本文介绍了一种可用于通过免疫荧光显微镜成像五种或更多荧光参数的方法。文中概述了一种从这些图像中提取单个细胞并采用类似流式细胞术设门策略进行单细胞分析的分析流程，该流程可识别组织切片中的细胞亚群。
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摘要
摘要
利用组织学方法研究中枢神经系统（CNS）等组织切片中免疫细胞多样性的应用，受到单次成像所能检测的荧光参数数量的严重限制。大多数免疫细胞亚群是通过流式细胞术利用多种蛋白标志物的复杂组合来定义的，通常需要四个或更多参数才能明确鉴定，而大多数常规显微镜无法满足这一需求。由于流式细胞术需将组织解离，导致空间信息丢失，因此亟需能够在保留空间信息的同时解析复杂细胞类型功能的技术。本文通过建立一种扩展可成像荧光参数数量的方法，解决了上述问题：该方法采集光谱重叠荧光染料的信号，并利用光谱拆分技术分离各个独立荧光染料的信号。随后，通过分析流程对这些图像进行处理，将高参数组织学图像中的单个细胞提取出来，从而在单细胞水平上分析每个细胞独特的荧光特性。借助类似流式细胞术的设门策略，可将细胞分型并映射回组织切片，不仅能够量化其丰度，还能揭示它们与组织微环境之间的相互作用。总体而言，本研究展示了组织流式细胞术（histoflow cytometry）在组织切片中研究复杂免疫细胞群体方面的简便性与潜力。
引言
由免疫系统细胞和胶质细胞驱动的炎症可导致中枢神经系统（CNS）的慢性疾病，其中这两类细胞群体可相互促进对方的活性1,2,3。目前，阐明免疫系统如何与中枢神经系统的这些组分相互作用以促进中枢神经系统炎症，是一个重要的研究热点，而单细胞RNA测序等高参数技术的应用极大推动了该领域的进展。通过单细胞RNA测序，我们发现，在多种中枢神经系统疾病中，胶质细胞与免疫系统之间存在广泛的相互通讯4,5,6。深入理解这些相互作用如何影响疾病进程，对于揭示这些疾病的生物学机制至关重要。
单细胞测序分析存在一个问题是，这些技术需要将组织解离以获得单个细胞或细胞核，从而导致空间信息的完全丢失。了解细胞在组织中的位置对于理解其在驱动炎症过程中的作用至关重要。例如，在神经炎症过程中，B细胞等免疫细胞可在中枢神经系统（CNS）中聚集；然而，它们很少进入CNS实质，而是主要集中于CNS屏障区域7。鉴于其定位特征，这些细胞通过与CNS实质中的胶质细胞直接物理接触来参与炎症的可能性较低，提示它们与胶质细胞之间的任何相互作用可能通过分泌因子介导。此外，CNS疾病中的病理变化常具有特定结构特征8,9，因此细胞在组织中的定位可能关键性地决定其是主动参与疾病进程还是仅作为旁观者存在。因此，利用空间定位信息来评估细胞在病理过程中的作用至关重要。
研究组织中的细胞通常采用免疫组织化学或免疫荧光显微镜技术。这些技术的一个问题是，通常只能同时对最多四个参数进行成像。这对于这些技术而言是一个主要限制，因为从流式细胞术和单细胞RNA测序分析中我们已知，许多细胞群体需要两个或更多参数才能被鉴定；此外，在寻找特定细胞类型的亚群时，通常需要更多的参数10。因此，使用常规成像技术来研究细胞亚群在组织内可能的相互作用是不切实际的。
这一问题已通过一些较新的高参数方法得到部分解决，这些方法能够保留空间信息，例如空间RNA测序11和成像质谱流式技术12。尽管这些技术具有重要价值，但仍存在若干问题，例如尚未广泛普及、将三维数据简化为二维，以及需要较高的专业技术才能实施。另一种称为连续染色的技术，即先用一组抗体对组织进行染色，随后灭活该组抗体，再用另一组抗体进行染色，可在无需特殊设备或专业技术的情况下实现高参数组织学分析13,14,15。然而，连续染色过程极为耗时，且需要大量的显微镜成像时间，对于没有配备个人显微镜的实验室而言可能不具可行性。因此，亟需发展能够在广泛可用的显微镜上及时实现更多荧光参数同步成像的技术。
获取高参数数据后，另一个问题随之出现：传统的图像分析方法难以成功分析此类数据。诸如人工计数或阈值分割等技术，仅在分析仅涉及单一参数，或多个标记物具有相同定位且仅对重叠信号进行计数的情况下才可行。这一限制使得传统分析方法无法有效处理高参数数据集。目前已有成功分析此类数据集的方法，即从组织学图像中对单个细胞进行分割，然后采用类似流式细胞术的设门策略来鉴定细胞类型16,17。然而，这些分析方法还存在另一个问题：它们仅适用于所有目标细胞在物理上相互分离的数据集，因为这些技术并未采用能够准确分离彼此接触的细胞的方法。因此，亟需一种新方法，能够在细胞彼此接触的情况下，仍对组织学切片进行单细胞分析。
