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基于高通量定量发光报告系统的DNA双链断裂修复活性评估

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DOI：

10.3791/66969

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2024年6月14日

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Artios Pharma Ltd, Cambridge, 2The Francis Crick Institute, London

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

我们介绍了利用基于发光的染色体外报告底物体系来评估细胞中双链断裂修复通路功能完整性的实验方案。

摘要

DNA双链断裂（DSBs）的修复对于维持基因组稳定性和细胞活力至关重要。细胞内的DSB修复（DSBR）通过多种机制介导：同源重组（HR）、非同源末端连接（NHEJ）、微同源介导的末端连接（MMEJ）以及单链退火（SSA）。细胞检测方法对于测量这些通路在不同刺激下的修复效率和调控能力至关重要。

本文介绍了一系列染色体外报告基因检测方法，每种方法均可检测细胞中四种主要双链断裂修复（DSBR）通路之一介导的纳米荧光素酶报告基因的重建。将通路特异性的报告基因底物瞬时转染入目标细胞后，可在24小时内通过检测纳米荧光素酶（NanoLuc）的发光信号来定量修复事件的发生。

这些稳健的检测方法具有定量性、高灵敏度、可滴定性，并适用于高通量筛选模式。这些特性为DNA修复研究和药物发现提供了广泛的应用前景，补充了目前可获得的细胞DSBR检测工具包。

引言

DNA双链断裂（DSBs）是一类毒性较强的DNA损伤1，因此细胞进化出多种DSB修复（DSBR）通路以修复此类损伤。四种主要的DSBR机制包括同源重组（HR）、非同源末端连接（NHEJ）、微同源介导的末端连接（MMEJ）以及单链退火（SSA）2,3。DSBR通路有助于维持正常组织发育和生理功能，并在预防癌症等疾病中发挥保护作用。此外，这些修复机制在精准肿瘤学中小分子调节剂的开发方面具有治疗潜力。例如，靶向MMEJ修复通路中的关键酶DNA聚合酶θ（Polθ），因其在HR缺陷型癌症中表现出合成致死效应，已引起广泛关注4。

因此，理解双链断裂修复（DSBR）具有广泛的临床意义，需要能够测量所有主要DSBR通路活性的功能性细胞检测方法5。这些检测方法必须适用于遗传学和药理学研究，并可在多种感兴趣的细胞模型中应用。为了支持小分子药物发现工作，检测方法必须具有高灵敏度、可滴定性、快速的周转时间，并可扩展至适用于化合物筛选的高通量形式。

通常，DSBR 既往是通过基于荧光的报告基因检测系统进行测量的，这些系统稳定整合于细胞基因组中6。然而，尽管该方法能够生理学地模拟染色体上的 DSBR，具有明显优势，但此类检测仅限于报告基因已整合的宿主模型，且需要采用流式细胞术进行耗时耗力的样本制备与分析，其通量、周转时间、稳健性和灵敏度均有限，而这些特性对于药物发现工作至关重要。

本文描述了一组DSBR报告基因检测方法，可用于评估四种主要的DSBR通路。该组报告基因检测底物如图1所示，并在近期一篇出版物中进行了进一步描述7。这些检测底物为染色体外元件，可通过简单的瞬时转染导入细胞；其包含一个纳米荧光素酶报告基因8，该基因必须通过特定DSBR机制的参与才能恢复功能，从而赋予检测方法高灵敏度、强健性和可扩展性。本实验方案中包含以下DSBR报告基因检测底物变体（图1）：

不依赖于末端切除的MMEJ：该线性底物由一个核心双链DNA（dsDNA）区域和模拟已发生末端切除的DNA末端的单链DNA（ssDNA）突出端组成9。ssDNA区域末端的四核苷酸微同源序列编码报告基因的起始密码子。通过MMEJ修复该底物可恢复报告基因的开放阅读框（ORF）。

依赖于末端切除的MMEJ： N端报告基因外显子被一段含有终止密码子的序列所中断，该序列两侧由8个碱基对（bp）的微同源序列所包围。在通过MMEJ介导的修复恢复完整的报告基因之前，需要进行核酸酶介导的末端切除。

平末端NHEJ： 报告基因被分为N端和C端两部分，其中C端位于启动子上游。通过EcoRV诱导产生双链断裂，需要通过NHEJ介导的直接连接（无需末端加工）使报告基因的两部分重新连接，从而恢复报告基因的开放阅读框（ORF）。

非平末端NHEJ：DSB位于一个内含子内，其末端为黏性末端或非黏性末端，具体取决于所选用的限制性内切酶。该底物通过NHEJ进行修复时，需要在连接之前进行末端加工。

长模板同源重组（HR）： 报告基因的N端外显子被一段含有限制性酶切位点的DNA片段所中断，该片段取代了报告基因原始序列中的22个碱基对。为了恢复该序列，同源重组（HR）利用位于C端外显子下游的2.5千碱基（kb）同源模板进行修复。

短模板同源重组（HR）： 用于产生双链断裂（DSB）的限制性酶切位点取代了报告基因序列的部分天然序列，并引入了一个同框的终止密码子。与长模板版本类似，该同源重组底物需要下游同源模板（360 bp）才能实现准确修复并恢复报告基因的开放阅读框（ORF）。

