优化小鼠尿动力学技术以提高准确性

Summary

该协议提供了用氰基丙烯酸酯对皮肤进行防水以防止尿液被毛皮和皮肤吸收的指南。它包括将胶水涂抹在皮肤上、植入膀胱导管以及用于清醒小鼠膀胱测压和尿道外括约肌电图记录的电极的说明。

Abstract

准确测量清醒小鼠的尿液参数对于了解下尿路 （LUT） 功能障碍至关重要，尤其是在神经源性膀胱创伤后脊髓损伤 （SCI） 等情况下。然而，在小鼠中进行膀胱测压记录存在显着挑战。当小鼠在记录过程中处于俯卧和受限位置时，尿液往往会被皮毛和皮肤吸收，导致排尿量 （VV） 被低估。本研究的目的是提高清醒小鼠膀胱测压和尿道外括约肌电图 （EUS-EMG） 记录的准确性。我们开发了一种独特的方法，利用氰基丙烯酸酯胶粘剂在尿道口和腹部周围形成防水皮肤屏障，防止尿液吸收并确保精确测量。结果表明，施用氰基丙烯酸酯后，VV 和 RV 的总和与注入的盐水量保持一致，实验后没有观察到潮湿区域，表明成功防止了尿液吸收。此外，该方法同时稳定了与尿道外括约肌 （EUS） 相连的电极，确保了稳定的肌电图 （EMG） 信号，并最大限度地减少了因醒来的小鼠的运动和实验者的操作而引起的伪影。讨论了方法学细节、结果和意义，强调了改进尿动力学技术在临床前研究中的重要性。

Introduction

尿液的储存和释放取决于膀胱和尿道外括约肌 （EUS） 的协调活动。在某些病理中，例如神经源性膀胱，膀胱逼尿肌和括约肌都可能功能障碍，导致严重的膀胱问题，尤其是在创伤性脊髓损伤 （SCI） 之后¹。

小型啮齿类动物通常用作研究下尿路 （LUT） 临床前功能的实验模型²。充盈膀胱测压法 （FC） 和 EUS 肌电图 （EUS-EMG） 记录技术可以提供精确的客观信息，具体取决于方法的选择、准确的测量和结果的解释³.尿动力学测试通常用于评估排尿量 （VV）、排尿效率 （VE） 和膀胱容量⁴。VE 测量膀胱自行排空的效率。它的计算方法是将排尿量除以排尿量和残余尿量之和 （VV+RV）。另一方面，膀胱容量的计算方法是将 VV（排尿时排出的尿液量）与 RV（排尿后留在膀胱中的尿液^量）相加5。因此，VV 和 RV 的测量是推导出其他参数的关键。

在尿动力学测试期间精确测量小鼠的 VV 存在各种挑战。啮齿动物的尿液在身体上被束缚在俯卧位时，由于重力的影响，往往会通过腹壁向下吸入⁶。这种现象会导致尿液被腹部毛皮和皮肤吸收，进而低估尿液排泄量。考虑到小鼠产生的尿液量很小，这种吸光度对结果准确性的影响更为明显⁷。此外，在 SCI 模型中，由于逼尿肌括约肌协同障碍 （DSD） 的影响，VV 通常低于正常小鼠，这增加了泄漏点压力和毛皮吸收尿液的风险⁸。这些因素对结果有重大影响。因此，在小鼠终末尿动力学研究期间准确测量 VV 和 RV 至关重要⁹。目前，已发表文献中提供的方法中缺乏有关如何在小鼠模型中准确测量尿量的细节。

氰基丙烯酸酯胶粘剂是一种胶水，由于其快速有效的粘合特性，常用于人类和动物模型的外科手术 10,11,12。这种胶粘剂特别适用于闭合伤口和撕裂伤，因为它在涂抹到皮肤上时会形成牢固而灵活的粘合¹³。此外，它可以成为防止尿液和湿气与毛皮和伤口接触的巨大屏障¹¹。

在本文中，我们开发了一种新颖且具有成本效益的技术，该技术利用氰基丙烯酸酯粘合剂在清醒小鼠的膀胱测压和 EUS-EMG 记录中获得精确的结果。这种方法将有助于了解膀胱功能障碍的根本原因和为 LUT 疾病设计更有效的治疗方法。

