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纳米颗粒递送寡核苷酸载荷在多形性胶质母细胞瘤动物模型中的应用

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DOI：

10.3791/66986

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2024年9月27日

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1Precision Health Program, Michigan State University, 2Department of Biomedical Engineering, College of Engineering, Michigan State University, 3Department of Radiology, College of Human Medicine, Michigan State University, 4Institute for Quantitative Health Science and Engineering, Michigan State University, 5Henry Ford Health, 6Transcode Therapeutics Inc.

本文内容

摘要

血脑屏障是胶质母细胞瘤治疗药物递送的重大障碍，而该疾病目前尚无治愈手段。本文报道了一种体内成像引导的氧化铁治疗性纳米平台，该平台凭借其尺寸可绕过这一生理屏障，并在肿瘤部位富集。

摘要

多形性胶质母细胞瘤（GBM）是最常见且最具侵袭性的原发性脑恶性肿瘤，目前尚无治愈手段。血脑屏障是向GBM递送治疗药物的重要障碍。本文报道了一种基于氧化铁、可影像引导的治疗性递送纳米平台，该平台凭借其尺寸可绕过这一生理屏障，并在肿瘤区域富集，实现有效载荷的递送。该25 nm纳米平台由交联的葡聚糖包被氧化铁纳米颗粒构成，标记有Cy5.5荧光染料，并负载反义寡核苷酸作为有效载荷。磁性氧化铁核心可实现对纳米颗粒的追踪 体内 磁共振成像可用于检测，而Cy5.5染料则可实现光学成像追踪。本报告详细描述了静脉注射后，该纳米颗粒平台（称为MN-anti-miR10b）在原位移植的胶质母细胞瘤肿瘤中富集情况的监测过程。此外，还提供了相关 insights 体内 RNA寡核苷酸的递送问题，这一难题一直阻碍着RNA治疗药物向临床应用的转化。

引言

多形性胶质母细胞瘤（GBM）是星形细胞瘤中恶性程度最高的一种，目前几乎无法治愈。每年约有15,000人被诊断为胶质母细胞瘤，其中位生存期仅为约15个月，5年生存率仅为5%1。在过去几十年中，尽管人们多次尝试拓展治疗手段，其预后改善仍十分有限。目前GBM的标准治疗方案包括在可行的情况下尽可能进行手术切除，随后辅以放疗和化疗2。替莫唑胺（TMZ）是首选的化疗药物，也是迄今为止最新发现具有显著临床疗效的胶质母细胞瘤治疗药物；然而，至少50%的GBM肿瘤对TMZ具有耐药性3。尽管现有治疗方案已十分严格，临床上仍迫切需要更有效的胶质母细胞瘤治疗方法。

胶质母细胞瘤（GBM）及其他脑部相关疾病治疗药物的研发受到血脑屏障（BBB）选择性特性的显著限制。血脑屏障是一种由内皮细胞、周细胞和星形胶质细胞终足组成的生理屏障，在循环系统与脑组织之间形成一层半透膜，限制了分子和细胞自由进入脑组织4。尽管血脑屏障在正常生理条件下具有保护作用，对维持脑内稳态至关重要，但它也阻止了许多治疗药物进入脑内，使GBM的治疗变得复杂。为了提高治疗药物向GBM的递送效率，研究人员已开发出基于纳米颗粒的递送载体、聚焦超声增强药物递送技术以及受体介导的药物递送方法5,6。

纳米颗粒已成为开发多种疾病（包括癌症）治疗手段的有前景媒介。在胶质母细胞瘤（GBM）的成像和治疗应用中，已尝试采用多种纳米颗粒结构进行研究。7,8。重点在于将药物递送至GBM，同时结合 在体 成像递送过程，所提出的方法利用由氧化铁核心和右旋糖酐包被层组成的磁性纳米颗粒（MN），以确保其稳定性。这些纳米颗粒的磁性使其可通过磁共振（MR）成像进行检测，同时通过简单的偶联化学方法与氨基化右旋糖酐涂层结合，可实现治疗性分子（如RNA分子）、额外的靶向分子或成像分子（如Cy5.5近红外荧光染料）的偶联。9,10除了成像功能外，该纳米平台还能通过保护寡核苷酸免受内源性核酸酶降解，延长RNA治疗药物的半衰期，从而改善治疗递送效果。此处介绍了该纳米平台在 体内 将治疗性寡核苷酸（称为 MN-anti-miR10b）递送至胶质母细胞瘤（GBM），并通过 体内 成像，被展示出来。此前，已证明该纳米平台能够在胶质母细胞瘤（GBM）细胞中聚集 体外 导致肿瘤细胞活力显著下降11在进行治疗之前 体内 研究中，有必要进行证明 体内 将该纳米平台递送至动物模型中的胶质母细胞瘤（GBM）肿瘤。为此，建立了原位GBM动物模型，并对模型进行静脉注射该构建物，随后 体内 成像。此处概述了这些研究的实验方案，通过成像证实了在肿瘤区域的聚集。 体内 成像和 离体 显微镜技术

