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利用多样化环境与基质中的真菌高速公路柱研究细菌-真菌相互作用

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DOI：

10.3791/66989

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2025年1月24日

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1Bioscience Division, Los Alamos National Laboratory, 2University of Neuchâtel

本文内容

摘要

本方案提供了详细的步骤，用于构建、灭菌、组装、使用以及重复利用真菌通道柱，以从多种环境基质中富集通过真菌通道相互作用的细菌-真菌配对。

摘要

细菌-真菌相互作用（BFIs）在塑造微生物群落组成、生物地球化学功能、空间动态以及微生物扩散方面发挥着关键作用。丝状真菌或其他丝状微生物（例如卵菌）形成的菌丝网络可作为“真菌高速公路”，细菌可利用这些通道在异质环境中进行迁移，从而显著增强其移动能力，并进入那些单独难以或无法到达的区域（例如由于土壤中的空气孔隙所致）。已有多种装置和实验方案被开发用于研究这些真菌高速公路，其中包括真菌高速公路柱。我们课题组设计的真菌高速公路柱可用于多种原位（in situ）或体外（in vitro）应用，并适用于多种环境样本和宿主相关样本类型。本文详细描述了使用此类柱装置开展实验的方法，包括装置的设计、打印、灭菌和准备步骤。同时讨论了对这些装置所获得数据的分析方法，并提供了针对使用真菌高速公路柱实验中可能出现问题的故障排查建议。这些装置有助于更全面地理解真菌高速公路介导的细菌-真菌相互作用的多样性、机制及动态过程，从而为复杂环境（如土壤）以及细菌与真菌共存的多种生境中结构与功能动态提供有价值的科学见解。

引言

细菌-真菌相互作用（BFIs）在塑造环境微生物组的结构、空间和功能特性方面具有极其重要的意义。例如，丝状真菌或其他类似真菌的丝状微生物的生长与扩展会形成一种生物网络，可作为“高速公路”，促进其他微生物（如细菌）的移动。环境基质中的异质性和不一致的饱和度会阻碍细菌的运动能力；然而，细菌可利用这些“高速公路”更便捷地进入环境中的其他区域1,2。这些相互作用对于理解微生物群落的空间动态至关重要。尽管已有多种技术和方法被用于研究真菌“高速公路”，但这些方法在很大程度上仍局限于实验室内的研究3,4。

在一种基于平板的方法中，从培养皿中央移除一大块琼脂，从而在两个琼脂岛之间形成一个间隙。真菌菌丝可跨越此间隙生长，使相容的细菌得以从一个琼脂岛转移到另一个琼脂岛5。其他改良的培养皿方法包括倒置平板法，即将土壤置于皿盖中，使真菌菌丝能够垂直生长并定植于培养基中，而无需直接接触，从而实现细菌的转运5,6。近年来发展出一种基于培养基液滴的方法，可用于评估细菌在特定营养条件下被菌丝选择性转运的过程7。此外，细菌桥和菌丝轨迹装置也被用于研究非生物因素对细菌迁移的影响8。尽管已有多种方法和技术被用于研究真菌高速公路，但仍亟需开发标准化装置，以在维持无菌微环境的同时，促进来自粪便、土壤和根际等复杂环境基质中的真菌高速公路的建立。

我们团队设计了一种可3D打印的真菌通道柱，可用于将细菌从一端运输到另一端9。这些装置由四个打印部件组装而成：具有沙漏形状和复杂内部晶格结构的柱体本身、一个螺纹环、两个盖子（一个大盖和一个小盖），以及一片灭菌的尼龙网（图1）。组装后的柱体可直接添加到所需的环境基质中。柱体允许微生物定植于位于柱体底部、通过尼龙网与环境基质接触的琼脂生长培养基塞，即“诱饵”培养基塞。该尼龙网可基于尺寸排阻其他可能运输细菌的土壤生物，从而将柱体内的细菌移动限制在真菌通道内。一旦该诱饵塞被定植，丝状真菌便可延伸并穿过柱体中心设计的内部晶格结构，该结构旨在形成一个类似于土壤（或其他非饱和介质）的非饱和系统，并最大限度减少来自诱饵培养基的潜在污染。随后，真菌向柱体顶部的目标培养基塞生长并定植其上。这些柱体既可接种特定的真菌分离株以测试其运输细菌的能力，也可不接种以鉴定来自基质中哪些真菌具有运输细菌的能力。到达目标培养基的生物体可进一步进行培养、分离，并进行测序分析（可通过纯培养物，或使用扩增子测序或宏基因组测序方法对混合群落进行分析）。总体而言，这些柱体为在多种基质中研究真菌通道提供了一种标准化、可重复、可重复使用且直观的方法。这些装置既可用于科研，也可作为课堂教学工具，本文将基于以往开展的实验，提供其使用的操作指南。尽管该方法有助于实验方案的标准化，但装置的设计与构建仍可根据其他应用和不同基质进行调整。

