一种简化的小鼠成年视网膜色素上皮细胞分离与培养方法

摘要

视网膜色素上皮（RPE）在脉络膜和视网膜之间起着至关重要的屏障作用，有助于维持视网膜细胞类型（如光感受器细胞）的健康与功能。本文中，我们描述了一种简单且有效的成年小鼠RPE分离与培养方案。

摘要

视网膜色素上皮细胞（RPE）对视网膜的正常功能至关重要。RPE功能障碍参与多种重要视网膜疾病的发生发展，例如年龄相关性黄斑变性、视网膜色素变性以及糖尿病视网膜病变。本文介绍一种从小鼠成年眼球中分离RPE的简化方法。与以往报道的方法相比，该方法能够从成年小鼠中分离并培养出高纯度的RPE细胞。该方法操作简便、快速，无需复杂的操作技术，仅需常规的科研工具和试剂即可完成。取3至14周龄、C57BL/6背景的小鼠，通过眼球摘除并去除前节段后，采用胰蛋白酶消化和离心的方法，将RPE从眼球杯状结构中解离并分离出来。总之，该方法为研究视网膜功能与疾病中RPE的应用提供了一种快速且有效的实验方案。

引言

视网膜色素上皮（RPE）是一种特化的单层细胞，位于光感受器与脉络膜之间的布鲁赫膜（Bruch's membrane）内侧¹。RPE细胞在视网膜正常功能中发挥关键作用。RPE细胞向光感受器转运葡萄糖和维生素A，通过将全反式视黄醛重新异构化为11-顺式视黄醛来促进视觉功能，并通过吞噬脱落的外节段维持光感受器外节的结构完整性，同时清除视网膜下腔的水分，通过紧密连接形成外层血-视网膜屏障，并分泌支持光感受器的神经营养生长因子（如色素上皮衍生因子和碱性成纤维细胞生长因子）²。RPE细胞功能障碍参与多种视网膜病变的发病机制，包括年龄相关性黄斑变性、视网膜色素变性以及糖尿病视网膜病变^3,4,5。利用RPE细胞进行的体外研究对于深入理解这些疾病的发病机制至关重要。在这些研究中，首选原代RPE细胞，因为尽管RPE细胞系易于获得，但缺乏原代RPE细胞的关键特性。

尽管已有多种物种被用作原代视网膜色素上皮（RPE）细胞的来源，小鼠的优势在于可通过遗传修饰来帮助理解视网膜病变的发病机制。以往报道的从啮齿类动物中分离RPE细胞的方案，或需使用新生动物，或耗时较长，或对操作技术要求较高，或不适合细胞培养^{6,7,8,9,10,11,12}。本文介绍一种简单、快速的方法，用于从成年小鼠中分离RPE细胞，可获得高纯度的细胞培养物。

方案

本研究中动物实验的使用已获得凯斯西储大学机构动物护理和使用委员会（IACUC）的批准。

1. 试剂准备

1. 通过在无钙、无镁、无酚红的Hank's平衡盐溶液（HBSS）中添加10 mM HEPES缓冲液来制备洗涤缓冲液。使用前将溶液置于4 °C保存。
2. 通过在Dulbecco改良Eagle培养基中添加4.5 g/L葡萄糖、1.25倍GlutaMAX补充剂（储存浓度为100倍或200 mM；L-谷氨酰胺终浓度为2.5 mM）、10%胎牛血清、1%青霉素/链霉素以及1倍MEM非必需氨基酸溶液（100倍）来制备RPE培养基。使用前，在水浴中将培养基预热至37 °C。