方案

所有涉及动物实验的操作均已获得密歇根州立大学机构动物护理与使用委员会（IACUC）的批准。实验所用雌性远交系裸鼠于7周龄时购自杰克逊实验室（品系编号 #007850），并在植入手术前适应环境1周。小鼠在植入时体重约为21-25 g。表达萤火虫荧光素酶的U251细胞由Ana deCarvalho博士提供并构建12。

1. 细胞培养及移植前准备

  1. 在含有D-葡萄糖、L-谷氨酰胺和丙酮酸钠，并添加10%胎牛血清和1%青霉素/链霉素的杜氏改良伊格尔培养基（DMEM）中，于37 °C、5% CO2条件下培养荧光素酶标记的人胶质母细胞瘤U251细胞。
  2. 当细胞融合度达到70%时，在37 °C下用0.25%胰蛋白酶/EDTA消化1–2分钟。T-75培养瓶使用2–4 mL，T-175培养瓶使用4–6 mL。
  3. 待细胞从培养瓶表面脱落后，加入2:1比例的完全DMEM终止反应，并通过轻柔吹打使细胞充分解离成单细胞悬液。将细胞转移至锥形管中，在300 x g条件下离心5分钟，收集细胞沉淀。
  4. 小心吸除上清液，将细胞沉淀重悬于1×磷酸盐缓冲液（PBS）中。使用台盼蓝染色法结合血细胞计数板对细胞进行计数，排除死细胞后计算活细胞总数。按上述方法再次离心收集细胞沉淀。
  5. 将细胞沉淀重悬于PBS中，调整细胞浓度至1 × 108 个细胞/mL，并将细胞悬液置于冰上保存，用于颅内接种。

2. 徒手原位肿瘤移植

注意：本方案改编自 Irtenkauf 等人（Ana deCarvalho 博士的操作程序；亨利·福特健康系统赫梅林脑肿瘤中心）12。所有步骤均应在生物安全柜中进行，以确保受试者和研究人员的安全。徒手移植法可加快操作过程，便于获得较大的样本量，同时保持颅内移植的质量。此外，也可使用立体定位仪将肿瘤移植至下述相同坐标位置。

