方法文章

利用肺动脉束带术建立大鼠右心重构与心律失常模型

2K 次观看

⸱

DOI：

10.3791/67001

⸱

2024年8月30日

 ,  ,  ,  ,  , 
1Montreal Heart Institute, 2Department of Pharmacology and Physiology, Université de Montréal, 3Department of Medicine, Faculty of Medicine, Université de Montréal

本文内容

摘要

右心衰竭（RHF）的特征是右侧心脏扩张和肥厚，导致心室和心房功能障碍。伴有RHF的 cardiopulmonary 疾病常伴随心脏心律失常风险增加。本文介绍了一种标准化的肺动脉结扎诱导的RHF模型，该模型伴随心室和心房心律失常的发生增强。

摘要

慢性阻塞性肺疾病或肺动脉高压（PAH）等临床状况可导致右心室长期压力超负荷，并进而引发进行性右心衰竭（RHF）。右心衰竭的特征表现为右侧心脏肥厚和扩张，并伴有影响右心室（RV）和右心房（RA）的心肌功能异常。我们近期的研究表明，严重的右心衰竭常伴随心房炎症、心房纤维化以及心房颤动（AF）风险的增加，其中心房颤动是心脏心律失常（CA）中最常见的类型。最近的研究显示，右心室和右心房的炎症在包括心房颤动在内的各类心脏心律失常的发生机制中起着重要作用。然而，炎症在右心衰竭相关心律失常及心房颤动发展过程中的具体影响仍缺乏充分描述。

为了更好地理解右心心肌炎症与CA之间的关联，需要建立RHF的实验模型。由野百合碱（MCT）诱导肺动脉高压（PH）的大鼠模型已被广泛用于诱发RHF。然而，MCT会引发严重的肺毒性及肺部炎症。因此，MCT诱导的RHF无法帮助区分后续出现的心肌炎症究竟是源于RHF本身，还是来源于受损肺组织所释放的循环炎症信号。

在本文中，采用了一种涉及肺动脉干结扎（PAB）的机械方法来诱发右侧心脏心律失常的发生。PAB 操作包括对肺动脉干进行永久性结扎，持续 3 周。该方法可导致右侧心脏压力负荷增加。在 PAB 术后第 21 天（D21），右心室（RV）和右心房（RA）出现肥厚、扩张和炎症。PAB 诱导的右心衰竭（RHF）还伴随有室性和房性心律失常的易感性，包括心房颤动（AF）。

引言

右心衰竭（RHF）的特征是右心室（RV）和右心房（RA）肥厚与扩张，继而导致右心功能障碍，其病因是由于肺动脉（PA）狭窄引起的慢性右心室压力超负荷1。因此，导致肺动脉狭窄的各种疾病可增加RHF的发生风险1,2,3,4。临床数据显示，在肺动脉高压（PAH）患者中，RHF是导致住院的主要原因（占56%）2。临床研究还表明，无论PAH的病因如何（包括血栓栓塞性肺动脉高压（PH）和特发性PAH），患者常伴有RHF，并且发生心律失常的风险增加20%，包括室上性心动过速和心房颤动（AF）2,5,6。

为了更好地理解肺动脉高压（PAH）与右心衰竭（RHF）之间的关联，研究人员已采用包括单次注射野百合碱（monocrotaline, MCT）在内的动物模型，以诱发严重的肺部炎症和右心衰竭7,8。我们近期观察到，MCT诱导的右心衰竭与右心房（RA）炎症及心房颤动（AF）相关9。然而，由于MCT诱导的肺部炎症和循环细胞因子具有重要作用，难以明确MCT引起的右心房炎症是否仅为右心衰竭的继发结果9。因此，亟需建立一种新的由右心衰竭诱导的心律失常模型，以研究右心房的炎症状态。

肺动脉干缩窄（PAB）实验模型已在多种动物物种中用于模拟阻塞性肺动脉疾病，并研究影响心脏右侧的相关病理性心肌重构10。已有报道表明，PAB是一种有效诱导右心室（RV）功能障碍和衰竭的方法，广泛应用于模拟右心室超负荷的研究中10,11,12,13,14,15,16。从技术上讲，PAB是在肺动脉干上放置一条永久性缝线，从而机械性地减小肺动脉干的直径10。PAB导致右心室承受的压力负荷增加10。首先，作为对右心室后负荷突然增加的代偿性适应，右心室腔发生扩张，进而发展为慢性右心室肥厚10,13。右心室扩张和肥厚会影响三尖瓣，使其出现反流13。更确切地说，显著的右心室扩张结合高后负荷会导致位于右心室与右心房（RA）之间的三尖瓣环被拉伸13,17。由于瓣膜关闭不全，部分在收缩期从右心室射出的血液将反流至右心房腔内17。通过超声心动图可观察到三尖瓣反流，该现象被称为三尖瓣反流17。随后，右心房承受异常升高的血压，导致右心房扩张和肥厚进一步加重13。慢性右心室和右心房重构伴随局部心肌炎症反应，最终导致右心室和右心房纤维化及功能丧失9,13。心肌纤维化的特征是低电压区域的形成，这些区域收缩能力减弱，更容易引发传导阻滞和折返环路，从而参与包括心室颤动和心房颤动（AF）在内的各种心律失常的发生18,19。

本文的创新之处在于采用标准化的肺动脉缩窄（PAB）方法诱导右心重构，以在PAB术后3周内诱发并研究心律失常的易感性。该手术方法的主要优势包括：i）可直接控制肺动脉主干直径的缩小程度；ii）避免肺部炎症，从而专注于研究右心衰竭（RHF）引起的心肌炎症在心房颤动（AF）等心律失常中的作用。

本文所述方法包括一种精确的显微外科手术以建立肺动脉缩窄（PAB），评估右心室后负荷的增加，通过超声心动图观察PAB诱导的心肌结构与功能重塑，并进行电生理研究以评估心脏心律失常（包括心房颤动）的易感性。

