方法文章

利用肽：主要组织相容性复合体四聚体鉴定小鼠肺中稀有抗原特异性T细胞

DOI：

10.3791/66939

⸱

2024年7月19日

 ,  , 
1Center for Immunology and Inflammatory Diseases, Division of Rheumatology, Allergy, and Immunology, Massachusetts General Hospital, 2Division of Immunology, Boston Children's Hospital, 3Harvard Medical School, 4Division of Pulmonary and Critical Care Medicine, Massachusetts General Hospital

本文内容

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

我们提供了一种详细的实验方案，通过磁珠法富集T细胞结合肽：主要组织相容性复合体（MHC）四聚体技术，从小鼠肺组织中分离并鉴定稀有的抗原特异性T细胞群体。

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

在健康与疾病状态下对抗原特异性T细胞的鉴定与表征，仍是深化免疫病理生理学理解的关键。针对在内源性T细胞库中追踪抗原特异性T细胞群体的技术难题，肽：MHC四聚体试剂的开发已带来显著进展。这些荧光标记的可溶性多聚体由MHC I类或II类分子与抗原肽表位复合而成，能够直接结合具有相应T细胞受体（TCR）特异性的T细胞，从而可在无需诱导功能性反应的情况下，识别处于天然状态的抗原特异性T细胞群体。 离体 刺激。对于极为稀有的细胞群体，可通过磁珠富集四聚体结合的T细胞，以提高检测的灵敏度和可靠性。

随着对组织驻留性T细胞免疫研究的不断深入，迫切需要鉴定那些迁移并驻留在非淋巴组织中的抗原特异性T细胞。本实验方案详细介绍了从小鼠肺组织中分离和鉴定抗原特异性T细胞的具体步骤。该方法包括从消化后的肺组织中分离T细胞，随后进行通用T细胞磁珠富集，再通过四聚体染色进行流式细胞术分析与分选。本方案所强调的步骤采用常规实验技术和易于获取的试剂，几乎适用于所有从事小鼠T细胞免疫学研究的研究人员，并且可高度适应于肺内任何低频率抗原特异性T细胞群体的多种下游分析。

引言

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

适应性免疫系统的核心在于T细胞识别并响应特定抗原的能力。T细胞在何时何地响应其同源抗原，决定了感染与自身免疫、稳态与癌症、健康与疾病之间的平衡1。因此，在特定免疫背景下研究T细胞时，应重点关注针对相关目标抗原具有特异性的T细胞。在诸多显著提升抗原特异性T细胞群体表征能力的技术进步中，最突出的是荧光标记的可溶性多聚体（通常为四聚体），即主要组织相容性复合物（MHC）I类或II类分子与抗原肽表位结合形成的复合物，更广为人知的名称是“肽-MHC四聚体”2,3,4,5。由于肽-MHC I类和II类四聚体代表了T细胞抗原受体（TCR）的天然配体，因此它们分别提供了一种直接识别免疫系统内源性T细胞库中抗原特异性CD8+和CD4+ T细胞的方法，且无需依赖实验中抗原刺激后的细胞应答。相较于TCR转基因T细胞过继转移模型，四聚体技术为研究抗原特异性T细胞提供了更为精确的方法6，并已越来越多地被用于在实验性小鼠模型及人类疾病中鉴定外来抗原和自身抗原特异性的T细胞群体4,5。

虽然四聚体能够轻易鉴定出因抗原刺激而扩增的高频T细胞群体，但其在初始T细胞、自身抗原特异性T细胞或记忆T细胞研究中的应用受到这些细胞群体频率极低的限制7。我们课题组及其他研究团队已开发并推广了基于四聚体的磁珠富集策略，该方法提高了检测灵敏度，使得在小鼠淋巴组织中对这些细胞群体的研究成为可能8,9,10,11。