本文介绍了一种称为组织流式细胞术（histoflow cytometry）的简单实验方案，该方法此前已有报道18，可利用广泛可用的显微镜同时成像更多荧光参数。该方案通过使用光谱重叠的染料对组织进行染色，然后采用光谱补偿技术去除重叠通道间的信号串扰，从而获得清晰的单染结果。为了便于高参数组织学图像的分析，本文还描述了一个详细的分析流程，该流程可从组织切片中提取单个细胞，并利用类似流式细胞术的设门策略将细胞分类到不同的细胞群中。该方案适用于细胞呈弥散分布或紧密聚集的组织，因此在研究中枢神经系统（CNS）在稳态及神经炎症状态下的组织时具有广泛的适用性。因此，组织流式细胞术是一种研究复杂细胞类型间相互作用的有效技术，可在保留空间信息的同时，利用多种细胞标志物对细胞进行鉴定。
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方案
本方案不涉及用于组织学的组织切片；有关组织学切片的详细描述，请参见Jain等人的文献18或19。本方案适用于载玻片上的任何已切片组织。本文以先前所述方法18从免疫动物中分离的腹股沟淋巴结为例进行说明。本方案的操作步骤和时间线总结于图1中。本研究中所用试剂和设备的详细信息列于材料表中。
1. 组织切片染色
注意：除了使用研究者感兴趣的全部抗体标记对组织进行染色外，研究者还应在相邻或完全相同的组织切片上制备单色对照（每种拟使用的荧光参数各一个），每个单色对照仅使用产生一种荧光参数信号所需的试剂进行染色。
- 配制破膜封闭缓冲液和破膜染色缓冲液（组成见表1）。
- 在室温下将玻璃载片上的组织切片解冻，并用擦拭纸擦去冷凝水。使用疏水性标记笔勾画出需要染色的组织边界，待标记干燥。
- 将组织切片浸入磷酸盐缓冲液（PBS）中1分钟以重新水化组织。轻轻甩去PBS，并用擦拭纸去除多余的PBS，注意不要直接接触组织。
- 加入足量的4%多聚甲醛（PFA）覆盖组织，以固定组织。室温孵育20分钟。
注意：PFA可能具有毒性，应在通风橱内操作。
备注：此步骤仅适用于新鲜冷冻组织。若组织已预先固定，则可跳过此步骤。此处描述的是PFA固定法，但也可根据实验需求采用其他固定方法。 - 将载片置于PBS浴中，轻轻振荡洗涤1分钟，然后取出载片。更换PBS，重复洗涤3次。
- 轻轻甩去多余的PBS，并用擦拭纸去除残留液体，避免直接接触组织。
- 确定在步骤1.12中需要使用的二抗及其来源物种。向破膜封闭缓冲液中加入这些物种的正常血清，使每种血清的终浓度为5%，以强化破膜封闭缓冲液。
备注：使用二抗有助于增强信号强度。因此，建议将产生弱信号的一抗与二抗配对使用以放大信号。如果所有待染靶标本身荧光足够强，无需二抗，则可跳过步骤1.7–1.12和步骤1.15。 - 加入足量强化后的破膜封闭缓冲液覆盖各组织，以阻断抗体的非特异性结合。将载片置于避光、湿润的环境中，室温孵育1–8小时。
- 将未标记的一抗按实验确定的稀释比例加入破膜染色缓冲液中（所用一抗的物种或免疫球蛋白同种型应各不相同，并能被研究人员计划在步骤1.12中使用的二抗所区分）。
- 倒掉破膜封闭缓冲液，并用擦拭纸去除残留液体，避免直接接触组织。加入足量含有已稀释一抗的破膜染色缓冲液覆盖组织，4 °C孵育12–48小时。
备注：研究人员需自行确定抗体孵育的最佳时间。 - 配制封闭缓冲液和染色缓冲液（表1）。
- 将二抗按实验确定的稀释比例加入步骤1.11中配制的染色缓冲液中。所用二抗应针对步骤1.9中使用的一抗的相同物种或抗体同种型。
- 配制淬灭缓冲液（如表1所示）。
备注：此步骤有助于降低组织的自发荧光。如无需此步骤，可跳过步骤1.13和1.14。 - 按步骤1.5–1.6所述方法洗涤组织。然后加入足量淬灭缓冲液覆盖载片上的组织，室温孵育1–2分钟。
- 按步骤1.5–1.6所述方法洗涤组织。然后将步骤1.12中配制的、已稀释于染色缓冲液中的二抗加入组织，确保组织完全被染色缓冲液覆盖。4 °C孵育2–8小时。
- 在步骤1.11中配制的封闭缓冲液中加入50 µL正常血清（来自步骤1.18中将使用的抗体所对应的物种），终浓度为5%，以配制封闭溶液。
- 按步骤1.5–1.6所述方法洗涤组织。然后加入步骤1.16中配制的含正常血清的封闭溶液，确保组织完全被染色缓冲液覆盖。室温孵育1–8小时。
