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利用划痕伤口迁移实验和球体出芽实验在功能和分子水平上研究血管生成

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DOI：

10.3791/66954

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2024年5月31日

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1Eye Center, Medical Center - University of Freiburg, Faculty of Medicine, University of Freiburg, 2Department of Medicine I, Medical Center - University of Freiburg, Faculty of Medicine, University of Freiburg, 3Institute of Pharmaceutical Sciences, Faculty of Chemistry and Pharmacy, University of Freiburg, 4Pharmacy, Medical Center - University of Freiburg, Faculty of Medicine, University of Freiburg, 5Ophtha-Lab, Department of Ophthalmology, St. Franziskus Hospital Muenster

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

本研究介绍了二维（2D）划痕伤口迁移实验和三维（3D）球状体出芽实验，以及相应的下游分析方法，包括RNA提取和免疫细胞化学，这些实验是研究血管生成的适宜方法 体外.

摘要

血管生成在机体的生理和病理过程中均发挥着关键作用，包括肿瘤生长或新生血管性眼病。深入了解其潜在的分子机制并建立可靠的筛选模型，对于有效靶向治疗疾病以及开发新的治疗方案至关重要。目前已开发出多种体外（in vitro）检测方法用于模拟血管生成，利用可控环境的优势，在分子水平上阐明促血管生成的驱动因素，并用于治疗靶点的筛选。

本研究介绍了用于研究血管生成的工作流程 体外 使用人脐静脉内皮细胞（HUVECs）。我们详细描述了一种划痕伤口迁移实验，该实验利用活细胞成像系统，在二维条件下测定内皮细胞的迁移能力；同时还介绍了球状体出芽实验，该实验在由胶原基质提供的三维环境中评估内皮细胞的出芽行为。此外，我们概述了样本制备策略，以支持进一步的分子分析，特别是在三维条件下进行转录组学研究，包括RNA提取和免疫细胞化学染色。总体而言，该技术框架为科研人员提供了一套可靠且多功能的工具，可用于开展相关科学探究 体外 血管生成实验

引言

血管生成是指从已有的血管形成新血管的过程1，在生理发育和病理状态下均是一个关键过程。它对于为代谢活跃的组织（如视网膜2或发育中的中枢神经系统3）提供能量以及在受损组织修复过程中至关重要4。另一方面，异常的血管生成是多种疾病的病理基础。实体瘤（如结直肠癌或非小细胞肺癌）通过促进血管生成来支持其生长并获得必要的能量供应5。除癌症外，眼部的新生血管疾病，如糖尿病视网膜病变或年龄相关性黄斑变性，这些是发达国家致盲的主要原因，均源于异常的血管生长6,7。深入理解其潜在的病理机制，对于明确如何在促进生理性血管生成（例如在伤口愈合中）的同时更好地控制病理性状况（如血管增殖性眼病）具有重要意义。

在细胞水平上，血管内皮细胞在血管生成过程中被多种信号分子激活，从而启动细胞增殖和迁移8。随后，这些细胞形成层级结构，其中不增殖的顶端细胞在新生血管分支的前沿形成丝状伪足8。与此同时，快速增殖的柄细胞紧随顶端细胞之后，促进新生血管的形成。随后，其他类型的细胞（如周细胞或平滑肌细胞）被募集到新生分支处，进一步增强其稳定性9。

为了在血管内皮细胞水平上探究分子过程，许多 体外 已开发出相关方案并进行了近期综述10这些实验通常分为两类：较为简单但可扩展的二维方法和更为复杂的三维方案。在最近的一项研究中，我们对二维划痕伤口迁移实验与三维球体出芽实验进行了全面的比较分析。11 评估它们之间差异的程度以及模拟血管生成不同方面的潜力12.

尽管两者都具有可靠且易于实施的优点，但在分子水平上，与...相比，三维球体出芽实验在解决血管生成的关键方面更具优势 体内 数据，例如代谢转换或细胞-基质相互作用。由于 体外 血管生成实验用于评估信号通路的血管调节潜能13 并用于筛选治疗剂，以及评估其可转移性 体外 结果至 体内 在受控条件下，针对血管生成过程进行靶向调控后，从RNA和蛋白质水平开展基于组学的分析，以表征分子层面的变化，这一优势仍然至关重要，相较于其他方法具有重要意义。 体内 设置14,15.