SSA：该底物在报告基因的N端外显子内含有一个提前终止密码子。去除该终止密码子并恢复完整的报告基因序列需要通过SSA进行修复，该过程涉及同源序列比对前的双向长片段切除。

为了产生双链断裂（DSB），部分报告基因底物可用 I-SceI 进行消化（图1）。对于具有反向串联 I-SceI 位点的非平末端NHEJ、依赖切除的MMEJ、长模板HR和SSA报告系统，该处理将生成具有非黏性末端的线性底物。在短模板HR报告基因底物中，单个 I-SceI 位点的消化将产生黏性末端。 非平末端NHEJ、依赖切除的MMEJ、长模板HR和SSA质粒也可用 HindIII 消化，从而产生互补的黏性末端。

我们提供了报告基因检测底物的制备方案，并描述了如何进行这些检测，详细说明了如何利用这些方法定量双链断裂修复（DSBR），包括对小分子的可滴定反应、评估细胞效力、靶标活性以及通路选择性。

方案

1. 报告底物的制备与质量控制（QC）

注意：编码报告底物的质粒可在标准的大肠杆菌（Escherichia coli）菌株（如 DH5α 及其衍生菌株）中扩增，并通过质粒提取进行回收。质粒的详细信息（大小和抗生素抗性）见表1和图1。

DNA修复机制示意图；MMEJ、NHEJ、HR通路；质粒构建，基因剪接过程。
图1：基于染色体外NanoLuc的DSBR报告系统示意图。 DSBR报告底物的示意图，包括其在各源质粒中的位置、主要序列特征以及通路特异性修复后的最终结构。MMEJ底物核心（不依赖切除）通过XhoI/HindIII双酶切从源质粒中切除，随后需在两端连接帽状结构以形成MMEJ底物。平末端NHEJ报告底物通过EcoRV酶切从源质粒中切除获得。依赖切除的MMEJ、非平末端NHEJ、长模板HR以及SSA报告底物通过使用I-SceI（产生非黏性末端）或HindIII（产生黏性末端）线性化源质粒获得。短模板HR报告底物通过使用I-SceI（产生黏性末端）线性化源质粒获得。每种报告底物经目标DSBR通路修复后，可重建完整的nanoluciferase开放阅读框（ORF），从而编码有功能的NanoLuc蛋白。本图改编自Rajendra等人的研究7。缩写：DSBR = 双链断裂修复；NanoLuc = Nanoluciferase；MMEJ = 微同源介导的末端连接；NHEJ = 非同源末端连接；HR = 同源重组；SSA = 单链退火；ORF = 开放阅读框。 请点击此处查看该图的放大版本。

