本研究建立了一种用于高通量筛选的检测方法 脓肿分枝杆菌 与一个 新近构建的双报告基因菌株，利用荧光和生物发光快速评估细菌活性。该实验方案适用于致力于筛选抗此类耐药细菌新药物的研究人员。
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摘要
摘要
脓肿分枝杆菌 (Mab) 感染由于具有高度的内在耐药性，治疗难度较大，其耐药程度可与耐多药结核病相媲美。目前的治疗方案疗效极差，依赖多种药物联合使用，导致患者依从性低下。因此，科学界迫切需要发现新的有效药物以应对此类感染。其中一种策略是药物再利用——即发掘市场上已有药物的新治疗用途，从而规避新药所需耗时的药代动力学和安全性评估过程。由于大多数针对 Mab 的药物研发研究依赖传统且耗时的方法，研究人员已开发出一种针对分枝杆菌的高通量药物筛选检测方法 内部 开发了Mab的双报告基因菌株。结合液体处理机器人、自动化显微镜及分析技术， 内部 开发了双报告菌株后，可通过两种不同的检测方式——发光和荧光——快速测量细菌活力，且无需添加试剂或进行额外操作步骤。这减少了检测所需时间以及不同实验间的变异，对于高通量筛选具有显著优势。所述实验方案通过筛选一个包含1280种化合物的文库得以验证，所得结果与文献报道一致，能够有效检出活性化合物。因此，本研究实现了为领域提供一种新工具以应对这种高度耐药细菌的初衷。
引言
Mycobacterium abscessus（Mab）是一种机会性病原体，可导致肺部感染，尤其在囊性纤维化及其他肺部疾病患者中较为常见。由于Mab具有极强的固有耐药性，其引发的感染治疗难度极高，其耐药程度可与耐多药结核病相媲美1。目前可用的药物大多疗效不佳，原因在于分枝杆菌细胞包膜通透性极低，且其基因组编码多种可使抗生素失活的酶2。因此，治疗通常需要联合使用多种药物，疗程长达数月甚至数年。这种复杂的多药治疗方案加上患者依从性较低，导致平均治愈率仅为30%至50%3。此外，在过去几十年中，由非结核分枝杆菌引起的肺部感染发病率持续上升，其中包括Mab所致感染1,4。因此，科学界正致力于加快研发用于治疗Mab感染的新型化合物。
实现这一目标的策略之一是药物再利用——即为现有药物寻找新的治疗用途。这种方法规避了新药研发过程中最大的挑战——时间5。这一简单概念利用了多种药物已建立的药代动力学和安全性特征，从而降低研发成本，并缩短药物从实验室到临床应用所需的时间6。因此，目前已汇编出包含数百至数千种此类化合物的化合物库，使研究人员能够快速测试将这些药物重新用于其目标病原体治疗的可能性。
针对Mab药物开发的大多数研究都基于一种传统但被视为金标准的检测方法，该方法用于评估化合物的 体外 抗分枝杆菌活性——菌落形成单位计数7尽管该方法具有较高的准确性，但其耗时极长，当需要测试包含数千种化合物的化合物库时，迅速变得不可行。为此，高通量筛选（HTS）已被整合到药物研发中——这是一类基于机器人技术和液体处理设备的稳健检测方法，可实现数千种化合物的并行快速筛选8这通常通过初始测试单一浓度来完成，使用96、384、1536或3456孔微孔板，作为筛选出阳性结果的起点，并在后续流程中进一步优化，以用于临床。
与基于染料和吸光度的其他检测方法相比，报告基因检测方法因其简便性和高灵敏度，在高通量筛选（HTS）中具有显著优势7,9。然而，据我们所知，目前仅有少数研究对针对Mab的高通量筛选进行了优化9。
近期，我们的实验室开发了能够同时发出生物发光和荧光的双报告菌株10。Mab operon_mScarlet 就是其中之一。该菌株由于表达了 LuxABCDE 操纵子而具有自发光特性，该操纵子包含细菌荧光素酶（由 luxAB 基因表达）和长链醛底物（由 luxCDE 基因表达）。另一方面，荧光信号则通过表达一种新近开发的红色荧光蛋白 mScarlet 获得，其信号强度优于常用的 eGFP 和 mCherry 蛋白11。使用该菌株可使我们通过微孔板检测仪测量发光信号来评估液体培养物中的细菌活力，无需添加试剂或进行额外操作步骤。在检测方面，其内在荧光特性使得在活细胞或固定细胞中均可通过显微镜直接观察，无需使用染料或抗体。单个菌株同时具备两种读出方式，为高通量筛选（HTS）实验提供了显著优势——由于无需根据实验类型更换菌株，不同读出方式之间的实验变异性显著降低。
因此，本研究建立了一种针对Mab的高通量检测方法 自主研发 基因工程双报告基因菌株（图1）。这使得能够快速评估 体外 活性1280种拟用于重新定位的药物，使用商业文库（见 材料表首先，通过发光检测在肉汤培养体系中评估活性；其次，利用荧光信号检测分枝杆菌感染的巨噬细胞，更真实地模拟实际感染过程 体内12.
