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小鼠视网膜神经节细胞的全层免疫染色与自动计数

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DOI：

10.3791/66991

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2024年10月4日

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1Sichuan Provincial Key Laboratory for Human Disease Gene Study, Sichuan Provincial People's Hospital, University of Electronic Science and Technology of China, 2School of Medicine, University of Electronic Science and Technology of China, 3Research Unit for Blindness Prevention of Chinese Academy of Medical Sciences (2019RU026), Sichuan Academy of Medical Sciences & Sichuan Provincial People's Hospital

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

本方案描述了分离小鼠全 mount 视网膜并进行免疫染色以标记所有视网膜神经节细胞（RGCs）的操作步骤。随后通过成像并利用基于人工智能的软件自动计数 RGCs，为定量分析整个小鼠视网膜中的 RGCs 提供了一种简便、快速且准确的方法。

摘要

青光眼是全球致盲的主要原因之一，其发病机制复杂，导致视力恢复困难。小鼠由于具有相对均一的遗传背景和结构上与人类相似的视网膜神经节细胞（RGCs），是研究青光眼发病机制和治疗方法的重要动物模型。在小鼠青光眼模型中，准确评估RGC损伤及治疗效果需要测定整个视网膜上的RGC数量。本实验方案介绍了一种综合性方法，包括完整视网膜的分离、使用特异性抗体标记RGCs，以及利用基于人工智能的程序对RGCs进行快速、准确的自动计数。该简化流程可高效且精确地量化小鼠视网膜中的RGC数量，有助于评估RGC的退行性变化及潜在的治疗干预效果。通过使研究人员能够评估RGC损伤的程度，本方案有助于深入理解青光眼的发病机制，并推动开发有效的治疗策略以控制和预防视力丧失。

引言

青光眼的特征是 视网膜神经节细胞进行性死亡，这些 对视力构成重大挑战 修复1,2该疾病因其高发病率及对视力的重大影响，成为眼科研究的重点。3小鼠模型在青光眼研究中不可或缺
研究由于 其同质的遗传背景，高 生殖能力，以及相似性 其神经节细胞特性与人类的相似性4该方法的主要目标是准确量化小鼠模型中的视网膜神经节细胞（RGCs），这对于理解青光眼的发病机制及开发相关治疗方法至关重要。

开发该技术的原理源于对一种可靠且高效方法的需求，以评估小鼠模型中视网膜神经节细胞（RGC）的退变。传统方法（如对视网膜切片中的RGC进行标记）由于RGC在视网膜中分布不均，结果往往不可靠5。对整个视网膜的RGC进行定量能更真实地反映其数量变化，对于评估疾病进展和治疗干预至关重要。

与替代技术相比，该方法具有多项优势。例如，在正常成年小鼠视网膜中手动计数视网膜神经节细胞（RGCs），由于其RGC数量介于40,000至60,000之间，该过程可能耗时且易产生误差6,7,8我们开发的用于自动RGC计数的软件可在3分钟内实现准确计数，有望为研究人员节省大量时间。此外，所采用的基于人工智能的软件 自动计数可最大限度减少偏差 提高可重复性。

此外，该技术为评估不同小鼠模型和实验条件下视网膜神经节细胞（RGC）的退变提供了标准化的方法，为青光眼研究领域提供了宝贵的数据。该方法与强调通过视网膜全层铺片分析来理解疾病中视网膜变化的其他研究相一致9。

为了帮助读者判断该方法是否适用于其研究需求，需要特别指出的是，此技术对于研究青光眼或其他视网膜疾病小鼠模型中视网膜神经节细胞（RGC）退变的研究人员尤为有利。该方法可适应多种实验设置，在RGC计数方面具有高度的准确性和效率，因此非常适合小规模和大规模研究。此外，该方案设计简洁，且配有用户友好的软件，使得具备不同视网膜分析经验水平的研究人员均可便捷地使用。