  1. 称量裸鼠（无胸腺小鼠），使用28G注射器通过腹腔注射给予氯胺酮/赛拉嗪麻醉剂溶液（100 mg/kg/10 mg/kg）。将小鼠置于加热垫上的恢复笼中以维持体温。通过检查足底反射确认麻醉效果。
  2. 涂抹眼科眼膏，使用28G注射器皮下注射酮洛芬（5 mg/kg），并进行耳缘打孔以作标识。
  3. 用70%乙醇对头部顶部手术区域进行消毒，随后使用碘伏擦洗，重复3次。然后，在头部中线右侧使用小型手术剪做一个5–7 mm的切口，用精细镊子牵拉皮肤以暴露颅骨及颅缝。
  4. 用棉签擦拭颅骨以去除骨膜，从而暴露骨面。使用新的棉签蘸取3%过氧化氢溶液，使骨面干燥。再用新的棉签擦去多余的过氧化氢及可能产生的泡沫。重复此步骤3次，直至颅骨上的前囟点清晰可见，且骨面足够干燥以进行钻孔。充分干燥的颅骨表现为颅缝明显变白，红肿程度较初始状态显著减轻。
  5. 以前囟点为参考，使用尺子测量-2.5 mm内外侧方向和-1 mm前后方向的位置，并用记号笔标记钻孔位点。钻孔前需再次测量，确保标记位置准确无误。
  6. 使用配备0.5 mm钻头的电动显微外科钻机（11,000 RPM），在先前标记的位置小心钻孔。用新的棉签吸除钻孔处可能积聚的血液或液体。
  7. 准备一支33G微量注射器，安装针套并调节针尖外露长度为3 mm。将先前制备的浓度为1 × 108 个细胞/mL的细胞悬液轻轻重悬后吸取5 µL，确保注射液中无气泡。使用70%异丙醇擦拭巾仔细擦去针头及针套外表面残留的细胞悬液。
  8. 将针头垂直插入钻孔位置，直至针套阻止进一步插入。然后小心回撤针头约0.5 mm，为注射细胞留出积聚空间。
  9. 在1分钟内缓慢注射细胞悬液。注射完成后，保持针头在原位1分钟，以减少注射液外溢。随后小心拔出针头。
  10. 用干净棉签擦去注射部位积聚的液体，然后涂抹骨蜡封闭钻孔。
  11. 使用兽用粘合剂闭合切口，并使其自然干燥。用干净棉签涂抹局部利多卡因作为镇痛剂。
  12. 持续监测小鼠直至其完全苏醒并能自主活动。植入术后连续两天皮下注射酮洛芬（5 mg/kg）以控制疼痛。

3. 纳米颗粒平台的合成

  1. 按照先前所述方法合成纳米颗粒，并将其与Cy5.5及寡核苷酸（anti-miR10b）进行偶联11。

4. MN-anti-miR10b 给药

注意：本研究中，注射在植入后第7天开始，每周进行一次，持续6周，但该方案也可用于不同的注射频率。

  1. 称重小鼠，并计算需给予小鼠的MN-anti-miR10b体积。在小鼠胶质母细胞瘤（GBM）模型中，MN-anti-miR10b的给药剂量为20 mg Fe/kg。例如，一只20 g的小鼠需接受80 µL浓度为5 mg Fe/mL的MN-anti-miR10b。对照组小鼠则接受与该剂量方案一致的等体积PBS。
  2. 用28G注射器抽取MN-anti-miR10b药液，确保注射液中无气泡。
  3. 在诱导箱中以2%–4%异氟烷诱导麻醉，维持麻醉时浓度为1.5%–2%，气体流速为1.5 L/min。将小鼠转移至鼻罩，并持续给予麻醉。检查麻醉深度，并涂抹兽用眼膏。
  4. 用70%异丙醇擦拭尾部进行消毒，待多余酒精自然挥发干燥。
  5. 旋转尾部，使尾侧静脉位于尾部上方。对准静脉进针，插入针头后回抽活塞以建立负压。
  6. 继续插入针头直至血液进入注射器，表明已成功进入静脉。
  7. 缓慢注射MN-anti-miR10b，注射完成后撤出针头。用纱布按压注射部位直至出血停止。
  8. 将小鼠从鼻罩移开。持续监测小鼠状态，直至其完全苏醒并能自主活动。
    注意：纳米颗粒的推注给药可能引起呼吸窘迫。需密切观察小鼠状态，若出现呼吸窘迫迹象，应立即实施轻柔胸部按压。