方案

研究中所用试剂和设备的详细信息列在材料表中。

1. 修改色谱柱的设计、材料和参数

  1. 下载公开可用的色谱柱设计9，可直接使用，或在兼容的计算机辅助设计（CAD）软件中修改色谱柱设计。
  2. 获取牙科手术导板树脂，或选择其他3D打印材料，例如其他光敏透明树脂。
  3. 若所选用的3D打印机、3D打印技术或3D打印材料与先前使用的不同，则需相应调整色谱柱的规格9。

2. 柱体的3D打印

  1. 设置打印参数，使用 0.05 mm 的切片厚度和 0.8 s 的曝光时间，或根据所选的打印机、打印材料和打印软件调整打印参数。
  2. 使用兼容的 3D 打印机打印真菌通道柱、螺纹环和盖帽（图 1）。

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图 1：真菌高速公路装置的组成部件。（A,B）小帽、螺纹环和大帽（从左至右）的俯视图和侧视图。（C,D）小帽的俯视图和侧视图。（E,F）螺纹环的俯视图和侧视图。（G,H）大帽的俯视图和侧视图。（I）置于柱末端的一块尼龙网滤膜（25 µm），插入环境基质中，以防止微型动物进入柱内。（J）未组装的柱。（K）组装完成的柱：其中“诱饵”端插入基质中，“目标”端保持暴露且不接触基质。请点击此处查看该图的放大版本。

3. 清洗3D打印的色谱柱组件

  1. 将打印的柱体、盖子和螺纹环浸入室温下的99%异丙醇中15分钟，每隔1分钟用手前后晃动清洗液10-15秒，以去除多余的树脂。
  2. 将部件转移至新鲜的99%异丙醇溶液中，浸没5分钟，并以与步骤3.1相同的方式手动晃动。
  3. 将部件转移至装有纯水的超声波清洗仪中，完全浸没部件后，以中等速度超声处理2分钟。切勿加热水。
  4. 将所有部件在空气中干燥至少30分钟。
  5. 为完成树脂的后固化处理，将所有3D打印部件暴露于405 nm光照下，60 °C条件下持续30分钟。

4. 柱子的灭菌

  1. 如果所选材料可高压灭菌，则将层析柱、螺纹环、盖子以及25 µm尼龙滤网分别或置于较大的烧杯中，在121 °C、1 atm条件下高压灭菌20-30分钟。
    注意：层析柱的组件在高压灭菌后可能会发生形状和颜色的变化，但其材料性能仍可保持理想状态。高压灭菌后层析柱组件的最终尺寸、形状和颜色如图1所示。

5. 准备层析柱的培养基

  1. 准备无菌的基于琼脂的培养基，使用90 mm的培养皿：可选用羧甲基纤维素钠培养基（CMC）、麦芽提取物琼脂（MEA）、马铃薯葡萄糖琼脂（PDA）或Reasoner’s 2A琼脂（R2A）9,10。按照生产商提供的说明配制培养基。
    1. 在121 °C、1 atm条件下，通过高压灭菌器灭菌21分钟，或按照生产商推荐的时间进行灭菌，然后在生物安全柜中将培养基倒入90 mm培养皿，直至琼脂接近培养皿侧壁顶部（图2），以提高无菌性。
    2. 根据生产商说明，使琼脂凝固并干燥。

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图2：真菌通道柱的组装过程。 使用柱子的一端开口切取一个塞子并插入其中，研究人员在将柱子从培养基中取出时轻轻旋转，以确保塞子保留在柱子末端内。该端用小盖部件封闭。然后以相同方式在柱子的另一端添加一个培养基塞。接着将网状部件覆盖在此端，并用螺纹环固定。在这一“诱饵”端的螺纹环上方再装上大盖。带有网状结构的一端将被置入环境基质中。请点击此处查看该图的放大版本。