2. 小鼠眼球摘除

1. 采用IACUC批准的安乐死方法处死小鼠，小鼠年龄建议为3至14周龄（本研究采用的方法为：按每20克小鼠体重注射0.1 mL的氯胺酮/甲苯噻嗪混合物[氯胺酮87.5 mg/kg，甲苯噻嗪12.5 mg/kg]进行麻醉后行颈椎脱位）。
   注意：相较于成年小鼠，从较年轻小鼠获取的眼球可随时间推移获得更高的视网膜色素上皮细胞产量，并延长连续传代的能力。
2. 将小鼠侧卧放置，使眼球朝上。
3. 分别用食指和拇指置于眼球上方和下方，轻柔地对眼球周围骨结构施加压力，使眼球突出。
4. 将略微张开的剪刀尖端插入眼球下方，然后轻柔地将手腕向外旋转90°，直至眼球从眼窝中脱离。
   注意：切勿闭合剪刀以切断眼球或视神经，否则将增加后续眼杯解剖的难度。
5. 立即将眼球在70%乙醇中滚动不超过5秒，随后转移至置于冰上的洗涤缓冲液中。
6. 在解剖显微镜下，每次将一个眼球转移至盛有洗涤缓冲液和浸湿纱布条的培养皿中。
7. 用镊子夹住视神经以固定眼球，使用3.00 mm 45°外科刀或0.009"剃须刀片，在锯齿缘水平处轻轻做一切口。
8. 使用Vannas剪刀，将剪刀尖轻轻插入切口，沿锯齿缘周向剪开，直至前节和玻璃体可被完整移除并弃去。
9. 使用带线镊子轻柔地将视网膜从眼杯上剥离，注意避免扰动RPE层。
   注意：为便于去除视网膜，可用移液管吸取洗涤缓冲液，小心地将其滴加至眼杯边缘，以轻柔抬起视网膜。
10. 最后，使用剪刀移除眼杯上的视神经及多余结缔组织，注意避免刺破眼杯。

3. 原代RPE的分离

1. 将眼杯转移至含有1 mL 0.25%胰蛋白酶 + 0.02% EDTA的1.5 mL微量离心管中。
   注意：可将两个眼杯加入一份胰蛋白酶-EDTA溶液中，以提高可培养的视网膜色素上皮（RPE）细胞产量。
2. 将微量离心管置于37 °C水浴中孵育10分钟。每2分钟将管子从水浴中取出，并用力在实验台面上轻敲管底40次。
3. 10分钟后，使用P1000或2 mL血清移液管轻轻吹打，对眼杯进行机械性解离，吹打次数不超过3次。
   注意：RPE细胞片的破碎至关重要，因为较大的细胞片无法正常贴壁。
4. 立即通过将解离的RPE细胞片（而非眼杯）叠加至含有0.5 mL胎牛血清（FBS）的15 mL锥形管中，以中和胰蛋白酶活性。
5. 进一步通过逐滴加入3 mL RPE培养基至FBS与RPE细胞片的液层上，稀释胰蛋白酶。
6. 以340 × g 离心3分钟，收集RPE细胞。
7. 弃去上清液，并根据需要将细胞重悬于适量RPE培养基中，用于接种24孔板（1.9 cm²/孔）或48孔板（0.75 cm²/孔）。
   注意：为提高细胞贴壁率，可将RPE细胞接种于包被有细胞外基质蛋白（特别是层粘连蛋白、IV型胶原或纤连蛋白）的培养板中¹¹。此外，也可将细胞重悬于1 mL RPE培养基中，叠加至40%密度梯度分离液上，以进一步纯化RPE细胞。另外，将培养板以340 × g 离心3–5分钟，可能有助于提高细胞贴壁率¹³。
8. 在37 °C、5% CO₂条件下孵育。

4. 视网膜色素上皮细胞的培养

1. 至少在3天内不要扰动分离的RPE细胞。72小时后，轻轻移除旧培养基，并更换为新鲜的预温培养基。
2. 在最初3天之后，每48小时更换一次培养基。
3. 当细胞达到汇合状态时，使用0.25%胰蛋白酶 + 0.02% EDTA进行传代，并将RPE培养基中的FBS浓度降至2%。
   注意：已有文献报道，原代RPE细胞在传代5–7次后开始出现去分化现象，并逐渐失去其六边形形态和色素沉着¹⁴。

结果

本方案已在C57BL/6背景小鼠中应用。性别似乎不影响RPE的培养能力。与较年长的小鼠相比，6周龄以下小鼠获得的RPE细胞片较少，可能需要更多眼球样本才能达到理想的汇合度。分离后，RPE细胞大约需要3天时间稳定并贴附于细胞培养板上。分离后约24小时，可见圆形、有色素、看似无核的细胞已开始沉降，但尚未完全贴附于培养板（图1A）。在接下来的48至72小时内，细胞逐渐贴壁并铺展，同时保持其深色色素沉着和透明的细胞核（图1B、C）。培养5天后，RPE细胞汇合度增加，并开始形成细胞间连接，呈现出类似极化单层细胞的六边形形态（图1D）。