  1. 无需切割的MMEJ报告底物的制备（图1 和 图2A-C）
    1. ssDNA/dsDNA末端帽的制备（图2A）
      1. 将 表2 中列出的四种寡核苷酸分别用退火缓冲液（20 mM Tris pH 7.5，50 mM NaCl，溶于分子生物学级水中）溶解，配制成100 µM的储存液。
      2. ss/dsDNA末端帽的退火
        1. 取步骤1.1.1.1中的长链和短链寡核苷酸（100 µM储存液）各50 µL，加入0.2 mL离心管中，用于制备左侧末端帽。
        2. 对右侧末端帽的寡核苷酸重复相同操作。
        3. 使用PCR仪，将每种寡核苷酸混合物在99 °C孵育5分钟，然后以1 °C/min的速率降温至10 °C。
          注：此过程将生成退火完成的左侧和右侧末端帽。
      3. （质量控制，可选）通过电泳验证寡核苷酸退火效果
        1. 取步骤1.1.1.2中每种产物100 ng，与步骤1.1.1.1中的单个寡核苷酸以及低分子量DNA Marker一同上样，在20%丙烯酰胺-Tris-硼酸-EDTA（TBE）凝胶中以200 V电泳80分钟。
        2. 用含有适当荧光DNA染料的TBE电泳缓冲液对凝胶染色，以便同时可视化ssDNA和dsDNA，染色时间不少于10–15分钟。
        3. 在凝胶成像系统中观察荧光信号（图2A）。
          注：步骤1.1.1.3.1至1.1.1.3.3用于验证末端帽是否正确退火。左侧末端帽和右侧末端帽的表观大小应分别约为120 bp和175 bp。
    2. 报告底物核心的纯化（图2B）
      1. 将100 µg报告核心质粒与4 µL HindIII、4 µL XhoI（每种酶4 U/µg质粒）及20 µL 10x缓冲液混合。用双蒸水（ddH2O）定容至200 µL，37 °C孵育2小时至过夜，以完成质粒消化。
        注：若消化量更大或更小，应按比例调整反应体系。
      2. 将消化反应在80 °C孵育20分钟，以热失活限制性内切酶。
      3. 向步骤1.1.2.2的反应混合物中加入40 µL碱性磷酸酶（2 U/µg质粒）和27 µL 10x缓冲液。37 °C孵育2小时，以去除质粒的磷酸化基团。
        注：根据需要调整反应体系大小。
      4. 向步骤1.1.2.3的反应体系中加入60 µL 6x上样缓冲液。与高分子量DNA Marker一同上样，在含荧光dsDNA染料的1.5%（w/v）琼脂糖-Tris-乙酸-EDTA（TAE）凝胶中以120 V电泳2.5小时，或直至条带充分分离。
      5. 在凝胶成像系统中观察荧光信号（图2B）。
      6. 使用洁净的手术刀从凝胶中切下报告核心片段（约1.5 kb），注意避免被载体骨架（约2.5 kb）污染。
      7. 使用凝胶回收试剂盒，按照制造商说明提取报告核心片段。
      8. 通过分光光度法测定DNA浓度和质量（A260/280）。
    3. 将报告底物核心与ssDNA/dsDNA末端帽连接并纯化最终报告底物（图2C）
      1. 将步骤1.1.2.7获得的30 µg报告核心片段与步骤1.1.1.2中退火完成的左侧和右侧末端帽各3.85 µL（末端帽与核心DNA的摩尔比约为6:1）、30 µL 10x连接酶缓冲液以及1.5 µL T4 DNA连接酶（20 U/µg DNA）混合。用ddH2O定容至300 µL总体积，16 °C孵育过夜，以完成末端帽与报告核心片段的连接。
        注：根据需要调整反应体系大小。
      2. （质量控制，可选）取步骤1.1.3.1所得产物200 ng，与未连接的报告底物核心及高分子量DNA Marker一同上样，在含荧光dsDNA染料的0.7%（w/v）琼脂糖-TAE凝胶中以120 V电泳至少1.5小时。验证连接产物对应的条带迁移速度略慢于未连接的报告底物核心（图2C）。
        注：此质量控制步骤用于确认末端帽已正确连接至报告核心片段。
      3. 使用首选方法（如磁珠法或柱式法），按照制造商说明从步骤1.1.3.1的连接反应中纯化DNA。
        注：步骤1.1.3.3的纯化可显著减少未连接末端帽的存在。
    4. 通过分光光度法测定DNA浓度和质量（A260/280）。
  2. 平末端NHEJ报告底物的制备（图1 和 图2D,E）
    1. 将100 µg报告核心质粒与5 µL EcoRV（5 U/µg质粒）及20 µL 10x缓冲液混合。用ddH2O定容至200 µL，37 °C孵育2小时至过夜，以完成质粒消化。
      注：若消化量更大或更小，应按比例调整反应体系。
    2. 将消化反应在65 °C孵育20分钟，以热失活限制性内切酶。
    3. 向步骤1.2.2的反应体系中加入50 µL 6x上样缓冲液。与高分子量DNA Marker一同上样，在含荧光dsDNA染料的1.5%（w/v）琼脂糖-TAE凝胶中以120 V电泳2小时，或直至条带充分分离。
    4. 在凝胶成像系统中观察荧光信号（图2D）。
    5. 使用洁净的手术刀从凝胶中切下报告底物（约1.7 kb），注意避免被载体骨架（约2.6 kb）污染。
    6. 使用凝胶回收试剂盒，按照制造商说明提取报告核心片段（图2E）。
    7. 通过分光光度法测定DNA浓度和质量（A260/280）。
  3. I-SceI介导的报告底物的制备（图1）
    注：这些底物包括依赖切割的MMEJ（图2F）、非平末端NHEJ（图2G）、长模板HR（图2H）、短模板HR（图2I）以及SSA（图2J）。
    1. 将100 µg报告核心质粒与50 µL I-SceI（5 U/µg质粒）及60 µL 10x缓冲液混合。用ddH2O定容至600 µL，37 °C孵育2小时至过夜，以完成质粒消化。
      注：若消化量更大或更小，应按比例调整反应体系。非平末端NHEJ、依赖切割的MMEJ、长模板HR和SSA质粒也可使用HindIII进行消化，该酶将产生互补的黏性末端。
    2. 将消化反应在65 °C孵育20分钟，以热失活I-SceI。若使用HindIII进行消化，则此步骤应设置为80 °C。
    3. 使用首选方法（如磁珠法或柱式法），按照制造商说明从步骤1.3.2的失活消化反应中纯化DNA。
    4. 通过分光光度法测定DNA浓度和纯度（A260/280）。
  4. 报告底物的质量控制
    1. 取200 ng报告底物与高分子量DNA Marker一同上样，在含荧光dsDNA染料的0.7%（w/v）琼脂糖-TAE凝胶中以120 V电泳2小时，或直至条带充分分离。同时将原始未切割的报告质粒作为对照上样。
    2. 验证每种报告底物是否出现预期大小的特异性条带（参见 表1 和 图2F-J）。