6. 准备真菌通道柱

注意：此步骤需在生物安全柜中进行，以保持柱组件和培养基的无菌状态。图2展示了真菌通道柱的组装过程。

  1. 使用柱子末端本身（不带任何盖帽）来提取一块与柱子一端紧密贴合的培养基塞。将柱子从培养基中提起时，采用旋转动作，使琼脂保留在柱子末端内。或者，也可将柱子末端作为模板，从培养基中挖出相应大小的培养基块，并用移液器吸头将其转移至柱子中。
  2. 在将第一块培养基塞加入柱子末端后，将小盖帽盖在该端，以维持目标培养基的无菌微环境。
  3. 将柱子翻转，对另一端重复步骤6.1。
  4. 使用灭菌剪刀剪取一块直径约2 cm的灭菌尼龙网膜（孔径25 µm）（图1）。将网膜覆盖在柱子暴露的末端上。将螺纹环旋紧在该端的诱饵培养基端，同时将网膜固定在螺纹内。
  5. 将大盖帽盖在柱子底部，覆盖网膜及螺纹环的另一端；在储存或运输柱子时应保持此盖帽处于盖合状态。

7. 用目标真菌预接种基质或诱饵培养基

注意：此步骤为可选。

  1. 通过以下方法在目标基质上接种目标真菌（例如，已知可形成真菌高速公路的真菌）：首先在培养皿中的固体真菌培养基（例如，MEA、PDA；制备方法见步骤5）上培养该真菌，然后将带有明显真菌生长的琼脂小块（约1 cm）转移至基质上。
    注意：先前的实验9在将柱状物加入已定植的基质前，曾使用经Coprinopsis cinerea定植10天的粪便基质。
  2. 也可不预先在基质上定植真菌，而是将诱饵真菌直接加入培养皿或直接加入柱内诱饵培养基的底部，所用材料为少量真菌菌丝（例如，用无菌接种环刮取）。
    1. 对于培养皿中的诱饵真菌，需等待其生长至覆盖培养皿大部分区域（约覆盖50%–75%），然后从菌丝生长最靠近边缘处的已定植培养皿中直接打孔取出诱饵培养基部分（如步骤6.1所述）。
    2. 若直接在诱饵培养基中进行预定植，则需在向基质中加入柱状物前，确保诱饵培养基中已有明显的菌丝生长（此过程可能需要数天）。
      注意：先前的实验9曾使用经C. cinerea预定植14天的培养基作为诱饵培养基；预定植时间将根据真菌的生长速率、培养基类型及培养条件的不同而有所变化。

8. 准备对照处理和重复实验

  1. 制备阴性对照柱（如步骤1-6所述），不接种任何样品，也不将这些柱放入底物中。用于为后续分析提供基线，并评估制备过程中可能存在的污染。
  2. 任何实验均应包含至少三个重复柱。

9. 将层析柱加入底物中

  1. 建立实验室微宇宙系统（例如，将土壤置于盒子、花盆或管中；图3A），或将柱体带至目标野外地点。
  2. 取下柱体底部的大盖帽，露出螺纹环和筛网。
  3. 根据下文所述不同基质类型的特定要求，将柱体插入相应的目标基质中（图3）。如有必要，为尽量减少对筛网的损伤，可在插入柱体前用手套包裹的手或小型工具（例如小铲子）在基质中预先挖出凹坑。
    1. 粪便：该柱体此前已成功用于新鲜马粪。使用前将粪便储存在4 °C环境中，并在插入柱体前将其加入培养室（如Magenta盒）中。将柱体插入基质，使其覆盖柱体总高度的1–2 cm。
    2. 土壤：将柱体插入土壤，使整个底部区域均位于土壤内（约1–2 cm深）（图3B）。柱体可置于土壤表面，或埋入至目标侧小盖帽下方为止。
    3. 根际：按照步骤9.3.2的指示，将柱体插入植物根系周围的土壤中，并以一定角度靠近特定根系放置，以提高捕获根际微生物的概率（图3C）。
    4. 管内基质：将约10 mL目标基质加入50 mL锥形管或类似容器中，如需可加水润湿（例如，在湿度极低的环境中）使用纯水。将柱体插入管中，使底部完全埋入，螺纹环或筛网部分均不可见（图3A）。旋紧50 mL管的盖子，并将其放入50 mL试管架中保持直立。

