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方法文章

利用肽：主要组织相容性复合体四聚体鉴定小鼠肺中稀有抗原特异性T细胞

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DOI：

10.3791/66939

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2024年7月19日

 ,  , 
1Center for Immunology and Inflammatory Diseases, Division of Rheumatology, Allergy, and Immunology, Massachusetts General Hospital, 2Division of Immunology, Boston Children's Hospital, 3Harvard Medical School, 4Division of Pulmonary and Critical Care Medicine, Massachusetts General Hospital

本文内容

摘要

我们提供了一种详细的实验方案，通过磁珠法富集T细胞结合肽：主要组织相容性复合体（MHC）四聚体技术，从小鼠肺组织中分离并鉴定稀有的抗原特异性T细胞群体。

摘要

在健康与疾病状态下对抗原特异性T细胞的鉴定与表征，仍是深化免疫病理生理学理解的关键。针对在内源性T细胞库中追踪抗原特异性T细胞群体的技术难题，肽：MHC四聚体试剂的开发已带来显著进展。这些荧光标记的可溶性多聚体由MHC I类或II类分子与抗原肽表位复合而成，能够直接结合具有相应T细胞受体（TCR）特异性的T细胞，从而可在无需诱导功能性反应的情况下，识别处于天然状态的抗原特异性T细胞群体。 离体 刺激。对于极为稀有的细胞群体，可通过磁珠富集四聚体结合的T细胞，以提高检测的灵敏度和可靠性。

随着对组织驻留性T细胞免疫研究的不断深入，迫切需要鉴定那些迁移并驻留在非淋巴组织中的抗原特异性T细胞。本实验方案详细介绍了从小鼠肺组织中分离和鉴定抗原特异性T细胞的具体步骤。该方法包括从消化后的肺组织中分离T细胞，随后进行通用T细胞磁珠富集，再通过四聚体染色进行流式细胞术分析与分选。本方案所强调的步骤采用常规实验技术和易于获取的试剂，几乎适用于所有从事小鼠T细胞免疫学研究的研究人员，并且可高度适应于肺内任何低频率抗原特异性T细胞群体的多种下游分析。

引言

适应性免疫系统的核心在于T细胞识别并响应特定抗原的能力。T细胞在何时何地响应其同源抗原，决定了感染与自身免疫、稳态与癌症、健康与疾病之间的平衡1。因此，在特定免疫背景下研究T细胞时，应重点关注针对相关目标抗原具有特异性的T细胞。在诸多技术进步中，荧光标记的可溶性多聚体（通常为四聚体）显著增强了对抗原特异性T细胞群体的表征能力，这类多聚体由主要组织相容性复合物（MHC）I类或II类分子与抗原肽表位结合而成，通常被称为“肽-MHC四聚体”2,3,4,5。由于肽-MHC I类和II类四聚体代表了T细胞抗原受体（TCR）的天然配体，因此可分别用于直接识别免疫系统内源性T细胞库中的抗原特异性CD8+和CD4+ T细胞，而无需依赖实验中抗原刺激后的应答反应。相较于TCR转基因T细胞过继转移模型，四聚体技术为研究抗原特异性T细胞提供了更为精确的方法6，并已越来越多地应用于实验小鼠模型及人类疾病中，用于鉴定针对外来抗原和自身抗原的T细胞群体4,5。

虽然四聚体能够轻易鉴定出因抗原刺激而扩增的高频T细胞群体，但其在初始T细胞、自身抗原特异性T细胞或记忆T细胞研究中的应用受到这些细胞群体极低频率的限制7。我们课题组及其他研究团队已开发并推广了基于四聚体的磁性富集策略，该方法提高了检测灵敏度，使得在小鼠淋巴组织中对这些细胞群体的研究成为可能8,9,10,11。