DNA修复通路凝胶电泳；不依赖切除的MMEJ、NHEJ、HR、SSA分析。
图2：DSBR报告底物构建的凝胶电泳分析。（A-C）生成不依赖切除的MMEJ报告底物所需的中间产物及最终构建体的凝胶电泳分析代表性图像。图（A）和（C）中的相邻图像来自同一凝胶；无关泳道已被省略。（D,E）用于生成平末端NHEJ报告底物所需的源质粒、EcoRV酶切产物以及凝胶回收的最终构建体的凝胶电泳分析代表性图像。（F-J）用于生成I-SceI酶切报告底物的源质粒及线性化DSBR构建体的凝胶电泳分析代表性图像：依赖切除的MMEJ、非平末端NHEJ、长模板HR、短模板HR、SSA。缩写：DSBR = 双链断裂修复；MMEJ = 微同源介导的末端连接；NHEJ = 非同源末端连接；HR = 同源重组；SSA = 单链退火。请点击此处查看该图的放大版本。

2. DSBR 报告底物的瞬时转染

注意：实验流程的概述及一些可能的变体如图3所示。以下方案描述了使用HEK-293细胞的实验，其中细胞被反向转染报告底物。以下数字可根据每块板所用孔数按比例放大或缩小。后续步骤按一块96孔板的检测进行计算；其他注意事项详见讨论部分。

使用荧光素酶检测的细胞系转染过程；基因编辑和发光分析示意图。
图3：DSBR报告基因检测的实验流程。 目标细胞被转染线性化的DSBR底物（编码一个需要通过特定DNA修复事件进行修复的NanoLuc开放阅读框）和一个海肾荧光素酶质粒（转染对照）。转染后6–24小时，加入Nano-Glo双荧光素酶试剂后可依次检测海肾荧光素酶发光信号和NanoLuc发光信号。对核心步骤（显示在浅蓝色框内）进行多种变式操作，可用于测试基因调控（敲除、敲低或过表达）或药物处理如何影响细胞中DSBR通路的功能效率。缩写：DSBR = 双链断裂修复；NanoLuc = Nanoluciferase；WT = 野生型；KO = 敲除。请点击此处查看该图的放大版本。

  1. （可选）若需评估化合物对报告基因检测的影响，根据预设的实验布局，将溶于载体（如二甲基亚砜 [DMSO]）中的化合物加入96孔板的各孔中。确保所有孔中载体浓度一致。
    注意：建议设置技术重复孔，并包含对照孔（如仅含载体的孔）。
  2. 在1.5 mL离心管中，用500 µL转染缓冲液稀释步骤1.1、1.2或1.3中制备的萤火虫对照质粒（对照荧光素酶）和NanoLuc DSBR报告基因底物（报告荧光素酶）。每1 × 106个细胞使用0.66 µg对照荧光素酶质粒。NanoLuc DSBR报告基因底物的使用量参见表3。
    注意：可使用一个持续表达报告荧光素酶的阳性对照质粒，用于验证仪器设置和转染条件，或检测对报告荧光素酶本身的非特异性影响。作为起始建议，每1 × 106个细胞使用0.1 µg报告荧光素酶质粒和0.66 µg对照荧光素酶质粒。
  3. 按照生产商推荐的比例（例如，对于材料表中所述试剂，DNA与试剂的比例为1:2，即µg DNA:µL试剂），将基于脂质的转染试剂加入步骤2.2中稀释的DNA溶液中，短暂涡旋充分混匀，室温孵育10分钟。
  4. 通过胰酶消化收集细胞，重悬于含10%胎牛血清（FBS）的新鲜培养基中，并进行计数。
  5. 将3 × 106个细胞转移至15 mL离心管中，用8.5 mL培养基重悬。
  6. 将步骤2.3中的DNA转染混合物加入细胞悬液中，反复倒置数次以混匀。
  7. 每孔接种80 µL细胞悬液（约含2.7 × 104个细胞）。
    注意：含有细胞和DNA转染混合物的悬液可通过手动移液或使用自动化液体处理设备加入板中，后者适用于高通量实验。
  8. 在37 °C、5% CO2条件下孵育24小时。

3. 发光检测

  1. 试剂的准备
    1. 根据制造商的说明准备并添加报告基因（NanoLuc）和对照（萤火虫）荧光素酶试剂，这些试剂分别为两种荧光素酶提供底物（分别为Furimazine和5´-荧光素）：
    2. 准备对照荧光素酶试剂。按照制造商的说明进行重悬，并通过倒置混匀，直至荧光素酶底物完全溶解。
    3. 根据制造商的说明新鲜配制报告基因荧光素酶试剂。计算每孔添加80 µL所需的试剂总量，并按1:100的比例（荧光素酶底物:缓冲液）将底物加入适量的检测缓冲液中。对于一块96孔板，将88 µL荧光素酶底物稀释至8,800 µL缓冲液中，并通过倒置混匀。
      注意：上述用量已包含约10%的过量。重悬后的对照荧光素酶试剂可根据制造商说明保存，以供后续使用。报告基因荧光素酶试剂必须每次使用前新鲜配制。
  2. 对照和报告基因荧光素酶发光信号的连续检测（96孔板）
    1. 将培养板和荧光素酶试剂恢复至室温。
    2. 每孔加入80 µL对照荧光素酶试剂。
    3. 在转速为450 rpm的摇床上振荡培养板3分钟。
    4. 使用发光检测仪测定对照荧光素酶的发光信号。
      注意：在580 nm波长下读取发射光（80 nm带通滤光片），或读取每孔总发光值。该发光信号用于评估转染效率和细胞密度，也可反映测试处理引起的细胞毒性。
    5. 每孔加入80 µL报告基因荧光素酶试剂。
      注意：该试剂会抑制对照荧光素酶活性；同时含有报告基因荧光素酶的底物。
    6. 在转速为450 rpm的摇床上振荡培养板3分钟。
    7. 将培养板在室温下静置7分钟。
    8. 使用发光检测仪测定报告基因荧光素酶的发光信号。
      注意：在470 nm波长下读取发射光（80 nm带通滤光片），或 alternatively 测定每孔总发光值。该发光信号反映由目标DSBR通路修复的报告基因底物的量。
    9. 导出发光读数用于后续分析。