图1：已建立方案的图形摘要。 该筛选中的关键角色是一种 自主研发 开发了双报告基因分枝杆菌菌株，并在所有实验中使用。首先，利用试剂分配器和浮游细菌，通过在单一浓度下测试化合物进行初筛。初筛得到的阳性结果进入验证实验，其中测试三种不同浓度。这两个实验均采用发光信号读数。验证后的阳性结果进入感染实验，同样测试三种不同浓度，并以感染复数（MOI）1感染骨髓来源巨噬细胞。采用高内涵成像系统获取细菌的荧光信号，通过Mycoload公式利用分析软件评估细胞内载菌量。随着实验复杂性的增加，化合物数量逐步减少。图片由BioRender.com制作。 请点击此处以查看此图的放大版本。
方案
所有动物实验均经i3S当地动物伦理委员会批准，并由葡萄牙食品与兽医总署（DGAV）许可，遵循欧洲理事会指令（2010/63/EU）及葡萄牙有关实验动物福利的法律（DL 113/2013）。
1. Z'因子评估
注意：为了评估高通量筛选（HTS）实验的性能，可以测定多个参数。其中最常用的参数是Z'因子（Z prime factor）。该指标用于衡量特定实验的统计效应大小，反映阳性对照与阴性对照之间的分离程度。若Z'因子介于0.5至1之间，则表明两组群体的分离效果极佳，适合用于HTS实验。若Z' < 0.5，则说明分离程度仅为勉强可接受，不建议进行筛选13。因此，设计了一个实验，使用半块孔板接种未经处理的细菌，另半块孔板接种阳性对照，以计算Z'因子（补充图1）。
- 在实验前 2-3 天，将 Mab 接种于液体培养基中（约 1 × 107 CFU/mL），置于锥形瓶中制备预培养物。将细菌置于 37 °C 摇床培养箱中培养（90 rpm）。
注意：操作 Mab 培养物时必须使用生物安全柜。 - 使用分光光度计在 600 nm 处测定 Mab 预培养物的光密度，监测其生长情况。当培养物进入对数生长期时，进行步骤 1.3。
- 利用处于对数生长期的预培养物，在液体培养基中制备浓度约为 5 × 105 CFU/mL 的细菌悬液（与光密度值相关）14。
- 在液体培养基中配制细菌生长抑制的阳性对照溶液。本实验中，阳性对照为克拉霉素（DMSO 中 10 mg/mL），终浓度为 4 µg/mL。克拉霉素需配制成目标终浓度的 2 倍储备液。
- 使用配备小型卡匣的微量板加样器，向黑色聚丙烯 384 孔板的空白组和未处理组各孔中加入 15 µL 液体培养基。对于空白组，额外再加入 15 µL 液体培养基。
注释：空白列可防止 37 °C 培养时内侧孔位的液体蒸发。 - 使用配备小型卡匣的微量板加样器，将步骤 1.4 中配制的阳性对照溶液 15 µL 加入阳性对照孔中。
- 使用配备大型卡匣的微量板加样器，将步骤 1.3 中制备的细菌悬液 15 µL 加入除空白组外的所有孔中，使所有成分稀释至 1:2。最终每孔体积为 30 µL。
注释：微量板加样器可配备大型或小型卡匣，其区别在于管路尺寸（分别为 0.5 mm 和 0.22 mm）。建议使用较大的卡匣以防止细菌在管路系统中发生聚集，尽管会导致更多液体浪费。然而，整个实验过程中也可始终使用同一规格的卡匣。 - 使用允许持续气体交换的板封膜密封每块微孔板。将微孔板置于湿润环境中，在 37 °C 静置培养箱中孵育 48 小时。
- 孵育 48 小时后，使用积分时间为 1 秒的酶标仪读取每块板中细菌发出的发光信号。
- 为确定 Z' 因子，使用步骤 1.9 中获得的数据，计算阳性对照（AVGP 和 SDP）与阴性对照（AVGN 和 SDN）的平均值和标准差。随后应用以下公式：
注释：3 × SD 是常用的阈值，但可根据筛选需求进行调整，即通过增大或减小乘以标准差的倍数来优化。
2. 筛选文库以获得阳性结果
注意：首次筛选针对在液体培养基中生长的细菌进行。实验设计采用384孔板，最终反应体积为30 µL。每块板包含空白孔（仅含液体培养基）、阴性对照（未处理细菌）和溶剂对照（细菌加化合物溶剂——本实验中为DMSO；补充图2）。将化合物或溶剂以目标终浓度的2倍浓度加入孔板中，随后等体积加入细菌，使所有成分稀释至一半。
- 按照步骤 1.1 至 1.3 所述方法制备细菌悬液。
注意：操作 Mab 菌株培养物时必须使用生物安全柜。 - 在液体培养基中配制溶剂溶液，溶剂的浓度应为所需最终浓度的 2 倍。
- 使用配备小型卡带的微孔板加样器，向黑色聚丙烯 384 孔板的每一列加入 15 µL 液体培养基，溶剂对照孔列除外。对于空白孔列，额外再加入 15 µL 液体培养基。
- 使用配备小型卡带的微孔板加样器，向溶剂对照孔列加入 15 µL 前述已配制的溶剂溶液。
- 使用液体处理设备，将化合物从储存用的 96 孔板（DMSO 中浓度为 1 mM）转移 200 nL 至 384 孔板中，空白孔、溶剂对照孔及未处理对照孔除外。此时化合物浓度为 13.3 µM。
- 使用配备大型卡带的微孔板加样器，向除空白孔外的所有孔中加入 15 µL 步骤 2.1 中制备的细菌悬液，使所有成分稀释至 1:2。最终每个 384 孔板的总体积为 30 µL，每种化合物浓度为 6.66 µM。