方案

本实验遵循视力与眼科学研究协会关于在研究中使用动物的指南，并已获得四川省人民医院机构动物护理和使用委员会（IACUC）的批准。本研究使用2月龄雄性C57Bl/6J小鼠。图1展示了此处描述的整体实验流程。所用试剂和设备的详细信息见于材料表。

1. 整体视网膜的分离

  1. 动物安乐处死
    1. 采用颈椎脱位法处死小鼠（遵循机构批准的方案）图 2A）。在进行颈椎脱位之前，
      通过吸入异氟烷（3%-5% 氧气混合）或腹腔注射麻醉小鼠 氯胺酮/赛拉嗪混合物
  2. 去核及眼球组织处理
    1. 用蓝色记号笔在眼球背面的角膜边缘做标记，以记录后续解剖过程中的方位。
    2. 用剪刀去除附着在眼球上的残留肌肉组织。将摘除的眼球转移至含有1x PBS的2 mL圆底微量离心管中，进行短暂冲洗（图2C).
  3. 固定
    1. 将眼球转移至另一含有 freshly made 4% 多聚甲醛（PFA）的 2 mL 圆底微量离心管中，于 4 °C 固定 10 min图2D).
    2. 在解剖显微镜下，使用精细剪刀在角膜上做一个小切口（约1-2 mm）。
    3. 将眼球放回固定液中，在 4 °C 下继续固定 3 小时，以保存组织形态（图2D).
  4. 角膜和晶状体的摘除1,9
    1. 使用精细的手术剪在角膜缘（角膜与巩膜的交界处）周围做一个约1毫米的小切口。
    2. 仔细沿角膜周缘剪切，完全切除角膜以暴露其下方结构。
    3. 使用精细镊子轻轻夹住晶状体，小心地从周围组织中抬起，以防止损伤视网膜。操作需轻柔，以保持视网膜的结构完整性。
    4. 将眼杯转移至微量离心管中，以进行后续处理。
      注意：使用以下方法可更高效地切除角膜并提取晶状体 "交叉狭缝" 技术10在角膜上做两个相互垂直的切口，用镊子取出晶状体。
  5. 巩膜切口
    1. 用精细的眼科剪刀在巩膜上切开一个精确的切口，以利于后续的解剖步骤（图2J).
  6. 视网膜分离
    1. 用有齿镊插入巩膜与视网膜之间的切口处，轻柔夹住巩膜边缘，避免用力过大，以防撕裂组织。
    2. 通过镊子沿巩膜与视网膜交界处进行缓慢、稳定的移动，逐渐扩大切口。使用镊子的齿状部分小心分离巩膜与视网膜，确保不损伤视网膜（图 2J).
  7. 视网膜切割
    1. 使用锋利的剪刀将视网膜切成四个大小大致相等的瓣状结构。切口应朝向视神经方向，深度约为视神经距离的一半，且各切口之间相互呈90°排列。
  8. 视网膜清洗
    1. 用软毛刷轻轻展开已解剖的视网膜，并仔细清除其表面的碎片（图 2K).
  9. 最终固定
    1. 将分离的视网膜用一次性巴斯德吸管转移至含有新鲜4% PFA的微量离心管中。冰上固定额外5小时至过夜，以保存组织。