方案

以下所述所有操作均经蒙特利尔心脏研究所伦理委员会批准（方案编号：2021-2938-2021-47-01 和 2024-3412-2024-48-01），并严格遵循加拿大动物护理委员会（CCAC）的指南。实验使用6至8周龄、体重225–275 g的雄性Wistar大鼠。所有动物均饲养于蒙特利尔心脏研究所的动物饲养设施中，可自由获取饮水和食物。

1. 术前准备

  1. 使用高压饱和蒸汽灭菌器，在121 °C至134 °C温度下、15-30 psi压力环境中，对所有手术器械和材料进行30-40分钟的灭菌处理，随后进行25分钟的干燥循环。
  2. 准备手术所需的所有药物剂量。采用多模式镇痛方案，在手术前30分钟皮下注射布托啡诺（0.05 mg/kg）和酮洛芬（5 mg/kg），并在术后6小时（布托啡诺）以及术后24小时（布托啡诺和酮洛芬）重复给药。此外，在切口部位实施局部镇痛（利多卡因5 mg/mL）。
  3. 术前进行基线经胸超声心动图检查（详见步骤6.1-6.13中的经胸超声心动图详细操作流程），以测定肺动脉（PA）直径，并选择合适的针头规格作为引导，以在肺动脉束窄术（PAB）期间实现预期的肺动脉直径缩小60%。
    注：本研究中使用体重为225-275 g的雄性Wistar大鼠，采用19 G针头可适当实现肺动脉直径60%的缩小。
  4. 准备一根19 G针头（或根据步骤1.3确定的合适规格），该针头将作为引导（见下文步骤4.18和4.19），用于获得理想的肺动脉主干缩窄程度，从而诱发大鼠心脏显著的结构重塑。使用镊子将19 G针头弯曲至90-110°（图1A）。
    注：将19 G针头弯曲有助于i）在肺动脉主干附近准确定位，以及ii）在操作过程中顺利实施结扎。该19 G针头作为引导物，缝线将围绕其缠绕，使肺动脉直径缩小至1.0 mm（对于体重225-275 g的大鼠，相当于直径减少60%），从而在3周内引起明显的右心室压力超负荷，导致严重的右心室结构重塑。

2. 麻醉诱导与动物准备

注意：实验使用6-8周龄、体重为225-275 g的雄性Wistar大鼠。在以下操作的所有步骤中，均应使用加热垫以维持动物体温在约37 °C，并通过直肠探针监测体温。

  1. 使用持续吸入的3%异氟烷和100%氧气（2-3 L/min）对动物进行麻醉。
  2. 涂抹眼用润滑凝胶，以保护角膜免受干燥损伤。
  3. 通过脚趾夹捏反射确认麻醉深度。

3. 插管

注意：插管操作按先前所述方法进行20。

  1. 将动物以仰卧位转移至倾斜的气管插管操作台。用一根线圈固定大鼠的上门齿，使其身体呈45°悬垂状态，以便更好地观察咽喉部位。
  2. 将柔性光源对准颈部表面，透过咽会厌区域进行透照。
  3. 使用棉签牵拉舌头，并用弯曲的称量勺作为压舌板将其固定在上颌上以保持稳定。
  4. 观察气管和声带。
  5. 使用16 G血管套管进行插管操作。将套管作为气管导管使用，将斜面针头的尖端钝化后作为引导器。
  6. 将安装在引导器（斜面针头）上的气管导管（16 G血管套管）推进气管，到位后撤出引导器（图1B）。
  7. 通过观察正常的呼吸节律（体重225 g的大鼠约为80次/分钟，体重275 g的大鼠约为70次/分钟）以及将金属刮匙（或小镜子）置于导管接头法兰处时其表面出现雾气，确认导管位置正确。
  8. 正确插管后，迅速将动物转移至手术台，仰卧于恒温加热垫上。
  9. 根据大鼠的体重调整呼吸机的潮气量和呼吸频率。体重约225–275 g的大鼠通常接受2.0–2.5 mL的潮气量和70–80次/分钟的呼吸频率。
  10. 将气管导管连接至呼吸机以启动机械通气。将呼吸机的出气端插入盛水的量筒中。每次呼吸后出气口产生的气泡表明插管成功。
  11. 待呼吸稳定后，用外科胶带固定气管导管，并将直肠探头沿尾巴固定，用于监测体温。

figure-protocol-1
图 1：进行肺动脉缩窄术（PAB）显微外科操作所需的关键器械。（A）经改造的19 G针头，用于引导完成PAB后获得直径为1 mm的肺动脉主干。（B）用于大鼠成功气管插管的气管插管工具。1. 使用压舌板在麻醉大鼠中压下舌头以暴露气管。2. 16 G导管在钝化其针芯尖端后，作为气管插管使用。请点击此处查看该图的放大版本。

