程（补充图5）。随后，该流程将应用于整个孔（57个视野）和整个数据集（所有板）。分析软件遵循一系列逻辑步骤，首先对不同兴趣区域（细胞核、细胞质、细胞和细菌）进行分割，然后建立它们之间的关系（例如细胞内的细菌），最后提取形态学和强度特征参数（例如面积、强度）。图像分析的关键步骤如下所述。完整分析流程详见补充图5。

  1. 使用 DAPI 信号分割细胞核，使用 DeepRed 信号分割细胞质，使用 mScarlet 信号分割细菌。
  2. 关联细胞核与细胞质的分割结果，生成细胞的掩膜。
  3. 移除所有位于视野边界的对象。仅保留完整出现在视野中的细胞（完整细胞）。
  4. 通过关联完整细胞与细菌，定义完整细胞内的细菌输出群体。
  5. 将含有一个以上细菌区域的完整细胞定义为感染细胞，将含有少于一个细菌区域的完整细胞定义为非感染细胞。
  6. 在完成所有感兴趣区域的分割并建立各群体后，计算并提取其各项属性。针对每个孔提取以下属性：
    1. 针对完整细胞 / 感染的完整细胞 / 非感染的完整细胞，提取：
      细胞数量（每孔总和）
      面积 [µm2]（每孔均值 + 标准差）
      细胞宽长比（每孔均值 + 标准差）
    2. 针对完整细胞内的细菌，提取：
      识别出的细菌区域数量（每孔总和）
      荧光强度（每个区域平均强度的每孔总和）
      区域面积（每孔总和）
  7. 导出数据并在电子表格中进行整理后，根据以下公式量化细胞内载量（Mycoload）：
    用于计算显微镜下细菌强度的 Mycoload 公式，包含定义的变量。

结果

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Z' 因子评估
图2 显示了为计算 Z' 因子而进行的两次实验中的一次实验数据。阳性对照为 4 µg/mL 的克拉霉素。两次实验得到的 Z' 因子分别为 0.64 和 0.62，表明本实验所用的条件和检测方法适用于后续的筛选实验（Z' > 0.5）。尽管如此，仍对所有其余实验（感染实验）计算了 Z' 因子，以监控每次实验的性能表现。

为验证所设计的高通量筛选（HTS）检测方法的概念可行性，测试了一个用于药物再利用的化合物库。该化合物库包含1280种结构多样且分子量较小的化合物，其中95%为美国食品药品监督管理局（FDA）和欧洲药品管理局（EMA）批准的药物。这些分子具有高度的化学和药理学多样性。

点图显示处理组与未处理组样本中的相对光单位（RLU）；用于可视化处理效应分析。
图2：Z' 因子评估结果。 将浓度为 2.5 × 105 CFUs/mL 的 Mab 菌株在 37 °C 条件下孵育 48 小时，部分样本加入 4 µg/mL 的克拉霉素处理，部分未加。孵育结束后，通过检测发光强度评估分枝杆菌的活力。该图显示了一次独立实验中经处理与未处理的活分枝杆菌各自的发光值。请点击此处查看该图的放大版本。

文库筛选以确定阳性化合物
所有化合物均在 6.66 µM 浓度下针对 Mab 进行测试。由于文库规模较大，化合物被分配至四个不同的 384 孔微孔板中（图 3A-D）。结果已对溶剂效应和经验证的边缘效应进行了归一化处理。

在该筛选实验中，共鉴定出33个阳性化合物，其中30个显著降低了发光强度，表明分枝杆菌的存活性下降（图3）。有趣的是，有3个化合物导致发光强度升高，可能与细菌代谢增强或增殖加快有关（图3）。所有33个阳性化合物均进入验证实验，包括那3个使发光增强的化合物，以检测其效应特征是否可重复。