- 使用允许持续气体交换的微孔板密封膜对每块板进行密封。
备注：该实验也可使用普通盖板进行，但边缘效应可能更为显著。 - 将微孔板置于加湿容器内，在 37 °C 培养箱中静置培养 48 小时。
- 培养 48 小时后，使用积分时间为 1 秒的酶标仪检测每块板中细菌发出的发光信号。
3. 阳性结果筛选数据分析
注意：为了利用获得的发光数据识别阳性结果，必须将数值相对于化合物所溶解的溶剂进行归一化处理，并且如果存在，还需对在384微孔板上观察到的边缘效应进行校正。
- 对于步骤 2.9 中获得数据的溶剂归一化，将每个孔的相对光单位（RLU）除以相应板中溶剂对照孔的平均 RLU。在本实验中，已证实筛选板中间区域存在显著的边缘效应；因此，决定对所有数据进行该效应的校正。为实现此目的，该过程以两步方式进行，如下所述。
- 通过将步骤 3.1 中获得的数值（排除阳性结果孔）在所有板（板 1 - P1，板 2 - P2，板 3 - P3，板 4 - P4）的对应位置上进行平均，创建边缘效应掩模。例如，对于 A1 和 A2 位置，Mask_A1 = 平均值 (P1_A1; P2_A1; P3_A1; P4_A1)；Mask_A2 = 平均值 (P1_A2; P2_A2; P4_A2) [P3_A2 被排除，因其为阳性结果]。
- 将步骤 3.1 中获得的数值除以步骤 3.1.1 中获得的边缘效应掩模值。例如，
。随后，计算每块板的平均值（AVG）和标准差（SD），以建立每块板的阈值（AVG ± 3SD）。任何超出该阈值的化合物均被视为阳性结果，并进入阳性结果验证实验。
4. 阳性结果验证实验
注意：在确定阳性结果后，需使用不同浓度进行验证。验证实验采用与之前相同的设置和对照，但每个阳性样品需进行1:2系列稀释。本实验使用三个浓度——13.3 µM、6.66 µM 和 3.3 µM。溶剂对照组所含溶剂百分比需与各化合物孔中的溶剂百分比相同（补充图3）。
- 按照步骤 1.1 至 1.3 所述方法制备细菌悬液。
注意：操作 Mab 菌株培养物时必须使用生物安全柜。 - 使用配备小型卡盒的微孔板试剂分配器，向黑色聚丙烯 384 孔板的每一列加入 15 µL 液体培养基。对于空白孔，在第一列和最后一列额外加入 15 µL 液体培养基。
- 使用微孔板试剂分配器，向含有每种化合物最高浓度 [µM] 的列中额外加入 15 µL 液体培养基。
- 从储存用的 96 孔板中，手动使用移液器将每种阳性化合物（DMSO 中 1 mM）0.8 µL 加入步骤 4.3 对应的孔中，每个样本设置两个复孔。此时化合物浓度为 26.6 µM。
- 手动使用移液器将 0.8 µL 溶剂加入对照孔中，每个样本设置两个复孔（与步骤 4.4 相同）。
- 使用多通道移液器，对每种化合物及溶剂对照进行两次 1:2 系列稀释。最后一次稀释后弃去多余的 15 µL。所有孔中液体体积现为 15 µL，化合物浓度分别为 26.6 µM、13.3 µM 和 6.66 µM。
- 使用配备大型卡盒的微孔板试剂分配器，向所有列（除空白孔外）加入 15 µL 步骤 4.1 中制备的细菌悬液，使化合物进一步稀释 1:2。所有孔的终体积为 30 µL，每种化合物的浓度分别为 13.3 µM、6.66 µM 和 3.3 µM。
- 使用允许持续气体交换的微孔板密封膜密封微孔板。将微孔板置于湿润培养盒中，在 37 °C 恒温培养箱中静置培养 48 小时。
- 48 小时后，使用酶标仪读取每块微孔板中细菌发出的发光信号，积分时间为 1 秒。
5. 感染实验
注意：Mab 是一种胞内兼性致病菌，因此必须在感染实验中确定候选化合物的抗菌活性和对宿主的毒性。为此，使用 Mab 感染骨髓来源的巨噬细胞（BMM），并用在步骤 4 中验证过的候选化合物在不同浓度下进行处理。每次实验均包括空白对照（仅含水）、阴性对照（未处理的感染巨噬细胞）、阳性对照（经有效抗生素处理的感染巨噬细胞）、溶剂对照（本实验中为 DMSO），以及待测化合物的三个浓度——13.3 µM、6.66 µM 和 3.3 µM（补充图 4）。
- 按照先前所述方法，从野生型成年小鼠（BALB/c 或 C57BL/6）的骨髓中分离巨噬细胞15。将细胞以每孔 200 µL、浓度为 2 × 105 个细胞/mL 的条件接种于 96 孔黑色光学平底板中。在 37 °C、7% CO2 条件下培养 10 天完成分化后15，细胞即可用于感染并进行后续处理。
注意：骨髓来源巨噬细胞的制备方案已较为成熟15；然而，本筛选方案也可适用于其他细胞类型，例如 RAW 264.7、THP-1 和外周血单个核细胞（PBMC）来源的巨噬细胞。 - 按照步骤 1.1 至 1.3 所述方法制备细菌悬液，并用细胞培养基调整细菌浓度，使感染时的感染复数（MOI）为 1。
注意：操作 Mab 培养物时必须在生物安全柜中进行。 - 使用连接玻璃移液管的真空泵小心吸除各孔中的含补充剂细胞培养基。此步骤需缓慢轻柔操作，以防止细胞脱落。