Protocol

动物研究方案已获得印第安纳大学医学院机构动物护理和使用委员会的批准。批准代码:21098MD/R/MSS/HZ 批准日期:2021 年 9 月 29 日。

1. 导管的准备

1. 切割一根 30 厘米的聚乙烯 PE-30 管（0.017 英寸 x 0.030 英寸）。使用打火机在管子的一端张开，确保它不会接触到火焰，并在管子形成适当圆形的钟形尖端后撤回打火机。
2. 小心地将大约 3/4 的 25G 针头插入管的另一端。准备一个 1 mL 注射器，并用无菌的 0.9% NaCl 填充。将注射器连接到 25 G 针头。
3. 轻轻注入生理盐水，检查针头尖端是否合适，针头末端是否泄漏。确保没有压力并且盐水顺利流过导管。

2. 电极的制备

1. 准备 2 根 20 厘米长的钢丝。取钢丝，在涂层区域的两端涂上砂光，剥去 5 毫米的钢丝。
2. 取一根 25G 针头，将其插入电线的一侧。确保小心插入针头，以免损坏电线。像钩子一样弯曲电线的剥皮部分。钩子将有助于将电线连接到 EUS 肌肉。
3. 使用焊料将引脚连接到带状线的另一端。焊接有助于将引脚固定到电线上并确保牢固连接。确保加热锡铅焊料，直到它熔化并覆盖电线和引脚。

3. 动物的准备

1. 根据机构动物护理，动物设施中的家养雌性 C57BL/6 小鼠（8 周龄，体重 18-20 克），具有 12 小时的明暗循环，可无限制地获得水和标准食物颗粒。

4. 手术中的麻醉

1. 将动物置于 2% 异氟醚和纯氧 （1 L/min） 的腔室中。在将动物转移到面罩之前，使用阴性脚趾捏检查确认动物的完全麻醉。确认后，将气体条件更改为面罩。
2. 确保麻醉面罩固定在无菌手术野上的适当位置。将动物仰卧在无菌窗帘上，鼻子放在吸入小面罩（0.8-1 L/min，2% 异氟醚）中以继续给药。

5. 手术准备

1. 用胶带固定动物的四肢。使用电动剃须刀剃除下腹部和尿道口周围（生殖器区域）的皮毛。
2. 涂抹眼药膏以防止任何潜在的眼睛干燥。使用聚维酮碘溶液准备剃须区域，并用 70% 乙醇擦去溶液。在手术区域贴上无菌窗帘。

6. 外科手术

1. 膀胱导管植入术
   1. 在手术显微镜下，使用 Metzenbaum 直钝剪刀，在腹盆皮肤中线切开一个 1-2 厘米的切口。继续切开中线的筋膜和肌肉，通过切口伤口露出膀胱。
   2. 一旦通过切口伤口可以看到膀胱，就根据需要继续缩回周围的任何器官或组织，以获得手术区域的清晰视野。注意避免对膀胱进行任何不必要的操作或紧张，因为这可能会导致并发症，例如漏尿或损伤周围结构。
   3. 抓住膀胱圆顶并用锥形尖端针使用 5-0 不可吸收的单丝缝合线放置钱包线。
   4. 使用微型剪刀，在钱包绳内创建一个小的膀胱造口术，并打一个孔，直到尿液流出。
   5. 抓住导管的圆端并将其插入孔中。一旦管子的尖端穿过孔，就把钱包线缝合在管子周围。然后，轻轻地向外拉管子，直到在缝合线下感觉到尖端。
   6. 从管的另一端缓慢注入 1 mL 生理盐水以扩张膀胱。检查导管周围是否有任何泄漏。如果存在渗漏，请再缝合一根。
   7. 盐水从尿道流出后，取出盐水以减压膀胱。
2. EUS 电极植入（图 1）
   1. 使用手术剪刀将腹部切口向上延伸到骨盆底。
   2. 与膀胱一致，将肌肉和膜移动到管，并找到尿道和括约肌。小心不要伤害髂尾中血管和神经。
   3. 使用包含电极的针头在距离尿道口 1 cm 处穿刺双侧皮肤。
   4. 用镊子小心地抓住钩尖，然后轻轻地将针头从皮肤上拉开。
   5. 使用电极的尖端，小心地双侧钩住 EUS 肌肉。避免打得太深，因为这可能会伤害肌肉，从而导致可能的漏尿。
   6. 使用 3-0 不可吸收的单丝缝合骨盆和腹部肌肉和皮肤。
3. 皮肤防水
   1. 在电极出口的皮肤上涂上一层薄薄的氰基丙烯酸酯胶，以将电极固定到位。
   2. 将氰基丙烯酸酯胶涂抹在尿道口周围 1 厘米处，并进一步延伸至腹部和缝合区域 3 厘米处。为避免接触胶水，请用镊子小心地将尿道口向上支撑。
   3. 使用 0.5-10 μL 微量移液器抽出促进剂液体以干燥胶水。
      注意: 促进剂液体是一种可燃液体。
   4. 添加促进剂液以确保适当的胶粘剂反应。这将有助于更快地干燥胶水并确保其牢固凝固。
4. 尿动力学准备
   1. 准备一个长、宽、深 4.5 厘米的倒置聚苯乙烯称重船。将其切成一个底部为 4 厘米的三角形，将鼠标的尿道口放在这个空间里。将一次性底模 37 mm x 24 mm x 5 mm 放在收集尿液的空间下方。
   2. 将鼠标重新定位为俯卧位置，然后小心地将其移动到装有防毒面具的定制板上。
   3. 确保尿道口正确定位在凹槽内。用胶带轻轻束缚鼠标的头部和肢体，并将板放在加热垫上，直到鼠标完全恢复意识（图 2）。
   4. 仅在小鼠完全清醒时进行膀胱测压，即从麻醉中恢复后至少 40 分钟。

