我们描述了制备小鼠胸腺上皮细胞单细胞悬液以及对细胞内分子进行染色以用于流式细胞术分析的实验方案。
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方法文章
小鼠胸腺上皮细胞单细胞悬液的制备及细胞内分子染色用于流式细胞术分析
* These authors contributed equally
本文内容
摘要
摘要
胸腺上皮细胞（TECs）在促进T细胞的发育和受体库选择中发挥着至关重要的作用。位于胸腺皮质的皮质胸腺上皮细胞（cTECs）可诱导早期T细胞发育并对皮质胸腺细胞进行阳性选择。相比之下，位于胸腺髓质的髓质胸腺上皮细胞（mTECs）则吸引来自皮质的阳性选择胸腺细胞，并在T细胞中建立自身耐受。多种分子参与支持胸腺功能以促进T细胞的发育与选择，其中包括cTECs中表达的DLL4和beta5t，以及mTECs中表达的Aire和CCL21。尽管目前制备TECs单细胞悬液的方法仅能从年轻成年小鼠胸腺中回收少量TECs（cTECs约1%，mTECs约10%），但对cTECs和mTECs中功能相关分子进行流式细胞术分析仍有助于加深我们对TECs生物学特性的理解。由于TECs中许多功能相关分子定位于细胞内，本文描述了我们用于制备小鼠TECs单细胞悬液以及对细胞内分子进行染色以进行流式细胞术分析的实验方案。
引言
胸腺是一种上皮-间充质器官，可促进T淋巴细胞的发育及其受体库的选择。在胸腺的皮质和髓质微环境中，胸腺上皮细胞（TECs）在指导T细胞发育和选择过程中发挥关键作用。目前普遍认为，胸腺皮质中的皮质胸腺上皮细胞（cTECs）主要参与诱导早期T细胞发育，并促进新生成的表达T细胞抗原受体（TCR）的胸腺细胞进行阳性选择。相比之下，胸腺髓质中的髓质胸腺上皮细胞（mTECs）对于吸引来自皮质的阳性选择胸腺细胞至关重要，并通过清除自身反应性T细胞以及生成调节性T细胞来建立中枢自身耐受1,2。TECs在支持T细胞发育和选择方面的这些功能，是通过cTECs和mTECs中表达的多种分子介导的。
这些分子包括Delta样配体4（DLL4），对淋巴样前体细胞的T细胞谱系特化至关重要3,4；beta5t（也称为Psmb11，对CD8 T细胞的阳性选择至关重要）5,6；以及Prss16（也称为胸腺特异性丝氨酸蛋白酶，或TSSP，对CD4 T细胞的阳性选择至关重要）7,
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方案
所有小鼠实验均在国家癌症研究所动物护理和使用委员会（ASP21-431、ASP21-432 和 EIB-076-3）的批准下进行。
1. 胸腺细胞悬液的制备
注意：小鼠的个体发育会影响从胸腺中酶解分离胸腺上皮细胞（TEC）的效率。以下根据小鼠年龄描述了三种方法。
- 适用于出生后超过3周的小鼠
- 从小鼠体内取出胸腺（两个胸腺叶），置于盛有5 mL含10 mM HEPES的RPMI1640培养基的60 mm塑料培养皿中，冰上放置。
- 在解剖显微镜下，使用弯头精细镊子去除血液、非胸腺组织和脂肪。用解剖剪将胸腺剪成小块（大小约1-2 mm）。
- 将胸腺组织块转移至含有3 mL RPMI1640培养基的15 mL锥形管中，培养基中含1 mg/mL胶原酶/分散酶和1 U/mL DNase，并含2%胎牛血清（FBS）。在37 °C水浴或加热块中孵育20分钟。
- 用3 mL塑料移液管轻轻混匀。若组织碎片仍可见，则继续孵育20分钟。
- 用3 mL塑料移液管轻轻混匀。若组织碎片仍可见，则继续孵育10分钟。
- 用3 mL塑料移液管轻轻混匀，加入5 mL含1% FBS的1x HBSS中的5 mM EDTA溶液。
- 将细胞悬液通过60 µm尼龙滤网过滤....
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结果
分析需要一台能够检测至少六个荧光通道（用于 CD45、EpCAM、Ly51、UEA1、Ghost Dye 以及 beta5t、CCL21 和/或 Aire）并具备前向散射和侧向散射参数的流式细胞仪。图中展示了 0 日龄小鼠和 2 周龄小鼠经胶原酶/分散酶消化后的胸腺细胞的代表性流式细胞术图谱 图1 和 图2，分别。在这两幅图中，面板中的点图 A 显示总颗粒信号的前向散射（FSC）强度和Ghost Dye Violet 510荧光强度。根据Ghost Dye试剂的阴性染色结果以及前向散射反映的细胞大小判断，超过90%的颗粒信号代表活细胞。图示 B 显示胸腺活细胞表面CD45和EpCAM的荧光信号，CD45为造血细胞表达的分子，EpCAM为上皮细胞表达的分子。其中存在一小群但特征明显的CD45阳性细胞- EpCAM+因此代表胸腺上皮细胞（TECs）。
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讨论
胶原酶（可联合或不联合中性蛋白酶Dispase）被广泛用于消化小鼠胸腺以制备胸腺上皮细胞（TECs）4,5,9,18,21。Liberase是一种包含胶原酶等多种蛋白酶的混合酶制剂，也常用于胸腺消化以制备TECs17,22。使用胶原酶与Liberase从小鼠胸腺中获得的皮质型胸腺上皮细胞（cTECs）和髓质型胸腺上皮细胞（mTECs）在产量和质量上基本相当，尽管不同批次的酶产品可能导致细微差异。胰蛋白酶也可用于高效消化胸腺21,23，但已有研究表明，TECs表达的多种细胞表面分子（如.......