- 将实验确定稀释比例的荧光素标记一抗加入步骤1.11中配制的染色缓冲液中，配制染色溶液。同时，按实验确定的稀释比例向染色溶液中加入核染料（如核黄）。
备注：仅当研究人员需要使用额外的、无需二抗进行信号放大的抗体标记时，才需执行步骤1.18–1.19。若不使用标记一抗，可在步骤1.12中加入核染料。 - 轻轻甩去封闭缓冲液，并用擦拭纸去除残留液体，避免直接接触组织。加入足量步骤1.18中配制的染色溶液覆盖组织，4 °C孵育12–48小时。
- 按步骤1.5–1.6所述方法洗涤组织。每张载片上滴加5滴封片剂，避免产生气泡，然后缓慢倾斜地将玻璃盖玻片轻轻覆盖在组织上，确保组织完全被封片剂浸没并排除所有气泡。将载片置于4 °C避光保存，直至准备成像。
2. 组织切片成像
注意：在此阶段，组织切片已使用所有目标抗体对所有拟成像条件进行染色，而单色对照则在每个切片上仅使用一种荧光参数进行染色。成像应使用配备多个可调检测器的显微镜进行，这些检测器可调节以检测特定波长范围的光信号；理想情况下，显微镜应具备尽可能多的激光激发谱线。
- 将一张完全染色的玻片放入显微镜中，并设置显微镜，使用计划用于采集数据的物镜对切片进行成像。
- 根据组织所染荧光染料的种类，确定用于激发这些荧光染料所需的激发激光谱线，并确定每种荧光染料发射光谱中信号最强的发射波长范围。
注意：在线荧光光谱查看工具（例如，参见 材料表可用于确定荧光染料的最佳激发波长以及确定荧光染料检测的最佳波长范围。用于组织流式细胞术的荧光染料应选择在最佳激发激光波长或最佳发射波长范围上具有差异的染料，以便相互区分。激发/发射波长越接近的荧光染料，越难以分离。本研究中所使用的荧光染料详见结果部分。 - 开放软件 1（参见 材料表在共聚焦显微镜中）并选择 配置选项卡 在顶部，然后选择 硬件按钮 在左侧并更改 位深度 转换为16位。
注意：建议在数据采集时使用较高的位深度（如16位数据），因为这将提高光谱补偿的准确性。此外，提高像素密度、增加扫描线平均次数以及在z轴堆栈中设置更多的步进层数，均可改善光谱分离的质量。 - 选择 获取标签 在屏幕顶部，输入格式设置以包含图像的像素密度（通常，较高的分辨率会产生更好的结果）。
- 如果可用，选择 双向 采集以加快成像速度，前提是该功能已进行充分校准。
- 选择一个 针孔值 对于共聚焦显微镜（通常在400-600 nm之间），较小的针孔值通常可获得更高质量的组织流式细胞术结果，但针孔值过小会增加图像采集难度，可能需要更长的成像时间或更高的激发强度才能获得图像。
- 选择 显示顺序扫描面板 在左侧菜单顶部点击以打开顺序扫描选项。使用 '+' 添加序列以设置额外的激发波长，每个序列包含在步骤 2.2 中确定的一个激发波长。
- 打开所有需要的激光器，方法是单击相应的 开启 点击屏幕中央与目标激光器关联的按钮，将其切换至开启状态。进入每个特定序列后，在屏幕中央将激光功率调整至所需数值，每个序列将使用一种激发波长。
- 转动 在 根据每条激光线需要成像的荧光染料，在屏幕底部的每个序列中设置所需数量的检测器。调整 范围 通过双击检测器的范围，并输入需要采集的波长上下限范围来设置检测器。
注意：建议尽可能使用高灵敏度检测器，理想情况下所有通道应使用相同类型的检测器进行采集，但此要求并非强制。 - 按压 实时按钮，然后聚焦于样品。使用 自动缩放按钮 在软件中查看图像左侧，以评估各通道信号是否达到充分饱和。用户应调整每个序列中的增益值和激光强度，直至自动缩放不达到最大值（16位数据为65535），但所有通道的信号均接近饱和。
注意：由于不同的荧光染料在亮度上可能存在差异，且不同抗体靶标的丰度也各不相同，当同一激光激发多种荧光染料时（此情况下激光强度不可调整，否则会同时影响两种荧光），需要相应调整检测器的灵敏度——对于强荧光信号应使用低灵敏度，而对于弱荧光信号则应使用高灵敏度。为获得最佳结果，实验中各通道的荧光信号应尽量平衡，使每个通道的信号强度大致相当，这有助于减少光谱渗漏至其他通道的现象，并增强信号强度。由于不同样本中目标标记物的表达丰度可能存在差异，建议在多种实验条件下测试显微镜设置，以确认在任何实验条件下均未发生荧光淬灭。 - 显微镜参数设定完成后，将单色对照玻片载入显微镜，为每种荧光染料寻找具有代表性的染色区域。通过将焦平面调至样本下方并点击 开始 z 轴堆叠菜单中的按钮，然后将焦距调至样本上方并点击 结束 按钮