10. 在底物中保留色谱柱

  1. 将柱子置于基质中 3-21 天。
    注意：柱子在基质中放置的时间长短取决于所用诱饵真菌的生长速率、定殖诱饵培养基的真菌生长速率以及环境条件（例如，干燥条件会导致培养基更快脱水，因此不能放置过久）。
  2. 为实验设定理想的光照/黑暗周期；以往的实验将实验室内的柱子保持在黑暗条件下，而野外的柱子则暴露于当地的昼夜环境中9。

11. 从底物上移除色谱柱

  1. 在层析柱与底物接触达到所需时间后，取下层析柱，轻轻振去多余的底物，并将大帽重新装回柱体底部的筛网下方，以便运输。
  2. 将层析柱放入无菌烧杯或50 mL离心管中进行运输。运输过程中应保持层析柱直立。

12. 从柱子的目标培养基中培养分离物

  1. 在无菌环境（如生物安全柜）中，取下诱饵培养基的大盖、螺纹环和滤网。丢弃滤网。
    注意：如果研究人员希望了解定殖于诱饵培养基上的生物种类，除目标培养基塞外，还需对诱饵培养基塞执行步骤 12.3–12.4。
  2. 取下含有目标培养基一端的柱状结构小盖。
  3. 通过翻转柱体使目标培养基塞自然滑出，或使用无菌镊子或移液器吸头取出目标培养基塞。将目标培养基塞直接置于已加入所选琼脂培养基的 90 mm 培养皿中央（按步骤 5 所准备）。
    注意：此处可使用真菌或细菌特异性培养基，以促进相应类群微生物的生长；也可使用无菌剪刀或移液器吸头将培养基塞分割为两块或多块，以便在多种培养基上接种，和/或保留部分目标培养基用于 DNA 提取（见步骤 14）。
  4. 将接种了目标培养基塞的培养皿置于 25 °C 黑暗条件下培养至少 72 小时。

13. 分离微生物的传代培养

注意：此步骤为可选步骤。

  1. 对于细菌：使用无菌接种环，从目标单菌落上轻轻刮取，尽量减少与其他区域的接触。将菌落划线接种至含有优选细菌培养基（如步骤5中配制的R2A）的新鲜90 mm培养皿中，采用可获得单菌落的方法（例如四区划线法）。在25–37 °C条件下培养24–72小时，定期观察菌落生长情况。
  2. 对于真菌：使用无菌接种环、无菌刀片或无菌移液器吸头，切取含有菌丝生长的最小面积（1 mm2）琼脂块。将该小块琼脂转移至含有优选真菌培养基（如步骤5中配制的MEA或PDA）的新鲜90 mm培养皿中。在25 °C避光条件下培养最多一周，每日观察以防止过度生长。
  3. 根据需要重复步骤1或步骤2，直至微生物形态一致。

14. 从培养板或直接从目标培养基中提取 DNA

  1. 若不立即进行提取，可将整个琼脂块（目标物和/或诱饵）或步骤1.5中柱内选出的片段置于-20 °C下冷冻保存于1.5 mL离心管中，或将其片段浸入1.5 mL离心管中的保存液中。
  2. 若已从目标培养基和/或诱饵培养基中进行培养，并进行了后续转接培养，则用工具戳取或切下一块约1 cm见方、带有真菌或细菌生长（若未进行分离操作，可为两者混合）的琼脂块。
    1. 对于分离的细菌菌落提取，使用无菌接种环从平板上挑取单个菌落，并直接在商业DNA提取试剂盒配套的提取缓冲液中（步骤14.4）涡旋混匀。
  3. 使用研钵和研杵在液氮中分别研磨琼脂块，并将研磨后的组织转移至提取管中。
  4. 采用适用于土壤、细菌或真菌的商业DNA提取试剂盒，并按照制造商提供的说明书提取DNA（参见材料表）。
  5. 使用荧光计或同类系统对提取所得的DNA进行定量。