本文中，我们介绍了一系列关键实验方法，用于通过活细胞成像迁移实验和球状体出芽实验来研究血管生成相关问题，并结合后续分子分析，如转录组测序分析以及蛋白质水平的免疫组织化学检测。

方案

1. 人脐静脉内皮细胞（HUVEC）培养

注意：所有后续步骤均须在无菌条件下进行（无菌工作台内操作）。

  1. 扩增 HUVECs
    1. 对于两种血管生成实验，均使用混合的人脐静脉内皮细胞（HUVECs）或人微血管内皮细胞（HMVECs）。
    2. 在未包被的 T75 培养瓶中，使用内皮细胞生长培养基（EGM）培养细胞，直至细胞融合度达到 90% 后进行传代。每周更换培养基三次。
      注：为加快细胞生长，可每日更换培养基。HUVECs 传代次数不得超过第六代。本研究中所有实验均使用相同代次的 HUVECs，结果最为一致。
  2. 传代 HUVECs
    1. 当 T75 培养瓶中的 HUVECs 达到所需融合度时，先用 5 mL 磷酸盐缓冲液（PBS）冲洗一次，随后在培养箱中加入 0.5% 胰蛋白酶孵育 2 分钟。
      ​注：长时间暴露于胰蛋白酶会损伤 HUVECs 的功能。
    2. 轻轻敲击培养瓶使细胞脱落，并在倒置相差显微镜下确认细胞是否已完全脱落。
    3. 加入 8 mL EGM 终止消化，将细胞悬液转移至离心管中，在 250 ×g 条件下离心 3 分钟以收集细胞沉淀。
    4. 如需进行细胞计数，将细胞沉淀用 5 mL EGM 重悬，并使用血细胞计数板（Neubauer 计数室）进行计数；否则，直接加入 40 mL EGM，均匀分配至 4 个新的 T75 细胞培养瓶中。

2. 划痕损伤迁移实验

注意：划痕伤口迁移实验需要持续3天才能完成（图1）。所有以下步骤均须在无菌工作条件（无菌工作台）下进行。

  1. 细胞铺板与饥饿处理（第1天）
    1. 使用专用于活细胞成像的96孔板，每孔加入含EGM培养基的20,000个HUVECs，总体积为100 µL。将细胞放入培养箱中静置6小时，使其贴壁。
      注意：建议根据不同供应商和实验室间血管内皮细胞生长速度的差异，优化接种细胞数量。目标是在划痕前一日获得完全融合的单层细胞。细胞密度过高可能改变内皮细胞行为，例如引发接触抑制16；而单层不完整则会严重影响后续分析。
    2. 所有孔均加入含2% FBS的EBM培养基100 µL，过夜饥饿处理。
      注意：操作时需小心避免损伤细胞单层，尤其是在使用多通道移液器时。
  2. 准备刺激溶液（第2天）
    1. 将所需处理物质及对照品溶于补充了2% FBS的内皮细胞基础培养基（EBM）中，每孔加入100 µL溶液。
      注意：添加2% FBS的EBM可作为阴性对照，而25 ng/mL的重组人血管内皮生长因子（VEGF）可作为阳性对照。使用96孔板时，建议实验至少设置技术重复（即相同条件的4个孔），但为获得更优结果，推荐使用8个重复孔。在设计实验布局时，应尽量减少边缘效应或角落效应的影响。
  3. 制造划痕（第2天）
    1. 在显微镜下检查细胞，确认已形成融合单层且细胞状态良好。将96孔板放入96孔划痕制造工具中，通过下压装置杠杆产生划痕。在释放杠杆前，应先小心取下划痕工具的盖子，以防止产生二次划痕。
    2. 每孔加入200 µL含2% FBS的EBM，清洗两次。在显微镜下确认细胞碎片已被有效清除。
  4. 细胞刺激处理（第2天）
    1. 每孔加入100 µL预先配制好的刺激溶液或对照溶液。
  5. 成像（第2–3天）
    1. 使用活细胞成像显微镜的自动程序，每小时采集一次图像，持续最长24小时。
      注意：为确保图像质量，在将96孔板转移至活细胞成像系统所处的培养箱后，应立即对每个孔进行扫描。在培养箱中适应30分钟有助于提高图像清晰度。显微镜软件应设置为每小时对每个孔的划痕中线位置采集一张图像。
  6. 若无划痕制造工具和活细胞成像仪，可按以下步骤操作。
    1. 在24孔板中使用移液枪头人工制造划痕，并在特定时间间隔使用传统细胞培养显微镜拍摄图像。建议使用配备精确X-Y轴定位功能的电动显微镜，以实现自动定位，确保在预设位置一致地获取图像。
      注意：若必须手动成像，一种可行方案是仅采集处理前（T0）和处理后某一时间点（'x'小时）的图像。在本方案中，使用HUVECs时，T12（刺激后12小时）是一个理想的时间点，此时阴性对照与VEGF刺激的阳性对照之间差异明显。然而，建议各实验室先进行初步的时间序列实验，每1小时或2小时成像一次，以确定适用于自身实验条件的最佳观察时间点。
  7. 数据分析（第3天）
    1. 活细胞成像显微镜的软件可能支持对采集图像的直接分析。定义用于标记细胞区域、初始划痕区域以及相对伤口密度区域的掩模，并基于对比度差异确定细胞边界。
      注意：在HUVECs实验中，采用的参数设置为：分割调整值1.6，填补孔洞面积500 µm2，调整尺寸1像素，面积>500 µm，偏心率>0.6。必须结合实际图像对细胞识别参数进行仔细的视觉验证。在优化配置后，软件可自动计算随时间变化的相对伤口密度（RWD），并生成包含技术重复标准差（SD）的时间曲线图。该数据可用于后续统计分析。