4. PAB 手术（图 2）

注意：所有操作必须严格遵循无菌外科手术技术进行。

  1. 使用电动剃须刀和脱毛膏剃除胸部左侧毛发，随后以2%氯己定涂抹皮肤，再用70%酒精擦洗三次（每次重复操作）。
  2. 用医用胶带将前肢固定在伸展位置，注意不要过度伸展肢体，以免影响呼吸。
  3. 将右后肢稍向下拉，并沿尾部固定。
  4. 伸展并内收左侧后肢，将其固定于动物右侧，以形成轻度右侧卧位，暴露胸部左侧。
  5. 在此手术的后续步骤中使用无菌手套。
  6. 在动物体表覆盖无菌手术巾，在胸部左侧作一2-3 cm的皮肤切口，切口起始于剑突上方约2 cm处，斜向朝向大鼠左前肢基部。
  7. 在皮肤下，用圆头剪刀进行钝性分离，依次分开胸小肌和胸大肌，并将其移开。使用磁性牵开器固定肌肉，以便充分暴露下方的肋骨结构。
  8. 通过将出流管（连接呼吸机）从水瓶中移除，使肺部放气（参见步骤 3.10）。将出流管从水中取出可降低进入肺部的压力，从而促使肺叶放气。
  9. 使用弯头解剖镊行左侧开胸术。在第三肋间位于锁骨中线的肌肉处刺一小孔。rd 和 4th 肋骨。
  10. 将弯钳插入切口，沿两根肋骨之间的肌肉左内侧壁滑入，轻轻抬起左侧胸壁，在切割肌肉时避免触碰肺部。
  11. 使用已引入的镊子作为引导，用虹膜剪沿肋骨纵向切开约1 cm。保持左侧胸壁抬起，谨慎操作剪刀，避免直接损伤其下方的左肺叶。
  12. 使用圆头剪刀将动物左侧的肋间切口扩大至1-2 cm。
  13. 将拉钩重新置于肋骨下方以保持切口开放。
  14. 观察胸腺的下部及左肺叶的一部分。
  15. 推开胸腺和肺脏，因为这些器官占据了较大空间。用镊子进行钝性分离以分开胸腺叶，并用湿纱布将左侧肺脏牵开。随后，暴露心脏上部、左心房（LA）、肺动脉干以及主动脉弓。
  16. 仔细钝性分离覆盖心脏的这一区域的薄层心包膜及任何相连的脂肪组织，以帮助定位主动脉和肺动脉干仍相连的部位。对心包膜进行最小限度的分离，并避免触碰胸膜。
  17. 将弯钳以闭合状态插入左心耳与肺动脉干之间的间隙中，位于血管可见部分的中部，以到达血管的另一侧（图2A).
    注意：避免在心脏主动脉根部附近操作，以防血管破裂和出血。
  18. 通过结膜膜在肺动脉干头侧可视化镊子尖端。使用第二把镊子在镊尖上方进行分离，并小心刺穿膜以创建一个小开口。然后将位于肺动脉干下方的弯镊略微张开，以夹住一根5-0丝线。回拉镊子，将丝线从肺动脉干的一侧引至另一侧（图2B，C).
  19. 进行肺动脉干缩窄。首先，在靠近动脉处用5-0丝线打一个松的双结。将19 G针头沿血管走行并从缝线下方插入。收紧第一个结，并在取出19 G针头前，用第二个单结固定。图 2D).
    注意：操作需迅速且谨慎，以尽量缩短肺动脉干完全阻塞的时间。
  20. 打最后一个简单的结，并将剩余的5-0丝线在距结约0.5–1 cm处剪断（图 2D).
  21. 重新定位胸腺叶并移除胸部拉钩。
  22. 通过夹闭呼吸机的出气端 2 秒，使肺部重新充气。
  23. 使用合成可吸收的5-0缝合线，以十字交叉缝合法关闭胸腔。
  24. 在伤口区域滴加数滴0.9%生理盐水，按压胸壁两侧以排出气泡，恢复胸腔负压。
  25. 重新放置胸肌，并用无菌纱布擦去残留的生理盐水。
  26. 使用注射器将利多卡因涂抹于伤口表面及其周围区域。
  27. 使用带针的合成可吸收5-0缝线，以连续皮下缝合方式闭合皮肤。
    注意：假手术组大鼠接受相同的手术操作，但不进行步骤 4.18 和 4.19。

figure-protocol-2
图2：PAB 手术操作及 5.0 丝线与金属夹结扎效果的验证。 肺动脉干分离与结扎步骤的摄影图示，显示（A）肺动脉干的暴露与分离，（B）将 5.0 丝线环绕肺动脉干进行定位，（C） 使用 19 G 针头作为引导完成肺动脉干结扎（PAB）；（D）PAB 后心脏搏动、肺动脉根部及右心室负荷情况的观察；（E） 采用丝线与金属夹进行 PAB 的对比；以及（F）验证选用丝线进行 PAB 可在肺动脉干周围形成更可重复的 1 mm 直径缩窄。 请点击此处查看该图的高清版本。

5. 术后恢复

  1. 仅维持氧气流进行机械通气，同时撤除异氟烷。将大鼠置于右侧卧位或腹侧卧位，以利于呼吸。
  2. 在麻醉期间，按10 mL/kg/h的剂量，于背部颈部皮下注射0.9%生理盐水，以促进体液恢复。
  3. 确认自主呼吸后，轻柔地拔除气管插管。
  4. 观察大鼠何时开始自主活动，随后将动物从加热垫转移至新的无菌笼具中恢复。提供水和湿粮 随意.
  5. 术后期间（4–6 小时），将笼子置于加热垫上（笼子的一半区域），以帮助维持动物体温，并密切监测动物状态。
  6. 及时处理任何疼痛、呼吸困难或行为异常的迹象。
  7. 术后护理中，手术6小时后注射第二剂0.05 mg/kg的丁丙诺啡。术后24小时的次日，注射第三剂0.05 mg/kg的丁丙诺啡以及第二剂5 mg/kg的酮洛芬。
  8. 监测大鼠直至其完全恢复健康。

6. 经胸超声心动图

注意：本文展示的是术后第21天的数据，此时大鼠接受了经胸超声心动图检查。然而，根据研究目的和实验设计的要求，研究人员可以设定其他时间点进行术前和术后经导管肺动脉瓣球囊成形术的经胸超声心动图检查。

