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从根际土壤构建多物种生物膜群落的方法 根际土壤，多物种生物膜，微生物群落，生物膜构建，土壤微生物学，微生物相互作用，体外模型，高通量筛选，微生物组工程，生物膜动态

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DOI：

10.3791/66926

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2024年5月24日

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1Jiangsu Provincial Key Lab for Solid Organic Waste Utilization, Key lab of organic-based fertilizers of China, Jiangsu Collaborative Innovation Center for Solid Organic Wastes, Educational Ministry Engineering Center of Resource-saving fertilizers, Nanjing Agricultural University, 2National Key Laboratory of Agricultural Microbiology and College of Resources and Environment, Huazhong Agricultural University

本文内容

摘要

本文介绍了一种从不同根际土壤中快速、标准化建立协同多物种生物膜群落的方法。该方法是一种独特的实验方案，旨在研究并模拟复杂的根际土壤微生物群落。

摘要

多物种生物膜是细菌在自然界中普遍存在且占主导地位的生活方式，包括根际土壤中的细菌，尽管目前对其了解仍然有限。本文提供了一种快速构建协同性多物种生物膜群落的方法。第一步是采用差速离心法从根际土壤中提取细胞。随后将这些土壤细胞接种至培养基中，以形成浮膜型生物膜。培养36小时后，利用16S rRNA基因扩增子测序方法分析生物膜及其下方溶液中的细菌组成。同时，采用极限稀释法对浮膜生物膜进行高通量细菌分离。然后，根据16S rRNA基因扩增子测序数据（浮膜生物膜样品）中丰度最高的前5个细菌分类群，用于构建多物种生物膜群落。通过24孔板快速建立这5个细菌分类群的所有组合，利用结晶紫染色法筛选出生物膜形成能力最强的组合，并通过qPCR进行定量。最终，通过上述方法获得了最稳定的合成细菌多物种生物膜群落。该方法为开展根际多物种生物膜研究提供了有益的指导，并有助于鉴定代表性群落，以深入探究这些物种间相互作用的规律。

引言

生物膜代表附着于表面或与界面相连的复杂微生物群落。人们普遍认为，在自然环境、临床环境和工业环境等各种环境中遇到的大多数细菌都是在生物膜群落中生存的1。在土壤中，根际——包括根表面及其邻近约2 mm厚的区域——构成了一个养分供应更为丰富的生态位。某些细菌已进化出利用这一生态位的策略，促进微生物增殖，并推动根际生物膜群落的形成2。

根际微生物被认为是植物的“第二基因组”3。植物促生微生物（PGPM）与植物建立互惠共生关系，具有显著的促生和生物防治功能4。一方面，PGPM 可以为植物根系提供养分，增强养分吸收，抵御病原菌侵染，并降解根际土壤中的污染物5；另一方面，PGPM 利用植物根系分泌物作为自身生长和进化的营养来源，从而通过其自身的代谢活动影响根际土壤和根系系统。值得注意的是，实现上述所有功能的前提是 PGPM 能够在植物根际有效定殖，并形成稳定的生物膜6。

根际生物膜影响根际微生物的组装过程，而根际微生物组装的时间和空间特征与多物种生物膜的相互作用密切相关7。根际生物膜作为植物-微生物组相互作用的核心，为它们 的有效互作提供了稳定且可控的微环境。因此，研究根际生物膜也是深入了解植物与微生物相互作用的重要方向。

然而，目前对根际多物种生物膜的研究还很少。微生物组构成的高度复杂性使得围绕天然微生物群落的基本生态学问题难以回答8。在实验过程中，需要考虑多种条件，如土壤类型、植物类型以及大量的微生物群落。多种因素限制了根际多物种生物膜的研究。

为了进一步研究根际土壤中多物种生物膜群落的特性，例如种间协同相互作用或代谢物交叉喂养8，在实验室条件下人工构建一个简化、具代表性、稳定且易于操作的合成微生物群落是十分必要的9,10。本文介绍了一种标准化实验方案，结合了多种最新的微生物学与生物信息学技术。

方案

该方案通常适用于多种植物的根际土壤微生物群。此处以黄瓜为例。本研究中所用试剂和设备的详细信息列于下文 材料表.