3. 使用二维培养细胞提取 RNA

注意：在无菌操作条件（无菌操作台）下进行从本步骤至步骤 3.3 的所有操作。

  1. 铺板细胞（第1天）
    1. 按照HUVEC细胞培养方案的第1.2步操作，消化HUVEC细胞。
    2. 在12孔板中每孔接种50,000个细胞，每孔加入2 mL EGM培养基。
    3. 6小时后更换培养基为含2% FBS的EBM（饥饿培养基），进行过夜饥饿处理。
  2. 细胞处理（第2天）
    1. 将待测试剂用含2% FBS的EBM稀释，替换饥饿培养基，将细胞置于培养箱中孵育所需时间。
  3. RNA提取（第2–3天）
    1. 每孔加入750 µL Trizol裂解细胞，在摇床上孵育10分钟。
    2. 用1000 µL移液器反复吹打重悬样品，随后转移至特制的低吸附RNA管（体积1.5 mL）中，于-80 °C保存。

4. 使用二维培养细胞进行免疫细胞化学染色

注意：从以下步骤开始至步骤 4.4，均需在无菌工作条件（无菌工作台）下进行。

  1. 盖玻片的准备
    1. 将100个直径为12 mm的盖玻片置于50 mL离心管中，加入含5%氢氧化钾的甲醇溶液，振荡孵育30分钟。
      注意：此步骤对去质子化盖玻片表面、改善包被和培养条件至关重要。建议确保盖玻片在溶液中充分分散，避免干燥后粘连在一起。
    2. 用去离子水洗涤盖玻片，每次30分钟，共洗4次。
    3. 洗涤后，将盖玻片转移至70%异丙醇溶液中保存。
  2. 盖玻片的包被
    1. 将盖玻片单独倾斜靠在方形培养皿的壁上，使异丙醇挥发。
    2. 5分钟后，将盖玻片转移至24孔板中（每孔放置一片）。每孔加入1 mL含10 mg/mL I型胶原的PBS溶液，于37 °C孵育60分钟。
    3. 随后，用PBS洗涤盖玻片4–5次，每次5分钟。 
  3. 细胞培养
    1. 按照HUVEC细胞培养方案中第1.2步所述程序消化HUVECs细胞。
    2. 在24孔板中，每孔接种50,000个细胞，每孔加入2 mL EGM培养基。
    3. 6小时后，更换为含2% FBS的EBM培养基，使细胞贴壁，并饥饿培养过夜。
    4. 次日，将待研究的试剂用含2% FBS的EBM培养基稀释。弃去饥饿培养液，加入已配制的稀释液，在培养箱中孵育所需时间。
  4. 固定与封闭
    1. 将细胞培养至所需时间后，用PBS洗涤5分钟。
    2. 用含2%多聚甲醛（PFA）的PBS溶液在室温（RT）下固定细胞20分钟。
    3. 用PBS洗涤3–4次，每次5分钟。
    4. 在室温下用封闭液（含5%正常山羊血清（NGS）和0.1% Triton-X-100的PBS溶液）孵育样本1小时。
      注意：此步骤中，充分洗涤以彻底去除PFA非常重要。血清的种属应根据二抗来源进行选择。
  5. 染色
    1. 在封闭液中加入一抗，4 °C孵育过夜。
    2. 次日，为去除未结合的一抗，用PBS洗涤样本3–4次，每次5分钟。
    3. 随后，在室温下用封闭液稀释相应的二抗和Phalloidin-FITC，共同孵育样本1小时。
    4. 再额外洗涤3–4 次。
    5. 将盖玻片倒置在载玻片上，滴加少量含DAPI的封片剂，避光干燥后用指甲油封片。样本于4 °C避光保存。