2. 免疫染色

  1. 洗涤
    1. 用1× PBS轻轻振荡清洗分离的全层视网膜5分钟，弃去PBS溶液。重复此步骤两次，以去除残留的固定剂和碎片。
  2. 封闭
    1. 将清洗后的视网膜浸入封闭缓冲液（含4%正常驴血清（NDS）和0.2% Triton X-100的1× PBS）中，孵育30分钟，以防止非特异性抗体结合并增强通透性（图3A）。
  3. 一抗孵育
    1. 用BRN3A一抗（以封闭缓冲液按1:200稀释）替换封闭液，于4 °C孵育过夜，以实现抗原与抗体的特异性结合（图3B）。
  4. 洗涤
    1. 用1× PBS对视网膜清洗三次，每次5分钟，以去除未结合的一抗，降低背景染色（图3C）。
  5. 二抗孵育
    1. 在室温下用Alexa594或Alexa488标记的抗兔二抗（按1:300稀释）孵育视网膜2小时，以可视化目标抗原（图3D）。
  6. 洗涤
    1. 用1× PBS连续清洗三次，每次5分钟，以去除过量的二抗，减少非特异性结合。
  7. 封片
    1. 将免疫染色后的视网膜轻轻转移至玻璃载玻片上，小心展平，以尽量减少折叠或变形。
    2. 在视网膜中央滴加少量抗荧光淬灭封片剂，确保其在组织上均匀分布。
    3. 小心将盖玻片覆盖在样本上，避免产生气泡（图3E、F）。

3. 图像处理

注意：将图像导入RGC自动计数软件并开始计数。整个视网膜中BRN3A阳性细胞的数量可在数分钟内获得。请从GitHub下载AutoCount软件（https://github.com/MOEMIL/Intelligent-quantifying-RGCs）。请按照以下详细的软件安装步骤操作：

  1. 从 GitHub 链接下载代码。将获得一个名为 "Intelligent-quantifying-RGCs.zip" 的文件。解压该文件。
  2. 从 云盘（参见 材料表）下载必要的文件并解压。下载的文件名为 "yolov5_cpu"。将此压缩包解压至当前文件夹，以避免出现意外问题。
  3. 找到步骤1中的 Config  文件，并修改其内容，使其指向 "yolov5_cpu" 的路径。
    注意：例如，如果下载的 "yolov5_cpu" 放置在 "D:\1me\yolov5_cpu_" 目录下，则需将步骤1中的 "config.ini" 文件修改为 "D:/1me/yolov5_cpu"（使用 / 而非 \）。（图4A）
  4. 通过点击 userinterface.exe 打开图形化界面。首次加载可能较慢（建议以管理员身份运行）。（图4B）
  5. 打开软件后，检查驱动器 C 的根目录中是否存在 "pmse_plus.pt" 模型文件。若不存在，请将其复制到该目录中。
    注意："pmse_plus.pt" 模型文件位于解压后的 Intelligent-quantifying RGCs 文件夹中的 "yolov5" 文件夹内的 weights 子文件夹中。（图4C）
  6. 准备待检测的图像。
    注意：软件每次仅允许读取一张或五张图片。读取更多图片将导致错误。

4. 自动细胞计数

  1. 打开计数软件（图5A）。
  2. 点击 打开图像 以导入图像（图5B）。
  3. 点击 运行，使软件自动计数细胞（图5C）。
    注意：软件将用红色方框标记已计数的细胞，并在右上角显示细胞数量（图5D）。

结果

本方案详细介绍了小鼠视网膜全层免疫染色的方法，确保组织制备精细、抗体孵育准确以及细胞自动计数可靠。该方法可实现视网膜神经节细胞（RGCs）的有效标记与定量，从而在多种实验条件下对细胞群体进行准确评估。该方法已用于野生型和青光眼模型小鼠中RGCs的计数，并获得了稳定的结果。代表性结果表明，正常成年小鼠在2月龄时RGCs数量约为45,000个（图6）。

为了评估人工智能软件是否能够准确量化正常和疾病模型中BRN3a标记的视网膜神经节细胞（RGC），我们建立了N-甲基-D-天冬氨酸（NMDA）诱导的小鼠青光眼模型7。对该模型的视网膜平铺标本进行抗BRN3A免疫染色，并使用自动计数软件对RGC进行量化。结果显示背景染色相对较高（图7）。尽管如此，该软件仍能准确识别几乎所有的RGC。在此视网膜中，共识别出15,231个RGC，而正常小鼠视网膜中约有45,000–50,000个RGC，表明存在严重的神经退行性变。因此，该人工智能软件也可有效用于染色质量欠佳的视网膜中RGC的计数。