组织驻留性T细胞的发现使研究领域更加重视开发新方法来探究非淋巴组织空间中的T细胞。与其他许多黏膜表面类似，肺部的T细胞会接触到一系列来源于宿主上皮、共生及致病微生物以及环境成分（包括过敏原）的自身和外来抗原。从非淋巴组织（NLT）中分离出的T细胞的转录组分析显示其具有类似记忆表型的特征，并表现出独特的组织特异性命运和功能，通常与迁移及组织稳态相关12。此外，组织驻留记忆T细胞（Trms）相较于循环中的T细胞通常具有更严格的克隆限制性13。明确抗原如何以及为何驱动T细胞在NLT中驻留，对于理解免疫系统如何抵御感染、维持组织稳态，以及在某些情况下如何演变为自身免疫反应至关重要。然而，肺部组织驻留性T细胞的损耗似乎比其他NLT更为显著14。因此，识别和表征具有特定抗原反应性的内源性肺T细胞的能力受到其本身稀有性的限制。

通过结合使用磁珠介导的细胞富集技术和肽：MHC 四聚体染色方法，我们成功检测到小鼠肺组织中数量扩增但极为稀有的自身抗原特异性 T 细胞15,16. 本文详细描述了一种经过我们优化的实验方案，可稳定地分离和鉴定小鼠肺组织中任何稀有的抗原特异性T细胞群体（图1）。该方案包含一个 体内 抗体染色步骤以区分组织驻留性T细胞与血管内T细胞17 随后采用两种不同的肺组织处理方法，以适应不同资源条件。接着进行通用的T细胞磁珠富集、四聚体染色及流式细胞术分析。本方案通过添加氨基胍以阻断诱导型一氧化氮合酶（iNOS）介导的T细胞活化诱导的凋亡，进一步提高细胞活力和四聚体染色效果18 以及限制TCR下调的达沙替尼19本方案中强调的步骤采用了常见的技术与 readily available 试剂，几乎任何从事小鼠 T 细胞免疫学研究的研究人员均可使用，并且高度适用于多种下游分析。尽管初始 T 细胞不太可能在肺组织中被发现，但我们认为本方案对于研究肺部自身抗原特异性 T 细胞及组织驻留记忆 T 细胞（Trms）将特别有帮助。

小鼠肺细胞分离：示意图、离心机设置、单细胞悬液、流式细胞术分析。
图1：实验方案流程概览。 从小鼠中取出肺组织并解离为单细胞。样品随后进行T细胞富集，再使用肽：MHC四聚体及荧光标记抗体染色，用于流式细胞术分析。请点击此处查看该图的放大版本。

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方案

本方案中描述的操作程序均根据麻省总医院机构动物照护与使用委员会（IACUC）制定的指南批准并制定，该委员会隶属于美国实验动物管理认证协会（AAALAC）认证的动物管理项目。实验所用动物为在麻省总医院动物设施中饲养并维持的8至12周龄雄性和雌性C57BL/6遗传背景小鼠，饲养环境为特定病原体-free条件。

1. 配制储备溶液

  1. 通过溶解10 mM HEPES、5 mM KCl、1.8 mM CaCl2、150 mM NaCl和1 mM MgCl2配制HEPES缓冲液，并调节pH至7.4。
  2. 通过将700 µg/mL的Liberase Thermolysin Medium（TM）（见材料表）溶解于含Ca++和Mg++的Hank's平衡盐溶液（见材料表）中，配制10倍浓度的Liberase储存液。
  3. 通过将100 mM氨基胍半硫酸盐（Aminoguanidine Hemisulfate Salt）（见材料表）溶解于含Ca++和Mg++的Hank's平衡盐溶液（见材料表）中，配制10倍浓度的氨基胍储存液。
  4. 通过将EHAA培养基（见材料表）与10%胎牛血清（FBS）、100 U/mL青霉素/链霉素、50 µg/mL庆大霉素、2 mM L-谷氨酰胺和55 µM 2-巯基乙醇混合，配制完全Eagle's Ham's氨基酸（EHAA）培养基。
    注：也可使用其他常见的T细胞培养基，如RPMI或DMEM。
  5. 通过将1×PBS与2% FBS和0.05%叠氮化钠混合，配制分选缓冲液。
  6. 将纯化的抗小鼠CD16/32抗体（见材料表）以1:100（v/v）的比例用分选缓冲液稀释，配制Fc阻断液。
  7. 在不含L-谷氨酰胺的RPMI 1640培养基（见材料表）中加入100 µg/mL Liberase TM和50 µg/mL DNase I（见材料表），配制Liberase TM/DNase消化液。
  8. 在生理盐水（0.9% NaCl）（见材料表）中加入10 mg/mL氯胺酮（ketamine）（见材料表）和1 mg/mL赛拉嗪（xylazine）（见材料表），配制氯胺酮/赛拉嗪混合液。

