该研究介绍了Zebra II，一种用于斑马鱼长期心电图采集与分析的先进系统。该系统配备独立的灌注系统和多点电极，可在受控环境中同时处理多条斑马鱼。研究采用野生型斑马鱼评估并分析了胺碘酮的急性效应。
本文内容
摘要
摘要
斑马鱼及其突变品系已广泛应用于生物医学研究、心血管研究和药物筛选。本研究介绍了新型系统 Zebra II 的商用版本。该方案展示了在可控工作环境中对多条斑马鱼进行心电图（ECG）采集与分析的操作流程。该设备由外部独立灌注系统、四点电极、温度传感器以及嵌入式电子系统组成。在前期研究中，该设备的原型已通过多项测试与成熟的 iWORX 系统进行验证，结果显示其数据质量及对药物干预的心电响应与 iWORX 系统相当。在此基础上，本研究进一步探讨了麻醉药物和温度波动对斑马鱼心电图的影响，这需要实时的数据评估能力。得益于该装置能够持续稳定地输送麻醉剂和药物，ECG 数据的采集时间可延长至 1 小时，显著超过现有系统支持的 5 分钟时长。本文介绍了一种开创性的基于云平台的自动化分析方法，利用来自四条斑马鱼的数据，为开展联合实验提供了高效手段，大幅减少了时间和工作量。该系统在捕获和分析心电图方面表现出色，尤其在检测野生型斑马鱼的药物诱导心律失常方面具有优势。此外，多通道数据采集能力使得利用斑马鱼模型开展随机对照试验成为可能。所开发的 ECG 系统克服了现有技术的局限性，在加速斑马鱼相关的药物发现和心血管研究方面展现出巨大潜力。
引言
心血管疾病（CVD）是全球范围内的首要死亡原因。根据2024年美国心脏协会（AHA）更新报告，美国每天约有2552人死于心血管疾病，2017至2018年期间，心血管疾病的直接和间接总成本估计达3780亿美元1。心房颤动（AF）是美国最常见的心律失常之一2，其预后不良，可增加心血管疾病及非心血管疾病情况下发生中风和死亡的风险，从而导致不良结局风险升高3。此类心律失常的特点是心房内出现快速且不规则的电活动，通常导致心室节律快速而不规则4。此外，鉴于近期发生的COVID-19疫情，越来越多的研究和证据表明，与COVID-19相关的心律失常发生率有所上升，其中以窦性心动过缓最为常见5。与心房颤动相反，窦性心动过缓表现为心率减慢，低于每分钟60次（bpm）。该诊断需通过心电图（ECG）确认存在低于60 bpm的正常窦性心律。
斑马鱼（Danio rerio）因其在形态学、生理学和遗传学方面与人类具有高度同源性，已被证明是心血管研究和药物开发的理想模型6,7。尽管斑马鱼的心脏仅有两个可辨别的腔室，而人类为四腔心脏，但斑马鱼具有类似的收缩结构以及相似的传导系统8,9。因此，斑马鱼模型适用于研究心律失常，并可通过心电图（ECG）分析探索相关遗传通路与电生理特征之间的关联。在斑马鱼心电图记录的传感器设计方面，通常使用传统的针状电极10。其他研究则通过设计由不同材料制成的新型针状电极，提出了传统针电极的替代方案11，所采用的材料包括钨丝、不锈钢和银丝，以评估记录数据的质量。结合便携式心电图设备，研究人员旨在建立一个适用于科研与教学实验室的通用平台。