发光检测数据，分析RLU值的图表，标记了统计学异常值。
图3：文库筛选结果。 （A-D）将浓度为 2.5 × 105 CFUs/mL 的 Mab 与 1280 种化合物（每种 6.66 µM）在 37 °C 下孵育 48 小时。孵育结束后，通过检测发光强度评估分枝杆菌的存活力。图中显示了一次独立实验的相对光单位（RLU）值，经溶剂校正和边缘效应校正后以任意单位表示。每块板的平均 RLU 及其对应的标准差（SD）被用于确定筛选阈值（灰色线；AVG ± 3SD）。圆形符号代表被测试的化合物。蓝色标记的化合物为超出该阈值的阳性结果。 请点击此处查看该图的高清版本。

命中验证实验
本实验使用的浓度分别为 13.3 µM、6.66 µM 和 3.3 µM。每种化合物均设置重复实验，以提高结果的可靠性。

重要的是，化合物 30、31 和 32 此前与较高的 RLU 相关（图 3A、C），在本实验中仍保持这一特征，其中经化合物 32 处理的孔中分枝杆菌存活率超过 200%（图 4）。

化合物20和33被认为无活性，因为在所有测试浓度下，分枝杆菌的存活率均接近100%（图4）。

化合物9和21在两个最低浓度下表现出相似的无活性；然而，与化合物20不同，它们在最高浓度13.3 µM时仍保持活性，其中化合物21表现出更强的效力（图4）。

化合物3在最低浓度下也表现出无活性，并在6.66 µM时出现活性下降，但其下降程度小于化合物21（图4）。仅在最低浓度下，化合物2、7、8、10、16、18、24和28表现出较低的治疗潜力。然而，化合物2、10和28仍导致分枝杆菌存活率<50%。

在全球范围内，其余十四种化合物在所有测试浓度下均表现出活性。

不同浓度化合物处理对分枝杆菌活性影响的柱状图。
图 4：命中化合物验证实验结果。 将 Mab 菌液（浓度为 2.5 × 105 CFU/mL）分别与先前鉴定出的各命中化合物在 13.3 µM、6.66 µM 和 3.3 µM 浓度下（对应的 DMSO 含量分别为 1.3%、0.7% 和 0.3%）于 37 °C 共孵育 48 小时。孵育结束后，通过检测发光信号评估分枝杆菌的存活情况。本图展示了一次独立实验中，经化合物处理后的分枝杆菌存活率相对于未处理组的百分比，每种化合物均设置两个重复。圆形符号代表每种化合物的两个重复值，柱状图表示两个重复值的平均值。请点击此处查看该图的放大版本。

感染实验
在测试的三十三种化合物中，有二十八种被选中用于感染实验（图4）。化合物7、8、9、20和33未被选中进行该实验。其中，化合物9、20和33因在验证过程中显示无活性而被排除（图4），前两种化合物则因技术原因未被纳入。尽管如此，这些化合物被鉴定为利福平和利奈唑胺，均为已用于治疗脓肿分枝杆菌（Mab）感染的抗生素12。所有在感染实验中测试的化合物均已鉴定，并列于表1中。通过利用细菌的内在荧光作为检测信号，评估了这些化合物对Mab感染巨噬细胞的抗菌活性。

化合物名称化合物名称
1Sulfathiazole18Cefuroxime
2Ciprofloxacin19Rifaximin
3Cefotaxime21Cefdinir
4Daunorubicin22Clarithromycin
5Doxorubicin 23Besifloxacin
6Thiostrepton24Levofloxacin
10Amikacin25Rifabutin
11Moxalactam26Gatifloxacin
12Sulfamethizole27Epirubicin
13Sulfamonomethoxine28Pyrvinium pamoate
14Cefoxitin29Moxifloxacin
15Novobiocin30Troleandomycin
16Cefmetazole31Lincomycin
17Roxithromycin32Spiramycin

表1：感染实验中测试的化合物列表。 在步骤4中验证的化合物在感染实验（步骤5）中进行测试。

首先评估了化合物对感染Mab的巨噬细胞的毒性。将化合物判定为有毒或无毒的阈值设定为存活巨噬细胞比例达到85%（图5）。在测试的28种化合物中，化合物4、5、6、27和28被判定为具有毒性（图5）。因此，这五种化合物被排除在后续的胞内抗菌活性评估之外。

