我们提出了使用一套基于发光的染色体外报告基因底物评估细胞中双链断裂修复途径熟练程度的方案。
DNA 双链断裂 (DSB) 的修复对于维持基因组稳定性和细胞活力至关重要。细胞中的 DSB 修复 (DSBR) 是通过多种机制介导的:同源重组 (HR)、非同源末端连接 (NHEJ)、微同源介导的末端连接 (MMEJ) 和单链退火 (SSA)。细胞检测对于测量这些通路对各种刺激的熟练程度和调节度至关重要。
在这里,我们提出了一套染色体外报告基因检测,每种检测都测量细胞中四种主要 DSBR 通路之一对纳米荧光素酶报告基因的重构。瞬时转染到目标细胞中后,通过检测纳米荧光素酶 (NanoLuc) 发光,可在 24 小时内测量通路特异性报告基因底物的修复。
这些稳定的分析方法具有定量、灵敏、可滴定的特点,并且适用于高通量筛选形式。这些特性在 DNA 修复研究和药物发现中提供了广泛的应用,补充了目前可用的细胞 DSBR 检测工具包。
DNA 双链断裂 (DSB) 代表一类毒性特别强的 DNA 损伤1,因此细胞进化出多个 DSB 修复 (DSBR) 途径来修复这些损伤。四种主要的 DSBR 机制是同源重组 (HR)、非同源末端连接 (NHEJ)、微同源介导的末端连接 (MMEJ) 和单链退火 (SSA)2,3。DSBR 通路有助于维持健康的组织发育和生理机能,并预防癌症等疾病。此外,这些修复机制具有在精准肿瘤学中开发小分子调节剂的治疗潜力。例如,靶向 DNA 聚合酶 θ (Polθ) 是 MMEJ 修复途径中的一种关键酶,由于其在癌症中对 HR 缺陷的合成致死性而引起了人们的兴趣4。
因此,了解 DSBR 具有广泛的临床意义,需要能够测量所有主要 DSBR 通路活性的功能性细胞检测5。检测必须适用于遗传学和药理学研究,并且可以在感兴趣的细胞模型中部署。为了支持小分子药物发现工作,分析必须具有高灵敏度、可滴定性、快速周转,并且可扩展到适合化合物筛选的高通量形式。
一般来说,DSBR 以前使用稳定整合到细胞基因组中的基于荧光的报告基因检测系统进行测量6。然而,虽然染色体 DSBR 的生理学概括是一个明显的优势,但这种检测仅限于集成了报告基因的宿主模型,利用劳动密集型的样品制备和流式细胞术分析,并且通量、周转时间、稳健性和灵敏度有限,这些都是药物发现工作所必需的基本特征。
在这里,我们描述了一套 DSBR 报告基因检测,可以评估四种主要的 DSBR 途径。 图 1 概述了报告基因检测底物套件,并在最近的出版物7 中进一步描述。它们是染色体外的,允许通过简单的瞬时转染将其引入细胞,并掺入纳米荧光素酶报告基因8(必须通过与特定 DSBR 机制结合来重构),从而产生灵敏度、稳健性和可扩展性。该方案中包括以下 DSBR 报告基因底物变体(图 1):
不依赖切除术的 MMEJ: 这种线性底物由一个核心双链 DNA (dsDNA) 区域和单链 DNA (ssDNA) 突出端组成,其模拟切除的 DNA 末端9。ssDNA 区域末端的四个核苷酸微同源编码报告基因的起始密码子。通过 MMEJ 修复这种底物可恢复报告基因开放阅读框 (ORF)。
切除依赖性 MMEJ: N 端报告基因外显子被包含终止密码子的片段中断,该终止密码子的两侧是 8 个碱基对 (bp) 微同源性。在 MMEJ 介导的修复之前需要进行溶核末端切除,以恢复完整的报告基因。
钝性 NHEJ: 报告基因分为 N 端和 C 端部分,其中后者位于启动子的上游。DSB 是使用 EcoRV 产生的,它需要 NHEJ 直接连接(无需末端处理)才能重新连接报告基因部分并恢复报告基因 ORF。
非钝性 NHEJ: DSB 位于内含子内,根据限制性内切酶的选择,将具有内聚或非内聚末端。NHEJ 对这种底物的修复需要在末端处理之前进行连接。
长模板 HR: 报告基因的 N 末端外显子被含有限制性位点的 DNA 片段中断,该片段取代了原始报告基因序列的 22 bp。为了恢复该序列,HR 修复使用放置在 C 端外显子下游的 2.5 kb 同源模板。
简短的 HR 模板: 生成 DSB 所需的限制性位点替换了天然报告基因序列的一部分,并引入了框内终止密码子。与长模板版本一样,该 HR 底物需要下游同源模板 (360 bp) 来准确修复和恢复报告基因 ORF。
SSA: 该底物包含位于报告基因 N 末端外显子内的过早终止密码子。去除该终止密码子和恢复完整的报告基因序列需要 SSA 修复,这涉及在同源对齐之前进行双向长距离切除。
