一种从成年小鼠中分离和培养视网膜色素上皮细胞的简化方法

视网膜色素上皮 （RPE） 是位于 Bruch 膜上的一种特殊细胞单层，位于光感受器和脉络膜¹ 之间。RPE 细胞在视网膜的正常功能中起着关键作用。RPE 细胞将葡萄糖和维生素 A 运输到光感受器，通过将全反式视网膜再异构化为 11-顺式视网膜来促进视力，并通过吞噬脱落的外段来维持光感受器的外段，从视网膜下空间去除水分，通过紧密连接的存在形成外血视网膜屏障并分泌嗜神经性生长因子（如色素上皮衍生因子、 和碱性成纤维细胞生长因子）支持光感受器²。RPE 细胞功能障碍参与各种视网膜病变的发病机制，包括年龄相关性黄斑变性、色素性视网膜炎和糖尿病性视网膜病变 ^3,4,5。使用 RPE 细胞的体外研究对于提高我们对这些疾病发病机制的理解至关重要。原代 RPE 细胞是这些研究的首选，因为 RPE 细胞系虽然很容易获得，但缺乏原代 RPE 细胞的关键特征。

虽然各种物种已被用作原代 RPE 细胞的来源，但小鼠具有使用基因修饰来帮助了解视网膜病变发病机制的优势。先前描述的从啮齿动物中分离 RPE 细胞的方案要么需要使用新生动物，要么冗长，需要技术技能，要么不适合培养 6,7,8,9,10,11,12。我们描述了一种从成年小鼠中分离 RPE 细胞的简单快速方法，可产生这些细胞的高纯度培养物。

本研究中动物受试者的使用得到了凯斯西储大学机构动物护理和使用委员会 （IACUC） 的批准。

1. 试剂制备

1. 通过补充 Hank 平衡盐溶液 （HBSS）、无钙、无镁、无酚红和 10 mM HEPES 缓冲溶液来制备洗涤缓冲液。将溶液保持在 4 °C 直至使用。
2. 通过在 Dulbecco 改良 Eagle 培养基中补充 4.5 g/L 葡萄糖、1.25x GlutaMAX 补充剂（储备液浓度 100 倍或 200 mM;终浓度为 2.5 mM L-谷氨酰胺）、10% 胎牛血清、1% 青霉素/链霉素和 1x MEM 非必需氨基酸溶液 （100x） 来制备 RPE 培养基。使用前，在水浴中将培养基预热至 37 °C。

2. 小鼠眼睛摘除

1. 使用 IACUC 批准的安乐死方法对小鼠实施安乐死，最好在 3 至 14 周龄之间（在麻醉下使用氯胺酮/甲苯噻嗪混合物以每 20 克小鼠 0.1 mL [87.5 mg/kg 氯胺酮和 12.5 mg/kg 甲苯噻嗪] 是本研究中使用的方法）。
   注意:随着时间的推移，从年轻小鼠收集的眼睛将有助于增加视网膜色素上皮细胞的产量，并延长连续传代的能力。
2. 将鼠标平放在一侧，眼睛朝上。
3. 将食指和拇指分别放在眼睛的上方和下方。轻轻按压眼睛周围的骨骼结构，以诱导眼球突出。
4. 将略微张开的剪刀的尖端插入眼睛下方，轻轻地将手腕从眼睛向外旋转 90°，直到眼睛从眼窝上脱落。
   注意: 不要用剪刀剪伤眼睛或视神经，因为这会使眼罩的解剖更加困难。
5. 立即将眼睛放入 70% 乙醇中并转动不超过 5 秒，然后将其转移到保存在冰上的洗涤缓冲液培养基中。
6. 在解剖显微镜下，一次将一只眼睛转移到装有洗涤缓冲液和浸泡纱布条的培养皿中。
7. 用镊子握住视神经来稳定眼睛。使用 3.00 毫米 45° 手术刀或 0.009 英寸剃须刀片在锯齿孔水平轻轻切开。
8. 使用 Vannas 剪刀，轻轻地将剪刀插入切口，并在锯齿孔的圆周周围剪断，直到可以去除和丢弃前段和玻璃体。
9. 使用系留镊子轻轻地从眼罩上剥离视网膜，小心不要干扰 RPE 层。
   注意:为了使视网膜更容易去除，请在移液管中加入洗涤缓冲液，然后小心地将其涂抹在眼罩的边缘，以轻轻提起视网膜。
10. 最后，用剪刀从眼罩上去除视神经和多余的结缔组织。小心不要刺穿眼罩。