组织驻留性T细胞的发现使研究领域更加重视开发新的方法来探究非淋巴组织中的T细胞。与其他许多黏膜表面类似，肺部的T细胞会接触到一系列来源于宿主上皮、共生微生物和致病微生物以及环境物质（包括过敏原）的自身和外来抗原。从非淋巴组织（NLT）中分离出的T细胞的转录组分析显示其具有类似记忆表型的特征，表现出独特的组织特异性命运和功能，通常与迁移及组织稳态相关12。此外，组织驻留记忆T细胞（Trms）相较于循环中的T细胞通常具有更严格的克隆限制性13。明确抗原如何以及为何驱动T细胞在NLT中驻留，对于理解免疫系统如何抵御感染、维持组织稳态，以及在某些情况下如何演变为自身免疫反应至关重要。然而，肺部组织驻留性T细胞的损耗似乎比其他NLT更为显著14。因此，识别和表征具有特定抗原反应性的内源性肺T细胞的能力受到其本身稀有性的限制。

通过结合使用磁珠介导的细胞富集技术和肽：MHC 四聚体染色方法，我们成功检测到小鼠肺组织中数量扩增但极为稀有的自身抗原特异性T细胞15,16在此，我们详细介绍了一种经过优化的实验方案，可用于可靠地分离和表征小鼠肺组织中任何稀有的抗原特异性T细胞群体图1）。该方案包含一个 体内 抗体染色步骤以区分组织驻留性T细胞与血管内T细胞17 随后采用两种不同的肺组织处理方法，以适应不同资源条件。接着进行通用的T细胞磁珠富集、四聚体染色及流式细胞术分析。本方案中通过添加氨基胍以阻断诱导型一氧化氮合酶（iNOS）介导的T细胞活化诱导的凋亡，从而进一步提高细胞活力和四聚体染色效果18 以及限制TCR下调的达沙替尼19本方案中强调的步骤采用了常规技术及易于获取的试剂，几乎适用于所有从事小鼠T细胞免疫学研究的研究人员，并可高度适配多种下游分析。尽管初始T细胞在肺组织中不太可能存在，但我们认为该方案对于研究肺部自身抗原特异性T细胞及驻留记忆性T细胞（Trms）将尤为有益。

小鼠肺细胞分离过程示意图；表面标志物分析的流式细胞术。
图1：实验方案流程概览。从小鼠中取出肺组织并解离为单细胞悬液。样本在使用肽：MHC 四聚体及荧光标记抗体染色前，先进行T细胞富集，随后进行流式细胞术分析。请点击此处查看该图的放大版本。

方案

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

本方案中所述操作程序均根据麻省总医院机构动物照护与使用委员会（IACUC）制定的指南批准并制定，该委员会隶属于美国实验动物照护评估认证协会（AAALAC）认证的动物管理项目。实验所用动物为在麻省总医院动物设施中饲养并维持的8至12周龄雄性和雌性C57BL/6遗传背景小鼠，饲养环境为特定病原体-free条件。

1. 配制储备溶液

  1. 通过溶解10 mM HEPES、5 mM KCl、1.8 mM CaCl2、150 mM NaCl和1 mM MgCl2配制HEPES缓冲液，并调节pH至7.4。
  2. 通过将700 µg/mL的Liberase Thermolysin Medium（TM）（见材料表）溶解于含Ca++和Mg++的Hank's平衡盐溶液（见材料表）中，配制10倍浓度的Liberase储存液。
  3. 通过将100 mM氨基胍半硫酸盐（Aminoguanidine Hemisulfate Salt）（见材料表）溶解于含Ca++和Mg++的Hank's平衡盐溶液（见材料表）中，配制10倍浓度的氨基胍储存液。
  4. 通过将EHAA培养基（见材料表）与10%胎牛血清（FBS）、100 U/mL青霉素/链霉素、50 µg/mL庆大霉素、2 mM L-谷氨酰胺和55 µM 2-巯基乙醇混合，配制完全Eagle's Ham's氨基酸（EHAA）培养基。
    注：也可使用其他常见的T细胞培养基，如RPMI或DMEM。
  5. 通过将1×PBS与2% FBS和0.05%叠氮化钠混合，配制分选缓冲液。
  6. 将纯化的抗小鼠CD16/32抗体（见材料表）以1:100（v/v）的比例用分选缓冲液稀释，配制Fc阻断液。
  7. 在不含L-谷氨酰胺的RPMI 1640培养基（见材料表）中加入100 µg/mL Liberase TM和50 µg/mL DNase I（见材料表），配制Liberase TM/DNase消化液。
  8. 将10 mg/mL氯胺酮（见材料表）和1 mg/mL赛拉嗪（xylazine）（见材料表）加入生理盐水（0.9% NaCl）（见材料表）中，配制氯胺酮/赛拉嗪混合液。