- 选择步骤数量及各步骤间的距离（并使用与完全染色切片成像时相同的步骤数量以及像素密度和位深度等参数），然后按下 开始按钮.
注意：理想情况下，这些图像应包含载玻片上真实染色所能找到的最亮信号。 - 在完成单色对照的成像后，继续使用相同的显微镜设置对所有完全染色的样品进行成像。
3. 荧光补偿
- 在软件1中打开.lif文件并点击 流程标签页.
- 选择 染料分离模块 然后选择 自动染料分离 选项。选择 手动方法 用于染料分离并选择 无需重新缩放.
- 打开其中一个单色对照图像。通过观察每个通道的灰度窗口，手动检查单色对照中是否存在从一个通道到下一个通道的光谱渗漏现象，以确认非目标通道中是否出现信号。使用 自动缩放 如有需要，可点击按钮以查看微弱的透射信号。
- 通过在屏幕上的矩阵中手动输入数值（通常为 0-1，其中 0 表示无串色，1 表示 100% 串色），然后按下 应用 测试串色是否已被充分去除。应重复此步骤，直至除目标通道外所有其他通道的信号均降低至背景水平。
注意：过度补偿将导致结果不准确，因此必须将荧光降低至背景水平，但不能低于背景水平。过度补偿的数据会表现为一个通道具有信号，而其他通道在目标信号位置出现黑洞状的空白区域。图2). - 完成一个单色对照后，将数值记录在矩阵中，然后 重置 基质，并移至下一个单色对照。对每个单色对照重复此过程。
注意：第一种染料位于“染料1”行中，需要从染料1中去除的荧光量将显示在相邻的列中。 - 将从每个对照中获得的所有数值汇总到一个矩阵中 应用 将该矩阵应用于完全染色的样本。如果分离效果准确，则将此设置应用于实验中的所有图像；否则，重新评估单色对照。
注意：有效的补偿应尽可能消除各通道间的串色，总结及图示如下所示 图3. - 将所有补偿后的文件保存为一个独立的 .lif 文件。
4. 使用 ilastik 鉴定细胞核和细胞
- 在 FIJI 中打开已补偿的 .lif 文件20。启用超堆栈中的堆栈视图，并选择一幅图像。
- （可选）使用矩形工具等选择工具，框选需要分析的图像区域，并排除不需要分析的区域。通过点击 图像 > 裁剪功能 对图像进行裁剪。
注意：减小图像尺寸有助于在后续步骤中降低随机存取存储器（RAM）的占用，并提高处理速度。 - 将图像另存为 .tif 文件。同时，通过点击 插件 > ilastik > 导出 hdf5，使用 FIJI 的 ilastik 插件将图像保存为 hdf5 文件。将文件保存为 "自定义名称".h5，压缩级别设为 0。
- 打开 Ilastik21，创建一个像素分类项目。进入“添加新输入数据”界面，使用 添加新 > 添加独立图像 功能，至少添加 3 幅具有代表性的图像。
- 右键单击其中一幅图像，选择 编辑属性，并将 显示模式 更改为灰度模式。
- 在屏幕左侧，选择 特征选择 选项卡。点击 选择特征，选中程序允许使用的最高 sigma 值以下的所有特征，然后点击 确定。
- 接着选择 训练选项卡。在选中 标签一 的情况下，使用画笔工具突出显示感兴趣的目标细胞（图 4），确保高亮区域包含细胞内部（细胞质和细胞核）以及细胞膜。
- 在所有训练样本中重复此操作，确保选中所有感兴趣的细胞类型，并从每个样本中选择具有不同强度、形态和组织定位的多个细胞。
注意：根据所选染色标记的不同，目标细胞可能存在或不存在胞内染色或细胞膜染色。无论是否使用了胞内染色，均应确保高亮区域包含目标细胞最外侧的染色信号，并覆盖细胞内部区域。 - 接下来，使用 标签二 高亮所有非目标细胞的区域（图 4）。这些区域可包括空白区域、未标记的细胞核或不表达目标标记物的组织。务必包含紧邻目标细胞的周围空间，以帮助模型更精确地学习细胞边界。
- 使用 实时更新 功能评估训练结果在目标图像上的表现。若训练效果不理想，请继续执行步骤 4.7 至 4.9 进行补充训练；若结果满意，则点击 预测导出 选项卡。
- 将数据源设置为 概率值。点击 选择导出图像设置 按钮，然后将 c 参数设置为导出 0–1 范围的数值（假设标签 1 对应感兴趣的目标参数）。
- 将数据类型转换为 16 位整型，并以 hdf5 格式导出至指定目录，文件名自定义（建议使用 {nickname} mask.h5），然后点击 确定。
- 点击 批量处理 选项卡。按下 选择原始数据文件 按钮，选中所有需要处理的 .h5 文件，然后点击 打开。点击 处理所有文件。