比较不同浓度化合物处理后细胞活力的柱状图。
图 5：候选化合物对Mab感染巨噬细胞的毒性作用。 将BALB/c小鼠骨髓来源巨噬细胞（BMMs）以Mab感染（MOI=1），并在37 °C、7% CO2条件下，分别与先前鉴定出的候选化合物在13.3 µM、6.66 µM和3.3 µM浓度（对应DMSO终浓度分别为1.3%、0.7%和0.3%）共同孵育48小时。使用高内涵筛选荧光显微镜对细胞成像，通过DAPI染色的细胞核数量评估细胞活力。图中显示了两个独立实验中，经处理的感染巨噬细胞相对于未经处理的感染巨噬细胞的存活百分比。圆形符号代表每次实验的细胞活力值，柱状图表示两个独立实验的平均值。请点击此处查看该图的放大版本。

为了推断其余23种化合物对巨噬细胞内鸟分枝杆菌（Mab）的胞内活性（图6），采用此前在步骤6中解释的Mycoload公式，计算相对于未处理感染巨噬细胞的分枝杆菌存活率百分比。与初筛验证实验（图4）相比，大多数化合物对胞内分枝杆菌的治疗潜力下降（图6），在最高测试浓度下，有效化合物数量从25个减少至6个。值得注意的是，此前在浮游状态下使Mab存活率高于未处理细菌的三种化合物（30、31和32；图3和图4）在针对胞内Mab时表现出抗分枝杆菌活性；其中化合物30和32与DMSO对照组相比具有显著统计学差异，尤其是化合物32在3.3 µM浓度下即呈现该差异（图6）。化合物11和23在13.3 µM浓度下处理后，分枝杆菌存活率<50%；但与DMSO对照组相比，差异无统计学意义（图6）。化合物21、26和29在13.3 µM浓度下表现出足够强的活性，与DMSO对照组相比具有显著统计学差异，其中化合物29活性最强（图6）。最后，化合物17、22和25在所有测试浓度下对胞内分枝杆菌均表现出极强的活性，分别被鉴定为罗红霉素（roxithromycin）、克拉霉素（clarithromycin）和利福布汀（rifabutin）（表1）。在这三种化合物中，克拉霉素对Mab的活性最强，分枝杆菌存活率从未超过10%，在所有测试浓度下与DMSO相比，p值均<0.0001（图6）。

显示不同浓度下化合物对菌荷减少功效的柱状图。
图 6：筛选命中化合物对感染巨噬细胞内脓肿分枝杆菌的杀伤活性。 将BALB/c小鼠骨髓来源巨噬细胞（BMMs）以MOI=1感染脓肿分枝杆菌（Mab），随后分别加入先前筛选获得的命中化合物，终浓度为13.3、6.66和3.3 µM（对应DMSO终浓度分别为1.3%、0.7%和0.3%），在37 °C、7% CO2条件下孵育48小时。使用高内涵筛选荧光显微镜对细胞成像，并通过荧光信号计算菌荷（见步骤6）。本图展示了两个独立实验中，经化合物处理的感染巨噬细胞相对于未处理感染巨噬细胞的菌荷百分比。统计分析采用双因素方差分析（two-way ANOVA）结合Dunnett多重比较检验；*，p < 0.05；**，p < 0.01；***，p < 0.001；****，p < 0.0001，与DMSO溶剂对照组相比。星号颜色与图例中各浓度对应的颜色一致。圆形符号代表每次检测的菌荷值，柱状图表示两个独立实验的平均值。请点击此处查看本图的高清版本。

补充图1：Z'因子评估中使用的384孔板布局示例。 白色 - 空白孔（仅含液体培养基）；黄色 - 阳性对照（经抗生素处理的细菌）；红色 - 阴性对照（未经处理的细菌）。请点击此处下载该文件。

补充图2：文库筛选中使用的384孔板布局示例。 白色 - 空白孔（仅液体培养基）；绿色 - 溶剂对照；红色 - 阴性对照（未处理细菌）；蓝色 - 待筛选化合物。请点击此处下载该文件。