  1. 术前进行基线经胸超声心动图检查，以确定肺动脉（PA）直径，并选择合适规格的针头作为引导，用于在肺动脉束带术（PAB）中实现预期的肺动脉直径缩小60%。
    注意：本研究中使用体重为225–275 g的雄性Wistar大鼠，采用19 G针头可适当实现肺动脉直径60%的缩窄。
  2. 称重并用持续吸入的异氟烷（3% 和 2 L/min 氧气）麻醉大鼠2).
  3. 使用12S扇形/多元素探头（4.5-11.5 MHz）和图像采集系统对每只动物进行经胸超声心动图检查。
  4. 在胸骨旁短轴二维（2D）切面中使用彩色多普勒成像，将12S探头置于主动脉瓣水平。点击超声设备上的彩色多普勒按钮，以观察穿过肺动脉干狭窄段（PAB区域）的血流模式。
  5. 在二维胸骨旁短轴切面中，通过彩色多普勒血流成像引导，将连续波多普勒（CW）取样线穿过肺动脉束带（PAB）位置，记录通过PAB区域的血流特性，包括峰值流速（cm/s）和平均压差（mmHg）。为获取多普勒频谱曲线，需将取样容积调整至肺动脉束带水平。
  6. 通过将12S探头置于心尖水平，采用二维心尖四腔观，显示术后右心房（RA）和右心室（RV）的扩大情况，并测定心脏收缩末期RA的水平径（RADs），以毫米（mm）表示。
  7. 在二维心尖四腔切面中应用彩色多普勒显像，通过超声机采集动态图像序列，以显示因肺动脉环缩（PAB）引起的三尖瓣反流。
  8. 执行 M型超声模式 通过三尖瓣环与右心室侧壁交界处，在心尖四腔心切面进行超声心动图检查，测量三尖瓣环平面收缩期位移（TAPSE），以毫米（mm）表示。
  9. 使用 组织多普勒成像 在心尖四腔心切面，于三尖瓣环与右心室侧壁连接处水平，采用组织多普勒成像（TDI）测量右心室侧壁收缩期收缩功能（Sr），以厘米/秒（cm/s）表示，用于评估右心室收缩功能。
  10. 在心尖四腔心切面中，采用脉冲波多普勒记录三尖瓣跨瓣舒张期血流（TTF），以评估右心室舒张功能，包括舒张早期充盈（E 波）峰值速度、心房充盈（A 波）峰值速度，以及 TTF 中 E/A 比值。
  11. 执行 M型超声模式 在心脏舒张末期，于胸骨旁长轴切面主动脉瓣水平通过超声心动图测量右心室流出道（RVOT，单位为毫米）；在心脏收缩末期测量左心房直径（LADs，单位为毫米）。
  12. 进行二维（2D）操作 M型超声 在乳头肌水平的胸骨旁短轴切面进行超声心动图检查，以评估收缩末期和舒张末期的左心室尺寸（LVDs 和 LVDd）以及舒张末期左心室前壁厚度（LVAWd），所有数值均以毫米表示。
  13. 在胸骨旁短轴切面进行二维M型超声检查，以测定左心室缩短分数（LVFS，以百分比表示）和左心室射血分数（LVEF，以百分比表示）。

7. 电生理学研究（图 3）

  1. 麻醉后继续维持大鼠的麻醉状态 体内 超声心动图用于 体内 经食管电生理检查（EPS）
  2. 将心电图电极插入大鼠皮下（左前肢附近1个，右后肢附近1个，左后肢附近1个）。
  3. 轻柔地将一根电极间距为5 mm的4F四极导管插入食管图3A).
  4. 通过精确定位，使食管内导管的P波（代表心房收缩）与体表心电图上的P波一致，从而将食管内导管调整至靠近右心房（RA）的位置。图3A，B).
  5. 确定每只动物的刺激阈值。该阈值是指刺激器能够直接影响心率的最低电压。
  6. 通过应用电压脉冲串评估心房颤动易感性，脉冲电压为阈值电压的4倍，采用如下方案：共3组，每组12次刺激脉冲，每次持续3秒，频率为50 Hz，随后休息2秒（每组共1分钟）。每组之间，大鼠休息1分钟。9,13,21.
  7. 每次电击后，识别并量化心脏快速性心律失常的发生情况，包括心房颤动（AF）或心房扑动。
    注：心房颤动（AF）定义为不规则且极快的心房搏动（>800 次/分钟）。心房扑动定义为一种规则但快速的心房节律，其特征为 P 波消失，或在规则连续的 R-R 间期之间出现规律的多个 P 波模式。仅考虑持续时间超过 1 秒的心律失常发作。
  8. 若在连续两次刺激之间的休息期内未自行恢复窦性心律，则不应通过停止下一组刺激来中断正在进行的房颤或房扑发作。

figure-protocol-3
图3：静息状态下心跳的示意图及经食管导管的适当放置位置 体内 电生理学研究 (A) 静息状态下连续两个心动周期的典型心电图，显示 P 波、PR 间期、QRS 波群、QT 间期和 RR 间期。B) 心脏（1）和食管（2）的纵切面示意图，其中引入四极导管（3）以刺激并采集心房心电图。C代表性心电图信号，显示当体表心电图（上排图迹，红色线条）的房性信号与导管心电图（下排图迹）的房性信号重合时，经食管导管的最佳位置。 请点击此处以查看此图的放大版本。

8. 心电图分析

注意：心电图记录和刺激使用心电图采集软件进行。分析使用心电图分析软件进行（图3A）。

  1. 测量对应于心房收缩的 P 波持续时间，以毫秒（ms）表示。
  2. 确定对应于电冲动经房室（AV）结传导所需时间的 PR 间期，以毫秒（ms）表示。
  3. 报告对应于心室去极化的 QRS 综合波持续时间，以毫秒（ms）表示。
  4. 评估反映心室去极化与复极化总持续时间的 QT 间期，以毫秒（ms）表示。
  5. 量化指示连续两次心跳间期的 RR 间期，以毫秒（ms）表示，并据此确定心率。

9. 组织学分析

  1. 在PAB术后第21天，于异氟烷麻醉（5%，2 L/min O2）下通过放血法处死大鼠。
  2. 分离右心房（RA）和左心房（LA），以分析与右心衰竭（RHF）及心脏心律失常相关或无关的心房组织学重构。
  3. 将新鲜离体心脏在距心尖5 mm处进行横向切取，以评估与右心衰竭（RHF） 及心脏心律失常相关或无关的心室重构。
  4. 将心肌样本用福尔马林固定，并用Masson三色染色液22对组织切片染色，以定量分析PAB术后第21天（D21）的心室壁厚度、扩张程度以及心房纤维化。

10. 统计分析

  1. 通过Shapiro-Wilk检验评估分布的正态性。使用Student t检验比较正态分布的数据。
  2. 若数据呈非参数分布，则进行Mann-Whitney检验。使用Fisher精确检验分析分类变量（如房颤可诱导性）。
  3. 结果以均值 ± 均值标准误（S.E.M.）表示。双侧P值＜0.05时认为差异具有统计学显著性。