该针式系统还被应用于其他研究11,12,13,14，用于开展关于生物效应和/或药物诱导效应的研究，并取得了令人鼓舞的结果。然而，为了获得最佳信号，必须小心地将针头穿过斑马鱼的真皮层。这种侵入性操作可能因针头的锐利而损伤鱼的心脏，从而可能改变信号形态13。此外，准确地将电极放置在微小的心脏上而不造成伤害，以确保清晰的心电图（ECG）采集，具有显著的学习难度。因此，已提出多种替代探针系统，例如微电极阵列（MEA）和3D打印传感器。我们团队及其他研究人员已成功利用MEA进行数据采集，获得了具有良好的信噪比（SNR）以及高空间和时间分辨率的数据15,16,17。例如，我们开发了一种可包裹鱼心脏的MEA，从而实现位点特异性心电图信号的采集15,16。相比之下，另一研究团队开发了一种基于聚酰亚胺薄膜制成的柔性印刷电路板（FPCB）的MEA，用于癫痫研究中的多通道脑电图（EEG）记录18。尽管MEA能够记录多个信号，但由于电极通道数量有限，每次只能评估一条鱼。针对这一限制，我们近期展示了一种先进的系统，可同时对多条鱼进行心电图记录19。该系统采用两个电极，每个电极厚度为125 µm，由聚酰亚胺制成，其底部设有溅射金电极，以促进数据采集。然而，系统中水循环泵的引入带来了噪声，影响了心电图信号的信噪比（SNR）质量。此外，还需使用体积庞大且成本较高的数据采集设备，并通过有线方式连接至计算机。市场上如iWORX等系统虽通过紧凑型放大器提高了便携性，但仍存在未解决的问题：（i）其记录时间过短（3–5分钟），难以满足需要较长时间的实验需求，例如急性药物效应研究；（ii）需要对动物进行麻醉，可能引起应激反应并扭曲固有的心脏电生理数据；（iii）手动、顺序式测量限制了大规模鱼类实验的研究效率；（iv）需要离线进行繁琐的人工心电图数据处理。重要的是，目前尚未出现整合微电子技术用于分析突变表型的高通量系统。因此，开发能够实现长时间心电图记录的高通量系统，对于揭示心律失常表型与突变基因型之间的关联、识别单个突变基因型相关的多种心律失常表型，以及利用斑马鱼模型测试心脏药物的有效性至关重要。为此，我们于2022年推出了Zebra II系统的开创性原型。该新型系统具备同时对多条鱼进行长时间心电图记录的能力。为实现这一目标，我们自主研发了一套电子系统，采用物联网（IoT）技术实现无线数据传输，并可通过移动应用程序进行数据分析。物联网技术的引入不仅增强了系统的灵活性和便携性，还促进了斑马鱼模型研究的远程协作。在先前的研究中，我们通过大量测试验证了该系统的有效性，展示了其具备以下能力：1）同时从四条鱼采集心电图数据；2）连续记录心电图长达1小时，远超现有系统仅能记录数分钟的能力；3）通过使用50%浓度降低的Tricaine，显著减少麻醉带来的干扰效应。此外，该系统在多种实验中均表现出强大的长时间心电图记录能力，例如在受控实验条件下，对Tg(SCN5A-D1275N)突变型和野生型斑马鱼进行的钠诱导窦房（SA）阻滞、温度诱导心率变化以及药物诱导心律失常实验。该系统采用多通道电极进行长时间心电图记录，进一步支持随机对照试验的实施，可在相同条件下对每组两条鱼进行研究20。本文中，我们介绍了该系统的升级版本，配备了四点电极。此项改进使用户能够从鱼体多个位置采集心电图信号，显著降低了获得低质量心电图信号的可能性。此外，该版本在之前研究19所描述的大多数功能基础上进行了优化和完善。这一进化的ECG系统在克服现有局限性方面展现出巨大潜力，将极大促进斑马鱼中心律失常表型的分析和药物筛选。新增的四点电极已通过一项针对野生型斑马鱼药物诱导心律失常的短期研究进行了严格测试，进一步验证了其有效性。
方案
严格遵守伦理准则可确保实验中所涉及的斑马鱼得到妥善管理和适当处理。所有实验活动均依照机构动物照护与使用委员会（IACUC）制定的标准进行。本文所述实验及研究结果均在IACUC批准的授权协议AUP-21-066下开展。
1. 储备液的配制与保存
注意：配制三卡因储备液时，应在通风橱中进行，并穿戴适当的个人防护装备（PPE）。