5. 体内 生物发光与荧光成像

注意： 在体 生物发光和荧光成像在以下条件下进行 体内 成像系统（IVIS）在注射纳米颗粒前及注射后24小时。

  1. 在不含 Mg2+ 和 Ca2+ 的 PBS 中配制浓度为 30 mg/mL 的无菌过滤 D-荧光素溶液。
  2. 打开 IVIS 操作软件并开始初始化以准备仪器。在系统初始化过程中，通过选择 Acquisition > Auto-Save To 来选择用于保存图像的文件夹，并定义文件保存路径。
  3. 在成像时间点，称量小鼠体重，并根据 150 mg/kg 的剂量计算所需注射的 D-荧光素体积。用 28G 注射器抽取相应体积的溶液，并避免溶液直接暴露于光线下。本研究在植入手术后第 2 天进行成像以确认细胞接种成功，并从植入后第 7 天开始每周成像，且成像时间紧接每周治疗之前。
  4. 在诱导室内使用 2%–4% 异氟烷进行诱导麻醉，维持麻醉使用 1.5%–2% 异氟烷，气体流速为 1.5 L/min。麻醉成功后，轻轻抓起小鼠颈部皮肤以避免进一步损伤手术部位，并将 D-荧光素通过腹腔注射给予。让小鼠恢复一段时间，成像前等待 10 分钟，以使生物发光信号充分产生并稳定。
  5. 在生物发光信号发展期间，准备 IVIS 扫描仪以进行生物发光成像。将黑色低荧光垫放置在成像台上，并根据待成像动物数量配置鼻罩阵列。
  6. 在软件中点击 Imaging Wizard，选择 Bioluminescence Imaging ，然后选择 Open Filter。在下一个界面中选择成像对象和视野范围。此时 IVIS 已设置为生物发光成像模式。
  7. 在成像前 3 分钟，开始通过让异氟烷/氧气混合气体充满诱导箱来预处理诱导箱。在成像前 2 分钟，将小鼠放入诱导箱中进行麻醉。
  8. 麻醉完成后，将小鼠从诱导箱转移至 IVIS 进行成像，并使其呈俯卧位放置。成像过程中使用 2% 异氟烷维持麻醉。
  9. 将小鼠放置于 IVIS 扫描仪后，点击 Acquire Sequence。使用自动曝光设置拍摄图像，最小信号阈值设为 3,000 计数。生物发光成像用于可视化荧光素酶标记的 U251 胶质母细胞瘤细胞的定位。自动曝光将根据视野中最亮信号计算曝光时间，最长不超过用户设定的 5 分钟上限。
    注意：通常一笼小鼠仅需一张图像，因为接种情况一般较为均匀。若存在一个或多个信号较强的小鼠，可将其移出后重新采集图像，以便更清晰地捕捉信号较弱小鼠的信号。
  10. 完成生物发光成像后，更改 IVIS 设置以准备透射荧光成像，并进行荧光扫描。
    1. 在成像向导中选择 Fluorescence > Filtered Pair with Epi-Illumination。在下一界面中选择待成像的探针，例如 Cy5.5。选择成像对象和视野范围。此时 IVIS 扫描仪已设置为对前一界面所选探针进行荧光成像。
  11. 使用自动曝光设置拍摄图像，最小信号阈值设为 6,000 计数。Cy5.5 荧光成像用于可视化 MN-anti-miR10b 的定位。自动曝光将根据视野中最亮信号计算曝光时间，最长不超过用户设定的 5 分钟上限。
    注意：即使在注射 PBS 的对照组小鼠中，荧光成像也很少需要超过 1 分钟的曝光时间。由于处理组小鼠之间的信号差异较小，单次成像始终足够。
  12. 成像结束后将小鼠从 IVIS 中取出，监测其直至完全从麻醉中恢复并能够自主活动。