4. 数据分析

  1. 将同一孔中报告基因荧光素酶（NanoLuc）的发光信号除以对照荧光素酶（Firefly）的发光信号，以计算检测信号。对所有孔应用该计算，如公式（1）所示。
    发光检测信号计算公式，NanoLuc与Firefly的比值，用于科研分析的示意图     （1）
  2. 计算对照孔（例如仅溶剂处理孔）检测信号的平均值。
  3. 使用公式（2）将测试孔的检测信号相对于对照孔的平均值进行归一化，以计算每孔的修复率（%）。
    修复效率计算公式示意图，用于微孔板各孔间信号比较的检测分析 （2）
  4. （可选，曲线拟合）若测试多个化合物浓度，将计算得到的修复率（%）对化合物浓度作图，并使用非线性回归模型拟合剂量-反应曲线。利用该曲线进行后续的EC50插值。

结果

每种报告基因检测的修复均可通过相同程序进行检测和定量。当细胞中相应的修复通路正确修复底物时，将重建一个完整且具有功能的编码NanoLuc的开放阅读框（ORF）。该发光信号可使用酶标仪进行检测。

共转染编码萤火虫荧光素酶的完整质粒可作为转染对照。该对照具有两个作用：第一，它为NanoLuc信号的标准化提供一个参照，因为无论通过遗传学还是药理学手段调节DSBR，该信号均应不受影响；第二，它可以提示是否存在影响荧光素酶信号的脱靶细胞扰动，例如细胞周期调控、对转录/翻译的影响或普遍的细胞毒性。

NanoLuc 与 Firefly 的比值可作为修复情况的替代读数。可通过归一化同一孔内的两种荧光素酶信号来导出并分析发光值。在基因扰动研究中（例如，比较野生型与基因敲除型，或非靶向与靶向 siRNA），修复水平通常以亲本样本（野生型细胞或经非靶向对照 siRNA 处理的细胞）为基准进行归一化。在药理学调控实验中，化合物处理样本的数值则以溶剂处理所产生的数值为基准进行归一化。

上述报告系统的完整验证最近已发表7。用于表征DSBR的遗传和药理学调控的数据如图4所示（改编自7）。Polθ是MMEJ的关键介导因子，该酶的缺失或抑制预计会特异性地消除细胞中的MMEJ3,10。利用POLQ基因（编码Polθ）已被敲除的细胞系11，通过不依赖于末端切除的MMEJ报告基因检测发现，MMEJ确实几乎完全被抑制。对NanoLuc和萤火虫荧光素酶组分发光信号的评估显示，所观察到的修复缺陷是由NanoLuc信号（由报告基因底物编码）减少所致，而萤火虫荧光素酶信号（对照）未受影响（图4A-C）。相反，使用平末端NHEJ报告基因检测对NHEJ功能的评估表明，POLQ基因敲除并不影响报告基因底物的修复（图4D-F）。这些遗传学数据共同支持Polθ在MMEJ介导的修复中的特异性作用。这些结果在药理学上通过ART558得到了完全重现12,13，ART558是一种最近报道的高效且特异性的Polθ聚合酶结构域抑制剂（图4G），在此条件下可观察到剂量依赖性的MMEJ抑制，这种抑制源于NanoLuc信号而非萤火虫荧光素酶信号的特异性下降（图4H）。此外，与遗传学数据一致的是，NHEJ未受到任何影响（图4I,J）。综上所述，这些数据突显了这些报告系统可用于表征DSBR通路的遗传调控，并可用于评估小分子化合物的细胞活性及其靶点/通路特异性。