补充图3：用于命中验证的384孔板布局示例。 白色 - 空白孔（仅液体培养基）；绿色 - 溶剂对照（设两个复孔）；红色 - 阴性对照（未处理细菌）；蓝色 - 待筛选化合物（设两个复孔）。颜色变浅表示1:2倍比稀释。 请点击此处下载该文件。

补充图4：感染实验所用96孔板布局示例。 白色 - 空白孔（加水以防止蒸发）；红色 - 阴性对照（未处理的巨噬细胞）；黄色 - 阳性对照（用抗生素处理的巨噬细胞）；绿色 - 溶剂对照；蓝色 - 待测化合物。颜色变浅表示进行1:2系列稀释。请点击此处下载该文件。

补充图5：图像分析方案。 本研究采用详细的图像分析方案，可适用于开源软件。请点击此处下载该文件。

讨论

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

本方案描述了一种针对Mab的药物筛选流程 自主研发的 菌株10利用液体处理机器人、自动化显微镜与分析系统以及双报告菌株，可在无需添加试剂或执行额外操作步骤的情况下，通过发光或荧光快速评估细菌活力。该方法减少了检测间的时间消耗与变异性，对于高通量筛选（HTS）检测的应用具有显著优势。

在筛选成千上万种化合物时，必须能够轻松识别出有效的药物。为此，通常使用Z'因子来衡量统计效应大小，以推断检测方法的性能。如果Z'因子>0.5，则表明测试条件足以有效区分处理组与未处理组的样本13。本实验条件所得Z'因子均>0.6（图2），在统计学上证明该条件适用于开展筛选实验。此步骤对于确保筛选的有效性至关重要。

因此，建立了一种高通量筛选（HTS）方案，用于检测数千种化合物对浮游生长的脓肿分枝杆菌（Mab）的抗菌活性。由于Mab是一种兼性胞内病原体，所设计的方案还可同时筛选化合物对同一菌株的胞内抗菌活性——这是一个关键优势。此外，该方案还可评估化合物对宿主细胞的毒性。因此，本文描述了一种针对Mab的多步骤药物筛选方法，通过不同的实验设置来评估抗菌活性及细胞毒性，从而提高筛选成功的机会。作为概念验证，对一个包含1280种化合物的化学文库进行了筛选。

共确定了三十三个命中结果（图3）。其中，有三种化合物显著提高了分枝杆菌在液体培养物中的存活性（化合物30、31和32； 图3 和 图4）。需要注意的是，这些化合物可能会干扰发光信号的发射，但并不影响细菌的存活能力。在针对胞内分枝杆菌的测试中，这些化合物表现出抗菌活性（图6)，表明在宿主细胞内化后对Mab具有更高的抑制效果。这些化合物分别为他克罗霉素（30）、螺旋霉素（32）和林可霉素（31； 表1。前两者属于大环内酯类抗生素，是一类用于治疗分枝杆菌感染的抗生素16，后者是一种林可酰胺类抗生素，其作用机制与大环内酯类相似17据报道，Mab在液体和固体培养物中对另一种林可酰胺类抗生素克林霉素尤其耐药。18然而，大环内酯类抗生素已被证实具有免疫调节和抗炎特性19,20 和林可酰胺类21，这可以解释对细胞内分枝杆菌增强的抗菌活性（图6).

在其余的30个阳性结果中，有11个化合物在所有浓度下均能使分枝杆菌的存活力降低>90%（图4）。鉴于典型的高通量筛选（HTS）实验的预期命中率约为~1%22，本研究所建立的方案与通常观察到的结果一致。尽管如此，其他多个化合物仍具有活性，共有28个化合物进入感染实验阶段。