2. 通过自动化组织解离仪从肺组织制备单细胞悬液

  1. 每只小鼠准备 4 mL 冰冷的 HEPES 缓冲液，置于专用组织解离管中（见材料表），并保持在冰上。
  2. 通过腹腔注射 150–200 µL 氯胺酮/赛拉嗪混合物对小鼠进行麻醉。将 1–3 µg 荧光染料标记的抗小鼠 CD45 抗体（见材料表）溶于 100 µL 生理盐水中，静脉注射至每只麻醉后的小鼠体内。抗体注射 3 分钟后，通过腹腔注射 500–600 µL 氯胺酮/赛拉嗪混合物处死小鼠。
  3. 切除肺组织，并将其放入预先冰浴冷却的对应组织解离管中。将解离管置于自动组织解离仪上（见材料表），运行针对肺组织的第一个程序（预设程序）。
  4. 向每根含有已解离肺组织的解离管中加入 500 µL Liberase 储存液和 500 µL 氨基胍储存液。在 37 °C 条件下，于旋转混匀仪中孵育 30 分钟。
  5. 将解离管重新放回组织解离仪，运行第二个程序（预设程序）用于肺组织处理。
  6. 将组织解离管中的单细胞悬液通过 100 µm 细胞滤网（见材料表）过滤至 50 mL 锥形管中。用 5 mL 完全 EHAA 培养基（或任何等效的 T 细胞培养基）冲洗组织解离管，并将冲洗液一并通过滤网收集至 50 mL 锥形管中。
  7. 移除滤网，用完全 EHAA 培养基将细胞悬液体积补至 50 mL。在 4 °C 条件下，以 400 × g 离心 5 分钟。小心吸除上清液，保留约 100 µL 上清液及细胞沉淀。
  8. 加入约 100 µL Fc 封闭液，使总体积达到 200 µL，然后剧烈涡旋振荡以充分重悬细胞沉淀。

3. 替代方案：通过手动解离法从肺组织制备单细胞悬液

  1. 每只小鼠准备1 mL完全EHAA，置于1.5 mL微量离心管中，并置于冰上保存。
  2. 通过腹腔注射150-200 µL的氯胺酮/赛拉嗪混合液对小鼠进行麻醉。将1-3 µg荧光染料标记的抗小鼠CD45抗体溶于100 µL生理盐水中，经静脉注射至每只麻醉后的小鼠体内。在抗体注射3分钟后，通过腹腔注射500-600 µL氯胺酮/赛拉嗪混合液处死小鼠。
  3. 切除肺组织，并将其放入各自预先置于冰上冷却的1.5 mL微量离心管中。
  4. 待所有肺组织采集完成后，将每份肺组织转移至不含细胞培养基的新微量离心管中。
  5. 在微量离心管内用剪刀将肺组织剪成小片段（约2-3 mm大小的组织块）。
  6. 向每根离心管中加入1 mL Liberase TM/DNase I消化液混合物。
  7. 在37 °C水浴中孵育30分钟。随后将样品放回冰上，以防止过度消化。
  8. 将样品倾倒在置于50 mL锥形离心管上方的100 µm细胞滤筛上，使用无菌1 mL注射器推杆的橡胶端在滤网上碾压组织。
  9. 用冷的分选缓冲液冲洗滤筛，最终在离心管中收集7 mL液体。在4 °C条件下，以400 x g 离心5分钟。小心吸除上清液，保留约100 µL上清液及细胞沉淀。
  10. 加入100 µL Fc阻断液，使总体积达到200 µL，并剧烈涡旋震荡以充分重悬细胞沉淀。