15. 利用扩增子或宏基因组测序方法评估目标和/或诱饵培养基中的微生物分类多样性

  1. 采用以下步骤进行扩增子测序（16S 和/或内转录间隔区 [ITS]）或宏基因组测序：
    1. 扩增子测序：使用引物 Bakt 341F (5′-CCT ACG GGN GGC WGC AG-3′) 和 Bakt 805R (5′-GAC TAC HVG GGT ATC TAA TCC-3′) 扩增 16S rRNA 基因的 V3-V4 区域；使用引物 ITS3 KYO2 (5′-GAT GAA GAA CGY AGY RAA-3′) 和 ITS4 (5′-TCC TCC GCT TAT TGA TAT GC-3′) 扩增真菌 ITS2 区域9。
    2. 使用与所选测序仪兼容的商业化文库构建试剂盒制备扩增子文库。根据测序平台制造商推荐的上样浓度，利用短读长测序仪生成 150 或 250 碱基对的双端测序数据，并确保足够的测序深度。
    3. 宏基因组测序：使用市售的、与所选测序仪兼容的宏基因组文库构建试剂盒，对提取的 DNA 构建宏基因组文库。根据测序平台制造商推荐的上样浓度，使用短读长测序仪生成 150 或 250 碱基对的双端测序数据，并确保足够的测序覆盖度（每个宏基因组约 10–20 Gb）。

16. 分析测序数据

  1. 分析扩增子数据：利用 QIIME2 平台11 与 DADA212 在可视化结果之前分析扩增子数据13. 按照以下步骤在基因组学专长赋能平台（EDGE）中运行 QIIME214 基于网络的生物信息学平台 QIAME2 也可以使用公开可用的教程来运行，例如 "移动的画面" 在线指南（https://docs.qiime2.org/2024.2/tutorials/moving-pictures/）
    1. 导航至 https://edgebioinformatics.org/ 并登录或创建账户。
    2. 选择 运行 QIIME2 从主页中选择 上传文件 在左侧菜单栏中上传扩增子测序运行的文件。
    3. 使用“元数据映射文件”旁边的“i”图标悬停时提供的说明，创建一个元数据映射文件。
    4. 添加所有必需的信息（项目/运行名称，读段类型，参数等）并选择正确的已上传输入数据。确保选择DADA2作为质量控制方法12；其他参数可保留默认值，除非需要其他修改。
    5. 选择扩增子类型为以下之一 16S Greengenes （http://greengenes.lbl.gov）用于细菌扩增子，或Fungal ITS用于真菌扩增子。分别分析细菌（16S）和真菌（ITS）数据。
    6. 按压 提交 等待运行完成以查看结果。
  2. 生成扩增子数据可视化图形（可选）：在 R 中使用常用软件包（如 phyloseq（https://github.com/joey711/phyloseq）、VEGAN（https://github.com/vegandevs/vegan））进行额外的群落数据分析， 以及 APE (https://emmanuelparadis.github.io/)，遵循 GitHub 上提供的指南以及通过 R Studio 中的 R 包 Help 获取的说明 包装 菜单，点击下载的软件包，查看文档。
  3. 分析宏基因组数据
    1. 导航至 NMDC EDGE 位点15 （https://nmdc-edge.org/home）并使用 ORCiD 账户（https://orcid.org/）登录。
    2. 选择 上传文件 在屏幕左侧的菜单栏中，拖放或浏览并选择正确的输入FASTQ文件。
    3. 选择 宏基因组学，然后 运行多个工作流程 屏幕左侧菜单栏中的选项，并将所有工作流设置为 在. 添加项目名称和可选的描述。
    4. 选择已上传的原始测序读段（fastq）文件，并选择相应的文件格式（交错式或成对式）。
    5. 点击开始运行 提交 并选择项目以查看运行完成后的汇总表格和可视化结果 我的项目 屏幕顶部的标签

17. 基于扩增子和/或宏基因组结果创建分类学数据的附加可视化图表

  1. 根据 GitHub 上提供的说明，使用 GraPhlAn (https://github.com/biobakery/graphlan) 软件包生成圆形进化分支图。 
    注意：可从代表序列的分类注释中获取美国国家生物技术信息中心（National Center for Biotechnology Information, NCBI）分类学（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/taxonomy）标识符，并将其输入 Entrez Direct E-utilities 中的 ‘efetch’ 程序，以获取 GraPhlAn 所需的分类汇总信息16。

18. 柱子的重复使用

  1. 如果柱子仍处于组装状态，请拧开并取下柱帽、螺纹环和筛网。弃去筛网。清除任何残留的琼脂塞，用99%异丙醇和纯化水清洗柱子，并按照步骤3.1-3.4所述方法清洁和干燥各部件。
  2. 准备新的尼龙筛网片，用于高压灭菌。
  3. 按照步骤4.1提供的说明对部件进行高压灭菌。

