本文介绍了一种从不同根际土壤中快速、标准化建立协同多物种生物膜群落的方法。该方法是一种独特的实验方案，旨在研究并模拟复杂的根际土壤微生物群落。
需要JoVE订阅才能观看此内容。 请登录或开始免费试用
方法文章
从根际土壤构建多物种生物膜群落的方法 根际土壤，多物种生物膜，微生物群落，生物膜构建，土壤微生物学，微生物相互作用，体外模型，高通量筛选，微生物组工程，生物膜动态
本文内容
摘要
摘要
多物种生物膜是细菌在自然界中普遍存在且占主导地位的生活方式，包括根际土壤中的细菌，尽管目前对其了解仍然有限。本文提供了一种快速构建协同性多物种生物膜群落的方法。第一步是采用差速离心法从根际土壤中提取细胞。随后将这些土壤细胞接种至培养基中，以形成浮膜型生物膜。培养36小时后，利用16S rRNA基因扩增子测序方法分析生物膜及其下方溶液中的细菌组成。同时，采用极限稀释法对浮膜生物膜进行高通量细菌分离。然后，根据16S rRNA基因扩增子测序数据（浮膜生物膜样品）中丰度最高的前5个细菌分类群，用于构建多物种生物膜群落。通过24孔板快速建立这5个细菌分类群的所有组合，利用结晶紫染色法筛选出生物膜形成能力最强的组合，并通过qPCR进行定量。最终，通过上述方法获得了最稳定的合成细菌多物种生物膜群落。该方法为开展根际多物种生物膜研究提供了有益的指导，并有助于鉴定代表性群落，以深入探究这些物种间相互作用的规律。
引言
生物膜代表附着于表面或与界面相连的复杂微生物群落。人们普遍认为，在自然环境、临床环境和工业环境等各种环境中遇到的大多数细菌都是在生物膜群落中生存的1。在土壤中，根际——包括根表面及其邻近约2 mm厚的区域——构成了一个养分供应更为丰富的生态位。某些细菌已进化出利用这一生态位的策略，促进微生物增殖，并推动根际生物膜群落的形成2。
根际微生物被认为是植物的“第二基因组”3。植物促生微生物（PGPM）与植物建立互惠共生关系，具有显著的促生和生物防治功能4。一方面，PGPM 可以为植物根系提供养分，增强养分吸收，抵御病原菌侵染，并降解根际土壤中的污染物5；另一方面，PGPM 利用植物根系分泌物作为自身生长和进化的营养来源，从而通过其自身的代谢活动影响根际土壤和根系系统。值得注意的是，实现上述所有功能的前提是 PGPM 能够在植物根际有效定殖，并形成稳定的生物膜6。
根际生物膜影响根际微生物的组装过程，而根际微生物组装的时间和空间特征与多物种生物膜的相互作用密切相关7。根际生物膜作为植物-微生物组相互....
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
方案
该方案通常适用于多种植物的根际土壤微生物群。此处以黄瓜为例。本研究中所用试剂和设备的详细信息列于下文 材料表.
1. 细菌分离
- 根际土壤的分离
- 黄瓜培养
- 用75%乙醇和2%次氯酸钠（NaClO）溶液对黄瓜种子进行消毒，然后用无菌水冲洗11。
- 在无菌条件下使种子萌发，并选择达到两叶期的种子12。随后将生长一致的黄瓜幼苗移栽至装有2 kg黑土的花盆中。
注：使用来自中国东北地区不同地点的两种黑土，以减少系统误差。
- 土壤悬液的制备
- 按以下配方配制PBS-S缓冲液：6.33 g NaH2PO4·H2O、16.5 g Na2HPO4·7H2O、200 µL Silwet L-77，加蒸馏水至1 L。
- 当幼苗达到四叶期12时，将花盆倒置，使用无菌手套分离根系及其附着的2 mm厚根际土壤。
- 将根系放入50 m....
- 黄瓜培养
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
结果
按照上述步骤操作，可观察到黄瓜根际土壤微生物群落在成膜能力方面存在显著梯度差异（图1）。生物膜扩增子测序结果确认了菌膜中所含的物种（图2）。根据测序数据的热图分析，筛选出在菌膜中丰度高于剩余液体部分的前五种细菌物种（图3）。此处以一组典型的合成菌群为例，通过结晶紫染色和定量PCR，可直接可视化菌膜生物量以及各物种在群落中相对丰度的差异。共培养生物量的增加表明，成功地从根际土壤中构建了具有协同作用的多物种生物膜群落（图4 和 图5）。
结果表明，Bacillus velezensis SQR9、Acinetobacter baumannii XL-1 和 Burkholderia cenocepacia XL-2 能够形成显著的协同群落.......