培养6天后，对分离的视网膜色素上皮细胞（RPE）进行纯度和紧密连接完整性的评估。首先检测RPE是否表达视黄醇异构水解酶或视网膜色素上皮65 kDa蛋白（RPE65），后者是RPE的特异性标志物（图2，绿色）。此外，RPE要形成一层具有色素且呈六边形的细胞单层，必须保持细胞间连接的完整性。紧密连接蛋白-1（tight junction protein-1）或称闭锁小带蛋白-1（zonula occludens-1, ZO-1）是维持单个RPE细胞间紧密连接结构与功能完整性的关键支架蛋白¹⁴。融合生长的分离RPE细胞培养物保留了细胞间连接蛋白，表现为ZO-1染色定位于细胞周边（图2，红色）。当这些细胞在大片区域达到融合状态后，可在长达2周内维持细胞间的接触而不发生过度生长。既往研究表明，ZO-1在体外培养中可高水平表达达9天之久¹⁵。在原代RPE细胞培养中还使用其他一些标志物，包括IV型胶原蛋白（Collagen IV）、细胞视黄酸结合蛋白（CRALBP）和OTX2¹¹。

图1．在标准聚苯乙烯24孔板上培养的小鼠原代视网膜色素上皮细胞的形态。（A）从小鼠C57BL/6的双眼分离原代视网膜色素上皮细胞，并在分离后直接接种于未包被的组织培养级聚苯乙烯24孔板中的单个孔内。（B、C）培养48小时和72小时后，原代视网膜色素上皮细胞开始贴壁，并形成有色素沉着的双核细胞。（D）培养5天后，明场显微镜显示色素加深、呈六边形的细胞逐渐融合，并开始形成细胞间连接。比例尺：100 µm。请点击此处查看该图的放大版本。

图2。在分离的小鼠原代RPE细胞中，视网膜色素上皮特异性标志物RPE-65和细胞间连接标志物ZO-1均得以保留。 来自三只C57BL/6小鼠的原代RPE细胞经培养6天后，使用4%多聚甲醛固定。细胞以含0.1% Triton-X的PBS溶液透化处理5分钟，用5%正常山羊血清封闭，随后分别与抗RPE-65抗体（绿色）或抗ZO-1抗体（红色）孵育。比例尺：50 µm。 请点击此处查看该图的放大版本。

图3。视网膜色素上皮细胞分离流程的简化示意图。 从小鼠体内取出眼球后，将眼球短暂浸入70%乙醇中进行表面消毒，然后转移至洗涤缓冲液中。在洗涤缓冲液中，沿锯齿缘剪开并移除眼前段。取出视网膜后，将眼杯放入含有胰蛋白酶/EDTA的离心管中。轻轻敲击管壁，每2分钟一次，共10分钟；将上清液转移至15 mL锥形离心管中，离心收集RPE细胞沉淀。重悬细胞后，接种于24孔或48孔板中。图片使用BioRender生成。 请点击此处查看该图的放大版本。

讨论

本文概述了一种简化的小鼠视网膜色素上皮细胞的分离与培养方案。从成年小鼠眼球中分离的RPE细胞表达了RPE特异性标志物RPE65以及细胞间连接标志物ZO-1。此外，培养的细胞在体外形成了具有色素沉着的六边形单层细胞片。

已有多种用于分离啮齿类动物RPE的方法被发表^{6,7,8,9,10,11,12}许多实验方案需要将视网膜色素上皮（RPE）层从布鲁赫膜上剥离，该操作技术要求高，且会增加RPE损伤或细胞死亡的风险^{6,7,9,11,12,16}因此，本方案采用酶法分离视网膜色素上皮（RPE）层，而非机械解离，以促进细胞存活并维持RPE单层在培养中的完整性。该方法获得的小鼠RPE在培养中保持典型的RPE形态，细胞呈高度色素化且为六边形，并保留紧密连接蛋白的表达。此外，本方案无需使用其他方案中常见的复杂试剂或材料，如可渗透膜插入物、额外的细胞外基质包被蛋白或专用组织解离试剂。相反，本方案仅采用简单的酶消化法，结合0.25%胰蛋白酶-EDTA处理与组织振荡，以将RPE层从布鲁赫膜（Bruch's membrane）上分离。该方案已成功应用于3-12周龄小鼠 至14周龄；然而，在年轻小鼠中可能需要更多眼球才能成功获得融合培养。