- 重复执行步骤 4.4 至 4.13，但此次目标改为识别细胞核并排除其他所有内容（图 4）。将此结果作为独立的预测文件导出，用于识别细胞核。
- 打开 Ilastik，创建一个新的数据转换项目。使用 添加新 > 添加独立图像 功能，在“输入数据”选项卡中添加一个具有代表性的 hdf5 文件。
- 点击 数据导出 选项卡，点击 选择导出图像设置 按钮，将数据源设置为 输入。将格式更改为多页 TIFF，使用选择功能指定保存路径，并将文件名设置为 {nickname}。点击 确定。
- 点击 批量处理 选项卡，使用 选择输入数据文件 按钮选中所有 hdf5 文件，然后点击 处理所有文件 按钮。
- 打开软件 2（参见 材料表），使用 添加文件 按钮导入在步骤 4.3 和 4.17 中生成的所有 tif/tiff 文件。选择输出文件的保存位置，点击 全部开始 按钮，将所有文件转换为 .ims 格式。这些文件现已准备好用于软件 3 中的分析（参见 材料表）。
5. 软件3中的分析
- 打开包含所有荧光染色图像的其中一个文件。选择 编辑-> 添加通道，并添加对应于细胞核和细胞体掩膜的 .ims 文件。对所有样本重复此操作。
- 点击 新建细胞 按钮。选择 检测细胞核和细胞 选项，然后继续。
- 选择 细胞核掩膜 作为检测细胞核的源通道，并选择 通过种子点分割细胞核的高级选项。输入细胞核直径值，然后继续。
注意：最佳细胞核直径值需通过运行模拟并手动评估来确定——若程序分割不足（多个细胞核被合并为一个），或过度分割（单个细胞核被分为多个），均需调整该参数。 - 设置质量评估值，然后继续。通常建议保留所有细胞核，因为遗漏细胞核可能导致多个细胞融合为一个。
- 设置用于生成细胞核表面的阈值，然后继续。确保即使较暗的细胞核也被包含在阈值范围内。阈值不宜过低，否则可能高估细胞核大小，或将碎片误判为细胞核染色。
- 设置每个细胞核的最小体素数量值，然后继续。通常建议保留所有对象，除非可通过此参数排除碎片或其他非细胞核结构。
- 选择 细胞边界与细胞质 选项，选择 细胞掩膜 作为检测细胞体的源通道，然后继续。
- 设置合适的细胞阈值，以准确捕获所有目标细胞，但不应过低以致包含背景信号或非特异性检测信号。选择分割相邻细胞的选项，确保 每个细胞仅含一个细胞核，并通过 细胞核间距 进行分离。同时选择 基于细胞核扩展细胞 选项，然后继续。
- 设置每个细胞的最小体素数量值，然后继续。通常建议保留所有对象，除非可通过此参数排除碎片或其他非细胞结构。
- 通过检查是否存在多个细胞被融合或细胞缺失的情况，评估所生成的细胞表面是否准确。若表面生成效果不理想，请返回第 5.2 步，尝试新的参数设置，直至确定最优条件。
- 确定最佳参数后，在左侧菜单中点击 已创建的细胞对象，点击 创建选项卡，然后点击 保存批处理参数 按钮，以保存当前设置。
- 打开多个 Software 3 窗口，并在每个窗口中加载不同的图像。在每个窗口中点击新的 细胞 按钮，在 常用创建参数 菜单中选择已保存的设置，并让每个窗口运行至完成。根据需要重复此过程，直至所有样本均被分析完毕。
注意：同时运行多个 Software 3 实例可加快分析速度，但可并行运行的窗口数量取决于执行分析的计算机中央处理器（CPU）处理速度及可用内存（RAM）容量。 - 所有样本分析完成后，在每幅图像的左侧菜单中点击 已创建的细胞对象，进入 统计选项卡。点击 配置可见统计值列表 按钮，除“细胞强度均值”外取消选择所有统计项，然后点击 确定。
- 对于每幅需要分析的图像，点击统计选项卡中的 将所有统计数据导出到文件 按钮，并将文件保存至指定位置。
6. 组织流式细胞术分析及细胞群在组织切片上的定位作图
- 在 Anaconda 中打开 Anaconda 和 JupyterLab。接着，打开 补充代码文件 1 中提供的脚本。通过 运行 菜单选择 运行所有单元格 来执行代码，或按顺序逐个选择并运行各个单元格，即选择 运行所选单元格。
- 当系统提示输入源文件时，输入在步骤 5.14 中导出的荧光值文件所在的目录路径。可通过查看其中一个导出的 .csv 文件的属性，复制其文件路径并粘贴到提示框中获得该路径。
- 接下来，程序将要求指定处理后文件的输出位置。请输入一个适合保存处理后文件的目录路径。程序将自动检测该文件夹中包含的荧光通道数量。