1. 细菌分离

  1. 根际土壤的分离
    1. 黄瓜培养
      1. 用75%乙醇和2%次氯酸钠（NaClO）溶液对黄瓜种子进行消毒，然后用无菌水冲洗11。
      2. 在无菌条件下使种子萌发，并选择达到两叶期的种子12。随后将生长一致的黄瓜幼苗移栽至装有2 kg黑土的花盆中。
        注：使用来自中国东北地区不同地点的两种黑土，以减少系统误差。
    2. 土壤悬液的制备
      1. 按以下配方配制PBS-S缓冲液：6.33 g NaH2PO4·H2O、16.5 g Na2HPO4·7H2O、200 µL Silwet L-77，加蒸馏水至1 L。
      2. 当幼苗达到四叶期12时，将花盆倒置，使用无菌手套分离根系及其附着的2 mm厚根际土壤。
      3. 将根系放入50 mL离心管中的30 mL PBS-S缓冲液中，振荡20 min后，用100 µm尼龙细胞滤网过滤，以去除根系和大颗粒沉淀物。
      4. 将滤液转移至另一50 mL离心管中，在室温下以3200 x g离心15 min，暂时保存于4 °C。
  2. 根际土壤细菌细胞的提取。
    注：本方法采用差速离心法13，但也可使用Nycodenz密度梯度离心法14完成此步骤。
    1. 用0.2% Na4P2O7溶液将土壤悬液稀释至500 mL，在1,000 x g下离心10 min，初步分离土壤中的微生物。
    2. 重新混匀沉淀物，在相同低速下再次离心60 s，重复该过程三次。合并上清液，在12,000 x g下离心20 min，弃去上清液。
    3. 将沉淀物重悬于50 mL PBS-S缓冲液中，即得根际土壤细菌细胞悬液。

2. 根际生物膜微生物群的测序与鉴定

  1. 培养基制备
    注意：胰蛋白胨大豆肉汤（TSB）和最低盐甘油谷氨酸盐（MSgg）培养基可商业获得。以下配方仅供参考。
    1. 使用以下配方制备TSB培养基：15 µg/mL 胰蛋白胨，5 µg/mL 大豆蛋白胨，5 µg/mL NaCl，pH = 7。
    2. 使用以下配方制备MSgg培养基：5 mM KH2PO4，100 mM 3-(N-吗啉代)丙磺酸（MOPS），2 mM MgCl2，700 µM CaCl2，50 µM MnCl2，50 µM FeCl3，1 µM ZnCl2，2 µM 硫胺素，0.5% 甘油，0.5% 谷氨酸，50 µg/mL 色氨酸，50 µg/mL 苯丙氨酸，pH = 7。
    3. 制备TSB-MSgg培养基时，将TSB培养基与MSgg培养基按1:1体积比（v/v）混合15。
  2. 浮膜生物膜共培养
    1. 将细胞悬液在TSB培养基中于30 °C条件下孵育过夜（通常为12小时），以活化细菌。
    2. 将100 µm尼龙细胞滤膜置于24孔板上。在TSB培养基中孵育细菌，并设置三个重复。于30 °C培养36小时以形成浮膜生物膜。
      注意：若上一步骤中浮膜生物膜生长不佳，可用TSB-MSgg培养基替代TSB培养基。
    3. 取出含有浮膜生物膜的滤膜。向新的24孔细胞培养板中加入2 mL PBS-S缓冲液，将带有滤膜的24孔板放入其中以清洗生物膜，去除游离细胞。重复清洗过程三次。
  3. 浮膜生物膜DNA提取
    1. 按照试剂盒说明书使用DNA提取试剂盒提取生物膜基因组DNA。
  4. 高通量测序
    注意：大多数实验室可由生物技术公司协助完成测序实验。若需分析剩余溶液中的微生物组成，可在本步骤进行测序。测序步骤因仪器而异，请遵循制造商说明书。步骤2.4.1仅供参考。
    1. 基于包含全长16S rRNA基因序列的数据库，扩增16S rRNA基因的V3-V4区。根据每个样本的最小序列数建立物种OTU16。对物种分类注释进行聚类，获得各样本中微生物群落的组成。
    2. 根据测序数据，选择相对丰度最高的前五种菌株。
  5. 高通量细菌分离与培养
    注意：本步骤依据最新的微生物学与生物信息学方法设计17。此处可采用稀释涂布平板法进行细菌分离，但相比高通量技术，该方法耗时更长且靶向性较差。
    1. 混匀已培养的生物膜。采用极限稀释法，确保24孔板中不超过30%的孔出现细菌生长。
      注意：为确定最适稀释度，应使用广泛梯度的稀释比例进行预实验。最佳稀释度应使每毫升培养液中可培养细菌不超过两个，对应少于30%的孔出现细菌生长。
    2. 在扩增细菌16S rRNA基因的同时，为各孔和培养板添加标签，并使用高通量Illumina平台进行测序17。
    3. 使用商业化的软件进行生物信息学分析，获得每种培养物的纯度及物种分类信息。
    4. 通过连续划线培养获得丰度最高的五种纯菌，并使用甘油于-80 °C保存细菌。