结果

手术过程中对肺动脉干适当结扎的视觉确认
在肺动脉狭窄（PAB）手术过程中，缝线位置良好的一个标志是血压立即升高，同时右心室（RV）及肺动脉干根部在与右心室连接处迅速扩张。为确保持续且稳定的压力超负荷状态维持3周，缝线必须固定不移位。本研究证实，使用5-0丝线比金属夹更为稳定（图2E、F）。此外，5-0丝线还允许根据特定实验设计的需要进行拆除。

本研究中的一个重要观察发现，使用金属夹会导致19 G导丝周围自由直径的形状不规则，这是变异性的主要来源之一。本研究要求保持稳定的1 mm直径。此外，移除金属夹时常导致肺动脉干撕裂，而在需要拆除缝线以评估正常压力恢复情况的研究设计中，这种情况是不可接受的图 2E,F).

确认和测量 PAB 诱导的右心室压力超负荷（图 4 和 图 5）
PAB 术后压力升高的理想确认方法是通过静脉内和心内导管进行血流动力学压力测量，如先前所述9。对于需要长期保存心脏或采用非侵入性方法的研究方案，上述超声心动图技术有助于利用连续波多普勒（CW Doppler）评估缝线周围血流速度的增加及压力梯度的变化（图 4A、C）。这种非侵入性方法甚至能够可视化结扎部位以及由于 PAB 导致动脉直径狭窄所引起的血流中断（图 4B、C）。此处展示的是 PAB 术后第 21 天（D21）获得的超声心动图数据，但研究人员可根据其具体研究需求和科研目标，在 PAB 术前和术后不同时间点进行此类无创经胸超声心动图检查。

figure-results-1
图4：肺动脉干结扎术后（PAB后）的评估。采用二维胸骨旁短轴切面的连续波多普勒成像，观察PAB大鼠与假手术大鼠肺动脉干内的血流模式。 (A) 假手术组（左图）和PAB组大鼠（右图）右心室经肺动脉干射出的血流速度测量结果。(B) 假手术组（左图）和PAB组大鼠（右图）肺动脉干的彩色血流显像。正常情况下，右心室射出的血液以层流形式远离心脏，在图像中呈蓝色；而由于PAB造成固定的右心室流出道阻塞，出现湍流，表现为红色和黄色。右侧图像中可观察到因丝线结扎导致的肺动脉干部分狭窄。(C) PAB组与假手术组在PAB术后第21天（D21）肺动脉峰值流速（单位：cm/s）的比较。(D)  PAB组与假手术组在PAB术后第21天（D21）肺动脉平均压差（单位：mmHg）的定量分析。（统计学分析：通过Shapiro-Wilk检验评估，数据呈正态分布。组间比较采用学生t检验。每组n = 6只大鼠。结果以均值 ± 标准误表示。）请点击此处查看该图的放大版本。

在心脏右侧，PAB 导致严重的右心衰竭（RHF），超声心动图在 PAB 术后第21天（D21）显示右心室（RV）壁增厚、右心房（RA）扩张并伴有心肌功能障碍，证实了这一点。就右心室功能而言，与假手术组（sham）相比，PAB 大鼠的右心室收缩压显著升高，体内超声心动图还显示，PAB 组的收缩率（Sr）低于假手术组（图5A-C）。与假手术组大鼠相比，PAB 组右心室舒张末期内径（RVDd）和右心室前壁舒张末期厚度（RVAWd）均显著增加。这些超声心动图观察结果在处死动物后，通过对 PAB 组与假手术组大鼠心脏横切面进行组织学分析得到进一步证实（图5D）。右心室为应对后负荷升高而发生的容量扩张，导致室间隔向左心室（LV）方向移位，从而引起左心室相对受压（图5A，D）。

figure-results-2
图5：PAB术后第21天确认右心室重构。（A） 四个心腔的二维心尖四腔切面图，显示与假手术组大鼠（左图）相比，PAB大鼠（右图）右心房（RA）和右心室（RV）扩张。采用组织多普勒成像技术对（B） PAB组与假手术组大鼠右心室收缩压（以mmHg表示）进行定量分析，以及（C）PAB组与假手术组大鼠右心室侧壁收缩期收缩功能（Sr，以cm/s表示）的测量。（D） 假手术组（左图）和PAB大鼠（右图）心脏横截面的组织学图像，证实PAB导致右心室显著增大，与假手术组相比。比例尺：5 mm。（统计分析：Shapiro-Wilk检验显示数据呈正态分布。组间比较采用学生t检验。每组n = 6只大鼠。结果以均值 ± 标准误表示。）请点击此处查看该图的放大版本。

PAB诱导的右心房扩张及三尖瓣反流的评估图6)
的 体内 在PAB术后第21天进行的超声心动图检查证实，由于PAB引起的心脏右侧压力持续升高，右心房内径（RADs）显著增加，而左心房内径（LADs）保持不变，图 5A, 图6A,B）。持续的PAB诱导的右侧压力超负荷伴随三尖瓣瓣环的变形。通过以下方法评估PAB诱导的三尖瓣功能障碍： 体内 在PAB术后第21天通过超声心动图观察三尖瓣反流情况进行评估，表现为收缩期血液反流至右心房（RA）图6C- E)

figure-results-3
图6：PAB术后第21天对右心房和三尖瓣的PAB诱导重塑的评估。 （A）通过二维心尖四腔切面测量假手术组和PAB大鼠在收缩末期的右心房尺寸（RADs）。（B）假手术组和PAB大鼠在收缩末期的左心房尺寸（LADs）的量化。（C）记录二维心尖四腔切面的彩色多普勒图像，以观察假手术组（左图）三尖瓣正常闭合，而PAB大鼠（右图）因PAB诱导的右侧三尖瓣环拉伸和变形，出现从右心室向右心房的血液反流，表现为三尖瓣反流。（D）采用心尖四腔切面M型超声心动图对PAB大鼠与假手术大鼠的三尖瓣环平面收缩位移（TAPSE）进行量化。（E）采用脉冲波多普勒对PAB大鼠与假手术大鼠的三尖瓣环移动速度进行量化。（统计分析：通过Shapiro-Wilk检验评估，数据呈正态分布。组间比较采用Student t检验。每组n = 6只大鼠。结果以均值 ± 标准误表示。） 请点击此处查看该图的放大版本。