5. 类球体出芽实验

注意：类球体出芽实验需要3天时间才能完成（图2）。从开始至步骤5.7的所有操作均需在无菌条件下（无菌工作台）进行。

  1. 通过悬滴法生成球状体（第1天）
    1. 按照HUVEC细胞培养方案第1.2步所述程序解离HUVEC细胞。
    2. 将200,000个细胞与8 mL EGM和2 mL甲基纤维素储备液混合，确保充分混匀。甲基纤维素储备液的配制方法详见补充文件1。
    3. 将25 µL溶液滴加至大型方形培养皿倒置的内表面。将皿盖轻轻旋转180°，并放置在细胞培养容器底部，使液滴悬挂。将容器置于细胞培养孵箱中过夜。
  2. 制备胶原凝胶（第2天）
    1. 将2.3 mL大鼠尾部I型胶原与0.280 mL 10倍浓缩的Medium 199充分混合，直至混合物呈现均匀一致的黄色。整个操作过程中需将混合物置于冰上。
  3. 调节胶原凝胶pH值（第2天）
    1. 使用2 N NaOH滴定混合物，调节至生理pH值（以呈现橙色为标志）。
    2. 向最终产物中加入50 µL HEPES缓冲液。
      注意：为确保检测具有最佳的动态范围，必须尽可能接近生理pH值。不同批次的胶原可能需要不同量的NaOH。整个过程中必须严格将混合物置于冰上，并始终保持均匀混合。
  4. 收集球状体（第2天）
    1. 用20 mL PBS冲洗细胞培养皿盖上的悬滴。
    2. 将溶液在250 × g 条件下离心7分钟。弃去上清液，通过轻弹管壁将球状体重悬于0.1 mL FBS和0.4 mL EGM中。
    3. 加入2 mL甲基纤维素储备液并充分混匀。使用最小容量为5 mL的移液器，以避免损伤球状体。
  5. 将球状体加入3D胶原基质中 （第2天）
    1. 向重悬的球状体中加入2 mL已配制好的胶原混合物，并充分混匀。
    2. 将0.5 mL上述混合物加入24孔板的各孔中，在细胞培养孵箱中孵育30分钟。
  6. 在3D胶原基质中刺激球状体（第2天）
    1. 将所需物质用EBM稀释。每孔使用100 µL溶液。
      注意：EBM作为阴性对照，而25 ng/mL血管内皮生长因子（VEGF）（在500 µL胶原基质和100 µL EBM层中的最终浓度）可作为阳性对照。
    2. 孵育所需时间。
      注意：标准检测建议孵育18–24小时，但各实验室需根据具体情况仔细优化时间。
  7. 成像球状体（第3天）
    1. 使用倒置显微镜和成像平台，对未接触孔边缘、彼此分离且无损伤迹象的所有球状体进行成像。所有条件下应保持一致的设置和放大倍数。
  8. 分析（第3天）
    1. 使用ImageJ Fiji中的测量工具，测定每张图像中每个球状体所有出芽的长度。
      注意：可使用补充文件2中提供的插件，该插件可提高分析效率，并生成输出.txt文件。
    2. 将数据导入电子表格、R或其他首选软件，以每个球状体所有出芽的平均累计长度作为各条件的检测读数。
      注意：不同凝胶的结果不能以绝对出芽长度的形式合并。在合并数据前，需将各处理组的数据相对于EBM或VEGF对照组进行归一化处理（即相对出芽长度）。

6. 使用三维培养细胞进行RNA提取

  1. 类球体出芽实验
    1. 按照第5节所述方法进行类球体出芽实验。
  2. 胶原凝胶裂解
    1. 用预热的PBS洗涤类球体凝胶5分钟。
    2. 用手术刀将类球体凝胶切成四等份，并将全部四份转移至一个50 mL离心管中。使用手术刀进行凝胶的机械分离。
    3. 用裂解液（含2 mg/mL Collagenase D的PBS）处理凝胶样品，在37 °C摇床上孵育45分钟。
    4. 用添加了2 mM EDTA的PBS轻轻洗涤凝胶，以终止裂解缓冲液的反应。
  3. RNA提取
    1. 将裂解后的凝胶重悬于750 µL Trizol中，孵育10分钟，以确保充分提取RNA，具体操作如步骤3.3所述。
    2. 用1000 µL移液器反复吹打重悬样品，并将样品转移至特制的低吸附RNA管（体积1.5 mL）。将样品储存于-80 °C。