视网膜处理示意图，包括免疫标记及通过显微镜自动计数RGC。
图1：RGC制备流程示意图。（A）取出眼球并置于1×PBS中。（B）在冰上用4%多聚甲醛（PFA）固定眼球3小时。（C）去除角膜。（D）取出晶状体。（E）用剪刀将眼杯分为4个瓣。（F）剥离巩膜，并用软毛刷轻轻清除视网膜表面的碎片。（G）使用抗BRN3A抗体对视网膜进行免疫标记。（H）利用共聚焦显微镜成像荧光信号。（I）自动计数RGC。（请点击此处查看该图的放大版本。）

小鼠视网膜剥离过程；手术操作；解剖学研究；眼组织提取。
图 2：小鼠全层视网膜的分离。（A）通过颈椎脱位法处死小鼠。（B）将小鼠置于平坦的表面上。（C）使用剪刀小心摘除眼球。（D）将眼球轻轻放入 1× PBS 中。（E）用镊子夹住角膜边缘固定眼球。（F）用针头在角膜边缘做一小切口。（G）去除角膜后，移除碗状结构。（H）用镊子小心取出晶状体。（I）沿角膜边缘向视神经方向在巩膜上做一小切口，注意避免损伤视网膜。（J）用镊子沿切口撕开巩膜。（K）用画笔将视网膜展平并清理干净。（L）用预冷的甲醇迅速固定展平的视网膜。请点击此处查看该图的放大版本。

显微镜用细胞样品制备；包括载玻片制备、移液、索引图像。
图 3：小鼠视网膜全层组织的免疫染色。 （A）用 1× PBS 洗涤后，视网膜用封闭缓冲液进行封闭。（B）视网膜在 4 °C 下与一抗孵育过夜。（C）用 1× PBS 洗涤视网膜三次。（D）视网膜在室温下与二抗孵育 2 小时。（E）将视网膜神经节细胞面向上固定在载玻片上。（F）使用激光共聚焦显微镜采集图像。 请点击此处查看该图的放大版本。

YOLOv5 设置流程、文件目录浏览、模型文件选择、系统路径配置。
图 4：自动计数软件的安装。（A）步骤 1：更新文件路径至“yolov5_cpu”目录。（B）启动图形界面。（C）验证模型文件是否存在于 C 盘根目录中。请点击此处查看该图的放大版本。

分割过程，叶片扫描；图示 A-D；软件分析阶段；绿色到红色的颜色变化。
图 5：自动RGC计数软件的操作。 （A）打开计数软件。 （B）点击OPEN IMAGE按钮以导入图像。 （C）点击RUN按钮以启动自动计数。 （D）被计数的细胞以红色方框标记，细胞数量显示在右上角。 请点击此处查看此图的放大版本。

视网膜全装片显微成像，BRN3A表达，细胞计数分析，荧光成像。
图6：小鼠视网膜神经节细胞的自动计数。 上图（左）显示使用抗BRN3A抗体对平铺视网膜进行免疫染色的代表性结果；上图（右）显示利用先前开发的软件对视网膜神经节细胞进行自动计数的结果。比例尺：100 µm。上图插图区域放大后分别显示于下图中。请点击此处查看该图的放大版本。

显示植物细胞中蛋白质定位的荧光显微镜图像；细胞内GFP表达。
图7：在NMDA诱导的青光眼小鼠模型中进行RGC计数。 左图：视网膜全层铺片的整体图像，显示由人工智能软件识别出的RGC。右图：视网膜局部区域的放大视图。 请点击此处查看该图的高清版本。