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致谢
感谢大崎泉博士对文稿的审阅。本工作由美国国立卫生研究院、国家癌症研究所和癌症研究中心的院内研究计划项目 ZIA BC 011806 资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 胶原酶/分散酶 | Roche | 11097113001 | |
| Liberase TM | Roche | 5401127001 | |
| Foxp3 / 转录因子染色缓冲液套装 | eBioscience | 00-5523-00 | |
| Ghost Dye Violet 510 | Tonbo | 13-0870-T500 | |
| BV421 抗小鼠 CD45 单克隆抗体，克隆号 30-F11 | BD Horizon | 563890 | |
| Alexa Fluor 647 抗小鼠 Ly51 单克隆抗体，克隆号 6C3 | BioLegend | 108312 | |
| PE/Cy7 抗小鼠 EpCAM/CD326 单克隆抗体，克隆号 G8.8 | BioLegend | 118216 | |
| DyLight 594 欧洲荆豆凝集素 I (UEA1) | Vector Laboratories | DL-1067-1 | |
| Alexa Fluor 488 抗小鼠 Aire 单克隆抗体，克隆号 5H12 | eBioscience | 53-5934-82 | |
| 抗小鼠 Psmb11/beta5t 兔单克隆抗体，克隆号 CPTC-PSMB11(mouse)-1 | NIH NCI | CPTC-PSMB11(mouse)-1 | https://proteomics.cancer.gov/antibody-portal |
| 抗小鼠 CCL21/exodus 2 兔多克隆抗体 | Bio-Rad | AAM27 | |
| Alexa Fluor 555 抗兔 IgG 重链山羊重组抗体 | Invitrogen | A27039 | |
| 抗小鼠 CD32/CD16 – 纯化型（Fc 阻断抗体） | Leinco Technologies | C247 | |
| 60 微米尼龙筛网 | Component Supply | W31436 | |
| 设备 | |||
| Thermomixer | Eppendorf | 加热模块 | |
| Cellometer Auto 2000 细胞活力计数仪 | Nexcelom | 活细胞计数 | |
| LSRFortessa 细胞分析仪 | BD Biosciences | 流式细胞仪 | 五激光系统（355、408、488、595 和 637 nm） |
| FACSDiva 软件 9.0.1 版本 | BD Biosciences | 流式细胞分析 | |
| FlowJo 10.9.0 | BD Biosciences | 流式细胞数据处理 | |
| 抗体 | 稀释比例（工作浓度） | 稀释缓冲液 | |
| 抗小鼠 CD32/CD16 – 纯化型（Fc 阻断抗体） | 1:40 | FACS 缓冲液 | |
| BV421 抗小鼠 CD45 单克隆抗体 | 1:25 | FACS 缓冲液 | |
| PE/Cy7 抗小鼠 EpCAM/CD326 单克隆抗体 | 1:100 | FACS 缓冲液 | |
| Alexa Fluor 647 抗小鼠 Ly51 单克隆抗体 | 1:100 | FACS 缓冲液 | |
| DyLight 594 欧洲荆豆凝集素 I (UEA1) | 1:400 | FACS 缓冲液 | |
| 抗小鼠 CCL21/exodus 2 兔多克隆抗体 | 1:200 | 1x 通透缓冲液 | |
| 抗小鼠 Psmb11/beta5t 兔单克隆抗体，克隆号 CPTC-PSMB11(mouse)-1 | 1:1000 | 1x 通透缓冲液 | |
| Alexa Fluor 555 抗兔 IgG 重链山羊重组抗体 | 1:400 | 1x 通透缓冲液 | |
| 缓冲液 | 用途 | ||
| 含 10 mM HEPES 的 RPMI1640 | 用于细胞制备 | ||
| 含 2% FBS 的 RPMI1640 | 用于细胞制备 | ||
| FACS 缓冲液（含 1% BSA 和 0.1% 叠氮化钠的 1x HBSS） | 用于细胞制备和抗体染色 | ||
| 含 1 mg/ml 胶原酶/分散酶和 1 U/ml DNase 的 RPMI1640（含 2% FBS） | 用于酶消化 | ||
| 含 2% PFA 的 PBS | 用于细胞固定 | ||
| 固定/通透缓冲液（1 份固定/通透浓缩液与 3 份固定/通透稀释液混合） | 用于细胞固定 | ||
| 1x 通透缓冲液（1 份 10X 浓缩液与 9 份蒸馏水混合） | 用于胞内抗体染色 |
参考文献
- Klein, L., Kyewski, B., Allen, P. M., Hogquist, K. A. Positive and negative selection of the T cell repertoire: what thymocytes see (and don't see). Nat Rev Immunol. 14 (6), 377-391 (2014).
- Takahama, Y., Ohigashi, I., Baik, S., Anderson, G. Generation of diver....
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重印与许可