2. 通过自动化组织解离仪从肺组织制备单细胞悬液

  1. 每只小鼠准备 4 mL 冰冷的 HEPES 缓冲液，置于专用组织解离管中（见材料表），并保持在冰上。
  2. 通过腹腔注射 150–200 µL 氯胺酮/甲苯噻嗪混合物麻醉小鼠。将 1–3 µg 荧光染料标记的抗小鼠 CD45 抗体（见材料表）溶于 100 µL 生理盐水中，经静脉注射至每只麻醉后的小鼠体内。抗体注射后 3 分钟，通过腹腔注射 500–600 µL 氯胺酮/甲苯噻嗪混合物处死小鼠。
  3. 切除肺组织，并将其放入预冷的专用组织解离管中。将解离管置于自动组织解离仪上（见材料表），运行针对肺组织的第一程序（预设程序）。
  4. 向每根含有已解离肺组织的解离管中加入 500 µL Liberase 储存液和 500 µL 氨基胍储存液。在 37 °C 条件下，于旋转混匀仪中孵育 30 分钟。
  5. 将解离管重新放回组织解离仪，运行针对肺组织的第二程序（预设程序）。
  6. 将组织解离管中的单细胞悬液通过 100 µm 细胞滤网（见材料表）过滤至 50 mL 锥形管中。用 5 mL 完全 EHAA 培养基（或任何等效的 T 细胞培养基）冲洗组织解离管，并将冲洗液一并通过滤网收集至 50 mL 锥形管中。
  7. 移除滤网，用完全 EHAA 培养基将细胞悬液体积补至 50 mL。在 4 °C 条件下，以 400 × g 离心 5 分钟。小心吸除上清液，保留约 100 µL 上清液及细胞沉淀。
  8. 加入约 100 µL Fc 封闭液，使总体积达到 200 µL，然后剧烈涡旋振荡以充分重悬细胞沉淀。

3. 替代方案：通过手动解离法从肺组织制备单细胞悬液

  1. 每只小鼠准备1 mL完全EHAA，置于1.5 mL离心管中，并置于冰上保存。
  2. 通过腹腔注射150–200 µL氯胺酮/赛拉嗪混合物对小鼠进行麻醉。将1–3 µg荧光标记的抗小鼠CD45抗体溶于100 µL生理盐水中，经静脉注射至每只麻醉后的小鼠体内。在抗体注射后3分钟，通过腹腔注射500–600 µL氯胺酮/赛拉嗪混合物处死小鼠。
  3. 切除肺组织，并将其放入预先置于冰上冷却的相应1.5 mL离心管中。
  4. 待所有肺组织采集完成后，将每份肺组织转移至不含细胞培养基的新离心管中。
  5. 在离心管内使用剪刀将肺组织剪成小片段（约2–3 mm大小）。
  6. 向每根离心管中加入1 mL Liberase TM/DNase I消化液。
  7. 在37 °C水浴中孵育30分钟。随后将样品放回冰上，以防止过度消化。
  8. 将样品倒入置于50 mL锥形管上方的100 µm细胞筛中，使用无菌1 mL注射器活塞的橡胶端在筛网上碾压组织。
  9. 用冷分选缓冲液冲洗细胞筛，最终收集7 mL液体至锥形管中。在4 °C条件下，以400 × g 离心5分钟。小心吸除上清液，保留约100 µL上清液及细胞沉淀。
  10. 加入100 µL Fc阻断液，使总体积达到200 µL，然后剧烈涡旋振荡以充分重悬细胞沉淀。