比较野生型和POLQ(-)细胞中MMEJ、NHEJ及ART558对发光信号影响的基因修复效率图表
图4：Polθ基因敲除和药物抑制对MMEJ与NHEJ报告信号的影响。eHAP1野生型（WT）和POLQ(-)细胞分别转染萤火虫荧光素酶对照质粒，以及（A-C）不依赖末端切割的MMEJ报告系统或（D-F）平末端NHEJ报告系统。MMEJ或NHEJ修复百分比定义为NanoLuc发光信号相对于萤火虫荧光素酶发光信号的比值，并以DMSO处理组为对照进行归一化，检测时间为转染后24小时。数据表示为三次生物学重复的平均值±标准误（SEM），每次生物学重复取8次技术重复的均值。HEK-293细胞转染萤火虫荧光素酶对照质粒，以及（G,H）不依赖末端切割的MMEJ报告系统或（I,J）平末端NHEJ报告系统，并用Polθ聚合酶抑制剂ART558处理。修复百分比同样为NanoLuc发光信号相对于萤火虫荧光素酶发光信号的比值，并以DMSO处理组为对照进行归一化，检测时间为转染后24小时。图（G）和（I）中各发光信号的抑制率相对于DMSO对照组计算，分别显示于图（H）和（J）。数据表示为两次生物学重复的平均值±标准误（SEM），每次生物学重复取4次技术重复的均值。本图改编自Rajendra等人的研究7。缩写：NanoLuc = Nanoluciferase；MMEJ = microhomology-mediated end joining（介导微同源末端连接）；NHEJ = non-homologous end joining（非同源末端连接）；WT = wild type（野生型）。 请点击此处查看该图的放大版本。

显示CAM833对HR修复和发光影响的剂量-反应曲线；EC<sub>50</sub>值已标出。
图5：RAD51抑制剂CAM833对HR报告信号的抑制作用。（A）将携带长模板HR报告底物和海肾荧光素酶对照质粒的HEK-293细胞用RAD51抑制剂CAM83314处理。转染后16小时检测NanoLuc和海肾荧光素酶的发光信号。HR修复百分比定义为NanoLuc发光值与海肾荧光素酶发光值的比值，并以DMSO处理组为对照进行归一化。虚线标示了曲线EC50处的HR抑制百分比及对应的CAM833浓度。数据表示两次生物学重复的平均值±标准误（SEM），每次生物学重复取四次技术重复的平均值。（B）计算（A）中各发光信号相对于DMSO处理对照组的抑制百分比。虚线标示在3.33 µM CAM833（EC50）时NanoLuc和海肾荧光素酶的抑制百分比。当CAM833浓度≥10 µM时，海肾荧光素酶信号下降提示高剂量下化合物具有细胞毒性；然而，在海肾荧光素酶信号未受影响的浓度下已观察到NanoLuc信号的降低，表明CAM833可诱导靶向性的HR抑制作用。本图改编自Rajendra等人的研究7。缩写：NanoLuc = Nanoluciferase；HR = 同源重组（homologous recombination）。 请点击此处查看该图的放大版本。

报告基因底物来源质粒
（大小，抗性）		DSB 产生方式最终报告基因底物的预期大小（kb）
不依赖切除的 MMEJ4.0, Kan通过连接帽结构产生切除后的 3' 末端1.6
依赖切除的 MMEJ6.5, KanI-SceI（非黏性末端），HindIII（黏性末端）6.5
平末端 NHEJ4.3, Kan通过 EcoRV 从质粒上切除产生平末端1.7
非平末端 NHEJ6.7, KanI-SceI（非黏性末端），HindIII（黏性末端）6.5
长模板 HR9.2, KanI-SceI（非黏性末端），HindIII（黏性末端）9.2
短模板 HR9.3, AmpI-SceI（黏性末端）9.3
SSA9.5, KanI-SceI（非黏性末端），HindIII（黏性末端）9.5

表1：报告底物质粒。 缩写：DSB = 双链断裂；MMEJ = 微同源介导的末端连接；NHEJ = 非同源末端连接；HR = 同源重组；SSA = 单链退火；Kan = 卡那霉素；Amp = 氨苄青霉素。

序列 (5’-3’)供应商纯化方式功能
5’[Phos]TCGAGGACTTGGTCCAGGTT
GTAGCCGGCTGTCTGTCGCCAGTCC
CCAACGAAATCTTCGAGTGTGAAGACCAT		SigmaPAGE左端帽，长寡核苷酸
5’[Phos]GCCGGCTACAACCTGGACCAAGTCCSigmaPAGE左端帽，短寡核苷酸
5’[Phos]AGCTTTATTGCGGTAGTTTATCA
CAGTTAAATTGCTAACGCAGTCAGTGG
GCCTCGGCGGCCAAGCTAGGCAATCC
GGTACTGTTGGTAAAGCCACCATGG		SigmaPAGE右端帽，长寡核苷酸
5’[Phos]CGAGGCCCACTGACTGCGTTA
GCAATTTAACTGTGATAAACTACCGCAATAA		SigmaPAGE右端帽，短寡核苷酸

表2：用于生成不依赖切除的MMEJ报告底物的加帽寡核苷酸。 缩写：ssDNA = 单链DNA；dsDNA = 双链DNA；MMEJ = 介导微同源末端连接；PAGE = 聚丙烯酰胺凝胶电泳。微同源序列已用下划线标出。

报告基因检测NanoLuc 报告基因底物 DNA（µg DNA/1x106 个细胞）萤火虫对照荧光素酶质粒（µg DNA/1x106 个细胞）
不依赖切除的 MMEJ0.50.66
依赖切除的 MMEJ10.66
平末端 NHEJ0.50.66
非平末端 NHEJ0.50.66
长模板 HR10.66
短模板 HR20.66
SSA10.66