为了产生 DSB,一些报告基因底物可以用 I-SceI 消化(图 1)。这将在切除依赖性 MMEJ、非平头 NHEJ、长模板 HR 和 SSA 报告基因中产生具有非粘性末端的线性底物,它们在倒置方向上具有串联的 I-SceI 位点。在短模板 HR 报告基因底物中,单个 I-SceI 位点的消化将产生内聚末端。非平末端 NHEJ、切除依赖性 MMEJ、长模板 HR 和 SSA 质粒也可以用 HindIII 消化,这将产生互补的粘性末端。
我们提供了用于生成报告基因检测底物的方案,并描述了如何进行检测,提供了有关如何使用它们来量化 DSBR 的详细信息,包括对小分子的可滴定反应、评估细胞效力、靶向活性和通路选择性。
在这里,我们描述了生成和实施一套基于染色体外发光的报告基因的方案,用于测量四种主要 DSBR 通路(HR、NHEJ、MMEJ 和 SSA)的细胞熟练度7。报告基因底物可以通过瞬时转染引入细胞中,并用于使用灵敏且稳定的基于板的 NanoLuc 发光读数来评估 DSBR 活性,该读数在与同源细胞 DSBR 通路结合时重构。
报告基因底物生成、底物转染到细胞中以及数据解释的几个阶段对于成功执行这些检测至关重要。尽管使用标准分子生物学技术来生成报告基因底物,但通过凝胶电泳对过程进行可视化可确保在转染前获得最高质量和纯度的底物。由于这些检测依赖于瞬时转染,因此这些方法的常见注意事项适用。这些包括优化接种密度、转染条件(包括试剂和 DNA 数量)以及评估正向和反向转染形式的适用性。这些报告基因检测已经通过一系列电穿孔和脂质转染方案成功进行,在进行这些检测之前应充分探索各种选择。还应注意检查元件 NanoLuc 和 Firefly 信号,而不仅仅是通过将 NanoLuc 信号(报告基板)归一化为 Firefly 信号(对照)而得出的复合修复信号。由 Firefly 信号的变化驱动的比率可能会产生伪影。例如,使用高度特异性化合物在剂量反应模式下评估抑制作用应以可滴定的方式抑制 NanoLuc 信号,而不会干扰应保持稳定的 Firefly 信号(图 4G,H)。然而,在 Firefly 信号受到干扰的情况下,仍然可以通过确定 Firefly 信号不受影响的剂量窗口来确定对修复的有用影响(图 5)。
与最常用的 DSBR 报告基因检测相比,这些基于染色体外发光的报告基因检测具有一些明显的优势。由于 DSBR 通路高度保守,即使细胞机制因细胞模型而异,检测仍然可以报告 DSBR 熟练度和通路选择。只要提前建立最佳瞬时转染条件,就可以对用户感兴趣的任何模型进行 DSBR 评估。
使用纳米荧光素酶作为报告基因也比荧光选项更具优势,荧光选项传统上用于 DSBR 报告基因检测。NanoLuc 成熟快,使用读板器以高灵敏度检测发光8。与底物修复的速度相结合(因为报告基因底物被转染到具有即用型可修复 DSB 末端的细胞中),这种形式的 DSBR 报告基因检测非常适合作为工业药物发现级联反应的一部分筛选小分子所需的快速周转和定量稳定性。事实上,我们最近描述了不依赖切除的 MMEJ 报告基因测定在用于鉴定 Polθ 聚合酶结构域13 的小分子抑制剂的发现级联反应中的实施。
报告基因分析的实施也具有灵活性,以解决有关 DSBR 遗传和药理学扰动的特定问题(图 3)。例如,在转染报告基因底物之前,可以用针对目标基因的 siRNA 转染细胞 48-72 小时。或者,可以通过在转染报告底物前 24-48 小时进行质粒转染来检测基因过表达对 DSBR 通路的影响。对于药理学研究,本方案已经描述了如何将小分子的使用纳入标准工作流程,但替代形式可能包括化合物处理方案的改变,例如预孵育或冲洗。
瞬时转染的可扩展性还可以支持大规模筛选方法,其中报告基因底物的批量转染在筛选之前进行。此外,从转染到读数的测定持续时间也可以变化。虽然标准持续时间可能是 16-24 小时,但一些检测结果可以在短短 6 小时7 内读出。在确定检测持续时间时,还应考虑对小分子或 siRNA 毒性可能损害细胞活力的担忧。
总之,本研究中概述的检测方法以及最近出版物7 中的完整描述提供了对细胞 DSBR 熟练度的快速而有力的评估。它们高度敏感且可滴定,使其适用于遗传学和药理学研究。至关重要的是,由于报告基因底物可以通过瞬时转染引入细胞,因此它们有可能用于任何感兴趣的可转染细胞模型,而不是像染色体 DSBR 报告基因那样通过稳定整合局限于特定细胞系。然而,这些报告基因染色体外测定的一个明显局限性是,缺乏与基因组的整合可能无法完全概括 DNA 修复的生理、染色质化背景及其相关的调节线索和编排15。为此,染色体外报告基因检测是对现有 DSBR 评估方法的补充,并扩展了适用于基础研究和药物发现的资源工具包。
The authors have nothing to disclose.