4. 通过磁珠富集法富集肺样本中的T细胞

  1. 加入 50 µL 抗小鼠 CD90.2 磁珠（参见材料表）。涡旋混匀，并在 4 °C 下孵育 10 分钟。
    注意：CD90.2 对应于 C57BL/6 小鼠 T 细胞表达的等位基因。若使用其他品系小鼠，请核对等位基因型。
  2. 在此期间，将一根顺磁性细胞分离柱（参见材料表）安装到单联或四联细胞分离磁架上（参见材料表）。在每根分离柱下方放置一个开口的 15 mL 尖底离心管，用于收集流穿液。用 3 mL 冷分选缓冲液预冲洗分离柱，依靠重力使缓冲液自然流至下方离心管中。
  3. 细胞与磁珠孵育 10 分钟后，加入冷分选缓冲液至总体积为 1 mL，并通过置于分离柱顶部的 100 µm 细胞滤筛转移样品。将分离柱的流穿液收集至分离柱下方新放置的 15 mL 尖底离心管中。
  4. 待细胞悬液完全依靠重力流穿分离柱后，用额外的 3 mL 冷分选缓冲液冲洗原离心管，并将冲洗液通过滤网加入分离柱，以清洗滤筛。随后移除滤筛。
  5. 当样品再次完全流入分离柱且无进一步流穿液流出时，将分离柱从磁架上取下，并置于一支新的 15 mL 尖底离心管上方。
  6. 向分离柱中加入 5 mL 冷分选缓冲液。
  7. 立即通过一次性连续推动分离柱活塞至顶部，将结合在柱上的细胞洗脱下来，迫使分选缓冲液从柱底部流入新离心管中。
  8. 将洗脱所得样品在 4 °C 下以 400 × g 离心 5 分钟。小心吸除上清液，保留约 100 µL 上清液及细胞沉淀。
  9. 加入 100 µL 冷分选缓冲液，使总体积达到 200 µL，充分涡旋振荡以重悬细胞沉淀。
  10. 如需分析，可对含有未结合细胞组分的流穿液样品进行检测。

5. 使用肽：MHC 四聚体染色抗原特异性T细胞

  1. 向每个样本中加入 1 µL 的 10 µM Dasatinib（参见材料表），涡旋混匀，并在室温下孵育 5 分钟。
  2. 加入 PE 或 APC 标记的肽：MHC 四聚体，使其终浓度为 10 nM（或根据经验优化的特定四聚体浓度）。
  3. 涡旋混匀，在避光条件下于室温孵育 1 小时（或根据经验优化的时间和温度）。

6. 通过流式细胞术分析四聚体标记的T细胞

  1. 在样本使用肽：MHC 四聚体染色的同时，配制用于染色细胞表面标志物的抗体主混合液（表1）。
    ​注意：避免使用与静脉注射的 CD45 抗体或四聚体发生荧光冲突的荧光染料。
  2. 在四聚体染色孵育期还剩 15 分钟时，向每份样本中加入按 1:100（或经经验优化的浓度）稀释的表面抗体主混合液。
  3. 继续在室温下避光孵育，直至完成总共 1 小时的孵育时间。
  4. 加入 50,000 个流式细胞术计数微球（见材料表），并加入冷分选缓冲液至终体积约 5 mL。在 4 °C 条件下，以 400 × g 离心 5 分钟。小心吸除上清液，保留约 100 µL 上清液以及细胞/微球沉淀。
  5. 用额外的 200 µL 分选缓冲液重悬样本，并将样本转移至 5 mL 荧光激活细胞分选（FACS）管中。
  6. 在流式细胞仪上分析样本。尽可能收集更多细胞，最多不超过总计 2,500,000 个事件。确保至少已收集 20,000 个微球计数事件。保持采集速率在每秒 5,000 个事件或以下。
  7. 将所有数据保存为 FCS 文件。

  

荧光染料抗体
BUV395CD90.2
Pacific BlueCD45（通过静脉注射预先加入）
Pacific OrangeCD8
Brilliant Violet 785CD4
FITCCD3
PerCP-Cy5.5排除标记抗体（B220, CD11b, CD11c, F4/80）
PEpMHC 四聚体或表型标记
PE-Cy7表型标记（例如 CD44, PD-1, CD69 等）
APCpMHC 四聚体或表型标记
AlexaFluor 700表型标记（例如 CD44, PD-1, CD69 等）
APC-Cy7活死染色