7. 膀胱测压和 EUS-EMG 记录准备

1. 根据制造商的说明设置和校准输液泵。
2. 取直径为 19.05 mm 的 20 mL 注射器，在室温下填充无菌 0.9% NaCl。将注射器固定到输液泵上。将输注速度设置为 0.01 mL/min。
3. 通过 PE-30 管将注射器连接到三通连接器的一侧。将膀胱导管连接到压力传感器的另一侧。在连接膀胱导管之前，请务必去除所有气泡。
4. 将压力传感器固定在与鼠标膀胱相同的水平。压力传感器通过放大器连接到数据采集系统。
5. 将一个接地线钩连接到皮肤，另一个连接到电极连接器部位。在软件中记录压力。
6. 启动软件后，检查膀胱内压 （IVP） 和 EUS-EMG 信号。保存样品名称并设置时间。
7. 开始泵输液。记录信号。

Results

采用膀胱测压和 EUS-EMG 活动追踪分析数据。连续膀胱测压法包括将生理盐水注入膀胱，同时测量膀胱中的压力和体积变化。为了测量 VV，以 0.01 mL/min 的速度注入 0.4 mL 生理盐水，并在盖子中收集尿液超过 40 分钟。排尿后残留尿量 （PVR） 可以通过导管吸出生理盐水来获得。在没有胶水的正常小鼠中，VV 和 RV 的总和通常小于 0.4 mL。实验后，由于吸收尿液，腹部和鼻道周围的皮毛是湿的（图 3A）。在涂上一层薄薄的胶水覆盖小毛皮后，VV 和 RV 的总和显示为 0.4 mL，并且没有潮湿区域（图 3B、C）。

由此产生的膀胱测压追踪提供了各种参数的详细分析，包括最大排尿膀胱收缩压力 （27.2 cmH₂O）、收缩持续时间 （16.26 s） 和宫间间隔 （4.48 min）。同时，我们对小鼠的膀胱内压力和 EUS-EMG 信号有很好的记录，如图 4 所示。

许多小鼠尿动力学测量是在麻醉下进行的¹⁴。尽管这似乎是一种减少电信号噪音和动物运动导致尿液损失的便捷方法，但必须考虑到麻醉药物会影响尿流，这可能导致不准确或不可靠的结果¹⁵。因此，清醒动物的尿动力学记录更受欢迎，以获得更接近生理条件的结果。清醒动物的尿动力学记录通常在从异氟醚¹⁶ 恢复 40-50 分钟后开始。这个过程包括密切监测小鼠，以确保它们在不需要麻醉的情况下放松和舒适。通过多项实验观察到，有意识的小鼠的运动会影响尿动力学信号 ^5,14，^导致特定参数（如泄漏点压力、VV 和 VE¹⁷）的测量不准确。因此，我们实施了一种方法，通过部分抑制清醒的小鼠来确保更可靠的尿动力学结果。然而，即使有有限的约束，清醒的小鼠在立即从麻醉中醒来时仍然会挣扎，这也会导致电极钩与 EUS 之间的分离或不稳定的接触，并在 EUS-EMG 信号中产生显着的噪音。如图 3B 所示，为了最大限度地减少这些伪影，我们采取了在皮肤出口点用胶水固定电极的方法。这种方法已被证明可以有效地最大限度地减少电极的移动和它们可能产生的后续伪影。