7. 三维胶原基质中球状体的免疫细胞化学

  1. 类球体出芽实验
    1. 按照第5节所述方法进行类球体出芽实验。
  2. 固定与封闭
    1. 用含4%多聚甲醛（PFA）的PBS溶液在室温下固定凝胶1小时。
      ​注意：为确保凝胶中细胞的良好固定，需在PBS洗涤后，用手术刀和镊子小心地将凝胶从孔壁四周分离。
    2. 用PBS轻柔洗涤凝胶3–4次，然后将凝胶完全从孔板表面分离，并转移至新的24孔板中。
    3. 将凝胶置于含5%正常山羊血清（NGS）和0.1% Triton-X-100的PBS封闭液中，在室温下于旋转摇床上孵育1小时。
  3. 染色
    1. 将样品加入用封闭液稀释的一抗溶液中，在4 °C下于旋转摇床上孵育过夜。
      注意：在此孵育过程中翻转凝胶并未改善染色效果。
    2. 次日，用PBS轻柔洗涤凝胶4–5次，每次5分钟。
    3. 将用封闭液稀释的相应二抗与Phalloidin-FITC混合后，加入凝胶中，在4 °C下于旋转摇床上孵育过夜。
    4. 再用PBS进行4–5次额外的洗涤步骤。
    5. 将凝胶转移至显微镜载玻片上，每块凝胶上放置盖玻片，并滴加两滴含DAPI的封片剂进行封片。待样品干燥后，用指甲油密封，并于4 °C避光保存。
  4. 显微成像
    1. 在共聚焦显微镜上对所有样品进行成像。使用20倍物镜，聚焦于目标区域。采集Z轴层扫图像以及单个焦平面图像。
      注意：对三维样品的多个层面采集Z轴层扫图像和焦平面图像是获得完整表征的关键，尤其适用于较厚的三维样品。

8. 人视网膜微血管内皮细胞（HRMVECs）

注意：所有描述的步骤也可使用微血管内皮细胞进行，例如人视网膜微血管内皮细胞（HRMVECs）。在此情况下，细胞培养需更换为含有10%胎牛血清（FBS）的特异性微血管内皮细胞培养基，并在每项检测中采用相应的特定步骤。以下列出了HRMVECs在检测方案中与前述方法的具体差异：

  1. 划痕伤口实验
    1. 使用含10% FBS的微血管内皮细胞培养基代替EGM培养细胞。
    2. 每孔接种20,000个细胞。
    3. 不要将细胞过夜饥饿处理。
    4. 划痕后，将培养基更换为含5% FBS的内皮细胞基础培养基，而不是含2% FBS的EBM。
  2. 二维培养HRMVECs的免疫细胞化学
    1. 使用含10% FBS的微血管内皮细胞培养基代替EGM培养细胞。
    2. 不要将细胞过夜饥饿处理。
    3. 处理前立即更换培养基为EBM + 5% FBS，而不是EBM + 2% FBS。
  3. 球体出芽实验
    1. 使用含10% FBS的微血管内皮细胞培养基代替EGM，将细胞以悬滴法接种。
  4. 三维胶原基质中球体的免疫细胞化学
    1. 使用含10% FBS的微血管内皮细胞培养基代替EGM，将细胞以悬滴法接种。

结果

进行迁移实验时，必须仔细检查 t = 0 h 时间点拍摄的图像，以确保系统能够准确识别出已形成完整单层的细胞（图1B）。此外，还需确认划痕边缘清晰且平直（图1B）。无细胞区域应基本无碎片残留。实验结束时，以例如 25 ng/mL VEGF 刺激的阳性对照组应在原始划痕区域显示出成功的细胞迁移（图1B）。技术问题的表现可能包括细胞生长不均、重复划伤或划痕边缘呈波浪状（图1C）。此外，阴性对照（EBM 刺激样本）与阳性对照（VEGF 刺激样本）之间应具有较大的动态范围（图1D）。在我们的实验条件下，我们认为在 12 小时后相对伤口密度（RWD）增加 25% 为理想范围（图1D）。若实验存在技术问题，则阳性与阴性对照无法有效区分，表明动态范围较低（图1E）。