- 手动向每孔加入 75 µL 步骤 5.2 中制备的细菌悬液。将培养板置于细胞培养箱中，在 37 °C、7% CO2 条件下孵育 4 小时。
- 准备用于细胞处理的化合物。使用配备小型卡盒的微孔板加样器，向聚丙烯圆底 96 孔板的相应列中加入 110 µL 含补充剂的细胞培养基（化合物或溶剂对照所在列）（补充图 4）。
- 使用微孔板加样器，向化合物或溶剂最高浓度所在的列额外加入 104 µL 含补充剂的细胞培养基。
- 手动向指定孔（步骤 5.6 中的列）加入 5.9 µL 化合物（DMSO 中 1 mM）或溶剂。此时化合物浓度为 26.6 µM。
- 使用多通道微量移液器对每种化合物和溶剂进行两步连续 1:2 稀释。最后一次稀释后弃去多余的 110 µL。所有孔体积现为 110 µL，化合物浓度分别为 26.6 µM、13.3 µM 和 6.66 µM。
- 使用微孔板加样器向所有列（空白孔除外）加入 110 µL 含补充剂的细胞培养基。此时所有孔体积为 220 µL，化合物浓度分别为 13.3 µM、6.66 µM 和 3.3 µM。
- 在含补充剂的细胞培养基中配制克拉霉素溶液（阳性对照），浓度为 2 µg/mL。
- 在步骤 5.4 进行 4 小时后，使用酶标洗板机用感染洗涤液对已感染的 96 孔板进行 3 次洗涤（每次 200 µL）。保持吸液和加液速度尽可能缓慢，以避免细胞脱落。
- 最后一次吸液后，将步骤 5.5–5.9 中制备的化合物溶液各 200 µL 转移至含有感染巨噬细胞的 96 孔板中。
- 向未处理孔中加入 200 µL 含补充剂的细胞培养基。向相应孔中加入 200 µL 步骤 5.10 中制备的克拉霉素溶液。
- 将培养板置于细胞培养箱中，在 37 °C、7% CO2 条件下孵育 48 小时。
- 孵育 48 小时后，使用酶标洗板机以化合物洗涤液对感染的 96 孔板进行洗涤（每孔 200 µL，共 3 次）。
- 使用多通道微量移液器向所有孔中加入 200 µL 固定液，作用 10 分钟。
- 固定后，使用酶标洗板机以化合物洗涤液洗涤细胞（每孔 200 µL，共 3 次）。
注意：本方案可在此处暂停。若能防止污染和细胞干燥，细胞可在化合物洗涤液中于 4 °C 保存数天至数周。在进行步骤 5.18 前必须吸除洗涤液。 - 使用多通道微量移液器向所有孔中加入 200 µL 通透液，作用 15 分钟。随后使用酶标洗板机吸除通透液。
- 使用多通道微量移液器手动向每孔加入 100 µL 染色液，并在室温下孵育 30 分钟。
- 使用酶标洗板机以化合物洗涤液洗涤培养板（每孔 200 µL，共 3 次）。最后将染色后的细胞保留在化合物洗涤液中。
- 使用高内涵成像系统对培养板进行扫描，设置如下：
物镜：20x 空气/0.4NA（96 孔板中的一孔，57 个视野）
模式：共聚焦
405 nm 激光用于 DAPI（细胞核）
561 nm 激光用于 mScarlet（细菌）
640 nm 激光用于 HCS Cell Mask Deep Red（细胞质）
不进行 z 轴层扫
注意：也可使用宽场成像系统进行细胞成像，但分辨率会降低。 - 设置自动化设备操作机器人以实现夜间图像采集。该机械臂可在无人干预的情况下在高内涵成像系统中更换培养板。
注意：此步骤非必需，也可手动更换培养板。
6. 图像分析
注意：图像分析使用与获取图像所用的高内涵成像系统相同的分析软件进行。必须首先利用样本图像创建分析流程（补充图5）。随后，该流程将应用于整个孔（57个视野）及全部数据集（所有板）。分析软件按照逻辑顺序执行步骤，首先对不同兴趣区域（细胞核、细胞质、细胞和细菌）进行分割，然后建立它们之间的关联关系（例如细胞内的细菌），最后提取形态学和强度特征参数（如面积、强度）。图像分析的关键步骤如下所述。完整的分析流程详见补充图5。
- 使用 DAPI 信号分割细胞核，使用 DeepRed 信号分割细胞质，使用 mScarlet 信号分割细菌。
- 将细胞核与细胞质的分割结果关联，生成细胞的掩膜。
- 去除所有位于视野边界的对象。仅保留完整出现在视野中的细胞（完整细胞）。
- 通过关联完整细胞与细菌，定义输出群体“完整细胞内的细菌”。
- 将含有一个以上细菌区域的完整细胞定义为感染细胞，将含有少于一个细菌区域的完整细胞定义为非感染细胞。
- 在完成所有感兴趣区域的分割并建立各群体后，计算并提取其各项属性。以下为每个孔提取的属性：
- 针对完整细胞 / 感染的完整细胞 / 非感染的完整细胞，提取：
细胞数量（每孔总和）
面积 [µm2]（每孔均值 + 标准差）
细胞宽长比（每孔均值 + 标准差） - 针对完整细胞内的细菌，提取：
识别出的细菌区域数量（每孔总和）
荧光强度（每个区域平均强度的每孔总和）
区域面积（每孔总和）
- 针对完整细胞 / 感染的完整细胞 / 非感染的完整细胞，提取：
- 导出数据并在电子表格中进行整理后，根据以下公式量化细胞内载量（Mycoload）：
结果