- 称取400 mg三卡因粉末，溶于97.9 mL去离子水（DI水）中。将磁力搅拌子放入容器中，逐渐混合溶液。
- 逐滴加入少于17 mL的NaOH溶液以调节pH值。持续添加NaOH溶液直至pH值达到6.8–7.2范围。
- 根据调节pH值所添加的NaOH体积，确定三卡因溶液的最终浓度，并妥善储存。
注意：三卡因溶液对光敏感，不使用时应储存在棕色容器中，并置于4 °C保存。 - 称取258.13 mg胺碘酮，溶于1 L去离子水中。将磁力搅拌子放入容器中，搅拌数分钟，直至溶液完全溶解且无任何粉末残留。不使用时将溶液置于冰箱中4 °C保存。
注意：胺碘酮必须在通风橱内配制，并在4 °C冰箱中储存。操作时务必穿戴适当的个人防护装备（PPE）。
2. 鱼类养殖
- 将鱼类饲养在连接循环水系统的独立水族箱中，保持水温在 28–29°C 之间。
- 持续监测水质，并维持 14 小时光照与 10 小时黑暗的昼夜循环。
- 将 40 条鱼分为四组，每组 10 条，分别饲养在不同的水族箱中。
3. 设备设置
注意：第 3.2 步中所述的操作必须针对设备的每个腔室分别进行（图 1）。尽管每个腔室的设置可以不同，但为了保证实验的一致性，建议在所有腔室中保持统一的设置。
- 将设备连接至电源，并按下前面板上的红色按钮以启动运行。
- 通过设备的触摸屏导航，选择需要配置的腔室。
- 将低通滤波器设置为 0.1 Hz，高通滤波器设置为 500 Hz，增益设置为 10,000。
- 打开前部盖板以接触四个腔室。在开始实验前，将每个腔室内海绵（标准纤维素海绵）浸入三卡因（Tricaine）溶液中，然后挤去多余液体。
- 旋转四电极阵列，确保在放入鱼类前海绵可被触及。
4. 胺碘酮治疗
注意：使用鱼缸中的水（鱼水）来配制胺碘酮和三卡因的稀释溶液。对于步骤 4.1 中配制的每种溶液，均需针对步骤 2.3 中分出的每组重复执行步骤 4.3 和 4.4。
- 按照以下步骤稀释胺碘酮储备液。
- 将8.75 mL储备液加入41.25 mL鱼水中，配制成70 µM浓度的溶液。
- 将12.5 mL储备液加入37.5 mL鱼水中，配制成100 µM浓度的溶液。
- 将25 mL储备液加入25 mL鱼水中，配制成200 µM浓度的溶液。
- 通过将4 mL三卡因（Tricaine）储备液稀释至100 mL鱼水中，配制麻醉溶液，最终三卡因浓度为0.16 mg/mL。
- 将每条鱼单独浸入配制好的胺碘酮溶液中5分钟。使用计时器准确监控浸泡时间。
- 将鱼转移至三卡因溶液中麻醉2–3分钟。确保处理过程不会导致鱼类死亡。若鱼出现异常行为，如体色变淡或鳃部运动明显减少，应立即将其从溶液中取出，并放回洁净的鱼水中。
5. 心电图数据采集
注意：完成步骤 4.4 后请立即按照这些说明操作。在密封装置之前，对每个腔室重复此过程。这些腔室的设计可容纳宽度为 4-10 mm、长度为 25-50 mm 的鱼类。
- 将鱼从三卡因溶液中取出，放置在海绵上，确保其腹面朝上。
- 将电极阵列以菱形排列置于鱼的胸部区域，以同时从四个不同点捕获心电图信号（图 2A、B）。请仔细调节每个电极，确保每个针脚均与鱼的皮肤接触。
- 旋转每个电极，降低针脚直至其与鱼的腹面接触。若针脚过高，顺时针旋转相应的旋钮以降低针脚，直至其接触鱼体。
- 对所有腔室中的电极执行上述调节操作。
- 当所有操作腔室中的电极阵列均已正确置于鱼体上后，关闭腔室盖。
- 通过触摸屏选择待记录的腔室进行标记，然后点击屏幕上的记录 按钮开始记录。