在盖玻片上对人脐静脉内皮细胞（HUVECs）进行免疫细胞化学染色，并在荧光显微镜下观察以验证染色成功（图1F）。应观察大多数细胞，并识别出载玻片上的典型区域。通过仅使用二抗处理的对照载玻片评估染色特异性，以排除非特异性结合（图1F）。应根据目标蛋白已知的亚细胞定位特征，严格评估特异性染色信号。我们以亚细胞定位模式以及对照样本中无信号作为判断免疫染色实验成功与否的指标。

同样，在进行高质量的类球体出芽实验时，也必须考虑某些关键因素。在此情况下，实验质量应在实验结束时进行评估，例如在 t = 24 h 时。在显微镜下观察到的胶原基质应具有均一性，不应呈现疏松或粗糙的外观（图2B）。仅以基础培养基作为阴性对照和以 25 ng/mL VEGF 作为阳性对照刺激的类球体应能够明显区分（图2B）。此外，类球体应悬浮于凝胶中，而不应沉降至底部并发生扩散，后者提示质量不佳（图2C）。该问题通常源于混合过程中胶原冷却不足，或 pH 滴定过度或不足（图2C）。每个孔中应至少有 10 个可成像的类球体。阴性对照（EBM 刺激样本）应表现出适度的基础出芽数量，而作为阳性对照的 VEGF 理想情况下应使相对出芽长度（RSL）达到对照组的两倍，或更优地达到三倍（图2D，左图）。出芽数量也应表现出类似的动态变化范围（图2D，右图）。技术上不理想的实验将无法显示对照组之间的这种动态范围，从而可能导致对数据的错误解读（图2E）。

与二维染色类似，在荧光显微镜下观察切片并对染色结构进行仔细评估对于染色成功至关重要（图2F）。如果与对照组相比，结构的细胞定位清晰且信号强度合理，则可认为染色成功。

细胞迁移实验示意图及结果；VEGF在划痕实验、显微镜观察和数据分析中的作用。
图1：活细胞成像划痕伤口迁移实验。（A）划痕伤口迁移实验示意图。（B）展示高质量技术重复样本在 t = 0 h 和 t = 12 h 时的图像。细胞经 25 ng/mL VEGF 刺激作为阳性对照。（C）由于划痕操作不当或重复划痕，导致在 t = 0 h 时出现两个低质量技术重复样本的示例。（D）成功的划痕伤口迁移实验结果。在 t = 12 h 时，通过小提琴图进一步可视化经 25 ng/mL VEGF 刺激的阳性对照组与仅使用基础培养基处理的阴性对照组之间的显著差异。每组包含 7–8 个技术重复样本。（E）典型的失败划痕伤口迁移实验结果。在 t = 12 h 时，小提琴图显示经 25 ng/mL VEGF 刺激的阳性对照组与仅使用基础培养基处理的阴性对照组之间区分不明显。每组包含 7–8 个技术重复样本。（F）接种于盖玻片上的 HUVEC 细胞的典型图像，经 DAPI、鬼笔环肽和 VEGF-R2 染色。请点击此处查看该图的放大版本。

类球体实验示意图，VEGF处理，显微镜观察，表型分析，RNA提取，免疫细胞化学。
图2：类球体出芽实验。（A）类球体出芽实验的示意图。（B）理想技术条件下实验结束时（t = 24 h）的阴性对照（基础培养基刺激的类球体）和阳性对照（VEGF 25 ng/mL刺激的类球体）图像。（C）t = 24 h时两个低质量类球体的示例。左侧图像显示一个已脱落至培养板底部的受损类球体，导致类球体结构松散，并出现异常增强的出芽率。右侧图像显示含有明显色斑的胶原蛋白，形成高度异质性的环境，显著影响实验质量。（D）一次成功实验的RSL（左图）和出芽数量（右图）分析，阴性对照与阳性对照之间具有良好的动态范围。数据以小提琴图形式展示，每组包含10–25个类球体。（E）一次存在技术问题的实验中RSL（左图）和出芽数量（右图）的分析，阴性对照与阳性对照之间的动态范围不理想。数据以小提琴图形式展示，每组包含10–25个类球体。（F）来自类球体出芽实验的HUVEC细胞经DAPI、鬼笔环肽和VEGF-R2染色后的代表性图像。

补充文件1：制备甲基纤维素储备液的说明。 请点击此处下载该文件。

补充文件2：SpheroidCount.ijm插件。 请点击此处下载该文件。

讨论

在本报告中，我们介绍了一系列具有功能性和分子水平检测结果的技术，用于研究血管生成 体外.