所有工作均由 Artios Pharma Ltd. 资助。 图 1 和 图 3 是使用 Biorender.com 创建的。
10x TBE buffer | Thermo Fisher | AM9863 | |
20% TBE-acrylamide gel | Invitrogen | EC6315BOX | |
50x TAE buffer | Fisher Scientific | BP13321 | |
6x Gel Loading Dye, Purple | NEB | B7024S | |
96-well white plate (with transparent bottom and lid) | Porvair | 204012 | |
Agarose | Cleaver Scientific | CSL-AG500 | |
AMPure XP beads | Beckman Coulter | A63881 | For bead-based purification of DNA |
Antarctic phosphatase and 10X buffer | NEB | M0289L | |
CLARIOstar | BMG Labtech | 430-101 | Plate reader |
Countess II Automated Cell Counter | Thermo Fisher | AMQAX1000 | Cell counter |
Custom oligonucleotides | Sigma-Aldrich | Custom order | For resection-independent MMEJ substrate. See Table 2. |
D300e | Tecan | 30100152 | DMSO-based compound dispenser |
D300e D4+ cassette | Tecan | 30097371 | High volume cassette for D300e compound dispenser |
D300e T8+ cassette | Tecan | 30097370 | Low volume cassette for D300e compound dispenser |
Dimethyl sulfoxide, cell culture grade | Sigma-Aldrich | D2650-100ML | Vehicle for compounds, used in Figure 4 and Figure 5 |
DSBR reporter source plasmids | Artios | Available to the academic community upon request | |
EcoRV-HF and 10x CutSmart buffer | NEB | R3195M | |
Ethanol absolute | VWR | 20821.365 | |
Foetal Bovine Serum | PAN-Biotech | P30-3031 | |
GeneRuler Ultra Low Range DNA Ladder | Thermo Fisher | SM1211 | Low molecular weight DNA ladder |
HEK-293 cells | ATCC | CRL-1573 | Example cell line used in protocol |
HindIII-HF and 10x CutSmart buffer | NEB | R3104M | |
HyClone Molecular Biology grade water | Fisher Scientific | 10275262 | |
I-SceI and 10x Tango Buffer | Invitrogen | ER1771 | |
Isopropanol | VWR | 20842.33 | |
JetPRIME reagent and buffer | PolyPlus | 114-15 | Lipid-based transfection reagent |
MegaStar 1.6 | VWR | 521-1749 | Centrifuge for 15 or 50 mL tubes |
MEM Eagle | PAN-Biotech | P04-08056 | Culture medium for HEK-293 cells |
Microplate shaker | Fisherbrand | 15504070 | Microplate orbital shaker |
MicroStar 17R | VWR | 521-1647 | Centrifuge for 1.5 or 2 mL tubes |
MultiDrop | Thermo Fisher | 5840300 | Cell or water-based reagent dispenser |
MultiDrop Standard Cassette | Thermo Fisher | 24072670 | Cassette for MultiDrop reagent dispenser |
NanoDLR Stop & Glo Buffer and Substrate | Promega | N1630 or N1650 | Reporter luciferase (NanoLuc) reagent to quench Firefly luminescence and detect NanoLuc luminescence. Part of the Nano-Glo Dual-Luciferase Reporter Assay System kit |
ONE-Glo EX Luciferase Assay Buffer and Substrate | Promega | N1630 or N1650 | Control luciferase (Firefly) assay reagent to detect Firefly. Part of the Nano-Glo Dual-Luciferase Reporter Assay System kit |
PBS (without calcium or magnesium) | PAN-Biotech | P04-36500 | |
pGL4 Firefly plasmid (or similar) | Promega | E1310 (or equivalent) | Firefly control plasmid |
pNL1.1 NanoLuc plasmid (or similar) | Promega | N1091 (or equivalent) | NanoLuc control plasmid, for adjustment of equipment settings/optimisation experiments |
QIAquick Gel Extraction Kit | Qiagen | 28706 | |
Quick-Load Purple 1 kb DNA Ladder | NEB | N0552S | High molecular weight DNA ladder |
Sodium Acetate (3 M), pH 5.5 | Thermo Fisher | AM9740 | For pH adjustment during gel extraction with QIAquick Gel Extraction Kit |
SYBR Gold (10,000x) | Invitrogen | S11494 | For visualisation of ssDNA and dsDNA |
SYBR Safe (10,000x) | Invitrogen | S33102 | For visualisation of dsDNA only |
T4 DNA Ligase and 10x Ligase buffer | NEB | M0202L | |
Trypan Blue stain 0.4% | Invitrogen | T10282 | For measurement of viability during cell counting |
Trypsin-EDTA solution; 0.25% Trypsin and 0.53 mM EDTA | Sigma-Aldrich | T4049-100ML | |
XhoI and 10x CutSmart buffer | NEB | R0146M |