在已鉴定的化合物中，有五种化合物被认为具有毒性（图5）——柔红霉素（4）、多柔比星（5）、表柔比星（27）、硫链丝菌素（6）和吡维铵苯甲酸盐（28；表1）。前三种为抗肿瘤药物23,24,25，因此对本实验所用的哺乳动物细胞具有毒性并不意外。吡维铵苯甲酸盐多年来被用作有效的驱虫药；然而自2004年起，它也被发现具有抗肿瘤活性26。最后，硫链丝菌素是一种寡肽类抗生素，常用于兽医领域，但从未被批准用于人类27。已有文献报道该药物对乳腺癌细胞具有活性28。由于硫链丝菌素对骨髓来源巨噬细胞具有毒性，其在巨噬细胞内的活性未予评估（图5）。然而，已有研究表明，硫链丝菌素在5 µM浓度下对Mab感染的THP-1细胞有效29。文献中报道的该药物对浮游细菌的抑制效果29与本研究筛选结果相似，均显示硫链丝菌素具有极强的活性（图4）。

大多数筛选出的具有胞内巨噬细胞活性的化合物未显示出治疗潜力（图6）。细菌的胞内生长与浮游培养存在显著差异。在后者中，细菌与药物之间始终能够直接接触；而在前者中，由于细菌被宿主细胞内化，多层宿主细胞膜构成物理屏障，药物必须穿透这些屏障才能到达靶标，这可能解释了大多数化合物抗菌活性降低的现象。在最高浓度13.3 µM下，有三种化合物表现出足够强的抑制效果，其与DMSO对照组相比具有统计学差异（图6）- 头孢地尼（21）、加替沙星（26）和莫西沙星（29； 表1）。尽管莫西沙星已作为二线抗结核药物使用16，头孢地尼常用于治疗多种呼吸道细菌感染，例如肺炎30。然而，其对 M. tuberculosis31 且已有报道称Mab与碳青霉烯类抗生素对后者联用时表现出显著的协同作用32加替沙星是一种氟喹诺酮类药物，既往已有其对多种分枝杆菌具有活性的报道。33,34本实验中活性最强的三种化合物（图6）为roxithromycin（17）、clarithromycin（22）和rifabutin（25； 表1），在所有浓度下均具有极强的活性。前两种为大环内酯类，而利福布汀属于利福霉素类，这两类抗生素均是治疗多种分枝杆菌感染的基础药物16.

该筛选依赖于特定且昂贵的液体处理设备，以减少不同检测之间的变异性。尽管该液体处理设备具有极高的可重复性，但其不具备非接触式的化合物转移功能（例如声波转移）。因此，某些黏附性较强的化合物可能在转移过程中残留在金属针头上，并带入后续孔中，导致筛选阶段出现假阳性结果——化合物33即为此情况。这正是验证筛选结果对整个流程成功至关重要的原因，以确保没有假阳性进入药物筛选流程的后续步骤。感染检测采用带有共聚焦模式的高内涵成像系统，以获得细菌区域尽可能清晰的定义。然而，即使不使用共聚焦模式仍可进行检测，但图像分辨率会有所下降，可能影响细菌区域的识别。本实验方案充分利用了与成像系统集成的简单且用户友好的分析软件；不过，也可根据该方案使用开源软件（补充图5）。最终，尽管本研究并未将药物重新用于治疗脓肿分枝杆菌（Mycobacterium abscessus）感染，但这些结果仍极为重要，因其验证了所建立的实验流程，并表明该流程可扩展应用于更大的化合物库。重要的是，我们相信只要具备荧光或发光检测信号，该方案即可适用于任何细菌。因此，本研究为药物发现领域做出了重要贡献，提供了应对重大公共卫生问题之一——耐药菌感染，尤其是几乎难以治疗的病原体——脓肿分枝杆菌的重要工具。