迁移实验是一种在湿实验研究各个领域中广泛应用的成熟技术。我们选择了 commercially available 的活细胞成像方法，以利用其适用于筛选和剂量-反应实验的96孔板格式、由WoundMaker工具产生的标准化且可重复的伤口尺寸、通过长达24小时的时间序列成像观察迁移动力学的能力，以及配套的自动图像定量分析软件。然而，该方法需要实验室或核心设施配备带有血管生成分析软件的活细胞成像系统。目前已建立多种替代性实验方案，无需特定的活细胞成像显微镜或其他特殊设备10。

根据我们的经验，优化分析仪设置至关重要，因为人脐静脉内皮细胞（HUVEC）及其他血管内皮细胞类型往往对比度较差，从而影响显微镜软件的自动读取效果。为解决这一问题，可引入额外的荧光染色步骤（例如活细胞染色）。活细胞成像系统支持此类染色，甚至支持多色染色以追踪目标蛋白。该实验方法的一个主要局限在于，难以明确区分细胞迁移与增殖，实验结果实际上反映了这两个过程的综合效应。本研究所采用的活细胞成像解决方案通过引入相对伤口密度（RWD）来尝试解决此问题。与传统上仅使用划痕区域内的汇合度不同，RWD是相对于划痕区域外部的汇合度来评估划痕区域内汇合度的指标。当细胞迁移进入划痕区域时，划痕区域内汇合度增加，同时因细胞迁移导致外部区域汇合度下降，从而提高RWD；相反，细胞增殖会使划痕区域外部的汇合度上升，进而降低RWD。需要认识到，这是一种策略性分析方法，旨在减轻增殖对最终读数的影响。为全面解决该问题，可能还需辅以独立的增殖检测实验。或者，可在实验中加入细胞周期抑制剂（如丝裂霉素C）以阻断细胞增殖。各实验室在使用此类抑制剂时，需仔细优化实验方案，以在实现预期抑制效果的同时，避免降低实验的动态范围。此外，通过提高每孔的扫描频率，该设置还提供了一种易于实施的方法，可在个体水平上精确追踪细胞的移动行为，尤其适用于需要此类精细追踪的研究场景。

尽管活细胞成像迁移实验具有可扩展性强以及能够进行自动化、无偏倚分析的优势，但我们的前期研究突出了类球体出芽实验在捕捉血管生成更精细细节方面的优势，包括顶端细胞与茎干细胞的形成、细胞与基质的相互作用以及糖酵解转换等基本过程12。为确保实验的可重复性，操作者必须具备制备胶原基质的熟练经验，因为在制备过程中pH值和温度的变化可能影响实验结果。此外，该实验的分析需手动完成，因此图像分析耗时较长，且存在引入偏倚的风险。在分析过程中对实验条件进行适当的盲法处理，对于防止偏倚至关重要。针对这一问题，我们近期提出了一种基于神经网络的方法，可用于识别并减轻出芽实验分析中的潜在偏倚，且该方法易于实施17。综上所述，验证实验结果的最佳策略是联合使用这两种实验方法。然而，必须认识到，由于二维（2D）与三维（3D）实验环境的本质差异，结果之间可能存在差异12。

由于有多种2D和3D可供选择 体外 血管生成实验中，需权衡所采用方法相较于其他技术的优缺点。例如，划痕损伤实验主要检测细胞在塑料培养皿表面的二维水平迁移，而Transwell小室实验则用于评估细胞在趋化因子作用下穿过网格插入膜的垂直迁移能力。由于划痕损伤实验操作简便、结果易于读取，适合开展高通量研究，尤其是在96孔板格式下，具有高度可重复性，并支持实验过程的可视化及时间序列成像。然而，该方法的缺点在于难以区分细胞增殖与迁移效应，要求使用贴壁生长的细胞，且在缺乏专用划痕工具时，因划痕不均而导致实验变异性增加。相比之下，Transwell小室实验的优势在于可定量测定可溶性物质对运动细胞的趋化效应18 并同时突出显示侵袭和迁移过程。然而，该方法的缺点包括实验重复性差、变异度高、无法观察细胞的运动过程、需要大量迁移细胞才能获得信号、实验设置和检测过程较为耗时且繁琐，以及无法进行时间推移成像。19.