3. 原发性 RPE 的分离

1. 将眼罩转移到含有 1 mL 0.25% 胰蛋白酶 + 0.02% EDTA 的 1.5 mL 微量离心管中。
   注意:可以将两个眼罩添加到一份胰蛋白酶-EDTA 中，以提高可培养 RPE 的产量。
2. 将微量离心管转移到设定为 37 °C 的水浴中并孵育 10 分钟。每 2 分钟，从水浴中取出试管，然后将试管底部用力敲击台面 40 次。
3. 10 分钟后，使用 P1000 或 2 mL 血清移液管上下移液不超过 3 次，轻轻地机械地破坏眼罩。
   注意:RPE 片材的碎裂是必不可少的，因为大片材无法正确粘附。
4. 通过将分离的 RPE 片而不是眼罩分层到 15 mL 锥形管中的 0.5 mL 胎牛血清 （FBS） 上，立即中和胰蛋白酶。
5. 此外，通过将 3 mL RPE 培养基滴加到 FBS 和 RPE 片层上来稀释胰蛋白酶。
6. 将 RPE 以 340 x g 离心 3 分钟。
7. 弃去上清液，将细胞重悬于适量的 RPE 培养基中，用于 24 孔板 （1.9 cm²/孔） 或 48 孔板 （0.75 cm²/孔）。
   注:RPE 可以接种到涂有细胞外基质蛋白（特别是层粘连蛋白、IV 型胶原或纤连蛋白）的孔板上，以提高粘附性¹¹。RPE 也可以重悬于 1 mL RPE 培养基中，并分层到 40% 密度分离梯度上，以进一步分离纯 RPE 细胞。此外，以 340 x g 旋转板 3-5 分钟可能会增加细胞粘附¹³。
8. 在 37 °C 下，5% CO₂ 孵育。

4. 培养 RPE

1. 至少 3 天内不要破坏分离的 RPE。72 小时后，轻轻去除旧培养基，并用新鲜的预热培养基替换。
2. 前 3 天后每 48 小时更换一次培养基。
3. 一旦细胞达到汇合，使用 0.25% 胰蛋白酶 + 0.02% EDTA 传代细胞，并将 RPE 培养基中的 FBS 降低至 2%。
   注意:先前报道原发性 RPE 在 5-7 代后开始去分化，并将开始失去其六边形和色素沉着¹⁴。

所述方案已用于 C57BL/6 背景小鼠。性别似乎并没有改变培养 RPE 的能力。与老年小鼠相比，6 周以下的小鼠产生的 RPE 片有限，可能需要更多的眼睛才能达到最佳汇合。分离后，RPE 细胞大约需要 3 天才能稳定并附着在细胞培养板上。分离后约 24 小时，看起来无核的圆形色素沉着细胞已经开始沉降，但尚未完全粘附在板上（图 1A）。在接下来的 48-72 小时内，细胞开始附着和扩散，同时保持其深色色素沉着和透明细胞核（图 1B、C）。5 天后，RPE 的汇合度增加，并开始形成细胞间接触，让人想起具有六边形的极化单层（图 1D）。

培养 6 天后，评估分离的 RPE 的纯度和紧密连接完整性。首先评估 RPE 是否存在类视黄醇异构水解酶或视网膜色素上皮 65 kDA 蛋白 （RPE65），RPE 是 RPE 的特异性标志物（图 2，绿色）。此外，为了使 RPE 形成单层着色和六边形细胞，细胞间连接必须保持完整。紧密连接蛋白-1 或闭合小带-1 （ZO-1） 是支架蛋白，对于维持单个 RPE 细胞之间的紧密连接和完整性至关重要14。汇合分离的 RPE 培养物保持其细胞间连接蛋白，细胞外围发现的 ZO-1 染色证明了这一点（图 2，红色）。一旦这些细胞以大片形式汇合，它们就会在长达 2 周内保持细胞间接触而不会过度生长。先前的研究表明，ZO-1 在培养物中高度表达长达 9 天15。原发性 RPE 培养物中使用的其他标志物包括胶原蛋白 IV、CRALBP 和 OTX211。

图 1.在标准聚苯乙烯 24 孔板上培养的小鼠原代 RPE 的形态。（A） 从 C57BL/6 小鼠的双眼中分离出原代 RPE，分离后直接在未包被的组织培养聚苯乙烯 24 孔板的单孔中培养。（B，C）48 小时和 72 小时后，原代 RPE 开始粘附在板上并形成着色的双核细胞。（D） 5 天后，明场显微镜显示色素沉着过度的六边形细胞增加汇合并开始形成细胞间接触。比例尺:100 μm。请单击此处查看此图的较大版本。

图 2.RPE 特异性标志物 RPE-65 和细胞间连接标志物 ZO-1 在离体的原代小鼠 RPE 中是保守的。 将 3 只 C57BL/6 小鼠的原代 RPE 培养 6 天，然后用 4% 多聚甲醛固定。用 0.1% Triton-X 的 PBS 溶液透化细胞 5 分钟，用 5% 正常山羊血清封闭，并与抗 RPE-65（绿色）或 ZO-1（红色）的抗体一起孵育。比例尺:50 μm。 请点击此处查看此图的较大版本。

图 3.视网膜色素上皮分离方案的简化示意图。 从小鼠中取出眼球后，在移至洗涤缓冲液之前，将其短暂浸入 70% 乙醇中对眼睛进行消毒。在洗涤缓冲液中，沿锯齿叶裂片切开并去除眼前段。取下视网膜，将眼罩放入装有胰蛋白酶/EDTA 的试管中。每 2 分钟轻轻敲击一次计数器上的试管，总共 10 分钟，将上清液转移到 15 mL 锥形管中，然后离心 RPE 沉淀。将细胞和板重悬于 24 孔板或 48 孔板上。使用 BioRender 生成的图形。 请单击此处查看此图的较大版本。

没有相关的财务或非财务披露。