4. 通过磁珠富集法富集肺组织样本中的T细胞

  1. 加入 50 µL 抗小鼠 CD90.2 磁珠（参见 材料表）。涡旋混匀，并在 4 °C 下孵育 10 分钟。
    注意：CD90.2 对应于 C57BL/6 小鼠 T 细胞表达的等位基因。若使用其他品系小鼠，请核对等位基因型。
  2. 与此同时，将一个顺磁性细胞分离柱（参见 材料表）安装到单联或四联细胞分离磁架上（参见 材料表）。在每个分离柱下方放置一个开口的 15 mL 圆锥形离心管，用于收集穿流液。用 3 mL 冷分选缓冲液预冲洗分离柱，使液体依靠重力自然流至下方离心管中。
  3. 细胞与磁珠孵育 10 分钟后，加入冷分选缓冲液至总体积为 1 mL，并通过置于分离柱顶部的 100 µm 细胞滤网转移样品。将分离柱的穿流液收集至位于其下方的新 15 mL 圆锥形离心管中。
  4. 待细胞悬液完全依靠重力流尽后，用额外的 3 mL 冷分选缓冲液冲洗原先的离心管，并将冲洗液通过滤网加至分离柱，从而清洗滤网。随后移除滤网。
  5. 当样品再次完全流入分离柱且无进一步穿流液流出时，将分离柱从磁架上取下，并置于一个新的 15 mL 圆锥形离心管上方。
  6. 向分离柱中加入 5 mL 冷分选缓冲液。
  7. 立即通过一次性连续推动分离柱活塞至顶部，将结合在柱上的细胞洗脱下来，迫使分选缓冲液从柱底部流入新离心管中。
  8. 将洗脱后的样品在 4 °C 下以 400 × g 离心 5 分钟。小心吸除上清液，保留约 100 µL 上清液及细胞沉淀。
  9. 加入 100 µL 冷分选缓冲液，使总体积达到 200 µL，并剧烈涡旋振荡以充分重悬细胞沉淀。
  10. 如需分析，可对含有未结合细胞组分的穿流液样品进行检测。

5. 使用肽：MHC 四聚体染色抗原特异性T细胞

  1. 向每个样本中加入 1 µL 的 10 µM Dasatinib（参见材料表），涡旋混匀，并在室温下孵育 5 分钟。
  2. 加入 PE 或 APC 标记的肽：MHC 四聚体，使其终浓度为 10 nM（或根据经验优化的特定四聚体浓度）。
  3. 涡旋混匀，在避光条件下于室温孵育 1 小时（或根据经验优化的时间和温度）。

6. 通过流式细胞术分析四聚体标记的T细胞

  1. 在样本使用肽:MHC 四聚体染色的同时，配制用于染色细胞表面标志物的抗体主混合液（表1）。
    ​注意：避免使用与静脉注射的 CD45 抗体或四聚体产生荧光冲突的荧光染料。
  2. 在四聚体染色孵育还剩 15 分钟时，向每份样本中加入按 1:100（或经经验优化的浓度）稀释的表面抗体主混合液。
  3. 继续在室温下避光孵育，直至完成总共 1 小时的孵育时间。
  4. 加入 50,000 个流式细胞术计数微球（见材料表），并加入冷分选缓冲液至终体积约 5 mL。将染色后的样本在 4 °C 条件下以 400 × g 离心 5 分钟。小心吸除上清液，保留约 100 µL 上清液以及细胞/微球沉淀。
  5. 用额外的 200 µL 分选缓冲液重悬样本，并将样本转移至 5 mL 荧光激活细胞分选（FACS）管中。
  6. 在流式细胞仪上分析样本。尽可能收集更多细胞，最多不超过总计 2,500,000 个事件。确保至少已收集到 20,000 个计数微球事件。保持采集速率在每秒 5,000 个事件或以下。
  7. 将所有数据保存为 FCS 文件。

  

荧光染料抗体
BUV395CD90.2
Pacific BlueCD45（通过静脉注射预先加入）
Pacific OrangeCD8
Brilliant Violet 785CD4
FITCCD3
PerCP-Cy5.5排除标记（B220、CD11b、CD11c、F4/80）
PEpMHC 四聚体或表型标记
PE-Cy7表型标记（例如 CD44、PD-1、CD69 等）
APCpMHC 四聚体或表型标记
AlexaFluor 700表型标记（例如 CD44、PD-1、CD69 等）
APC-Cy7活/死染色