3. 合成微生物群落的构建

  1. 重建生物膜培养
    注意：详细信息请参见 Ren 等人18。这 5 种菌株共构成 31 种合成组合，包括 5 种单菌种、10 种双菌种、10 种三菌种、5 种四菌种和 1 种五菌种群落。
    1. 将 5 种菌株在 TSB 培养基中培养，直至其 OD600 达到 1，以进行活化。
    2. 准备若干含 TSB 培养基的 24 孔板，并在孔中放置 100 µm 尼龙细胞滤膜。
      注意：若上一步的生物膜培养效果不佳，TSB-MSgg 培养基可有效替代 TSB 培养基。
    3. 将 31 种合成群落组合接种至培养基中培养。确保每个孔中的细菌接种量一致。每种组合设置三个重复。
    4. 在 30 °C 下培养生物膜 36 小时。
  2. 浮膜型生物膜的定量
    1. 按照步骤 2.2.3 的相同流程操作。
    2. 将生物膜转移至另一含有 180 µL 结晶紫溶液的 24 孔板中，染色 20 分钟。
    3. 将染色后的样品转移至另一含有 200 µL 96% 乙醇的 24 孔板中，脱色 30 分钟，测定 OD590。

4. 菌膜细胞数量的定量分析

注意：为了确定菌膜及剩余溶液中各物种的比例和细胞数量，需要进行定量 PCR。具体细节请参考 Sun 等人的研究16。

  1. 为选定的合成微生物群落设计菌株特异性引物。
  2. 使用 Roary 进行基因组比较，找出每个分离株的菌株特异性单拷贝基因，并确保引物靶向这些基因。
  3. 将扩增的片段连接至 PMD19T 质粒，并以包含相应片段的质粒为模板生成标准曲线。
  4. 按照步骤 2.2 中所述的相同步骤进行操作。
  5. 按如下方式配制反应体系：7.2 µL H2O、10 µL 2x qPCR Master mix、0.4 µL 10 µM 的每种引物，以及 2 µL 模板 DNA。
  6. 在实时荧光定量 PCR 仪上按以下条件进行 PCR 扩增：95 °C 预变性 10 min，随后进行 40 个循环（95 °C 变性 30 s，60 °C 退火 45 s），最后进行标准熔解曲线分析。
  7. 每种处理设置六个生物学重复。

结果

按照上述步骤操作，可观察到黄瓜根际土壤微生物群落在成膜能力方面存在显著梯度差异（图1）。生物膜扩增子测序结果确认了菌膜中所含的物种（图2）。根据测序数据的热图分析，筛选出在菌膜中丰度高于剩余液体部分的前五种细菌物种（图3）。此处以一组典型的合成菌群为例，通过结晶紫染色和定量PCR，可直接可视化菌膜生物量以及各物种在群落中相对丰度的差异。共培养生物量的增加表明，成功地从根际土壤中构建了具有协同作用的多物种生物膜群落（图4 和 图5）。

结果表明，Bacillus velezensis SQR9、Acinetobacter baumannii XL-1 和 Burkholderia cenocepacia XL-2 能够形成显著的协同群落，其中由这三种物种组成的群落最为稳定。预测它们在生物膜形成方面表现出强烈的协同作用。值得注意的是，XL-1 充当“促进者”的角色：尽管其在群落中生长能力较差且丰度极低，但仍能促进 XL-2 和 SQR9 的生物膜形成（图5）。尽管许多多物种共培养生物膜表现出协同表型，但某些物种（如 Chryseobacterium sp.）始终与其他菌株呈负相关，因其会降低合成生物膜的生物量（图2）。虽然该现象与本实验方案的目标无关，但未来可能值得进一步研究。

培养皿实验示意图；微生物生长阶段；XL-1、XL-1+XL-2、XL-1+SQR9 样品。
图1：不同合成菌群（SynComs）的生物膜形成。 此处样品置于标准的24孔板中。照片未进行任何放大拍摄。请点击此处查看此图的放大版本。

微生物多样性柱状图；黑色生物膜和溶液中属的相对丰度。
图 2：菌膜和溶液中的细菌组成。 图表基于第 2.3 步实验方案中提到的 16S rRNA 基因扩增子测序数据。请点击此处查看该图的放大版本。