图 1:肌电图电极的位移。 双侧电极（黄色星号）植入尿道外肌（EUS;黑色箭头）。 请单击此处查看此图的较大版本。

图 2:唤醒鼠标的约束。 植入导管和电极后，将小鼠束缚在板上以保持尿动力学记录的稳定性。 请单击此处查看此图的较大版本。

图 3:尿动力学记录后的腹部和尿道口区域。 （A） 在腹部和生殖器区域看到一个大的湿区（由红色虚线勾勒）。（B） 记录后，用氰基丙烯酸酯胶（由红色虚线勾勒）创建干燥、防水的腹部和生殖器区域。（C） 尿动力学记录过程中在尿道口形成的尿液滴剂（黄色箭头），并长时间保持为滴剂，未被皮肤和皮毛吸收。 请点击此处查看此图的较大版本。

图 4:清醒和受束缚的雌性小鼠膀胱测压和尿道外括约肌电图 （EUS-EMG） 的代表性痕迹。 （A） 痕迹 A:连续膀胱测量图 （CMG） 和 EUS-EMG 的同时记录（分别为上下轨迹）。（B） 迹线 B 是迹线 A 的扩展部分，由具有不同时间刻度的矩形框表示。在排尿阶段，间歇性排尿与 CMG 记录中膀胱内压的降低相吻合（上图;箭头），这发生在 EUS-EMG 活动的低强直期和降低期（下图;箭头）。 请单击此处查看此图的较大版本。

Discussion

这种尿动力学技术描述了一种改进的程序，用于测量清醒和受束缚小鼠的尿量和 EUS-EMG 信号。尿道口和腹部周围存在的毛皮会吸收尿液，从而干扰 VV 测量的准确性。尽管尿道口和腹部周围的毛皮在手术前已被仔细剃除，但这些区域和皮肤内剩余的小毛皮仍然吸收尿液，通常在记录后在腹部留下潮湿区域。由于尿道口与周围皮肤之间的距离极短，这个问题在雌性啮齿动物中尤为明显¹⁸。在这项技术中，将氰基丙烯酸酯胶涂在腹部和周围的尿道皮肤上，以形成防水皮肤表面，并在尿动力学记录期间提供对尿量的精确评估，从而更好地了解膀胱功能。胶水涂得非常精确，确保它覆盖了尿道口周围和附近的皮肤。涂抹胶水的目的是创造一个防水屏障，防止毛皮吸收任何尿液。胶水均匀涂抹，小心避免尿道口结块或堵塞。手术记录的结果证实我们的目标已完全实现，因为 VV 和 RV 的总和在输注量时保持不变，并且没有观察到进一步的潮湿区域。为确保测量的准确性，我们在实验后检查了膀胱，发现它是空的。这个检查膀胱的额外步骤至关重要，因为它消除了任何尿液潴留的可能性，从而导致我们通过注射器抽出的量与 RV 的实际量之间存在差异。

这种方法有局限性:1） 它不适合纵向和多时间点研究。2） 它不能应用于自由移动的鼠标。3） 如果电极与 EUS 分离，则很难打开腹部并重新安装它们。4） 虽然氰基丙烯酸酯胶粘剂因其易用性和有效性而在许多手术环境中是一种有价值的工具，但重要的是要谨慎使用它们并遵循适当的安全协议，以尽量减少任何潜在风险。氰基丙烯酸酯通常对皮肤是安全的，但应避免频繁接触，研究人员应采取适当的个人防护措施。氰基丙烯酸酯胶粘剂吸入会释放有毒蒸气。为了最大限度地降低吸入这些蒸气的风险，研究人员应保持较高的湿度水平并优化工作环境中的房间通风¹⁹。也可以使用特殊的空调过滤器来进一步降低蒸气的毒性。

总体而言，该实验为在尿动力学记录期间测量排尿的准确性提供了重要的见解，并有助于确定可能导致输注后 VV 和 RV 总量差异的潜在错误来源。

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
促进	BOB SMITH INDUSTRIES	BSI-152
氰基丙烯酸酯	TED PELLA， Inc	14478
一次性基础模具	TED PELLA， Inc	27147-4
输液泵	哈佛仪器 PHD ULTRA	70-3006
异氟醚	Henry Schein Inc	1182097
PIN	世界精密仪器	5482
聚乙烯管 30	Braintree Scientific Inc	PE30
无菌称重船	HEATHROW SCIENTIFIC	797CK2
Windaq/Lite	DATAQ INSTRUMENTS	249022