- 2 分钟后点击停止 按钮，随后在屏幕上弹出的提示窗口中点击保存 按钮。根据具体研究需求，将数据保存至磁盘或云端。
6. 四电极阵列定位系统的故障排除
注意：偶尔可能有一个或多个电极无法采集到清晰的心电图信号，需要重新放置。必要时请按照以下步骤对电极阵列进行故障排查。
- 按下设备界面上的 停止 按钮，以终止记录过程，并识别信号不一致的通道。
- 打开前部盖板，进入电极室，确定出现问题的电极室及具体电极。
- 顺时针旋转顶部拇指旋钮，调节电极与鱼的距离，使电极更靠近鱼体。
- 根据需要重复步骤 6.3。如果仅靠靠近无法解决问题，则将电极旋转至鱼体的其他位置，直至获得满意的信号。
7. 提取与分析数据
注意：本文中呈现的所有基本数据分析均采用小波技术21来降低多种类型的噪声，并利用正常窦性心搏的标准差（SDNN）来计算每分钟时间段内心率逐搏变异。
- 将数据保存到磁盘或云端后，可将其取回进行分析，或直接发送至云服务器以进行进一步处理。
- 通过点击屏幕上的浏览按钮，找到已保存的数据，并选择要使用的数据集。
- 在屏幕选项中选择提取按钮，并将U盘连接到设备背面，以导出数据。
- 按照设备提示，将选定的数据集保存到外部驱动器上，以便后续检索和分析。
结果
该设备能够同时记录多条鱼的ECG信号，这一能力显著区别于其他设备，在减少斑马鱼或其他类似物种的药物或心脏研究所需时间方面具有显著优势（图1）。由于鱼类在解剖结构上存在差异，准确记录ECG信号具有挑战性，尤其是在电极放置方面。传统方法中，为避免记录到机械性搏动或运动伪影，需将作用电极置于心脏上方，参考电极置于腹部下方。然而，由于心脏位于组织深层或鱼体表面不平整，精确定位心脏位置可能较为困难。有时必须使用显微操作器调整电极位置以实现准确定位，这可能需要多次尝试才能获得高质量的信号。
为克服这些挑战，该系统采用了一种创新方法，使用四个电极的配置，取代传统的单个工作电极。每个电极均可独立运行，实现三个方向上的调节——上下移动（垂荡）、前后倾斜（俯仰）以及绕垂直轴旋转（横滚）。这种灵活性在处理不同体型的鱼类时尤为有用，可精确调整电极位置，以获取最佳心电图信号，或探究心电图读数随鱼类体表接触点变化的情况。
该设备不仅提高了心脏和药物研究的效率，还拓展了心电图（ECG）乃至ECG记录技术的应用前景。鉴于这些方法尚未标准化，且通常需要根据实验对象的具体条件进行定制，该设备为研究开辟了新的途径，提供了更灵活、更可靠的数据采集方法（图2）。
该系统的一个显著特点是能够在四条独立的斑马鱼上同时评估最多四种不同药物，或在四条不同的斑马鱼上研究单一药物的最多四个不同剂量所产生的效应。实验设置可从短暂的急性暴露到持续长达1小时的较长时间段，期间可涉及可变的药物剂量或环境条件（如温度和麻醉状态）的变化。在本研究中，我们开展了一项短时实验，以验证该方法的有效性，尤其突出了四电极阵列的功能。我们测试了三种不同剂量的胺碘酮（Amiodarone）——一种III类抗心律失常药物，已知可在斑马鱼中诱发心动过缓并延长QT间期——暴露时间为5分钟，类似于先前使用该设备第一代原型的研究20。
与先前的研究一致，与未经处理的对照组相比，鱼类表现出QTc间期延长以及心率降低。尽管暴露时间较短，短于许多持续达1小时的类似研究，我们仍能够观察到心电图信号和心脏参数的显著改变（图3）。