在执行本方案的过程中可能会遇到若干挑战。需要具备一定的技术技巧，以精确地在锯齿缘周围进行切割，并在不破坏RPE层的情况下小心地移除视网膜。在环形切割巩膜时可能会扰动视网膜，从而影响RPE的活性。该技术的优化只能通过反复、持续的练习来实现。此外，移除后RPE层可能仍附着在视网膜层上。为避免RPE过度丢失，可使用装有洗涤缓冲液的注射器或移液器轻轻抬起眼球杯边缘的视网膜，以促进视网膜脱离。透明质酸酶孵育也有助于脱离过程¹⁶。如果RPE未能从Bruch膜和脉络膜上正常脱离，可延长水浴中胰蛋白酶的孵育时间。此外，建议将新鲜胰蛋白酶分装后于-20 °C冷冻，并在使用前直接解冻，以保持其最佳酶活性。若分离后的RPE细胞未能成功贴附于培养板，可能是由于接种密度过低，或在分离过程中细胞受到损伤所致。此外，本方案在培养过程中无需包被细胞外基质（ECM）蛋白。然而，已有研究表明，如纤连蛋白、IV型胶原、层粘连蛋白或I型胶原等ECM蛋白可提高细胞贴附性，若贴附效果不佳，可考虑使用¹¹。

为提高RPE培养单层细胞的产量，应汇集至少2-3只年龄匹配且遗传背景相同的小鼠眼球；若接种密度过低，细胞可能随时间推移失去其六边形形态和色素。对于年龄超过8周的小鼠，每24孔板使用2只眼球即可达到最佳汇合度；若小鼠年龄小于8周，则使用3-4只眼球可获得更好的细胞贴壁和汇合效果。随着时间延长，细胞可能易于发生上皮-间质转化（EMT），表现为色素丧失并呈现拉长的形态。添加Rho激酶和TGFβR-1/ALK5抑制剂（如Y27632和Repsox）可有效防止培养RPE细胞发生EMT¹²。尽管分离操作流程简短，分离2-4只眼球仅需1小时，但原代培养可能需要7-10天才能达到完全汇合。此外，RPE细胞传代能力有限，每次后续传代均会增加EMT发生的风险。

视网膜色素上皮细胞是维持眼部稳态的关键细胞。RPE 具有吞噬细胞的功能，有助于感光细胞的维持，防止神经层受到光损伤，并作为紧密的上皮屏障以调控物质转运¹⁷。直接影响 RPE 的疾病，如年龄相关性黄斑变性、视网膜色素变性以及糖尿病视网膜病变，可能加剧炎症反应，增加细胞凋亡，并破坏细胞连接，从而提高视网膜退变和失明的风险¹⁷。原代 RPE 细胞的培养有助于研究影响 RPE 的眼病发病机制。总之，本实验方案在保持高纯度细胞培养的同时，缩短了细胞分离所需时间，并简化了所需的技术与试剂。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
0.009 RD 单刃刀片	Personna	941202
杜尔贝科改良伊格尔培养基（DMEM）	Corning	10-013-CV	含 4.5 g/L 葡萄糖、L-谷氨酰胺、丙酮酸钠
胎牛血清	Corning	35010CV
GlutaMAX（100 倍浓度）	Gibco	35050061
亨克氏平衡盐溶液	Gibco	14175095	不含钙、不含镁、不含酚红
HEPES 缓冲液（1 M）	Gibco	15630106
MEM 非必需氨基酸（100 倍浓度）	Gibco	11140050
微型切片刀（Micro-Unitome Knife）	BVI Beaver	377546
青霉素-链霉素溶液（100 倍浓度）	Corning	30-002-CI
聚苯乙烯微孔板	Falcon	08-772-1	24 孔或 48 孔
普通胎牛血清	Corning	35-010-CV
胰蛋白酶-EDTA（0.25%）	Gibco	25200056	含酚红
Vannas 剪刀	Fine Science Tools	10091-12