结果

组装完成的真菌通道柱长度约为 5 cm（图 1）。柱体任何部位均不应断裂，盖帽与螺纹环应能轻松且紧密地扣合，以在柱内形成微环境。滤膜网可略微超出螺纹环（如 图 1 和 图 2 所示），也可使用灭菌剪刀修剪。琼脂塞应紧密地嵌入柱体两端。将柱体放入基质时，滤膜网需与基质接触，但柱体不应被完全埋入。

色谱柱此前已在马粪中进行过测试9. 将柱状样品同时置于研究样地的非根际土壤和根际土壤中，以及实验室内50 mL离心管中的少量土壤中图3）。在将真菌通道柱从基质中取出并拆解后，可在诱饵和目标培养基塞上观察到微生物生长（示例见 图4A）。从目标培养基和诱饵培养基中分离出细菌和真菌 通过 传代培养技术图4B），并利用扩增子测序对培养基小块上的微生物进行分类学鉴定（图 4C，D). 图 4C，D 展示多个实验中扩增子测序的综合结果，表明哪些微生物能够从添加至马粪的柱状样品迁移至目标培养基凝胶塞9按照步骤17所述生成该细菌和真菌数据的可视化结果。结果也可显示为分类单元的相对丰度。

当将柱子置于极低湿度环境中时，曾获得不理想的结果，培养基塞在数天内完全干燥，导致定植的微生物无法恢复（图 5A）。我们也观察到微生物无法从目标培养基塞中生长的情况（图 5B），以及从目标培养基塞中获得的测序数据不足以进行有意义分析的情况。此外，真菌过度生长超出柱子范围的情况也导致实验需要重做（图 5C）。

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图3：在实验室和野外环境中将反应柱置于环境样品中的示例。（A）在实验室条件下，将反应柱置于装有湿润土壤的50 mL离心管中，图中同时展示标尺以指示比例。（B）在野外将反应柱插入土壤中。（C）在野外将反应柱插入植物的根系网络中。请点击此处查看该图的放大版本。

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图4：柱实验成功时的代表性结果。 (A) 从柱中提取的已定植培养基小块示例。 (B) 从目标培养基上继代培养的真菌分离株示例。底物为土壤。自左至右的ITS序列NCBI BLAST比对结果： Rhizopus azygosporous，Aspergillus novofumigatus，Curvularia subpapendorfii，以及 Phaeomycocentrospora cantuariensis (C，D) 显示系统发育多样性的环形分支图 (C）真菌ITS和（D) 从多次利用马粪进行的真菌通道实验中，从目标培养基回收的细菌16S序列。各分支按门分类并着色标注，末端节点代表不同的属。 请点击此处以查看此图的放大版本。

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图5柱实验结果不理想。 (A) 干燥培养基块的一个示例 由低湿度环境条件导致。B) 柱层析介质小柱无微生物生长示例。C) 真菌从柱体顶部（目标培养基）过度生长的示例。 请点击此处以查看此图的放大版本。

讨论

在制备色谱柱组件时，可根据可用性及所需材料特性灵活选择3D打印机和打印材料17,18。本课题组在选择材料时，综合考虑了材料的生物相容性、表面纹理、可高压灭菌性、精细结构打印能力以及相对透明度等因素。其他特性，如孔隙率、疏水性、打印参数等，也应纳入考量范围。在最终选定材料前，我们测试了多种树脂（参见材料表），许多生物相容性材料均可适用于此类色谱柱的打印。所选材料将决定后续清洁、后固化及灭菌方法的适用性。并非所有材料均可高压灭菌，可能需要根据材料制造商的说明采用紫外线照射、漂白剂或其他灭菌技术。某些灭菌或清洁方法可能对所选材料造成损伤或不兼容，因此应特别关注材料制造商提供的相关信息。对于3D打印机的选择，需考虑打印时间、材料兼容性、构建平台尺寸、打印技术及成本等因素19。色谱柱的3D打印部件较为脆弱，若操作过于用力可能发生断裂。环状结构与端盖的螺纹可能无法完全对齐，因此建议在组装前预先多打印并灭菌若干备用组件，或先进行试打印以评估所选参数和材料对螺纹成型的影响。端盖与环状结构内部的螺纹设计参数可能需根据所选3D打印材料进行调整。在打印前，可通过CAD设计软件修改尺寸、晶格复杂度及其他物理特征。按原设计，色谱柱本身高4 cm，柱中心晶格结构的单胞尺寸为2 mm，杆径为0.5 mm，整个晶格高度为22 mm9。若研究人员需要更大或更复杂的晶格结构，可对上述参数进行调整。总体而言，此类装置的3D打印制造既提供了设计灵活性，又能确保单一设计在不同机构和研究团队之间以标准化方式使用，甚至可用作课堂教学工具9。