表3：NanoLuc报告基因底物和萤火虫对照荧光素酶质粒瞬时转染的DNA用量（HEK-293细胞，96孔板格式）。 缩写：MMEJ = 微同源介导的末端连接；NHEJ = 非同源末端连接；HR = 同源重组；SSA = 单链退火。

讨论

本文中，我们描述了一套基于染色体外发光报告系统的构建与应用方案，用于检测细胞中四种主要双链断裂修复通路（HR、NHEJ、MMEJ 和 SSA）的修复能力7。报告底物可通过瞬时转染导入细胞，并利用NanoLuc发光信号进行灵敏且可靠的板式检测，当底物被相应的细胞内双链断裂修复通路识别并修复时，即可恢复发光信号。

报告分子底物的制备、将底物转染入细胞以及数据分析的多个步骤，对于这些检测的成功实施至关重要。尽管报告分子底物的构建采用的是标准的分子生物学技术，但通过凝胶电泳对过程进行可视化观察，可确保转染前底物具有最高质量和纯度。由于这些检测依赖于瞬时转染，因此需遵循此类方法的常规注意事项，包括优化细胞接种密度、转染条件（如试剂和DNA用量），以及评估正向与反向转染方式的适用性。这些报告基因检测已成功结合多种电穿孔和脂质体转染方案进行，因此在开展检测前应充分探索各种可行方案。此外，应仔细分析NanoLuc和Firefly的独立信号，而不仅仅关注通过将NanoLuc信号（报告分子底物）归一化至Firefly信号（对照）所获得的综合修复信号。若比值变化由Firefly信号的波动所驱动，则可能产生假象。例如，在剂量-反应模式下使用高特异性化合物评估抑制作用时，应以可滴定的方式抑制NanoLuc信号，而不干扰Firefly信号，后者应保持稳定（图4G，H）。然而，在Firefly信号受到干扰的情况下，仍可通过识别Firefly信号未受影响的剂量窗口，来确定对DNA修复的真实影响（图5）。

与最常用的DSBR报告基因检测方法相比，这些基于染色体外发光的报告基因检测具有一些显著优势。由于DSBR通路高度保守，即使不同细胞模型之间的细胞机制存在差异，这些检测仍能有效反映DSBR的功能状态及通路选择。这使得研究者能够在任何感兴趣的模型中评估DSBR，前提是预先建立最佳的瞬时转染条件。

使用Nanoluciferase作为报告基因相较于传统DSBR报告基因检测中常用的荧光选项具有诸多优势。NanoLuc成熟迅速，且可通过酶标仪以高灵敏度检测其发光信号8。结合底物修复的快速性（报告基因底物转染细胞时已具备可直接修复的DNA双链断裂末端），此类DSBR报告基因检测体系非常适用于工业级药物发现级联流程中对小分子化合物进行高通量筛选所需的快速周转和定量稳健性。事实上，我们近期已报道了将不依赖于末端切除的MMEJ报告基因检测方法应用于Polθ聚合酶结构域小分子抑制剂发现级联流程中的实践13。

报告基因检测的实施也具有灵活性，可用于研究关于DSBR的遗传学和药理学扰动的具体问题（图3）。例如，在转染报告基因底物之前，可先用针对目的基因的siRNA对细胞转染48-72小时。或者，可通过在报告基因底物转染前24-48小时进行质粒转染，来检测基因过表达对DSBR通路的影响。对于药理学研究，本方案已描述了如何将小分子化合物的使用整合到标准操作流程中，但也可采用其他实验设计，例如改变化合物处理方案，如预孵育或洗脱步骤。

瞬时转染的可扩展性还可支持大规模筛选方法，其中可在筛选前对报告基因底物进行批量转染。此外，从转染到检测的实验持续时间也可根据需要进行调整。尽管标准的持续时间通常为16-24小时，但某些实验可在短短6小时内完成检测7。在确定实验持续时间时，还应考虑小分子或siRNA可能带来的毒性问题，因其可能影响细胞活力。

总之，本研究中概述并在近期出版物中详细描述的检测方法7，可对细胞的DNA双链断裂修复（DSBR）能力进行快速且可靠的评估。这些方法具有高度敏感性和可滴定性，适用于遗传学和药理学研究。关键的是，由于报告基因底物可通过瞬时转染导入细胞，因此这些方法可应用于任何可转染的细胞模型，而不像染色体整合型DSBR报告系统那样受限于特定细胞系的稳定整合。然而，这类报告基因的染色体外检测方法存在一个明显局限性：由于未整合到基因组中，可能无法完全模拟DNA修复所处的生理状态，即染色质化环境及其相关的调控信号与协调机制15。因此，染色体外报告基因检测方法是对现有DSBR评估技术的有益补充，并进一步拓展了适用于基础研究和药物发现的研究工具资源。

披露

D.G.、E.R.、B.M.、A.G.、S.J.B.、G.C.M.S. 和 H.M.R.R. 均为 Artios Pharma Ltd. 的员工及股东。G.C.M.S. 是 AstraZeneca PLC 的股东。S.J.B. 是 Artios Pharma Ltd. 的创始科学家及股东。本研究中所述的部分报告基因已申请专利（WO 2021/001647）。NanoLuc® 技术及修饰后的 NanoLuc® 多核苷酸来源于 Promega。Artios Pharma 已获得 Promega 授权，用于生成修饰后的 NanoLuc® 多核苷酸。