评估 PAB 诱导的心律失常发生（图 7 和 图 8）
通过术后第21天（D21）的电生理分析可观察到 PAB 诱导的心脏重构。与假手术组大鼠相比，PAB 大鼠的 ECG 参数（包括 R-R 间期、P 波持续时间和 QT 间期）均显著增加（图 3A）。这些变化表明，PAB 影响了心率、心房传导以及心室收缩功能（图 7）。

此外，与假手术组相比，PAB 大鼠在电刺激下对心律失常（包括心房颤动）的易感性显著更高（图 8）。

figure-results-4
图7：心电图分析。 测量了心电图参数（单位：ms），包括（A）R-R间期、（B）P波持续时间、（C）P-R段、（D）QRS波群和（E）QT间期。（统计分析：通过Shapiro-Wilk检验评估，数据呈正态分布。采用Student's T检验进行组间比较。每个数据点代表一只独立动物。每组n = 6只大鼠。结果以均值 ± 标准误表示）。请点击此处查看该图的放大版本。

figure-results-5
图8：PAB诱导的心律失常，包括心房颤动（AF）。（A）假手术组（上图）和PAB大鼠（下图）在电生理研究期间记录的代表性体表心电图，显示窦性心律（SR）、3秒猝发起搏（刺激）后出现心房颤动（AF）或/和恢复为窦性心律（SR）。（B）PAB诱导的心房快速性心律失常（包括心房颤动和心房扑动[AFl]）易感性的定量分析。（C）可诱发AF的假手术组与PAB大鼠AF持续时间。（统计学分析：（B）Fisher精确检验；（C）假手术组n值过小，无法进行比较检验。每组n = 6只大鼠。结果以均值±标准误表示。）请点击此处查看该图的放大版本。

死亡率（图9）
在手术后数分钟至第3天（D3），PAB组大鼠的死亡率为30%，而假手术组（sham）为0%。术后存活超过前3天的大鼠均存活至最终实验日（D21）。D21之后，PAB组大鼠的死亡率显著上升（60%对比假手术组的0%），其原因为右侧心室重构加重及右心衰竭（RHF）（图9）。

figure-results-6
图9：死亡率。假手术组和PAB大鼠在术后D0至D3、D4至D21以及D21之后各时间段的死亡率（%）。请点击此处查看该图的放大版本。

讨论

成功实施肺动脉束带术（PAB）是本方案中最关键的部分。必须准确区分主动脉和肺动脉干。分离肺动脉时必须细致操作，以避免术中发生撕裂、出血和动物死亡。围绕19G导丝缝合时应迅速操作，并立即撤出导丝，以避免因导丝存在导致肺动脉长时间“完全阻塞”。

根据实验要求，我们确定使用5-0丝线比金属夹更稳定，更适合进行肺动脉缩窄术（PAB）10,13。此外，5-0丝线可被拆除，而金属夹则可能增加肺动脉撕裂的风险。研究人员在进行PAB时，应根据自身研究目的选择合适的缝合材料（丝线、金属夹或塑料夹）10。

在本研究中，肺动脉缩窄术（PAB）保留1 mm的自由直径，术后3周进行in vivo分析。术后21天，由于右侧心脏重构严重，实验动物的死亡率上升10,13,23（图9）。本方案的设计与优化旨在探索为期3周的心律失常性心脏重构过程。研究人员在重复构建该模型时，可考虑使用除19 G以外的其他规格导丝调整缩窄直径，和/或延长或缩短PAB术后重构期至动物处死前的时间23。

单次注射MCT是一种公认的诱导严重肺动脉高压（PAH）和右心衰竭（RHF）的方法8,9。然而，由于MCT诱导的肺毒性在本研究中具有重要意义，该方法在我们特定的研究背景下并不适用，因为本研究旨在探讨炎症在RHF诱导的心源性肝病（CA）中的作用9。本研究的特定科学假设要求采用一种在不引起肺损伤的前提下升高肺动脉压力的方法，以避免来自肺部的炎症信号干扰。因此，在本研究背景下，肺动脉狭窄（PAB）策略是最合适的选择13。

该方法可应用于多个研究领域。在心脏病学中，肺动脉缩窄（PAB）方案可用于研究右侧心脏肥厚、心脏心律失常的发生机制以及瓣膜性疾病（肺动脉狭窄、三尖瓣功能障碍）24,25,26。在衰老相关研究中，PAB方案可用于评估右心衰竭（RHF）在加重年龄相关性心脏功能障碍中的作用27。在肺科研究中，PAB方案可用于研究肺动脉主干狭窄对肺内功能的影响28。此外，PAB模型还可用于评估长期PAB诱导的右心衰竭对脑功能及神经退行性疾病的作用29。总体而言，心脏炎症和纤维化在心脏相关疾病中的影响是一个重要问题30。用于研究心脏纤维化和炎症的PAB模型提供了一种有趣且标准化、可重复的方法，可用于探讨与心脏炎症相关的机制，并评估潜在干预策略的可能性31,32。

根据所研究模型的特异性，研究人员可能希望使用与本文所述不同的穿刺针规格（而非文中使用的19 G针头）来诱导其他程度的右心衰竭（RHF）严重性。因此需要注意的是，当使用直径更小的导针（如20 G或21 G）时，由于肺动脉主干被阻塞，225–275 g大鼠在缝合后数分钟内即出现100%的死亡率。

由肺动脉狭窄（PAB）诱导的右心衰竭（RHF）是一种可重复且高效的方法，可用于诱导和研究心房颤动（AF）等心律失常（CA）。由窄径肺动脉狭窄（直径1 mm）引发的心房和心室重构表现为心肌炎症和纤维化，为研究与右心衰竭相关的室性和房性心律失常的发生机制提供了有价值的途径。