6. 体内 磁共振成像

注意：在注射纳米颗粒前和注射后24小时进行磁共振成像，且可在接受光学和生物发光成像的同一动物体内进行磁共振成像。

  1. 在诱导箱中使用2%-4%异氟烷进行诱导麻醉，维持麻醉时使用1.5%-2%异氟烷，气体流速为1.5 L/min。麻醉成功后，将小鼠俯卧位放置于MRI床面上，并置于呼吸监测气囊上方。将鼻罩紧密贴合小鼠吻部以在成像过程中持续输送麻醉气体，并涂抹眼用软膏以保护角膜。
  2. 使用咬合固定杆和耳杆对头部进行固定并调整至扫描所需位置。
  3. 插入润滑过的直肠温度探针，并确认呼吸和体温监测设备正常工作。通过将小鼠床面上的定位销插入线圈上的孔洞，将小鼠脑部线圈置于头部上方，并用胶带固定线圈以减少扫描过程中的移动。
  4. 在小鼠体表放置小型循环温水垫以维持麻醉期间的体温。注意保持线圈与加热垫之间留有一定距离，以减少水介质对图像的干扰导致的失真。
  5. 将小鼠及成像床移至扫描位置。
  6. 在采集软件中启动Wobble校准步骤，对MRI线圈进行调谐与匹配。在MRI设备的服务端，调节线圈上的调谐（tune）和匹配（match）旋钮，使信号曲线居中（tune）并达到最大深度（match）。
  7. 获取三平面定位像扫描，并在必要时调整成像床位置，使小鼠脑部位于磁体的等中心位置。
  8. 采集2D T2加权扫描图像，用于检测肿瘤内注射的示踪剂，扫描参数如下：重复时间（TR）= 2500 ms，回波时间（TE）= 25 ms，视野（FOV）20 x 20 mm，18层冠状面切片，层间间隙0.2 mm，面内分辨率150 x 150 µm，层厚0.5 mm。
  9. 采集全脑B0图，利用Mapshim工具计算局部匀场参数。随后使用3D T2加权图像观察纳米颗粒，扫描参数为：TR = 30 ms，TE = 10 ms，FOV 20 x 15 x 12 mm，分辨率100 µm各向同性。
  10. 以2D T2加权图像为参考，对肿瘤区域进行T2*图采集以进一步观察纳米颗粒。使用参数：TR = 800 ms，TE = 3.5 ms，FOV 20 x 20 mm，5层冠状面切片，无层间间隙，面内分辨率100 µm。采集10幅正回波图像，回波时间间隔为5 ms。
  11. 在整个成像过程中持续监测呼吸和体温，并根据需要调整异氟烷浓度和水温。
  12. 成像结束后，将小鼠从MRI扫描仪中取出，置于加热的恢复笼中。持续观察直至小鼠完全从麻醉中恢复并能够自主活动。

7. 离体 生物发光与荧光成像

  1. 执行 离体 在IVIS中的生物发光和荧光成像，类似于 体内 成像。按照上述步骤进行IVIS初始化和扫描设置。
  2. 在实验终点，称量小鼠体重，并根据150 mg/kg的剂量计算所需注射的D-荧光素体积。注射D-荧光素后10分钟进行活体成像，操作步骤同前文所述。
  3. 最终步骤后 体内 生物发光与荧光 成像后，在麻醉状态下迅速通过颈椎脱位法处死小鼠，解剖小鼠并将主要器官（包括脑）收集至培养皿中。
  4. 将切除的器官置于培养皿中，放入IVIS扫描仪，使用与之前相同的采集参数，通过生物发光和荧光两种模式对器官进行成像 体内 成像
  5. 使用长镊子将含有组织样本的OCT包埋模具缓慢浸入液氮浅层中，对后续分析所需的任何器官进行速冻，直至OCT完全变为白色。切勿让液氮接触液态OCT或过快地放入模具，以免OCT产生气泡。将冷冻样品储存在-80 °C条件下。
  6. 将含有肿瘤的脑组织置于OCT包埋剂中，并进行速冻以备冷冻切片。储存于-80 °C，直至分析时使用。

8. 荧光显微镜

  1. 为冷冻切片准备冷冻切片机。将样品室和样品头的温度设置在 -15 °C 至 -20 °C 之间。
  2. 从 -80 °C 保存环境中取出包埋在 OCT 中的速冻脑组织，放入冷冻切片机腔室内。在切片前，让样品温度升至与腔室温度一致（-20 °C）。
  3. 使用单刃剃刀在注射部位对脑组织进行冠状面切割。该部位通常在脑表面可见为一个小凹陷。用少量 OCT 将样品固定在样品盘上，使脑组织的切面朝下以便切片。在腔室内使用预冷的压块对样品施加足够的压力，以确保样品固定稳定。
  4. 将安装好的样品和样品盘移至样品头上，准备切片。通过连续切取 20 µm 厚的切片，修切至目标深度，并调整样品角度，使切面尽可能与组织水平一致。
  5. 当达到目标组织深度后，调整冷冻切片机以切取 5–7 µm 厚的切片。将切片转移至预先标记有小鼠编号、所切组织类型和载玻片编号等信息的玻璃载玻片上，操作时将载玻片带电的一侧迅速轻触切片以完成贴附。
  6. 配制新鲜的 4% 多聚甲醛（PFA）溶液。将带有组织的载玻片浸入 PFA 溶液中固定 15 分钟。固定后用 DPBS 洗涤 3 次。
  7. 在已固定的玻璃载玻片组织切片上，滴加 40 µL 含有 4',6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）的封片剂，DAPI 可对细胞核进行染色。小心地将一块 24 mm × 50 mm 的玻璃盖玻片覆盖在封片剂上，并确保整个组织被完全包裹在封片剂中。
  8. 使用 DAPI（激发波长（ex）359 nm，发射波长（em）457 nm）和 Cy5.5（ex 683 nm，em 703 nm）荧光显微镜观察组织。