表1：样本染色矩阵。 用于鉴定和表征抗原特异性T细胞的典型荧光素偶联流式细胞术抗体组合。

7. 数据分析

  1. 使用合适的流式细胞术软件分析 FCS 数据文件。
    1. 设置一系列连续的包含性门控，以鉴定出：1）类似淋巴细胞的，2）单细胞的，3）活细胞，4）血管外，5）倾倒通道阴性，以及6）CD90.2阳性且CD4或CD8阳性的细胞事件（图2）。
    2. 在上述细胞群中鉴定四聚体阳性T细胞。
  2. 通过计算样本运行过程中加入的微球数（50,000）与实际采集到的微球数的比值，并将该比值乘以采集到的四聚体阳性细胞总数，从而确定四聚体阳性细胞的绝对数量。
    四聚体检测公式，用于计算总的四聚体阳性细胞数，是免疫学实验中的关键步骤。

结果

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

图2展示了利用肽：MHC II类四聚体在肺部鉴定稀有抗原特异性CD4+ T细胞的代表性设门策略。相同的方法也可用于通过肽：MHC I类四聚体鉴定抗原特异性CD8+ T细胞（数据未显示）。

由于肺组织中含有大量非淋巴样细胞，通过四聚体技术可靠地检测稀有抗原特异性T细胞需要对目标T细胞进行某种形式的预先富集，以提高信噪比。图3展示了本方案中所述基于CD90.2抗体的磁性富集法从肺组织中富集总T细胞的效果。通过该富集方法，我们平均可回收肺中超过99%的CD90.2+ T细胞，且纯度超过90%。图4展示了经此富集后对稀有四聚体阳性CD4+ T细胞的检测效果改善情况，相较于未富集或直接采用四聚体为基础的细胞富集策略具有明显优势。

图5展示了经达沙替尼处理后抗原特异性T细胞的四聚体标记效果得到改善，尤其是在稀有细胞群中更为明显。

流式细胞术示意图；淋巴细胞设门过程；用于鉴定T细胞；使用FSC、SSC参数。
图2：流式细胞术分析的设门策略。 通过逐级的包含与排除设门，鉴定在急性组织损伤后积聚于肺部的稀有自身抗原特异性CD4+ T细胞。计数微球可根据其在FITC通道中的荧光信号直接识别。请点击此处查看该图的放大版本。

肺部T细胞富集的流式细胞术图谱，比较未结合组分与结合组分。
图3：基于CD90.2抗体的磁珠富集法从肺组织中富集总T细胞。图中显示了肺组织样本经富集后，未结合组分（左）和结合组分（右）的代表性流式细胞术图谱。请点击此处查看该图的放大版本。

显示CD44与四聚体染色的流式细胞术图谱；细胞富集方法的比较。
图4：比较细胞富集策略以提高肺中稀有抗原特异性T细胞的检出率。三只在肺上皮细胞中表达模型自身抗原的小鼠，通过皮下注射用完全弗氏佐剂（CFA）乳化的自身抗原肽表位进行免疫。7天后，收集小鼠肺组织并合并，均分为三份，分别在无细胞富集（左）、基于CD90.2抗体的细胞富集（中）或基于四聚体的细胞富集（右）条件下进行四聚体染色。样品通过流式细胞术分析，总事件数不超过1,500,000个（显示CD4+门控事件）。四聚体阳性事件数以黑色标注，而肺组织样本中抗原特异性T细胞的计算总数以红色标示。请点击此处查看该图的放大版本。

流式细胞术图谱比较达沙替尼对野生型与CC10-USA小鼠Tet表达的影响。
图5：达沙替尼处理增强四聚体染色。 将野生型小鼠（左）或在肺上皮中表达模型自身抗原的小鼠（右）通过皮下注射方式免疫，所用抗原为来自该自身抗原的肽段表位，并以完全弗氏佐剂（CFA）乳化。收集小鼠的脾脏及淋巴器官，合并后均分为两份样本，分别用于肽-MHC II类四聚体染色，其中一份在染色前经达沙替尼预处理。图中叠加显示了有（红色）或无（蓝色）达沙替尼处理样本的四聚体染色直方图，每份样本的中位荧光强度已标出。 请点击此处查看该图的放大版本。