表1：样本染色矩阵。 用于鉴定和表征抗原特异性T细胞的典型荧光素偶联流式细胞术抗体组合。

7. 数据分析

  1. 使用适当的流式细胞术软件分析 FCS 数据文件。
    1. 设置一系列连续的包含门控，以鉴定以下事件：1）类似淋巴细胞的，2）单细胞的，3）活细胞，4）血管外，5）转储通道阴性，以及 6）CD90.2 阳性且同时为 CD4 或 CD8 阳性的细胞群（图 2）。
    2. 在上述细胞群中鉴定四聚体阳性 T 细胞。
  2. 通过计算样本运行过程中加入的微球数（50,000）与实际采集到的微球数之比，并将该比值乘以采集到的四聚体阳性细胞总数，从而确定四聚体阳性细胞的绝对数量。
    四聚体分析方程，用于计算免疫学研究中四聚体阳性细胞总数的公式。

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结果

图2展示了利用肽:MHC II类四聚体鉴定肺中稀有抗原特异性CD4+ T细胞的代表性设门策略。相同的方法也可用于通过肽:MHC I类四聚体鉴定抗原特异性CD8+ T细胞（数据未显示）。

由于肺组织中含有大量非淋巴细胞，通过四聚体技术可靠地检测稀有抗原特异性T细胞需要对目标T细胞进行某种形式的预先富集，以提高信噪比。图3展示了本方案中所述基于CD90.2抗体的磁珠富集肺组织总T细胞的效果。通过该富集方法，我们平均可回收肺中超过99%的CD90.2+ T细胞，且纯度超过90%。图4展示了经此富集后，稀有四聚体阳性CD4+ T细胞的检测灵敏度显著提高，相较于未富集样本或直接采用四聚体为基础的细胞富集策略更为有效。

图5

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讨论

既往对肺部抗原特异性T细胞的表征得益于急性初始刺激事件（如鼻内免疫或感染）后大量扩增的抗原特异性T细胞，从而提供了充足的细胞数量20,21,22。然而，肺部较为稀有的T细胞群体，例如自身抗原特异性T细胞或组织驻留记忆T细胞，在缺乏针对目标T细胞的某种样本富集手段时，难以被检测到15,16,23。我们通过结合先前描述的肺组织解离技术，以获得高比例的活淋巴细胞24,25，并整合一种区分血管内与实质T细胞的策略，以及基于T细胞的通用富集方法，随后进行四聚体染色17，实现了这一目标。利用本方案，我们已证明能够识别...

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披露

作者声明无利益冲突。

致谢

感谢 L. Kuhn 在组织处理和四聚体生产方面提供的技术支持。本研究由美国国立卫生研究院（R01 AI107020 和 P01 AI165072 资助 J.J.M.，T32 AI007512 资助 D.S.S.）、马萨诸塞州病原体应变能力联盟（J.J.M.）以及麻省总医院研究执行委员会（J.J.M.）提供经费支持。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
100 mm 细胞筛Fisher Scientific22-363-549
不含 Ca++ 或 Mg++ 的 10x PBSCorning46-013-CM
不含 Ca++ 或 Mg++ 的 1x PBSCorning21-031-CV
AccuCheck 计数微球InvitrogenPCB100
氨基胍半硫酸盐Sigma-AldrichA7009
小鼠 CD90.2 磁珠Miltenyi130-121-278
细胞分离磁铁（MidiMACS 分离器）Miltenyi130-042-302可容纳单个 LS 柱
细胞分离磁铁（QuadroMACS 分离器）Miltenyi130-090-976可容纳 4 个 LS 柱
达沙替尼Sigma-AldrichCDS023389
DNase IRoche10104159001
Eagle’s Ham’s 氨基酸培养基Sigma-AldrichC5572
gentleMACSMiltenyi130-093-235自动化组织解离仪
gentleMACS C 管Miltenyi130-093-237自动化组织解离仪专用管
含 Ca++ 或 Mg++ 的 Hank's 平衡盐溶液Corning21-020-CM
HEPESGibco15630080
氯胺酮VedcoNDC 50989-996-06
Liberase TMRoche5401119001
Pacific Blue 标记的抗小鼠 CD45 抗体（克隆：30-F11）Biolegend103126
磁性细胞分离柱（LS 柱）Miltenyi130-042-401配有推杆
纯化的抗小鼠 CD16/32 抗体（克隆：93）Biolegend101302
不含 L-谷氨酰胺的 RPMI 1640 培养基Corning15-040-CM
0.9% 氯化钠（生理盐水）CytivaZ1376
赛拉嗪PivetalNDC 466066-750-02

参考文献

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