- 运行代码的下一部分，以使用各通道名称对数据进行注释。可根据需要修改代码，将 "numberOfChannels" 参数设置为与步骤 6.3 中检测到的通道数一致。此外，可通过重复 'ChX':'Marker' 行并修改标记名称，根据需要为任意数量的通道自定义名称。
- 运行下一行代码将在指定位置生成一个已注释的 .csv 文件，其中包含数据集中所有荧光参数。对每一份 Software 3 导出的数据集重复执行步骤 6.1–6.5，以生成所有数据对应的 .csv 文件。
- 通过打开 Software 4（参见 材料表）并将 .csv 文件拖入程序窗口，将其转换为 .fcs 文件。Software 4 将自动开始将这些文件转换为 .fcs 格式。
- 在 Software 4 中双击其中一个 样本，以打开该样本的窗口。使用 Software 4 中的设门工具建立设门策略。建议首先根据一个包含所有目标细胞的谱系定义标记进行设门，然后依次对稀有亚群进行排除性设门，最后分析更丰富的细胞类型。
- 建立设门策略后，通过在菜单中右键单击该 群体 并选择 导出 来检验设门的准确性。将所有参数导出为包含表头的 .csv 文件。
- 在 Anaconda 中打开 JupyterLab，然后打开 补充代码文件 2 中提供的脚本并运行代码。当提示输入 Software 4 文件的位置时，请输入上一步生成的导出 .csv 文件的目录路径。可通过查看该导出 .csv 文件的属性，复制其文件路径并粘贴到提示框中获得该路径。
- 当提示输入输出位置时，选择任意目标目录路径，并确保路径末尾包含文件名（例如“文件目录”\filename.txt）。运行代码其余部分。
- 复制 .txt 文件中的文本内容，并在 Software 3 中打开与导出数据所基于的相同样本对应的 .ims 文件。点击文件中的 细胞对象，切换到 统计标签页，将文本粘贴至搜索栏并开始搜索。所有目标细胞将被高亮显示。
- 手动检查设门策略是否成功捕获了所有目标细胞。如果细胞数量被低估或高估（示例见 图 5），返回步骤 6.7，调整设门范围，并重新评估新设门是否能准确捕获目标细胞。对设门策略中的所有门重复此过程，并在多个样本上验证设门效果。
- 当所有设门均经过验证后，使用 Software 4 的 表格编辑器 功能导出数据，并采用首选的分析方法进行数据分析。
注意：可通过在 Software 3 中按照步骤 6.8–6.11 的方法识别已设门的细胞群体，并基于所选细胞创建表面，从而将细胞群体映射回组织切片上。此操作可针对每个已设门的细胞群体进行，如 图 6 和 图 7 所示。
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结果
图1：组织流式细胞术工作流程。 组织切片使用光谱重叠的染料进行染色（步骤1）。通过将单个激发激光与可调带通滤光片配对，采集各通道图像，以最大程度减少荧光染料之间的光谱渗漏（步骤2）。根据单色染色组织对照样本生成的补偿矩阵，对通道间的光谱渗漏进行校正（步骤3）。随后使用 ilastik 软件识别图像中的细胞核和细胞（步骤4），并在 Software 3 中将细胞分割为单个细胞（步骤5）。在将所有数据从 Software 3 导出至 Software 4 以进行流式细胞术分析之前，可整合其他参数。随后将细胞身份信息从 Software 4 导出，并映射回原始组织中的细胞编号，以解析组织切片中细胞的空间定位（步骤6）。美元符号代表需要购买的商业软件，计算机符号代表免费软件。每个步骤的大概耗时显示在沙漏...
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讨论
本文描述了组织流式细胞术（histoflow cytometry）的应用，该技术此前已被验证18。研究表明，在使用光谱重叠染料对组织切片进行染色时，可通过光谱补偿消除通道间的信号溢出，从而实现比传统方法更多数量的荧光参数的清晰分辨。由于高参数组织学图像难以通过传统方法进行分析，本文提供了一种分析流程，用于从这些图像中分割出单个细胞。通过导出这些单个细胞的荧光特征，证明了类似于流式细胞术中的单细胞分析同样可应用于组织学图像。与流式细胞术缺乏空间分析能力不同，本文证明组织流式细胞术可将通过设门策略鉴定出的细胞群映射回组织切片，以评估其空间定位。总体而言，本文证明了组织流式细胞术结合了流式细胞术与组织学各自的优势。