微生物丰度热图；颜色编码数据；分类分布；倍数变化分析。
图 3：菌膜和溶液中生物膜形成能力的热图。 红色表示生物膜中的丰度高于溶液，蓝色表示相反情况。无差异的属未显示。丰度排名前5的物种在左侧用勾标记。bb：黑色菌膜；bs：黑色溶液。 请点击此处查看该图的放大版本。

显示不同处理及其对生长影响的生物膜生物量（OD₅₉₀）柱状图
图 4：合成群落生物膜生物量的定量分析（见 图 1）。 数据来源于结晶紫染色定量测定，OD = 590 nm。所展示数据为均值 ± 标准差，n = 5。请点击此处查看该图的放大版本。

DNA拷贝数的柱状图，比较XL-1、XL-1+XL-2、XL-1+SQR9、XL-1+XL-2+SQR9。
图5合成群落中细胞数量及物种相对丰度 图1. 数据来自定量PCR。所展示数据为均值 ± 标准差，n = 6。 请点击此处以查看此图的放大版本。

讨论

根据该方案，基于不同植物根际土壤中的微生物群落，构建了一系列稳定的合成多物种生物膜群落。利用定量PCR技术，可清晰解析每个群落的组成。生物膜的生物量反映了其潜在代谢相互作用的强度，但本研究未能揭示合作背后的各种特性和机制19。鉴于天然微生物群落的规模和复杂性，合成群落（SynComs）为克服现有障碍提供了一个模型系统14。该方案重点介绍了从复杂的根际土壤微生物群落构建合成生物膜群落的系统性与基础性方法。

从最后一部分可以明显看出，SQR9、XL-1 和 XL-2 在实际根际环境中表现出强大的稳定定殖潜力。研究人员可基于这些菌株开展代谢关系及共定殖机制的研究。此后，针对黄瓜的微生物接种剂相关研究也得以顺利展开。

尽管存在上述优点，但不应忽视该方案的缺点。由于实验室培养条件与原位（in situ）环境之间存在差异，每个合成群落的结果可能无法准确反映真实根际土壤中的微生物群落20。因此，有必要通过进一步的根际接种实验加以验证。此外，这些结果的可重复性相对较低。实验室中形成的菌膜生物膜物种相较于土壤中的野生型可能已历经多代发生突变，从而导致一些不可控的偏差。

本方案中某些步骤存在多种可选方法。例如，在步骤1.2中，采用Nycodenz密度梯度离心法收集土壤细胞样品的效率相对更高13。此外，在步骤2.4中，最新的高通量细菌培养与鉴定技术虽成本较高，但可显著提高实验效率。因此，传统的稀释涂布平板法仍适用于少数菌种的筛选。最后，在步骤3.2中，培养所得生物膜的生物量既可通过结晶紫染色法测定，也可直接使用分析天平称重进行评估。

该方案不仅限于为微生物和环境研究制备基础实验材料。识别最稳定的合成细菌多物种生物膜群落仅仅是解析开放而复杂的根际生态系统的第一步。通过聚焦于合成群落（SynComs）的核心物种，研究人员能够深入了解真实 原位 以更有针对性和更快速的方式应对各种情况。该方法还可为大规模探索生物膜（如根际土壤团聚体）以及精准调控根际微生物群落以促进植物生长与健康提供新的研究视角21.

最重要的是，该方法将有助于进一步研究调控根际土壤微生物群落组成和动态变化的物种间相互作用。例如，在处理复杂的根际群落时，通常将共现网络分析或基因组尺度的代谢建模15等其他分析方法与这些基本步骤相结合，以人工构建具有代表性的生物膜群落，其中需考虑物种间的相互关系。