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
讨论
根据该方案，基于不同植物根际土壤中的微生物群落，构建了一系列稳定的合成多物种生物膜群落。利用定量PCR技术，可清晰解析每个群落的组成。生物膜的生物量反映了其潜在代谢相互作用的强度，但本研究未能揭示合作背后的各种特性和机制19。鉴于天然微生物群落的规模和复杂性，合成群落（SynComs）为克服现有障碍提供了一个模型系统14。该方案重点介绍了从复杂的根际土壤微生物群落构建合成生物膜群落的系统性与基础性方法。
从最后一部分可以明显看出，SQR9、XL-1 和 XL-2 在实际根际环境中表现出强大的稳定定殖潜力。研究人员可基于这些菌株开展代谢关系及共定殖机制的研究。此后，针对黄瓜的微生物接种剂相关研究也得以顺利展开。
尽管存在上述优点，但不应忽视该方案的缺点。由于实验室培养条件与原位（in situ）环境之间存在差异，每个合成群落的结果可能无法准确反映真实根际土壤中的微生物群落20
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
披露
作者声明无利益冲突。
致谢
本研究受到国家自然科学基金（42307173 和 42107328）以及国家重点研发计划（2022YFD1500202 和 2022YFF1001800）的资助。P.W. 和 Z.X. 设计了研究方案。P.W.、B.X.、Z.C.、J.X. 和 N.Z. 分析了数据并制作了图表。P.W. 撰写了论文初稿。Z.X.、R.Z. 和 Q.S. 对论文进行了修改。
....访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 0.2 % Na4P2O7 溶液 | 国药集团化学试剂有限公司 | 20041418 | 用于稀释土壤悬浮液。 |
| 100 μm 尼龙细胞滤膜 | Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. | F613463-0001 | 用于过滤培养液并分离浮膜生物膜。 |
| 2% NaClO 溶液 | 国药集团化学试剂有限公司 | L03336903 | 用于种子的灭菌。 |
| 24孔板 | 默克 & Co., Inc. | PSRP010 | 用于微生物培养及浮膜型生物膜的分离。 |
| 3-(N-吗啉代)丙磺酸（MOPS） | Bioolook 科学研究专题 | 2360010 | 用于制备 MSgg 培养基。 |
| 50 mL 离心管 | 北京速博生物技术有限公司 | 62.547.254 | 适用于本实验方案的合适尺寸离心管 |
| 75% C2H5OH溶液 | 国药集团化学试剂有限公司 | 801769680 | 用于种子的灭菌。 |
| 鲍曼不动杆菌 XL-1 | 南京农业大学 | N/A | 从根际土壤中分离的菌株。 |
| Bacillus velezensis SQR9 | 南京农业大学 | N/A | 从根际土壤中分离的菌株。 |
| 细菌DNA试剂盒 | 南京迪斯生物技术有限公司 | D3350020000K04U021 | 用于提取细菌DNA。 |
| 黑土 I | 南京农业大学 | N/A | 中国吉林黑土 |
| 黑土 II | 南京农业大学 | N/A | 中国黑龙江的黑土 |
| 洋葱伯克霍尔德菌 XL-2 | 南京农业大学 | N/A | 从根际土壤中分离的菌株。 |
| CaCl2 | 西龙科学有限公司 | 10035048 | 用于制备MSgg培养基。 |
| 离心 | Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. | G508009-0001 | 高速离心机 |
| ChamQ SYBR qPCR 预混液 | Vazyme Biotech Co., Ltd. | Q311-02 | 用于qPCR中的DNA扩增。 |
| 洁净工作台 | 苏州安泰空气技术有限公司 | NB026143 | 用于无菌操作。 |
| 恒温培养箱 | 上海 CIMO 医疗器械有限公司 | GNP-9080BS-<图片替代文本="公式 1" 源文本：src="/files/ftp_upload/66926/66926eq01.jpg" 样式="margin: auto;"/> | 用于微生物培养。 |
| 结晶紫染料 | Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. | A600331 | 用于菌膜染色及定量分析。 |
| 黄瓜种子 | 南京农业大学 | N/A | "Jinchun I" 黄瓜种子 |
| Culturome v 1.0 | 中国科学院遗传与发育生物学研究所 | N/A | 用于高通量根际土壤细菌培养与鉴定 |
| FeCl3 | 国药集团化学试剂有限公司 | 10011918 | 用于制备MSgg培养基。 |