根据环境或实验设置的不同，该方案中的多个步骤可能需要进行故障排除。在低湿度条件下，真菌高速公路柱的效果较差，因为培养基塞会迅速脱水，无法支持真菌生长，从而限制了在这些环境中实验的持续时间（图5A）。在低湿度环境中提高柱体有效性的技术包括通过向基质添加水分来人工增加湿度，和/或使用带有水源（例如一小容器纯水）的次级容器将柱体和基质密封起来。设计沙漏形状和晶格结构的目的是防止在高湿度环境中因冷凝水形成而导致细菌单独移动（即在未建立真菌高速公路的情况下移动）。生长迅速的真菌可能会过度生长，覆盖目标和诱饵培养基的表面，并延伸至柱体的顶部或底部（图5C）。缩短诱饵真菌的培养时间或减少实验持续时间，可减轻或避免这种过度生长。此外，这些装置的一个局限性在于，目标基质中快速生长的真菌可能会限制慢速生长真菌对诱饵和目标培养基的定殖，从而可能造成所观察到的高速公路相互作用存在偏倚。某些真菌，尤其是生长较慢的真菌，可能无法以允许其穿过琼脂塞并进入晶格结构的方式定殖于诱饵培养基上。如果环境中湿度充足，可使用较薄的琼脂塞，以促进在诱饵琼脂塞定殖后向晶格结构内的生长。研究人员可根据希望选择促进真菌或细菌生长的目的来选择培养基，但这同时也可能限制仅能在该类型培养基上生长的微生物的继代培养20。如果在目标培养基上未观察到任何生长，可能需要接种已知能够形成真菌高速公路的真菌至诱饵培养基或基质中。

可以将宏基因组测序或扩增子测序作为这些实验的一部分进行，这两种策略各有其局限性和优势21。宏基因组测序适用于获取微生物的额外基因组信息。然而，直接从目标培养基中可回收的核酸量可能非常低，这可能需要在测序前采用扩增子测序或其他扩增方法。扩增子测序文库必须分别制备（16S 和 ITS），该方法缺乏分类学分辨率，并且无法评估基因组特征或功能潜力，而这些可通过宏基因组测序实现。在微生物无法进行继代培养的情况下，可能更倾向于采用直接从琼脂块中进行测序的方法。建议将琼脂块分割成多个部分，以便同时进行培养和测序分析。

这些装置的优点是既可在实验室中使用，也可在野外使用。在野外使用时需特别注意，确保柱体保持直立，并防止动物或环境扰动影响其位置。目前尚未在水平位置、完全被基质覆盖的位置，以及暴露于大量降雨或降雪的环境中对柱体进行测试。如上所述，晶格结构的设计旨在尽量降低在高湿度环境中细菌移动至目标培养基的可能性。然而，如果柱体暴露于较大量的水中，且水完全饱和了柱体，则可能促进细菌在整个柱体内的移动，而不再依赖于是否存在真菌通道。对于基于实验室的实验，可将柱体置于50 mL锥形管中、小型基质微宇宙中、盆栽植物周围的土壤中、盒子中，或其他受控实验系统中。这些柱体已成功应用于土壤、根际和粪便中，其应用还可扩展至其他基质，包括枯枝落叶、污泥、沙子、雪、堆肥等。

真菌通道柱可用于多种比较，以在不同类型的样本中理解这种细菌-真菌相互作用（BFI）表型。通过比较诱饵培养基与目标培养基中的群落组成，可以判断哪些细菌能够利用真菌通道，以及哪些真菌可能作为潜在的通道9。如果采用宏基因组测序，还可以分析区分来自诱饵培养基与目标培养基中生物体的基因组特征。此外，还可以比较置于不同基质（例如土壤与粪便）中的柱子所获得的目标培养基，或比较在相同基质但不同条件（例如温度或湿度）下放置的柱子所获得的目标培养基。总体而言，真菌通道柱拓展了以往方法在探究此类BFI形式方面的能力，使得能够深入研究塑造复杂环境微生物组空间动态的这些相互作用。