尽管组织流式细胞术具有保留空间信息的优点，但它也存在许多与传统组织学相同的局限性。流式细胞术擅长对整个组织中的细胞进行定量，而组织学通常仅通过分析少量被认为具有代表性的组织切片来进行。为了准确量化组织中的细胞数量，需要对从组织中获取的每一张切片都进行成像，并分别计数其中的细胞数量，这在实际操作中是不现实的。另一个问题是，在组织切...
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披露
作者无经济利益冲突。
致谢
感谢霍奇基斯脑研究所高级显微镜平台提供的成像设施与专业技术支持。Rajiv W. Jain（RWJ）获得了卡尔加里大学“Eyes High”博士后项目以及加拿大多发性硬化症协会与罗氏加拿大公司联合资助的无限制性教育博士后奖学金的支持。V. Wee Yong（VWY）获得了加拿大研究主席一级计划的薪金资助。本研究得到了加拿大卫生研究院基金（资助号：1049959）、加拿大多发性硬化症协会基金（资助号：3236）以及美国国防部国会指定多发性硬化症研究计划的运营资金支持。图1 使用 BioRender.com 制作。本出版物中改编的图示最初发表于《免疫学杂志》（The Journal of Immunology）。Rajiv W. Jain、David A. Elliott 和 V. Wee Yong，2023年。利用组织流式细胞术对高参数组织学图像进行单细胞分析。《免疫学杂志》（J. Immunol）。210: 2038–2049。版权所有 © [2023]。美国免疫学家协会（The American Association of Immunologists, Inc）。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 100% 乙醇 | Sigma | 676829-1L | |
| 4% 多聚甲醛（PFA） | Electron Microscopy Sciences | 157-4 | |
| Anaconda | N/A | N/A | https://www.anaconda.com/download |
| 牛血清白蛋白 | Sigma | A4503-50G | |
| 冷鱼染色明胶 | Sigma | G7765 | |
| 从 Imaris.ipynb 脚本中整合多通道数据 | N/A | N/A | https://github.com/elliottcalgary/Histoflow-Cytometry-Analysis- |
| 将 FlowJo 输出结果转换为用于 Imaris 细胞筛选的 txt 文件的 ipynb 脚本 | N/A | N/A | https://github.com/elliottcalgary/Histoflow-Cytometry-Analysis- |
| 驴抗大鼠 Alexa Fluor 647 | JacksonImmunoResearch | 712-605-153 | 1:300 浓度 |
| 驴抗大鼠 DyLight 405 | Jackson ImmunoResearch | 712-475-153 | 1:200 浓度 |
| 驴血清 | JacksonImmunoResearch | 017-000-001 | |
| F(ab')2-山羊抗小鼠 IgG PerCP-eFluor 710 | Thermofisher | 46-4010-82 | 1:25 浓度 |
| FIJI | N/A | N/A | https://imagej.net/software/fiji/ |
| FlowJo | FlowJo LLC | 软件 4 | |
| 荧光光谱查看器 | https://www.thermofisher.com/order/fluorescence-spectraviewer/#!/ | ||
| Fluoromount-G | Southern Biotech | 0100-01 | |
| 新鲜冷冻人扁桃体切片 | amsbio | HF-707 | |
| 玻璃盖玻片 | VWR | 48393 106 | |
| 山羊抗人 IgA Alexa Fluor 488 | JacksonImmunoResearch | 109-546-011 | 1:400 浓度 |