| 冰箱 | 合肥美的电冰箱有限公司 | BCD-556WKPM(Q) | 用于菌种保藏。 |
| 谷氨酸 | Bioolook 科学研究专题 | 2180020 | 用于制备MSgg培养基。 |
| 甘油 | 国药集团化学试剂有限公司 | 10010618 | 用于制备MSgg培养基。 |
| 水培种植篮 | 玉鹿家具店 | 6526262626 | 用于黄瓜水培。 |
| KH2PO4 | 西龙科学有限公司 | 10017618 | 用于制备MSgg培养基。 |
| MgCl₂2 | 西龙科学有限公司 | 7791186 | 用于制备MSgg培养基。 |
| MnCl2 | 西龙科学有限公司 | 10400101 | 用于制备 MSgg 培养基。 |
| Msgg 培养基 | 上海拜恩斯生物科技有限公司 | BES20791KB | 牙菌斑生物膜培养基 |
| Na2HPO4·7H2O | 默克 & Co., Inc. | S9390-100G | 用于制备TSB培养基。 |
| NaCl | Chinasun Specialty Products co., Ltd. | HS0416 | 用于制备TSB培养基。 |
| NaH2PO4·H2O | 默克 & Co., Inc. | S9638-25G | 用于制备TSB培养基。 |
| PBS-S 缓冲液 | Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. | E607008-0001 | 用于活体组织的缓冲液 |
| 苯丙氨酸 | RYON | RT3486L005 | 用于制备MSgg培养基。 |
| 移液器 | 北京莱伯捷科技有限公司 | BS-1000-T | 用于菌株接种。 |
| PMD19T 质粒 | 宝生物医学科技（北京）有限公司 | D102A | 用于生成qPCR标准曲线。 |
| 盆 | 国药集团化学试剂有限公司 | YHHWS2401 | 用于黄瓜的土壤栽培。 |
| qPCR 引物 | Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. | N/A | 用于qPCR中的DNA扩增。 |
| 实时荧光定量PCR仪 | 赛默飞世尔科技（中国）有限公司 | 4484073 | 用于对选定的浮膜生物膜进行qPCR。 |
| Roary | 威康信托桑格研究所 | N/A | 用于设计qPCR引物 |
| 沙克尔 | 上海志楚仪器有限公司 | ZQTY-50S | 用于溶液混合和微生物培养。 |
| Silwet L-77 | Cytiva 生物技术（杭州）有限公司 | SL77080596 | 用于制备TSB培养基。 |
| 大豆蛋白胨 | 青岛高新技术产业开发区希望生物技术有限公司 | HB8275 | 用于制备TSB培养基。 |
| 分光光度计 | 上海一典分析仪器有限公司 | 76713100010 | 用于检测浮膜型生物被膜的结晶紫定量分析。 |
| 无菌水 | 国药集团化学试剂有限公司 | SW150302 | 用于清洗浮膜生物膜。 |
| 无菌丁腈手套 | 北京莱伯捷科技有限公司 | 223016852LLZA | 用于基本的实验操作。 |
| 模板DNA | Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. | N/A | 用于qPCR中的DNA扩增。 |
| 硫胺素 | Bioolook 科学研究专题 | 2180020 | 用于制备MSgg培养基。 |
| 胰蛋白胨 | 赛默飞世尔科技 | LP0042B | 用于制备TSB培养基。 |
| 色氨酸 | Bioolook 科学研究专题 | 2190020 | 用于制备 MSgg 培养基。 |
| TSB 培养基 | 广东环凯微生物科技有限公司 & Tech. Co., Ltd. | 024048 | 广谱细菌培养基 |
| TSB-Msgg 培养基 | 南京农业大学 | N/A | 适用于更广泛菌膜培养的混合培养基 |
| ZnCl2 | 南京化学试剂有限公司 | C0310520123 | 用于制备MSgg培养基。 |
参考文献
- Davey, M. E., O'Toole, G. A. Microbial biofilms: from ecology to molecular genetics. Microbiol Mol Biol Rev. 64 (4), 847-867 (2000).
- Campbell, R., Greaves, M. P., Lynch, J. Anatomy and community structure of the rhizosphere. Rhizosphere. , 11-34 (1990).
- Berendsen, R. L., Pieterse....
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
重印与许可