披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

作者感谢Colombe Roy、YanFen Shi、Sandra Querry和Josiane Deslandes在经胸超声心动图技术操作方面的协助，感谢Nathalie L'Heureux在PAB方法标准化初期提供的技术帮助。我们感谢蒙特利尔心脏研究所动物饲养设施的工作人员。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
0.9% 氯化钠注射液 USB（100 ml） BaxterJB1302P用于稀释药物（镇痛药和抗炎药）以及配制生理盐水注射器，以在手术后对动物进行补液
19 G × 1 1/2 PrecisionGlide 针头BD305187经改造（弯曲并钝化）的针头，用作肺动脉干部分缩窄术中的间隔物
2" × 2" 非织造非无菌 Ritmed 纱布块，4层AMD-RitmedA2101-CH用于吸收伤口血液或轻柔地推开器官（例如：胸腺）
4" × 4" 非织造非无菌 Ritmed 纱布块，4层（×200）AMD-RitmedA2100-CH用于吸收伤口血液或轻柔地推开器官（例如：胸腺）
5-0 紫色 Vicryl 缝线 RB-1 1/2 圆形针 17 mm 27"EthiconJ303H带圆锥形针头的无菌可吸收合成外科缝线，用于肌肉和皮肤伤口的闭合
Anafen（100 mg/mL）Merial Canada, Inc.1938126稀释后的注射用酮洛芬溶液，作为非甾体抗炎药、镇痛药和解热药使用
AutoClip 系统FST12020-00可用于闭合皮肤伤口，包括夹子施加器、伤口夹（9 mm）和夹子移除器
Dumont #5/45 镊子FST11251-35Dumoxel 镊子，尖端呈45°角，用于收紧围绕置于肺动脉干上的间隔物的结扎线
精细剪刀 - 锐利型FST14060-10不锈钢虹膜剪刀，专用于肋间肌切开和缝线剪断
Forane（异氟烷）100 mLBaxter CanadaBAXCA2L9100用于啮齿类动物PAB手术期间的吸入麻醉剂
静脉导管 16 G × 1.77 "（直型）BD Insyte381257用作气管内插管，其金属导丝已钝化处理
Light  LED 130 F - DrMachEickemeyerM130300壁挂式LED照明灯
磁性固定牵开系统：底板FST18200-50用于安装相关配件的金属板，放置于加热板周围
磁性固定牵开系统：弹性体（2 m 卷）FST18200-07用于将牵开器连接至固定器
磁性固定牵开系统：固定器FST18200-02可移动锚点，可安装在底板上
磁性固定牵开系统：牵开器FST18200-11牵开器，用于维持手术切口的期望张开状态
Metzenbaum 剪刀（弯型）FST14017-14不锈钢钝头剪刀，用于皮肤和肌肉的钝性分离
Micro-Adson 镊子FST11018-12不锈钢带齿镊子，用于夹持皮肤和其他组织
Oster Golden A5 2速剃毛器Oster Professional34264416949宠物美容剃毛器，用于准备手术区域。由于该设备主要用于大型动物，操作者在用于大鼠时需格外小心
啮齿类动物加热板或温控系统定制N/A连接至一个配备LED显示屏的装置，显示直肠探头检测到的温度及目标温度
啮齿类动物呼吸机 Model 683Harvard Apparatus74240-2用于小型实验动物（最大5 kg）的机械通气设备
Semken 带齿镊子（弯型）FST11009-13不锈钢镊子，用于组织解剖
Semken 带齿镊子（直型）FST11008-13不锈钢镊子，用于组织解剖
Silky Fresh 脱毛膏Veet62200825036剃毛后用于准备手术部位的脱毛产品
Soluprep 3M103.26含2%氯己定和70%酒精的瓶装消毒液，225 mL
不锈钢刮勺 195 mmHeathrow ScientificHS15907用作大鼠插管时的压舌板
体视显微镜系统 SZ61TROlympus88-126配备双目镜和内置摄像头的显微镜，可用于视频拍摄
无菌氯化钠0.9%冲洗瓶（60 mL）Saline H2O25-6048SA-L用于在整个手术过程中保持伤口湿润的溶液
手术剪刀 - 锐-钝型（直型）FST14001-12不锈钢剪刀，用于进行初始皮肤切口
5-0 丝线缝线（无针）Henry Schein102-6344用于肺动脉干缩窄的丝线
Systane 眼膏Alcon2444062眼部润滑剂，可暂时缓解因手术期间眼睛干燥引起的灼烧感和刺激
SZ2-STU2 体视显微镜支架OlympusN1198900连接至底座的臂可为显微镜头部提供极大的活动自由度
组织镊子 - 1×2 齿FST11021-15不锈钢镊子，用于夹持、固定和操作组织（皮肤和肌肉）
Transpore 外科胶带3M1527-1医用胶带，用于固定大鼠的前肢和后肢
Vetbond 组织粘合剂（3 mL）3M1469SB可少量涂抹于皮肤的外科胶水，可作为皮下缝合的补充
Vetergesic 多剂量（0.3 mg/mL）10 mLCeva Canada2342510稀释后的注射用布托啡诺溶液，作为镇痛药使用
兽用麻醉蒸发器 Tec 4Dispomed34001 Iso可实现异氟烷的汽化，并调节浓度至0–5%