结果

MN-anti-miR10b 的合成与表征方法如前所述11。MN-anti-miR10b 的透射电子显微镜图像显示了该纳米平台的形态和多分散性 (图 1B)。该纳米平台的平均粒径为 25.12 ± 0.34 nm，zeta 电位为 13.18 ± 1.47 mV (图 1C,D)。在本研究中，按照上述方案将 U251 人胶质母细胞瘤细胞原位植入无胸腺裸鼠体内。通过系统静脉注射给予 MN-anti-miR10b，剂量为 20 mg Fe/kg。末次给药后 7 天处死小鼠，并采集组织。注射 MN-anti-miR10b 的小鼠体内 Cy5.5 荧光与生物发光信号显示出明显的共定位 (图 2A,B)，表明纳米颗粒已递送至肿瘤部位，而对照组小鼠未检测到荧光信号。离体 荧光成像显示纳米颗粒主要分布于肝脏和肾脏等主要清除器官，这与该类纳米颗粒的预期分布一致 (图 2C)。在另一项独立研究中，如上所述将 GBM 细胞原位植入小鼠体内，并进行 体内 MR 成像。在给予纳米颗粒前及单次注射 20 mg Fe/kg 后 24 小时，分别获取 T2* 加权图像和 T2* 图谱。T2 加权 MRI 信号的特征性降低表明 MN-anti-miR10b 具有作为 MRI 对比剂穿越血脑屏障并在肿瘤区域蓄积的潜力 (图 3)。在完成 体内 成像后，进一步通过荧光显微镜检测以验证纳米颗粒向肿瘤的递送情况。如前所述，组织被切片并进行 DAPI 染色以制备显微样本。肿瘤区域内检测到 Cy5.5 荧光信号，证实了纳米颗粒的成功递送 (图 4)。

纳米颗粒示意图和尺寸分布图；含抗miR-10b LNA的氧化铁核。
图1．MN-anti-miR10b的表征。（A）MN-anti-miR10b的结构示意图。该纳米平台由一个氧化铁核组成，表面包被葡聚糖，标记Cy5.5荧光染料，并偶联治疗性寡核苷酸（anti-miR10b）。图片使用BioRender.com绘制。（B）MN-anti-miR10b的透射电子显微镜图像。（C）该结构的流体动力学粒径为25.12 ± 0.34 nm。（D）MN-anti-miR10b的Zeta电位为13.18 ± 1.47 mV。请点击此处查看该图的高清版本。

生物发光成像；荧光研究；MN、PBS小鼠的结果；肿瘤可视化。
图2. 胶质母细胞瘤（GBM）模型中的体内与体外研究。(A) 体内生物发光成像（左）和荧光成像（右）显示磁性纳米颗粒信号在肿瘤区域的共定位。(B) 切除脑组织的体外生物发光与荧光成像进一步证实了信号的共定位。(C) 器官生物分布结果显示信号主要蓄积于主要清除器官。B：脑；H：心脏；Lu：肺；Li：肝；S：脾；K：肾；M：肌肉；（所有组别n=6）。请点击此处查看该图的放大版本。

MRI T2* 分析；通过T2*加权成像及T2*图在注射前后进行组织评估。
图3. 体内 GBM 模型中的 MRI T2* 加权（上排）和T2* （底部一行）注射 MN-anti-miR10b 前（左）和注射后 24 小时（右）获得的图像。注射后图像中信号强度的降低表明氧化铁的聚集（n=3）。 请点击此处以查看此图的放大版本。

PBS与MN的荧光显微镜观察；细胞分布与信号强度比较
图4. 离体 肿瘤组织的荧光显微镜观察 代表性显微图像显示纳米颗粒的聚集情况。蓝色 - DAPI，品红色 - Cy5.5。比例尺 = 100 µm（所有组别 n=6）。 请点击此处查看此图的放大版本。