Z' 因子评估
图2 展示了为计算 Z' 因子而进行的两次实验中的一次实验数据。阳性对照为 4 µg/mL 的克拉霉素。两次实验得到的 Z' 因子分别为 0.64 和 0.62，表明本实验所用的条件和检测方法适用于后续的筛选实验（Z' > 0.5）。尽管如此，仍对所有其余实验（感染实验）计算了 Z' 因子，以监控每次实验的性能表现。
为验证所设计的高通量筛选（HTS）检测方法的概念可行性，测试了一个用于药物再利用的化合物库。该化合物库包含1280种结构多样且分子量较小的化合物，其中95%为美国食品药品监督管理局（FDA）和欧洲药品管理局（EMA）批准的药物。这些分子具有高度的化学和药理学多样性。
图 2：Z' 因子评估结果。 将浓度为 2.5 × 105 CFUs/mL 的 Mab 在 37 °C 条件下，分别与 4 µg/mL 克拉霉素共孵育以及不加药物孵育 48 小时。孵育结束后，检测发光强度以评估分枝杆菌的活力。该图显示了一次独立实验中经处理与未处理的活分枝杆菌各自的发光值。请点击此处查看该图的放大版本。
文库筛选以确定阳性化合物
所有化合物均以 6.66 µM 浓度针对 Mab 进行测试。由于文库规模较大，化合物被分配至四个不同的 384 孔微孔板中（图 3A-D）。结果已对溶剂效应和已验证的边缘效应进行了归一化处理。
在该筛选实验中，共鉴定出33个阳性化合物，其中30个显著降低了发光强度，表明分枝杆菌活力下降（图3）。有趣的是，有3个化合物导致发光强度升高，可能与细菌代谢增强或增殖加快有关（图3）。所有33个阳性化合物均进入验证实验，包括那3个使发光增强的化合物，以检测其效应特征是否可重现。
图3：文库筛选结果。（A-D）将浓度为2.5 × 105 CFUs/mL的单克隆抗体与1280种化合物（每种6.66 µM）在37 °C下孵育48小时。孵育结束后，通过检测发光强度评估分枝杆菌的存活情况。图中显示了一次独立实验的相对光单位（RLU）结果，经溶剂和边缘效应校正后以任意单位表示。计算每块板的平均RLU及其对应的标准差（SD），以确定筛选阈值（灰色区域；平均值±3倍标准差）。圆形符号代表被测试的化合物。位于该阈值范围之外的化合物（蓝色标记）被视为阳性命中。请点击此处查看该图的高清版本。
命中化合物验证实验
本实验使用的浓度分别为 13.3 µM、6.66 µM 和 3.3 µM。每种化合物均设置重复实验，以提高结果的可靠性。
重要的是，化合物 30、31 和 32 之前与较高的 RLU 相关（图3A, C)，保持了该特征，经化合物32处理的孔中分枝杆菌存活率超过200%（图4).
化合物20和33被认为无活性，因为在所有测试浓度下，分枝杆菌的存活率均接近100%（图4）。
化合物9和21在两个最低浓度下表现出相似的无活性；然而，与化合物20不同，它们在最高浓度13.3 µM时仍保持活性，其中化合物21表现出更高的效力（图4）。
化合物3在最低浓度下也表现出无活性，并在更高浓度下出现活性丧失 6.66 µM，尽管其效果弱于化合物21（图4）。仅在最低浓度下，化合物 2、7、8、10、16、18、24 和 28 表现出较低的治疗潜力。然而，化合物 2、10 和 28 仍可导致 <50% 的分枝杆菌存活率。
在全球范围内，其余十四种化合物在所有测试浓度下均表现出活性。
图 4：命中化合物验证检测结果。 将 Mab 菌液（浓度为 2.5 × 105 CFUs/mL）与先前鉴定出的每个命中化合物在 37 °C 下孵育 48 小时，化合物浓度分别为 13.3 µM、6.66 µM 和 3.3 µM（对应的 DMSO 浓度分别为 1.3%、0.7% 和 0.3%）。孵育结束后，通过检测发光信号评估分枝杆菌的活性。该图显示了一次独立实验中，经处理样本相对于未处理样本的分枝杆菌存活率百分比，每种化合物均设置两个重复。圆形符号代表每种化合物的两个重复值，条形线段表示重复值的平均值。请点击此处查看该图的放大版本。
感染实验
在测试的三十三种化合物中，有二十八种被选中用于感染实验（图4）。化合物7、8、9、20和33未被选中进行该实验。其中，化合物9、20和33因在验证过程中显示无活性而被排除（图4），前两种化合物则因技术原因未被纳入。尽管如此，这些化合物被鉴定为利福平和利奈唑胺，均为目前用于治疗脓肿分枝杆菌（Mab）感染的抗生素12。所有在感染实验中测试的化合物均已鉴定，并列于表1中。通过利用细菌的内在荧光作为检测信号，评估了这些化合物对Mab感染的巨噬细胞的抗菌活性。
| 化合物 | 名称 | 化合物 | 名称 |
| 1 | Sulfathiazole | 18 | Cefuroxime |
| 2 | Ciprofloxacin | 19 | Rifaximin |
| 3 | Cefotaxime | 21 | Cefdinir |
| 4 | Daunorubicin | 22 | Clarithromycin |
| 5 | Doxorubicin | 23 | Besifloxacin |