致谢

所有工作均由 Artios Pharma Ltd. 资助。图 1 和 图 3 使用 Biorender.com 制作。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
10x TBE 缓冲液Thermo FisherAM9863
20% TBE-丙烯酰胺凝胶InvitrogenEC6315BOX
50x TAE 缓冲液Fisher ScientificBP13321
6x 凝胶上样染料，紫色NEBB7024S
96 孔白色板（带透明底和盖）Porvair204012
琼脂糖Cleaver ScientificCSL-AG500
AMPure XP 磁珠Beckman CoulterA63881用于基于磁珠的 DNA 纯化
南极磷酸酶及 10X 缓冲液NEBM0289L
CLARIOstarBMG Labtech430-101酶标仪
Countess II 自动细胞计数仪Thermo FisherAMQAX1000细胞计数仪
定制寡核苷酸Sigma-AldrichCustom order用于不依赖切除的 MMEJ 底物。见表 2。
D300eTecan30100152基于 DMSO 的化合物分配仪
D300e D4+ 模块Tecan30097371D300e 化合物分配仪的高容量模块
D300e T8+ 模块Tecan30097370D300e 化合物分配仪的低容量模块
二甲基亚砜，细胞培养级Sigma-AldrichD2650-100ML化合物溶剂，用于图 4 和图 5
DSBR 报告系统来源质粒Artios应学术界请求可提供 
EcoRV-HF 及 10x CutSmart 缓冲液NEBR3195M
无水乙醇VWR20821.365
胎牛血清PAN-BiotechP30-3031 
GeneRuler 超低分子量 DNA MarkerThermo FisherSM1211低分子量 DNA Marker
HEK-293 细胞ATCCCRL-1573本方案中使用的示例细胞系
HindIII-HF 及 10x CutSmart 缓冲液NEBR3104M
HyClone 分子生物学级水Fisher Scientific10275262
I-SceI 及 10x Tango 缓冲液InvitrogenER1771
异丙醇VWR20842.33
JetPRIME 转染试剂及缓冲液PolyPlus114-15基于脂质的转染试剂
MegaStar 1.6VWR521-1749适用于 15 或 50 mL 离心管的离心机
MEM Eagle 培养基PAN-BiotechP04-08056HEK-293 细胞的培养基
微孔板振荡器Fisherbrand15504070微孔板轨道振荡器
MicroStar 17RVWR521-1647适用于 1.5 或 2 mL 离心管的离心机
MultiDropThermo Fisher5840300用于细胞或水基试剂的分配仪
MultiDrop 标准模块Thermo Fisher24072670MultiDrop 试剂分配仪的模块
NanoDLR Stop & Glo 缓冲液和底物PromegaN1630 或 N1650报告基因荧光素酶（NanoLuc）试剂，用于淬灭萤火虫荧光并检测 NanoLuc 荧光。Nano-Glo 双荧光素酶报告基因检测系统试剂盒的一部分
ONE-Glo EX 荧光素酶检测试剂缓冲液和底物PromegaN1630 或 N1650对照荧光素酶（萤火虫）检测试剂，用于检测萤火虫荧光。Nano-Glo 双荧光素酶报告基因检测系统试剂盒的一部分
PBS（不含钙或镁）PAN-BiotechP04-36500
pGL4 萤火虫质粒（或类似物）PromegaE1310（或等效产品）萤火虫对照质粒
pNL1.1 NanoLuc 质粒（或类似物）PromegaN1091（或等效产品）NanoLuc 对照质粒，用于设备参数调整/优化实验
QIAquick 凝胶回收试剂盒Qiagen28706
Quick-Load Purple 1 kb DNA MarkerNEBN0552S高分子量 DNA Marker
乙酸钠（3 M），pH 5.5Thermo FisherAM9740用于使用 QIAquick 凝胶回收试剂盒进行凝胶回收时的 pH 调节
SYBR Gold（10,000x）InvitrogenS11494用于单链 DNA 和双链 DNA 的可视化
SYBR Safe（10,000x）InvitrogenS33102仅用于双链 DNA 的可视化
T4 DNA 连接酶及 10x 连接酶缓冲液NEBM0202L
台盼蓝染色液 0.4%InvitrogenT10282用于细胞计数过程中活力测定
胰蛋白酶-EDTA 溶液；0.25% 胰蛋白酶和 0.53 mM EDTASigma-AldrichT4049-100ML
XhoI 及 10x CutSmart 缓冲液NEBR0146M

参考文献

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  9. Wyatt, D. W., et al. Essential roles for polymerase θ-mediated end joining in the repair of chromosome breaks. Mol Cell. 63 (4), 662-673 (2016).
  10. Wood, R. D., Doublié, S. Genome protection by DNA polymerase θ. Annu Rev Genet. 56, 207-228 (2022).
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DNA DNA NanoLuc

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