讨论

在通过不同方法验证纳米颗粒跨越血脑屏障（BBB）的累积过程中，若干关键步骤可能对实验方案的成功起决定性作用。首先，在GBM细胞原位移植过程中，需确保颅骨干燥后颅缝清晰可见，这有助于准确地将肿瘤细胞植入预定位置。进行颅骨钻孔时，应以轻柔压力接触钻孔部位，先在骨面形成浅表凹痕；一旦初始标记完成且位置准确，便可更稳定地继续钻孔，从而最大限度减少钻头滑移。穿透颅骨后应立即停止钻孔，以避免对脑组织造成不必要的损伤。在静脉注射纳米颗粒及其他试剂时，必须确保注射液中无气泡，以防发生潜在致命的静脉空气栓塞。根据本方案，成功插入尾静脉的标志包括：血液被吸入注射器内，以及针尖周围尾静脉区域颜色变淡。对于 离体 离体组织的生物发光与荧光成像应尽快进行，因为生物发光信号会随时间推移逐渐衰减。不同细胞系的生物发光信号动力学可能存在差异，因此了解特定模型的特性至关重要。

某些步骤可以进行调整，以有助于检测纳米颗粒的定位。在 体内 生物发光成像中，肿瘤细胞植入的差异及肿瘤生长速率的不同可能导致生物发光信号的差异。在某些情况下，信号最强的小鼠可能缩短扫描曝光时间，从而导致其他小鼠的信号检测减弱。此时，建议继续进行荧光扫描，以使小鼠在生物发光成像和荧光成像中保持相同位置，便于共定位分析。随后，在移除初次生物发光扫描中已检测到信号的小鼠后，重新进行生物发光成像。这将使曝光时间的计算基于信号较低的小鼠，从而最终实现对肿瘤的有效检测。在进行 体内 荧光成像时，可通过用黑色纸张覆盖尾部以减少尾静脉注射后残留纳米颗粒产生的高荧光信号，从而更准确地确定纳米颗粒在体内的定位。基于相似的考虑，在 离体 器官的荧光扫描中，单独成像大脑可能更清晰地显示纳米颗粒在脑组织及肿瘤区域的定位，因为纳米颗粒在网状内皮系统器官中的积聚可能干扰信号检测。

该方法在治疗性RNA递送方面的一个局限性是纳米颗粒在体内的系统性分布。与其他所有系统性注射一样，治疗剂会被肝脏、肾脏和脾脏等器官从血液中清除，最终导致递送至目标区域的纳米颗粒减少。为解决这一问题，已合成了具有交联葡聚糖涂层的MN-anti-miR10b，以延长其在体内的循环时间13。尽管已通过优化纳米颗粒结构来延长循环时间并提高其富集程度，但根据特定的模型和疾病状态，仍可能需要多次注射纳米颗粒，才能在肿瘤区域实现显著的富集。

在胶质母细胞瘤（GBM）中递送治疗分子面临重大挑战，主要由于血脑屏障（BBB）具有高度选择性。许多研究已尝试使用基于纳米颗粒的递送载体，但由于其尺寸和电荷特性，这些载体最终难以有效穿透血脑屏障5,6,7。本文所述的25 nm纳米颗粒结构MN-anti-miR10b在系统性注射后能够穿越这一生理屏障，并在肿瘤区域聚集。该纳米颗粒平台有望介导RNA分子向GBM的递送，并可通过成像手段监测递送载体的聚集情况。氧化铁纳米颗粒的生物分布呈现预期模式，即主要在网状内皮系统器官中聚集以进行清除。类似生物分布特征已在用于成像或治疗目的的类似纳米颗粒中被报道。重要的是，在先前的研究中，即使在30 mg Fe/kg剂量下，也未发现主要器官存在相关脱靶毒性的迹象14,15。

这种纳米颗粒平台系统的一个优势在于其具备体内成像能力，可实现对纳米颗粒蓄积情况的无创追踪。与葡聚糖包被层偶联的Cy5.5近红外荧光染料可实现快速光学成像，以检测其存在。除该成像方式外，MN-anti-miR10b中的超顺磁性氧化铁纳米颗粒核心还可使该结构适用于作为磁共振成像（MRI）对比剂，代表了诊疗一体化领域的一个新兴方向16。MRI的解剖学分辨率结合氧化铁纳米颗粒的对比效应，能够精确定位纳米颗粒在脑组织中的蓄积位置。这两种成像方式相结合，使得该纳米平台在临床前阶段的体内追踪成为可能，从而监测RNA或其他载荷物质穿越血脑屏障（BBB）的递送过程。