参考文献

  1. Cassady, S. J., Ramani, G. V. Right heart failure in pulmonary hypertension. Cardiol Clin. 38 (2), 243-255 (2020).
  2. Campo, A., et al. Outcomes of hospitalization for right heart failure in pulmonary arterial hypertension. Eur Respir J. 38 (2), 359-367 (2011).
  3. Naeije, R., Manes, A. The right ventricle in pulmonary arterial hypertension. Eur Respir Rev. 23 (134), 476-487 (2014).
  4. Vonk-Noordegraaf, A., et al. Right heart adaptation to pulmonary arterial hypertension: physiology and pathobiology. J Am Coll Cardiol. 62 (25 Suppl), D22-D33 (2013).
  5. Olsson, K. M., Nickel, N., Tongers, J., Hoeper, M. M. Atrial flutter and fibrillation in patients with pulmonary hypertension. Int J Cardiol. 167 (5), 2300-2305 (2013).
  6. Mercurio, V., et al. Pulmonary arterial hypertension and atrial arrhythmias: incidence, risk factors, and clinical impact. Pulm Circ. 8 (2), 2045894018769874(2018).
  7. Dignam, J. P., Scott, T., Kemp-Harper, B., Hobbs, A. J. Animal models of pulmonary hypertension: Getting to the heart of the problem. Br J Pharmacol. 179 (5), 811-837 (2021).
  8. Silva, A. L., et al. Monocrotaline induces acutely cerebrovascular lesions, astrogliosis and neuronal degeneration associated with behavior changes in rats: A model of vascular damage in perspective. Neurotoxicology. 94, 59-70 (2023).
  9. Hiram, R., et al. Right atrial mechanisms of atrial fibrillation in a rat model of right heart disease. J Am Coll Cardiol. 74 (10), 1332-1347 (2019).
  10. Hirata, M., et al. Novel model of pulmonary artery banding leading to right heart failure in rats. Biomed Res Int. 2015, 753210(2015).
  11. Jalal, Z., et al. Unexpected internalization of a pulmonary artery band in a porcine model of tetralogy of Fallot. World J Pediatr Congenit Heart Surg. 8 (1), 48-54 (2017).
  12. Akazawa, Y., et al. Pulmonary artery banding is a relevant model to study the right ventricular remodeling and dysfunction that occurs in pulmonary arterial hypertension. J Appl Physiol. 129 (2), 238-246 (2020).
  13. Le Quilliec, E., et al. Atrial cardiomyocytes contribute to the inflammatory status associated with atrial fibrillation in right heart disease. Europace. 26 (4), euae082(2024).
  14. Cheng, H. W., et al. Assessment of right ventricular structure and function in mouse model of pulmonary artery constriction by transthoracic echocardiography. J Vis Exp. (84), e51041(2014).
  15. Cheng, T. C., Philip, J. L., Tabima, D. M., Hacker, T. A., Chesler, N. C. Multiscale structure-function relationships in right ventricular failure due to pressure overload. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 315 (3), H699-H708 (2018).
  16. Mamazhakypov, A., Veith, C., Schermuly, R. T., Sydykov, A. Surgical protocol for pulmonary artery banding in mice to generate a model of pressure-overload-induced right ventricular failure. STAR Protoc. 4 (4), 102660(2023).
  17. Prihadi, E. A., et al. Morphologic types of tricuspid regurgitation. Characteristics and prognostic implications. JACC: Cardiovasc Imaging. 12 (3), 491-499 (2019).
  18. Samson, N., Paulin, R. Epigenetics, inflammation and metabolism in right heart failure associated with pulmonary hypertension. Pulm Circ. 7 (3), 572-587 (2017).
  19. Liu, Z., et al. Low-voltage zones as the atrial fibrillation substrates: Relationship With initiation, perpetuation, and termination. Front Cardiovasc Med. 8, 705510(2021).
  20. Tomasello, G., et al. Simple and fast orotracheal intubation procedure in rats. Acta Biomed. 87 (1), 13-15 (2016).
  21. Halațiu, V. B., Perian, M., Balan, A. I., Scridon, A. Transesophageal atrial burst pacing for atrial fibrillation induction in rats. J Vis Exp. (180), e63567(2022).
  22. Prophet, E. B., Mills, B., Arrington, J. B., Sobin, L. H. Laboratory Methods in Histotechnology. , American Registry of Pathology. Washington. (1992).
  23. Silva, J. M. A., et al. Hypertrophy of the right ventricle by pulmonary artery banding in rats: a study of structural, functional, and transcriptomics alterations in the right and left ventricles. Front Physiol. 14, 1129333(2023).
  24. Camacho, P., Fan, H., Liu, Z., He, J. Q. Small mammalian animal models of heart disease. Am J Cardiovasc Dis. 6 (3), 70-80 (2016).
  25. Andersen, S., et al. A pulmonary trunk banding model of pressure overload induced right ventricular hypertrophy and failure. J Vis Exp. (141), e58050(2018).
  26. Ukita, R., et al. A large animal model for pulmonary hypertension and right ventricular failure: Left pulmonary artery ligation and progressive main pulmonary artery banding in sheep. J Vis Exp. (173), e62694(2021).
  27. Myers, P. O., et al. Impact of age and duration of banding on left ventricular preparation before anatomic repair for congenitally corrected transposition of the great arteries. Ann Thorac Surg. 96 (2), 603-610 (2013).
  28. Liu, C., et al. Reverse remodeling of pulmonary arterioles after pulmonary artery banding in patients ≥ 2 years old with severe pulmonary arterial hypertension and congenital heart disease. Pediatr Cardiol. 40 (5), 958-964 (2019).
  29. Roy, B., Vacas, S., Ehlert, L., McCloy, K., Saggar, R., Kumar, R. Brain structural changes in patients with pulmonary arterial hypertension. J Neuroimaging. 31 (3), 524-531 (2021).
  30. Hiram, R. Resolution-promoting autacoids demonstrate promising cardioprotective effects against heart diseases. Mol Biol Rep. 49 (6), 5179-5197 (2022).
  31. Hiram, R. Cardiac cytokine therapy? Relevance of targeting inflammatory mediators to combat cardiac arrhythmogenic remodeling. Int J Cardiol Heart Vasc. 37, 100918(2021).
  32. Al-U'datt, D. G. F., et al. Implications of enigmatic transglutaminase 2 (TG2) in cardiac diseases and therapeutic developments. Biochem Pharmacol. 201, 115104(2022).

重印与许可

申请许可以重复使用本 JoVE 文章的文本或图表

申请许可

标签

相关文章