| 6 | Thiostrepton | 24 | Levofloxacin |
| 10 | Amikacin | 25 | Rifabutin |
| 11 | Moxalactam | 26 | Gatifloxacin |
| 12 | Sulfamethizole | 27 | Epirubicin |
| 13 | Sulfamonomethoxine | 28 | Pyrvinium pamoate |
| 14 | Cefoxitin | 29 | Moxifloxacin |
| 15 | Novobiocin | 30 | Troleandomycin |
| 16 | Cefmetazole | 31 | Lincomycin |
| 17 | Roxithromycin | 32 | Spiramycin |
表1：感染实验中测试的化合物列表。 在步骤4中验证的化合物在感染实验（步骤5）中进行测试。
首先评估了化合物对感染Mab的巨噬细胞的毒性。将化合物判定为有毒或无毒的阈值设定为存活巨噬细胞比例达到85%（图5）。在测试的28种化合物中，化合物4、5、6、27和28被判定为具有毒性（图5）。因此，这五种化合物被排除在后续的胞内抗菌活性评估之外。
图 5：候选化合物对 Mab 感染巨噬细胞的毒性作用。 BALB/c 小鼠骨髓来源巨噬细胞（BMMs）以 Mab（MOI=1）感染后，在 37 °C、7% CO2 条件下，分别用先前鉴定出的候选化合物在 13.3 µM、6.66 µM 和 3.3 µM 浓度下处理 48 小时（DMSO 终浓度分别为 1.3%、0.7% 和 0.3%）。使用高内涵筛选荧光显微镜对细胞成像，通过细胞核数量（DAPI 染色）评估细胞活力。图中显示了两个独立实验中，经处理的感染巨噬细胞相对于未经处理的感染巨噬细胞的活力百分比。圆形符号代表每次实验的细胞活力值，柱状图表示两个独立实验的平均值。请点击此处查看该图的放大版本。
以推断其余二十三种化合物对胞内鸟分枝杆菌（Mab）的巨噬细胞内活性图6），采用Mycoload公式（此前在步骤6中已说明）计算相对于未经处理的感染巨噬细胞的分枝杆菌存活率百分比。大多数化合物对胞内分枝杆菌失去了治疗潜力（图6）与命中验证实验相比（图4），因为在最高测试浓度下，命中化合物数量从25个减少至6个。值得注意的是，与未处理细菌相比，三种化合物（30、31和32）均提高了浮游态Mab的存活率。 图3 和 图4) 对细胞内脓肿分枝杆菌（Mab）表现出抗分枝杆菌活性，其中化合物30和32与DMSO相比显示出显著的统计学差异，即使在 3.3 µM 对于化合物 32 的情况（图6）。经化合物11和23处理的分枝杆菌表现出活力 <在13.3 µM浓度下抑制率为50%；然而，该结果与DMSO对照组相比无显著差异。图6）。化合物21、26和29的活性足够强，可达到 13.3 µM 以确保具有显著的统计学差异，其中29号活性最高（图6最后，化合物17、22和25在所有测试浓度下对胞内分枝杆菌均表现出极强的活性。它们分别为罗红霉素、克拉霉素和利福布汀。表1）。在三种化合物中，克拉霉素对脓肿分枝杆菌（Mab）的活性最强，分枝杆菌存活率从未超过10%，其p值 <0.0001，与DMSO相比，在所有测试浓度下图6).
图 6：候选化合物对感染分枝杆菌的巨噬细胞的胞内活性。 BALB/c 小鼠骨髓来源巨噬细胞（BMM）以 Mab（感染复数 MOI=1）感染后，在 37 °C、7% CO2 条件下，分别与先前鉴定出的候选化合物在 13.3、6.66 和 3.3 µM 浓度（对应的 DMSO 终浓度分别为 1.3%、0.7% 和 0.3%）共同孵育 48 小时。使用高内涵筛选荧光显微镜对细胞成像，并利用荧光信号计算分枝杆菌载量（Mycoload，见步骤 6）。该图显示了在两个独立实验中，经处理的感染巨噬细胞相对于未经处理的感染巨噬细胞的 Mycoload 百分比。统计分析采用双因素方差分析（two-way ANOVA）结合 Dunnett 多重比较检验；*，p < 0.05；**，p < 0.01；***，p < 0.001；****，p < 0.0001，与 DMSO（溶剂对照）相比。星号的颜色编码与图例中各浓度对应。圆形符号代表每次检测的 Mycoload 值。柱状图表示两次独立实验的平均值。请点击此处查看该图的放大版本。
补充图1：Z'因子评估中使用的384孔板布局示例。 白色 - 空白孔（仅含液体培养基）；黄色 - 阳性对照（用抗生素处理的细菌）；红色 - 阴性对照（未经处理的细菌）。请点击此处下载该文件。
补充图2：文库筛选中使用的384孔板布局示例。 白色 - 空白孔（仅含液体培养基）；绿色 - 溶剂对照；红色 - 阴性对照（未处理细菌）；蓝色 - 待筛选化合物。请点击此处下载该文件。
补充图3：用于初筛验证的384孔板布局示例。 白色 - 空白孔（仅含液体培养基）；绿色 - 溶剂对照（设两个复孔）；红色 - 阴性对照（未处理细菌）；蓝色 - 待筛选化合物（设两个复孔）。颜色变浅表示进行1:2系列稀释。请点击此处下载该文件。