披露

Z.M. 和 A.M. 是 TransCode Therapeutics 公司的联合创始人及股东。其余作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

本研究的部分经费由亨利·福特医疗系统与密歇根州立大学健康科学联盟授予 A.M. 和 A.dC. 的资助项目提供。我们感谢密歇根州立大学的 Danielle R. Ferguson 博士对动物实验的监督以及对本视频的批准。

材料

本文使用的材料清单
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无胸腺裸鼠 "J:NU" 小鼠杰克逊实验室RRID:IMSR_JAX:007850免疫缺陷小鼠模型
0.25% 胰蛋白酶Gibco25200-056U251细胞培养试剂
1.7 mL 微量离心管DOT ScientificRN1700-GMT用于组织采集
10 µL，神经外科注射器，型号 1701 RN，33 号针头，4 型针尖Hamilton65460-06用于肿瘤细胞颅内植入的注射器
3M Vetbond3M1469SB用于手术部位闭合的组织粘合剂
4% 甲醛 赛默飞世尔科技J199943-K2组织固定液
70% 异丙醇擦拭巾红衣主教（Cardinal）MW-APL用于肿瘤移植和尾静脉注射的局部消毒擦拭
Aperio VersaLeica用于染色组织切片玻片的扫描
聚维酮碘外科洗手液普渡大学6761815101用于肿瘤移植的局部消毒剂
BioSpec 70/30Bruker磁共振成像扫描仪
骨蜡MedlineDYNJBW25用于封闭植入部位的骨蜡
微型钻头用磨头F.S.T.19007-05用于在颅骨上钻孔以植入肿瘤的钻头
DAPI Fluoromount-GSouthernBiotech0100-20含DAPI染色剂的组织封片介质
杜尔贝科’DMEM（杜尔贝科改良伊格尔培养基）Gibco11995-065U251细胞培养基
超细格雷夫镊F.S.T.11150-10用于肿瘤植入的手术工具
胎牛血清康宁35-010-CVU251细胞培养基添加剂
精细剪刀 - 锐利型 10.5cmF.S.T.14060-10用于肿瘤植入的手术工具
Glydo（利多卡因）Sagent673-76手术部位局部镇痛剂
理想微型钻机CellPoint Scientific67-1200A用于在颅骨上钻孔以植入肿瘤的钻头
胰岛素注射器 1毫升 29G × 1/2英寸"Becton, Dickinson324704用于D-荧光素注射和纳米颗粒尾静脉注射的注射器
异氟烷Covetrus11695067772麻醉
异氟烷蒸发器SOMNI 科学VS6002麻醉设备
IVIS SpectrumCT 活体成像系统PerkinElmer/Revvity128201生物发光与荧光成像扫描仪
IVISbrite D-荧光素钾盐PerkinElmer/Revvity122799-100MG生物发光成像底物
氯胺酮（Ketamine）硕腾10004027肿瘤植入手术的麻醉
凯托芬（酮洛芬）硕腾10004031用于肿瘤移植手术的镇痛剂
Leica CM1950LeicaCM1950用于OCT包埋样本的冷冻切片
PBSGibco14190-144用于U251细胞移植的细胞培养试剂及细胞悬浮液
青霉素-链霉素Gibco15140-122用于U251细胞培养基的抗生素
Puralube 宠物用软膏MWI 动物健康27505用于肿瘤植入期间眼部保护的眼科眼膏
尺子F.S.T.18000-30用于测量植入物的钻孔位置
Tissue-Tek Cryomold  中等尺寸 15 x 15 x 5 mm樱花4566用于采集组织样本的收集模具
Tissue-Tek O.C.T. 化合物樱花4583用于采集组织样本的冷冻包埋剂
人源U-251 MG细胞系Millapore Sigma9063001人胶质母细胞瘤细胞系
赛拉嗪注射液，100 mg/mlCovetrus1XYL006肿瘤移植手术用麻痹剂

参考文献

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纳米颗粒递送寡核苷酸载荷在多形性胶质母细胞瘤动物模型中的应用
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