披露

作者声明无利益冲突。

致谢

本研究受到国家自然科学基金（42307173 和 42107328）以及国家重点研发计划（2022YFD1500202 和 2022YFF1001800）的资助。P.W. 和 Z.X. 设计了研究方案。P.W.、B.X.、Z.C.、J.X. 和 N.Z. 分析了数据并制作了图表。P.W. 撰写了论文初稿。Z.X.、R.Z. 和 Q.S. 对论文进行了修改。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
0.2 % Na4P2O7 溶液国药集团化学试剂有限公司20041418用于稀释土壤悬浮液。
100 μm 尼龙细胞滤膜Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.F613463-0001用于过滤培养液并分离浮膜生物膜。
2% NaClO 溶液国药集团化学试剂有限公司L03336903用于种子的灭菌。
24孔板默克 & Co., Inc.PSRP010用于微生物培养及浮膜型生物膜的分离。
3-(N-吗啉代)丙磺酸（MOPS）Bioolook 科学研究专题2360010用于制备 MSgg 培养基。
50 mL 离心管北京速博生物技术有限公司62.547.254适用于本实验方案的合适尺寸离心管
75% C2H5OH溶液国药集团化学试剂有限公司801769680用于种子的灭菌。
鲍曼不动杆菌 XL-1南京农业大学N/A从根际土壤中分离的菌株。
Bacillus velezensis SQR9南京农业大学N/A从根际土壤中分离的菌株。
细菌DNA试剂盒南京迪斯生物技术有限公司D3350020000K04U021用于提取细菌DNA。
黑土 I南京农业大学N/A中国吉林黑土
黑土 II南京农业大学N/A中国黑龙江的黑土
洋葱伯克霍尔德菌 XL-2南京农业大学N/A从根际土壤中分离的菌株。
CaCl2西龙科学有限公司10035048用于制备MSgg培养基。
离心Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.G508009-0001高速离心机
ChamQ SYBR qPCR 预混液Vazyme Biotech Co., Ltd.Q311-02用于qPCR中的DNA扩增。
洁净工作台苏州安泰空气技术有限公司NB026143用于无菌操作。
恒温培养箱上海 CIMO 医疗器械有限公司GNP-9080BS-<图片替代文本="公式 1" 源文本：src="/files/ftp_upload/66926/66926eq01.jpg" 样式="margin: auto;"/>用于微生物培养。
结晶紫染料Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.A600331用于菌膜染色及定量分析。
黄瓜种子南京农业大学N/A"Jinchun I" 黄瓜种子
Culturome v 1.0中国科学院遗传与发育生物学研究所N/A用于高通量根际土壤细菌培养与鉴定
FeCl3国药集团化学试剂有限公司10011918用于制备MSgg培养基。
冰箱合肥美的电冰箱有限公司BCD-556WKPM(Q)用于菌种保藏。
谷氨酸Bioolook 科学研究专题2180020用于制备MSgg培养基。
甘油国药集团化学试剂有限公司10010618用于制备MSgg培养基。
水培种植篮玉鹿家具店6526262626用于黄瓜水培。
KH2PO4西龙科学有限公司10017618用于制备MSgg培养基。
MgCl₂2西龙科学有限公司7791186用于制备MSgg培养基。
MnCl2西龙科学有限公司10400101用于制备 MSgg 培养基。
Msgg 培养基上海拜恩斯生物科技有限公司BES20791KB牙菌斑生物膜培养基
Na2HPO4·7H2O默克 & Co., Inc.S9390-100G用于制备TSB培养基。
NaClChinasun Specialty Products co., Ltd.HS0416用于制备TSB培养基。
NaH2PO4·H2O默克 & Co., Inc.S9638-25G用于制备TSB培养基。
PBS-S 缓冲液Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.E607008-0001用于活体组织的缓冲液
苯丙氨酸RYONRT3486L005用于制备MSgg培养基。
移液器北京莱伯捷科技有限公司BS-1000-T用于菌株接种。
PMD19T 质粒宝生物医学科技（北京）有限公司D102A用于生成qPCR标准曲线。
盆国药集团化学试剂有限公司YHHWS2401用于黄瓜的土壤栽培。
qPCR 引物Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.N/A用于qPCR中的DNA扩增。
实时荧光定量PCR仪赛默飞世尔科技（中国）有限公司4484073用于对选定的浮膜生物膜进行qPCR。
Roary威康信托桑格研究所N/A用于设计qPCR引物
沙克尔上海志楚仪器有限公司ZQTY-50S用于溶液混合和微生物培养。
Silwet L-77Cytiva 生物技术（杭州）有限公司SL77080596用于制备TSB培养基。
大豆蛋白胨青岛高新技术产业开发区希望生物技术有限公司HB8275用于制备TSB培养基。
分光光度计上海一典分析仪器有限公司76713100010用于检测浮膜型生物被膜的结晶紫定量分析。
无菌水国药集团化学试剂有限公司SW150302用于清洗浮膜生物膜。
无菌丁腈手套北京莱伯捷科技有限公司223016852LLZA用于基本的实验操作。
模板DNASangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.N/A用于qPCR中的DNA扩增。
硫胺素Bioolook 科学研究专题2180020用于制备MSgg培养基。
胰蛋白胨赛默飞世尔科技LP0042B用于制备TSB培养基。
色氨酸Bioolook 科学研究专题2190020用于制备 MSgg 培养基。
TSB 培养基广东环凯微生物科技有限公司 & Tech. Co., Ltd.024048广谱细菌培养基
TSB-Msgg 培养基南京农业大学N/A适用于更广泛菌膜培养的混合培养基
ZnCl2南京化学试剂有限公司C0310520123用于制备MSgg培养基。

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