补充图4：感染实验所用96孔板布局示例。 白色 - 空白孔（加水以防止蒸发）；红色 - 阴性对照（未处理的巨噬细胞）；黄色 - 阳性对照（用抗生素处理的巨噬细胞）；绿色 - 溶剂对照；蓝色 - 待测化合物。颜色变浅表示进行1:2系列稀释。请点击此处下载该文件。
补充图5：图像分析方案。 本研究采用详细的图像分析方案，该方案可适用于开源软件。请点击此处下载该文件。
讨论
本方案描述了一种针对Mab的药物筛选流程 自主研发的 菌株10利用液体处理机器人、自动化显微镜与分析系统以及双报告菌株，可在无需添加试剂或执行额外操作步骤的情况下，通过发光或荧光快速评估细菌活力。该方法减少了检测间的时间消耗与变异性，对于高通量筛选（HTS）检测的应用具有显著优势。
在筛选成千上万种化合物时，必须能够轻松识别出有效的药物。为此，通常使用Z'因子来衡量统计效应大小，以推断检测方法的性能。如果Z'因子>0.5，则表明测试条件足以有效区分处理组与未处理组的样本13。本实验条件所得Z'因子均>0.6（图2），在统计学上证明该条件适用于开展筛选实验。此步骤对于确保筛选的有效性至关重要。
因此，建立了一种高通量筛选（HTS）方案，用于检测数千种化合物对浮游生长的脓肿分枝杆菌（Mab）的抗菌活性。由于Mab是一种兼性胞内病原体，所设计的方案还可同时筛选化合物对同一菌株的胞内抗菌活性——这是一个关键优势。此外，该方案还可评估化合物对宿主细胞的毒性。因此，本文描述了一种针对Mab的多步骤药物筛选方法，通过不同的实验设置来评估抗菌活性及细胞毒性，从而提高筛选成功的机会。作为概念验证，对一个包含1280种化合物的化学文库进行了筛选。
共确定了三十三个命中结果（图3）。其中，有三种化合物显著提高了分枝杆菌在液体培养物中的存活性（化合物30、31和32； 图3 和 图4）。需要注意的是，这些化合物可能会干扰发光信号的发射，但并不影响细菌的存活能力。在针对胞内分枝杆菌的测试中，这些化合物表现出抗菌活性（图6)，表明在宿主细胞内化后对Mab具有更高的抑制效果。这些化合物分别为他克罗霉素（30）、螺旋霉素（32）和林可霉素（31； 表1。前两者属于大环内酯类抗生素，是一类用于治疗分枝杆菌感染的抗生素16，后者是一种林可酰胺类抗生素，其作用机制与大环内酯类相似17据报道，Mab在液体和固体培养物中对另一种林可酰胺类抗生素克林霉素尤其耐药。18然而，大环内酯类抗生素已被证实具有免疫调节和抗炎特性19,20 和林可酰胺类21，这可以解释对细胞内分枝杆菌增强的抗菌活性（图6).
在其余的30个阳性结果中，有11个化合物在所有浓度下均能使分枝杆菌的存活力降低>90%（图4）。鉴于典型的高通量筛选（HTS）实验的预期命中率约为~1%22，本研究所建立的方案与通常观察到的结果一致。尽管如此，其他多个化合物仍具有活性，共有28个化合物进入感染实验阶段。
在已鉴定的化合物中，有五种化合物被认为具有毒性（图5）——柔红霉素（4）、多柔比星（5）、表柔比星（27）、硫链丝菌素（6）和吡维铵苯甲酸盐（28；表1）。前三种为抗肿瘤药物23,24,25，因此对本实验所用的哺乳动物细胞具有毒性并不意外。吡维铵苯甲酸盐多年来被用作有效的驱虫药；然而自2004年起，它也被发现具有抗肿瘤活性26。最后，硫链丝菌素是一种寡肽类抗生素，常用于兽医领域，但从未被批准用于人类27。已有文献报道该药物对乳腺癌细胞具有活性28。由于硫链丝菌素对骨髓来源巨噬细胞具有毒性，其在巨噬细胞内的活性未予评估（图5）。然而，已有研究表明，硫链丝菌素在5 µM浓度下对Mab感染的THP-1细胞有效29。文献中报道的该药物对浮游细菌的抑制效果29与本研究筛选结果相似，均显示硫链丝菌素具有极强的活性（图4）。
大多数筛选出的具有胞内巨噬细胞活性的化合物未显示出治疗潜力（图6）。细菌的胞内生长与浮游培养存在显著差异。在后者中，细菌与药物之间始终能够直接接触；而在前者中，由于细菌被宿主细胞内化，多层宿主细胞膜构成物理屏障，药物必须穿透这些屏障才能到达靶标，这可能解释了大多数化合物抗菌活性降低的现象。在最高浓度13.3 µM下，有三种化合物表现出足够强的抑制效果，其与DMSO对照组相比具有统计学差异（图6）- 头孢地尼（21）、加替沙星（26）和莫西沙星（29； 表1）。尽管莫西沙星已作为二线抗结核药物使用16，头孢地尼常用于治疗多种呼吸道细菌感染，例如肺炎30。然而，其对 M. tuberculosis31 且已有报道称Mab与碳青霉烯类抗生素对后者联用时表现出显著的协同作用32加替沙星是一种氟喹诺酮类药物，既往已有其对多种分枝杆菌具有活性的报道。33,34本实验中活性最强的三种化合物（图6）为roxithromycin（17）、clarithromycin（22）和rifabutin（25； 表1），在所有浓度下均具有极强的活性。前两种为大环内酯类，而利福布汀属于利福霉素类，这两类抗生素均是治疗多种分枝杆菌感染的基础药物16.