披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

本研究得到了美国能源部（DOE）生物与环境研究（BER）生物系统科学部（BSSD）科学重点区域资助项目的支持，资助编号为LANLF59T。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
50 mL 离心管Greiner BIO-ONE5622-7261用于在实验室中进行柱实验的 50 mL 离心管
90 mm 培养皿赛默飞世尔科技 Nunc08-757-099用于制备琼脂及微生物培养的培养皿
Asiga Freeform Pico Plus 39 数字光处理（DLP）3D 打印机Asiga 德国Freeform Pico Plus 39使用3D打印机批量制备色谱柱；也可采用其他3D打印机
高压灭菌Fisher ScientificLS40F20台式高压灭菌器，用于灭菌色谱柱组件
烧杯Fisher ScientificFB100600600 mL烧杯，用于本方案中的各种用途
Dental LT Clear Resin V2FormlabsRS-F2-DLCL-02已测试的3D打印替代树脂
牙科手术导板树脂FormlabsRS-F2-SGAM-01用于生成论文中讨论的柱体；其他光敏树脂可替代该材料使用
DNA低吸附1.5 mL离心管Eppendorf13-698-791用于各种制备的试管，包括核酸提取
DNA/RNA保护剂Zymo ResearchR1100-50核酸提取前使用的防腐剂
EDGE 生物信息学开源；由洛斯阿拉莫斯国家实验室（LANL）开发n/a扩增子数据分析生物信息学平台
FastDNA土壤试剂盒MP Biomedicals LLC116560200-CF土壤DNA提取试剂盒选项
镊子Fisher Scientific10-300可高温灭菌的镊子
Formlabs BioMed Clear 树脂FormlabsRS-F2-BMCL-01已测试的3D打印替代树脂
Formlabs Form 3B+ 光固化成型（SLA）3D 打印机Formlabs3B+型替代型3D打印机
Formlabs IBT 树脂FormlabsRS-F2-IBCL-01已测试的3D打印替代树脂
接种环Fisher Scientific22-363-598用于分离/转移微生物
麦芽提取物琼脂（MEA）标准89405-654一种用于色谱柱的介质类型
MiSeq 测序仪 + MiSeq 测序试剂盒IlluminaSY-410-1003可使用其他测序仪
研钵 &研钵与研杵Fisher ScientificFB961K；FB961A可使用任何常见的研钵 &可重复使用间进行灭菌的研钵和研杵
NEBNext Ultra II DNA文库构建试剂盒（适用于Illumina）New England BiolabsE7805S用于宏基因组测序的文库制备试剂盒
Nextera XT DNA文库制备试剂盒（24个样本）IlluminaFC-131-1024扩增子测序文库制备试剂盒
NMDC EDGE开源：由国家微生物组数据协作组织（NMDC）开发n/a用于处理宏基因组数据的生物信息学平台
尼龙网Sefar03-25/19用于柱体构建的筛网
移液器吸头Rainin30807966可使用多种不同的灭菌移液器吸头进行实验步骤
马铃薯葡萄糖琼脂Cole ParmerEW-14200-28一种用于色谱柱的介质类型
QIIME2开源n/a扩增子数据分析软件
Qubit dsDNA HS 检测试剂盒赛默飞世尔科技Q32851用于提取后定量DNA
Qubit 荧光仪赛默飞世尔科技Q33238用于提取后定量DNA
Quick-DNA 真菌/细菌微量制备试剂盒Zymo ResearchD6005一种可同时用于细菌和真菌的DNA提取试剂盒选项
R2A 琼脂BD Difco218263一种用于柱状培养基的培养液类型（细菌培养基）
50 mL 离心管架Fisher Scientific03-448-11用于直立放置50 mL离心管的支架
剪刀Fisher Scientific12-000-155可高温灭菌的精细精密剪刀
羧甲基纤维素钠培养基Aldrich419273-100G一种用于色谱柱的介质类型
SolidWorks CAD 软件SolidWorksn/a用于设计柱体的软件
刮铲Fisher ScientificS41701在添加色谱柱之前，在基质中制造一个凹陷
UltraPure 无DNase/RNase蒸馏水Invitrogen：赛默飞世尔科技10977015超声波清洗机水浴用水
超声波破碎仪Fisher ScientificFB-11201用于清洗柱子的超声波清洗仪

参考文献

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