球状体出芽实验通过定量检测内皮细胞向三维凝胶基质中的出芽来评估其活性，而管状结构形成实验则用于表征细胞在凝胶基质表面形成管状结构的能力20。出芽实验的优势在于能够同时评估细胞侵袭基质、增殖和迁移的能力；其缺点是滴定胶原凝胶存在较高的变异性，从而影响球状体的质量。管状结构形成实验的优点是在特定时间（取决于细胞因子）即可观察到血管样管状结构的形成，且操作简便；其缺点是无法反映细胞的侵袭行为，且Matrigel本身可能对管状结构的形成产生影响21。

所有实验均使用人脐静脉内皮细胞（HUVECs）进行。众所周知，不同来源的血管内皮细胞（例如大血管与微血管来源）在行为上存在显著差异22,23。因此，可能需要使用其他血管内皮细胞系对实验结果进行验证。除人视网膜微血管内皮细胞（HRMVECs）需要更高浓度的胎牛血清（FBS）外，上述实验条件可适用于HRMVECs。然而，由于基础出芽率过高，常用的牛主动脉内皮细胞系（BAECs）无法用于球体出芽实验。

两种检测方法均存在局限性，即仅限于单一细胞类型。鉴于血管生成 体内 是一种复杂的多细胞过程，而现有的两种检测方法均未能准确捕捉这一关键方面。针对这两种检测方法，已开发出多种共培养变体，特别是球状体出芽检测法，并已在近期得到讨论10,24. 或者，可直接在相关环境中验证数据 体内 血管生成模型是一种可行的选择。用于此目的的成熟检测方法包括氧诱导视网膜病变（OIR）小鼠模型。25激光诱导的脉络膜新生血管形成（Laser-CNV）模型26，以及塞片实验27.

总体而言，二维活细胞成像迁移实验和三维球体出芽实验，结合本文介绍的分子分析工具，为血管生成研究提供了一个可靠的平台，并已在血管生成研究领域得到广泛认可。将这些实验方法与后续的体内分析相结合以验证研究结果，可为探索特定的血管生成相关科学问题奠定坚实的基础。

披露

作者声明本项目中不存在利益冲突。

致谢

作者感谢 Sophie Krüger 和 Gabriele Prinz 提供出色的技术支持。感谢 Sebastian Maier 开发用于定量分析球状体出芽的 ImageJ 插件，以及弗莱堡大学医院医学一科转化细胞研究中心（ZTZ）Lighthouse 核心设施提供 IncuCyte 系统的使用支持。插图使用 biorender.com 制作。本研究由德国研究基金会 [Bu3135/3-1 + Bu3135/3-2 至 F.B]、弗莱堡阿尔伯特-路德维希大学医学院 [Berta-Ottenstein 临床科学家及高级临床科学家项目资助 F.B.]、Else Kröner-Fresenius 基金会 [2021_EKEA.80 至 F.B.]、德国癌症联盟 [CORTEX 临床科学家奖学金资助 J.R.]、Volker Homann 基金会 [资助 J.N. 和 F.B.] 以及 "弗莱堡大学眼科诊所之友协会（Freunde der Universitäts-Augenklinik Freiburg e.V.）" [资助 P.L.] 提供支持。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
10x Medium 199Sigma-AldrichM0650
Alexa Fluor 647 标记的 AffiniPure F(ab)‘2 片段Jackson IR 115-606-072
Axio Vert. A1Zeiss
CapturePro 2.10.0.1JENOTIK Optical Systems
Ⅰ型胶原（大鼠尾来源）Corning354236
胶原酶 DRoche 11088858001
内皮细胞基础培养基LonzaCC-3156EBM
内皮细胞生长培养基LonzaCC-3162EGM
乙二胺四乙酸 Serva11290.02EDTA
胎牛血清Bio&SELLS 0615FBS
混合人脐静脉内皮细胞LonzaC2519AHUVEC
IncuCyte ImageLock 96 孔板 Sartorius4379
Incucyte S3 活细胞分析系统Sartorius
甲基纤维素Sigmam-0512
含 10% FBS 的微血管内皮细胞培养基PB-MH-100-4090-GFPPELOBiotech
NaOHCarl RothP031.2
鬼笔环肽-异硫氰酸荧光素标记（0.5 mg/mL 甲醇溶液）Sigma-AldrichP5282-.1MGPhalloidin-FITC
磷酸盐缓冲液Thermo Fisher Scientific14190-094PBS
原代人视网膜微血管内皮细胞Cell SystemsACBRI 181
含 NucBlue 的 ProLong Glass 抗荧光淬灭封片剂Invitrogen by ThermoFisher Scientific2260939
QIAzol 裂解试剂QIAGEN79306
重组人血管内皮生长因子PeproTech100-20VEGF
方形培养皿Greiner688102
TrizolQiagen79306
胰蛋白酶PAN-BiotecP10-024100
VEGF-R2（单克隆抗体）ThermoFisher Scientific Inc.B.309.4
WoundMakerSartorius4493

参考文献

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