该筛选依赖于特定且昂贵的液体处理设备，以减少不同检测之间的变异性。尽管该液体处理设备具有极高的可重复性，但其不具备非接触式的化合物转移功能（例如声波转移）。因此，某些黏附性较强的化合物可能在转移过程中残留在金属针头上，并带入后续孔中，导致筛选阶段出现假阳性结果——化合物33即为此情况。这正是验证筛选结果对整个流程成功至关重要的原因，以确保没有假阳性进入药物筛选流程的后续步骤。感染检测采用带有共聚焦模式的高内涵成像系统，以获得细菌区域尽可能清晰的定义。然而，即使不使用共聚焦模式仍可进行检测，但图像分辨率会有所下降，可能影响细菌区域的识别。本实验方案充分利用了与成像系统集成的简单且用户友好的分析软件；不过，也可根据该方案使用开源软件（补充图5）。最终，尽管本研究并未将药物重新用于治疗脓肿分枝杆菌（Mycobacterium abscessus）感染，但这些结果仍极为重要，因其验证了所建立的实验流程，并表明该流程可扩展应用于更大的化合物库。重要的是，我们相信只要具备荧光或发光检测信号，该方案即可适用于任何细菌。因此，本研究为药物发现领域做出了重要贡献，提供了应对重大公共卫生问题之一——耐药菌感染，尤其是几乎难以治疗的病原体——脓肿分枝杆菌的重要工具。
披露
作者声明不存在利益冲突。
致谢
本工作由葡萄牙国家基金通过科学技术基金会（FCT - Fundação para a Ciência e a Tecnologia, I.P.）资助，项目编号为 PTDC/BIA-MIC/3458/2020（DOI: 10.54499/PTDC/BIA-MIC/3458/2020），以及授予 GSO 的博士奖学金 2021.07335.BD 和授予 CMB 的博士奖学金 UI/BD/150830/2021；同时由弗拉芒研究基金会（FWO - Research Foundation Flanders）资助，项目编号 n° 1S68720N；创新药物计划2期第16号（IMI2-Call 16）项目RespiriTB，协议编号853903。作者感谢i3S科研平台BioSciences Screening提供的支持，该平台为国家基础设施PT-OPENSCREEN（NORTE-01-0145-FEDER-085468）和葡萄牙生物成像平台（PPBI - Portuguese Platform of Bioimaging，PPBI-POCI-01-0145-FEDER-022122）的成员。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 10% 中性缓冲福尔马林 | Bio Optica | 05-01005Q | 固定液 |
| 384孔黑色圆底未处理聚丙烯微孔板 | Corning | 3658 | 可使用白色微孔板；可使用聚苯乙烯材质 |
| 50 TS 洗板机 | BioTek | ||
| Breathe-Easy 密封膜 | Sigma-Aldrich | Z380059-1PAK | |
| cell::explorer | Revvity | 自动化实验机器人设备 | |
| 克拉霉素 | Sigma-Aldrich | A3487-100MG | 用DMSO溶解至所需浓度 |
| DMSO | Fisher Scientific | D/4121/PB15 | 用液体培养基稀释至所需浓度 |
| Harmony 5.1 | Revvity | 分析软件 | |
| Heracell VIOS 160i CO2 培养箱，165 L | Thermo Scientific | 细胞培养箱 | |
| JANUS 配4通道移液臂和MDT臂 | Revvity | 液体处理系统 | |
| KB 8182 | Termaks | 带振荡功能的培养箱 | |
| Libra S4+ | Biochrom | ||
| Multidrop Combi 试剂分配器 | Thermo Scientific | ||
| Opera Phenix Plus | Revvity | 成像系统 | |
| PhenoPlate | Revvity | 6055302 | 高内涵显微镜必需耗材 |
| 磷酸盐缓冲液 (PBS) 1x | NA | NA | 洗涤液 |
| Prestwick 化学文库 | 用于药物再利用研究的商业化合物库 | ||
| 3031 型振荡培养箱 | GFL | ||
| VICTOR Nivo | Revvity | ||
| 细胞培养基： | 必要时添加10%补充物 | ||
| DMEM | Gibco | 10938-025 | |
| 胎牛血清 (FBS) | Biowest | S1810 | |
| HEPES 缓冲液 (1 M) | Gibco | 15630-056 | |
| LCCM | NA | NA | 来自L929细胞系的条件培养基，可释放巨噬细胞集落刺激因子 (M-CSF)；细胞培养基补充物 |
| L-谷氨酰胺 (200 mM) | Thermo Scientific | 25030024 | |
| 丙酮酸钠 100 mM (100X) | Gibco | 11360-039 | |
| 感染后洗涤液 | |||
| 无菌去离子水 | 多个供应商可提供 | ||
| Hank's 平衡盐溶液 10x | Gibco | 14060-040 | 用无菌去离子水稀释至1x |
| 通透液 | 含0.1% Triton X100的PBS | ||
| PBS 1x | NA | NA | |
| Triton X100 | Sigma-Aldrich | T8787 | 其他供应商亦可提供 |
| 染色液 | 含DAPI (500 ng/mL) 和 HCS Far Red (10 ng/mL) 的PBS | ||
| DAPI | Sigma-Aldrich | D9564 | |
| HCS Far Red | Invitrogen | H32721 | |
| PBS 1x | NA | NA | 多个供应商可提供 |
| 液体生长培养基 | 必要时添加10%补充物 | ||
| Middlebrook 7H9 肉汤 | BD Difco | 271310 | |
| Tween80 | Sigma-Aldrich | P4780 | 终浓度0.05%；其他供应商亦可提供 |
| 液体生长培养基补充物： | |||
| 牛血清白蛋白 | Fisher Scientific | BP9702-100 | |
| 无水D-葡萄糖 | Fisher Scientific | G/0450/60 |
参考文献
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