| 山羊抗人 IgG Cy3 | JacksonImmunoResearch | 709-166-098 | 1:400 浓度 |
| 山羊抗人 IgM Dylight 405 | JacksonImmunoResearch | 109-476-129 | 1:300 浓度 |
| 山羊抗兔 A546 | Thermo Fisher Scientific | A-11035 | 1:250 浓度 |
| 山羊抗兔 IgG PE-Alexa Fluor 610 | Thermofisher | A-20981 | 1:250 浓度 |
| 马血清 | Sigma | H1138 | |
| Ilastik | N/A | N/A | https://www.ilastik.org/ |
| Ilastik FIJI 插件 | N/A | N/A | https://www.ilastik.org/documentation/fiji_export/plugin |
| Imaris 文件转换器 | Oxford Instruments | 软件 2 | |
| 带细胞模块的 Imaris | Oxford Instruments | 软件 3 | |
| kimwipe | Kimtech | 34155 | |
| LasX 生命科学软件 | Leica | 软件 1 | |
| 小鼠抗人 CD20 | VWR | CA95024-322 | 1:40 浓度 |
| 小鼠抗人 CD38 APC-R700 | BD Biosciences | 564980 | 1:20 浓度 |
| 正常山羊血清 | JacksonImmunoResearch | 005-000-001 | |
| 正常小鼠血清 | JacksonImmunoResearch | 015-000-001 | |
| 正常兔血清 | JacksonImmunoResearch | 011-000-001 | |
| 正常大鼠血清 | JacksonImmunoResearch | 012-000-120 | |
| 核黄染料（Nuclear Yellow） | Abcam | ab138903 | 用 DMSO 溶解至 2 mg/ml 浓度，并避光保存于 4°C |
| PAP 笔 | Cedarlane | MU22 | |
| PBS | Gibco | 10010-023 | |
| 兔抗人 Ki67 | Abcam | ab15580 | 1:500 浓度 |
| 兔抗小鼠 Iba1 | Wako | 019-19741 | 1:500 浓度 |
| 大鼠抗人 Blimp1 | Thermofisher | 14-5963-82 | 1:40 浓度 |
| 大鼠抗小鼠 B220 Alexa Fluor 647 | BioLegend | 103226 | 1:250 浓度 |
| 大鼠抗小鼠 CD138 | Biolegend | 142502 | 1:200 浓度 |
| 大鼠抗小鼠 CD3 PE-eFluor 610 | Thermo Fisher Scientific | 61-0032-82 | 1:40 浓度 |
| 大鼠抗小鼠 CD4 Alexa Fluor 488 | BioLegend | 100529 | 1:200 浓度 |
| 大鼠抗小鼠 CD45 别藻红蛋白-R700 | BD Biosciences | 565478 | 1:50 浓度 |
| 大鼠抗小鼠 IgD PerCP-eFluor 710 | Thermo Fisher Scientific | 46-5993-82 | 1:50 浓度 |
| SP8 共聚焦显微镜 | Leica | ||
| 吐温 X-100（Triton X-100） | Sigma | X100-500ml | |
| Trueblack | Biotium | 23007 | |
| 吐温-20（Tween-20） | Sigma | P7949-500ml | |
| Ultracomp ebeads | Thermofisher | 01-2222-42 |
参考文献
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