讨论

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

既往对肺部抗原特异性T细胞的表征得益于急性初始刺激事件（如鼻内免疫或感染）后大量扩增的抗原特异性T细胞，从而提供了充足的细胞数量20,21,22。然而，肺部较为稀有的T细胞群体，例如自身抗原特异性T细胞或组织驻留记忆T细胞，在缺乏针对目标T细胞的某种样本富集手段时，难以被检测到15,16,23。我们通过结合先前描述的肺组织解离技术，以获得高比例的活淋巴细胞24,25，并整合一种区分血管内与实质T细胞的策略，以及基于T细胞的通用富集方法，随后进行四聚体染色17，实现了这一目标。利用本方案，我们已证明能够识别并表征肺中针对自身抗原的稀有T细胞，这些T细胞可由外源性肽段直接免疫或组织损伤过程中抗原释放所引发的间接激活而产生15,16。在本方案的开发过程中，考虑了多个关键因素。

我们介绍了两种效果良好的肺组织处理方案。一种方案使用自动组织解离仪器，另一种则依赖手动操作。重要的是，这两种方法均使用Liberase TM，这是一种胶原酶I和II的混合物，其中还含有金属蛋白酶嗜热菌蛋白酶。研究表明，与单一胶原酶混合物相比，该酶混合物可增强消化活性，并且在从肺组织中回收白细胞方面表现出良好效果26。

自动组织解离方案需要前期投入较高成本用于购买仪器和专用的组织解离管，但这些解离管可清洗后与细胞筛网一同重复使用，而细胞筛网通常也可重复使用。手动解离方案无需购置专用设备的前期投入，但耗时耗力，且由于每个样本需单独切割，延长了收获时间。两种方案在是否使用氨基胍或DNase I以减少细胞死亡和细胞聚集方面也存在差异，但我们尚未系统比较这些添加剂的影响。选择使用哪种方案应根据研究类型的操作经验以及是否具备自动组织解离仪器而定，其中仪器的可用性是成本方面的最主要因素。实际上，可将两种方案中的步骤灵活组合，以满足特定研究需求并实现最佳效果。

上述方案显著地省略了使用密度梯度法从组织解离所制备的单细胞悬液中分离淋巴细胞的步骤。我们发现，为鉴定稀有抗原特异性T细胞所需的磁珠富集T细胞步骤可省去此操作。然而，当抗原特异性T细胞频率足够高，足以完全省略T细胞富集步骤时，建议使用密度梯度法，因为该方法可通过去除大量非淋巴样细胞，实现目标细胞的显著富集。此外，如果肺组织单细胞制备物特别大量和/或含有较多杂质，则可在磁珠富集前采用密度梯度步骤，以去除可能堵塞后续分离柱的过量细胞碎片（步骤4.4–4.7）。

我们选择基于CD90泛T细胞标记物（在C57BL/6小鼠中表达的等位基因为CD90.2）对所有T细胞进行通用富集，而不是采用更直接的四聚体（tetramer）介导的细胞富集策略。该方法具有多项优势。（1）与未富集样本或基于四聚体的富集样本相比，基于CD90的富集在流式细胞术中可检测到更高数量的抗原特异性事件（图4）。这有助于更准确地估算稀有抗原特异性T细胞的频率，而无需采集过多的总事件数（>2,500,000），从而避免延长样本采集时间并降低信噪比分辨率。（2）与基于四聚体的富集不同，基于CD90的富集可在同一样本中全面评估肺部T细胞区室，包括CD4+和CD8+ T细胞、血管内与血管外T细胞，以及抗原特异性与非抗原特异性T细胞（图2）。（3）由于基于CD90的富集步骤在四聚体染色之前进行，因此可最大限度缩短四聚体标记细胞在流式细胞仪上分析前的时间，从而减少因四聚体脱落导致的信号丢失风险。