披露

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

作者声明不存在利益冲突。

致谢

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

本工作由葡萄牙国家基金通过科学技术基金会（FCT - Fundação para a Ciência e a Tecnologia, I.P.）资助，项目编号为 PTDC/BIA-MIC/3458/2020（DOI: 10.54499/PTDC/BIA-MIC/3458/2020），以及授予 GSO 的博士奖学金 2021.07335.BD 和授予 CMB 的博士奖学金 UI/BD/150830/2021；同时由弗拉芒研究基金会（FWO - Research Foundation Flanders）资助，项目编号 n° 1S68720N；创新药物计划2期第16号（IMI2-Call 16）项目RespiriTB，协议编号853903。作者感谢i3S科研平台BioSciences Screening提供的支持，该平台为国家基础设施PT-OPENSCREEN（NORTE-01-0145-FEDER-085468）和葡萄牙生物成像平台（PPBI - Portuguese Platform of Bioimaging，PPBI-POCI-01-0145-FEDER-022122）的成员。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
10% 中性缓冲福尔马林Bio Optica05-01005Q固定液
384孔黑色圆底未处理聚丙烯微孔板Corning3658可使用白色微孔板；可使用聚苯乙烯材质
50 TS 洗板机BioTek
Breathe-Easy 密封膜Sigma-AldrichZ380059-1PAK
cell::explorerRevvity自动化实验机器人设备
克拉霉素Sigma-AldrichA3487-100MG用DMSO溶解至所需浓度
DMSOFisher ScientificD/4121/PB15用液体培养基稀释至所需浓度
Harmony 5.1Revvity分析软件
Heracell VIOS 160i CO2 培养箱，165 LThermo Scientific细胞培养箱
JANUS 配4通道移液臂和MDT臂Revvity液体处理系统
KB 8182Termaks带振荡功能的培养箱
Libra S4+Biochrom
Multidrop Combi 试剂分配器Thermo Scientific
Opera Phenix PlusRevvity成像系统
PhenoPlateRevvity6055302高内涵显微镜必需耗材
磷酸盐缓冲液 (PBS) 1xNANA洗涤液
Prestwick 化学文库 用于药物再利用研究的商业化合物库
3031 型振荡培养箱GFL
VICTOR NivoRevvity
细胞培养基：必要时添加10%补充物
DMEMGibco10938-025
胎牛血清 (FBS)BiowestS1810
HEPES 缓冲液 (1 M)Gibco15630-056
LCCMNANA来自L929细胞系的条件培养基，可释放巨噬细胞集落刺激因子 (M-CSF)；细胞培养基补充物
L-谷氨酰胺 (200 mM)Thermo Scientific25030024
丙酮酸钠 100 mM (100X)Gibco11360-039
感染后洗涤液
无菌去离子水多个供应商可提供
Hank's 平衡盐溶液 10xGibco14060-040用无菌去离子水稀释至1x
通透液含0.1% Triton X100的PBS
PBS 1xNANA
Triton X100Sigma-AldrichT8787其他供应商亦可提供
染色液含DAPI (500 ng/mL) 和 HCS Far Red (10 ng/mL) 的PBS
DAPISigma-AldrichD9564
HCS Far Red InvitrogenH32721
PBS 1xNANA多个供应商可提供
液体生长培养基必要时添加10%补充物
Middlebrook 7H9 肉汤BD Difco271310
Tween80Sigma-AldrichP4780终浓度0.05%；其他供应商亦可提供
液体生长培养基补充物：
牛血清白蛋白Fisher ScientificBP9702-100
无水D-葡萄糖Fisher ScientificG/0450/60

参考文献

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  33. In vitro and in vivo activities of gatifloxacin against Mycobacterium tuberculosis. Antimicrob Agents Chemother. 46 (4), 1022-1025 (2002).">Alvirez-Freites, E. J., Carter, J. L., Cynamon, M. H. In vitro and in vivo activities of gatifloxacin against Mycobacterium tuberculosis. Antimicrob Agents Chemother. 46 (4), 1022-1025 (2002).
  34. Susceptibilities of Mycobacterium marinum to gatifloxacin, gemifloxacin, levofloxacin, linezolid, moxifloxacin, telithromycin, and quinupristin-dalfopristin (synercid) compared to its susceptibilities to reference macrolides and quinolones. Antimicrob Agents Chemother. 46 (4), 1114-1116 (2002).">Braback, M., Riesbeck, K., Forsgren, A. Susceptibilities of Mycobacterium marinum to gatifloxacin, gemifloxacin, levofloxacin, linezolid, moxifloxacin, telithromycin, and quinupristin-dalfopristin (synercid) compared to its susceptibilities to reference macrolides and quinolones. Antimicrob Agents Chemother. 46 (4), 1114-1116 (2002).

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