讨论

本方案提供了一种用于确定小鼠视网膜中所有视网膜神经节细胞（RGCs）的方法，可用于监测青光眼研究中小鼠模型RGC退行的进展。小鼠视网膜是一种精细的神经组织5，从小鼠眼球中分离完整的视网膜铺片需要反复练习。在实验过程中发现，固定时间显著影响视网膜的形态。对于约2周龄的小鼠，由于巩膜较薄且脆弱，固定20分钟即可获得良好的结果。然而，对于2个月以上的成年小鼠，20分钟的固定时间则不足。固定3小时是获得完整视网膜铺片的最佳条件。

在视网膜分离过程中，最具挑战性的步骤是将巩膜与视网膜分离10。使用两把带齿尖的镊子可以相对容易地将巩膜从视网膜上剥离。通过两把镊子夹住巩膜并将其撕开，可将巩膜撕成小片，从而与视网膜分离。

视网膜神经节细胞（RGCs）的高质量图像对于准确计数至关重要。由于视网膜具有三维结构，在平铺的视网膜样本中，并非所有RGCs都位于同一焦平面上8。当将视网膜安装在玻璃载片上时，应尽可能将其展平，以利于后续成像。在成像过程中，需在多个焦平面上采集图像，以确保覆盖整个视网膜不同区域的所有RGCs。

综上所述，本方案提供了一种标准化流程，用于自动计数平铺小鼠视网膜中的所有视网膜神经节细胞（RGC）。该方法使科研人员能够准确评估小鼠模型中RGC的退变情况，从而提高RGC定量分析的效率与准确性。这种精确性对于理解及治疗青光眼及相关疾病至关重要。

披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

本研究项目得到了中国国家自然科学基金（82371059（H.Z.））、中国四川省科学技术厅（2023JDZH0002（H.Z.））、成都市科学技术局（2022-YF05-01984-SN（H.Z.））以及四川省人民医院（30320230095（J.Y.）、30420220062（J.Y.））的资助。 

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
1× PBSServicebioG4202
Alexa594 标记的驴抗兔 IgG （H+L）ThermoFisherA-11012
抗 BRN3A 抗体 [EPR23257-285]Abcamab245230
AutoCount 软件https://github.com/MOEMIL/Intelligent-quantifying-RGCs
云盘Google 云端硬盘链接https://drive.google.com/file/d/1yOEsBvil6KEdZFa5ENQxB6 
云盘百度网盘链接提取码：g44khttps://pan.baidu.com/s/1lccg1OVbeudsp2VtnqxWZg 
记号笔Sharpie
正常驴血清Biosharp, Labgic25030081
多聚甲醛MacklinP804536
ProClean 300BeyotimeST853
蔗糖BBI, SangonA610498
Triton X-100BioFroxx, neoFroxx1139ML100

参考文献

  1. Quigley, H. A., Broman, A. T. The number of people with glaucoma worldwide in 2010 and 2020. Br J Ophthalmol. 90 (3), 262-267 (2006).
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  3. Atkinson, M. J., et al. A new measure of patient satisfaction with ocular hypotensive medications: the Treatment Satisfaction Survey for Intraocular Pressure (TSS-IOP). Health Qual Life Outcomes. 1, 67(2003).
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  7. Zhang, J., et al. Automatic counting of retinal ganglion cells in the entire mouse retina based on improved YOLOv5. Zool Res. 43 (5), 738-749 (2022).
  8. Al-Khindi, T., et al. The transcription factor Tbx5 regulates direction-selective retinal ganglion cell development and image stabilization. Curr Biol. 32 (19), 4286-4298 (2022).
  9. Claes, M., Moons, L. Retinal ganglion cells: Global number, density and vulnerability to glaucomatous injury in common laboratory mice. Cells. 11 (17), 2689(2022).
  10. Zhang, N., Wang, Z., Lin, P., Xing, Y., Yang, N. Methanol-based whole-mount preparation for the investigation of retinal ganglion cells. J Vis Exp. (194), e65222(2023).

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