本方案中的T细胞富集过程基于使用CD90.2磁珠的阳性选择法，但采用CD4、CD8或全T细胞分离试剂盒提供的阴性选择策略也可获得类似结果。我们描述了特定品牌的微珠、层析柱和磁铁的使用方法，但其他磁性富集系统同样适用。选择何种方法应基于具体研究中的实际表现以及总体成本，后者可能相当高昂。根据我们对富集方案的经验，目标细胞的得率与纯度之间通常存在权衡；而在检测极为稀少的抗原特异性T细胞时，优先考虑得率。

尽管代表性结果展示的是涉及CD4+ T细胞和肽段:MHC II类四聚体的实验，但本方案同样适用于CD8+ T细胞和肽段:MHC I类四聚体。在这些情况下，应考虑I类四聚体染色可能需要的不同条件（浓度、时间、温度）。此外，我们未发现任何理由排除将其用于抗原特异性B细胞研究，只需使用适当的荧光染料标记的B细胞抗原试剂即可27。

最后，本方案中还包括在四聚体染色前向样本中添加蛋白激酶抑制剂达沙替尼（Dasatinib）。达沙替尼可阻断T细胞受体（TCR）信号传导及内化过程，从而在改善T细胞四聚体标记的同时，可能减少四聚体诱导的T细胞死亡19。我们发现，达沙替尼处理在检测较稀有的自身抗原特异性T细胞群体时效果尤为显著。这很可能是因为，在中枢耐受过程中经历阴性选择后，自身抗原特异性T细胞表达的TCR亲和力较低28,29,30,31。

本实验方案已成功与细胞内染色技术联用，用于分析稀有肺驻留抗原特异性T细胞中转录因子和细胞因子的表达。我们还成功对这些稀有细胞群进行了流式分选，用于后续分析，包括单细胞转录组学和TCR测序。该方案的持续应用与优化将极大促进肺部病理生理过程中适应性免疫的研究。

披露

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

作者声明无利益冲突。

致谢

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

感谢 L. Kuhn 在组织处理和四聚体生产方面提供的技术支持。本研究由美国国立卫生研究院（R01 AI107020 和 P01 AI165072 资助 J.J.M.，T32 AI007512 资助 D.S.S.）、马萨诸塞州病原体应变能力联盟（J.J.M.）以及麻省总医院研究执行委员会（J.J.M.）提供经费支持。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
100 mm 细胞筛Fisher Scientific22-363-549
不含 Ca++ 或 Mg++ 的 10x PBSCorning46-013-CM
不含 Ca++ 或 Mg++ 的 1x PBSCorning21-031-CV
AccuCheck 计数微球InvitrogenPCB100
氨基胍半硫酸盐Sigma-AldrichA7009
小鼠 CD90.2 磁珠Miltenyi130-121-278
细胞分离磁铁（MidiMACS 分离器）Miltenyi130-042-302可容纳单个 LS 柱
细胞分离磁铁（QuadroMACS 分离器）Miltenyi130-090-976可容纳 4 个 LS 柱
达沙替尼Sigma-AldrichCDS023389
DNase IRoche10104159001
Eagle’s Ham’s 氨基酸培养基Sigma-AldrichC5572
gentleMACSMiltenyi130-093-235自动化组织解离仪
gentleMACS C 管Miltenyi130-093-237自动化组织解离仪专用管
含 Ca++ 或 Mg++ 的 Hank's 平衡盐溶液Corning21-020-CM
HEPESGibco15630080
氯胺酮VedcoNDC 50989-996-06
Liberase TMRoche5401119001
Pacific Blue 标记的抗小鼠 CD45 抗体（克隆：30-F11）Biolegend103126
磁性细胞分离柱（LS 柱）Miltenyi130-042-401配有推杆
纯化的抗小鼠 CD16/32 抗体（克隆：93）Biolegend101302
不含 L-谷氨酰胺的 RPMI 1640 培养基Corning15-040-CM
0.9% 氯化钠（生理盐水）CytivaZ1376
赛拉嗪PivetalNDC 466066-750-02

参考文献

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