不同剂量的胺碘酮治疗引起心电图（ECG）出现可观察到的变化，且变化程度随剂量增加而加剧，如图3A、B所示。值得注意的是，与对照组QTc间期为330 ms相比，每增加一次剂量，QTc间期均相应延长。在经药物处理的各组中，70 µM胺碘酮对应的QTc间期为365 ms，100 µM时为480 ms，200 µM时为546 ms。相应地，在不同剂量胺碘酮作用下，伴随QTc间期延长，心率也显著下降。心率从对照组平均120 ±5次/分钟（BPM）显著降低至70 µM胺碘酮时的105 ±10 BPM、100 µM时的90 ±5 BPM以及200 µM时的84 ±5 BPM（图3C、D）。
基于这些发现，可以得出结论：新提出的技术在质量上可与以往研究17,18相媲美，采用的是双电极方法（一个工作电极和一个参考电极）。我们成功从四个工作电极获取了数据，并选择其中最优的一个用于分析，进而报告预期的心脏参数。选择标准与先前方法一致，强调需要在心电图信号中清晰显示PQRST波群，并具有较低的基线噪声。这使得能够准确计算QT和QTc间期，并有助于识别出明显的差异。此外，该方法还通过本研究团队中另外三位未参与当前设备开发的研究人员的测试进行了进一步验证。他们首先实施了设计者提出的初步方法，随后根据实际操作反馈提出了改进建议，从而优化了现有方案。这种迭代式的改进过程对于提升设备性能至关重要，通过吸收外部研究人员的见解，使设备在未来的应用中更加用户友好且高效。
本项关于药物反应的简要研究凸显了该设备不仅能够在不同条件下同时记录四条鱼的 ECG 信号，还能为每条鱼捕获多个（四个）ECG 信号的强大功能。这种多因素能力显著减少了电极放置所需的时间和工作量，并通过提供多个可选信号降低了人为误差的可能性。这种选择性使得研究人员可根据研究目标，选择最准确的信号，或整合来自多个信号的数据。然而，需要明确的是，采用四电极配置并不能自动确保所有四个信号都清晰且高质量。引入这一创新功能的主要目的是通过实现四通道同步记录而非依次记录，减少人为误差并节省时间；这种方式更高效，也减轻了鱼类因离水时间过长及麻醉状态所承受的压力，因为鱼类对离水和麻醉的耐受能力有限。
图1：Zebra II系统。（A）Zebra II设备（SolidWorks模型）的等轴视图，标注了各组成部分。请点击此处查看此图的放大版本。
图2：斑马鱼电极放置位置。（A）四点式电极夹具的自由度（概念示意图）。（B）电极在鱼体胸部的放置位置。（C）四点式电极夹具记录的心电图信号（通道1-4）。请点击此处查看该图的放大版本。
图3：急性胺碘酮暴露对心电图信号的影响。 （A）由系统获取的代表性心电图数据，以及不同胺碘酮浓度引起的心电图参数变化。（B）胺碘酮暴露引起的心电图变化。（C）描述心率（HR）差异的柱状图。（D）描述不同胺碘酮浓度下心电图数据中QTc间期差异的柱状图。*p<0.05（采用Tukey检验的单因素方差分析）。误差线表示标准差。本图经修改自20。 请点击此处查看此图的放大版本。
讨论
当前步骤根据我们团队先前研究中该设备的新版本进行了修改和完善20。此处还包含设备的带标注的计算机辅助设计（CAD）图。
正如本方案的故障排除指南中所强调的，操作人员必须认真细致地执行某些关键步骤，因为这些步骤会显著影响心电图信号的质量。与我们先前研究的结果一致20，电极的放置位置在获取高质量且清晰的斑马鱼心电图信号方面起着重要作用。由于该方法将工作电极数量从一个增加到四个，并引入了更多的自由度，因此需要额外的故障排除步骤，并对斑马鱼腹侧区域的电极放置进行更精细的优化，以获得最佳结果。
该设备的优势和新颖特性在于，能够延长多步骤实验的测量时间（传统方法仅限于数小时的研究），支持高通量筛选（可同时对多条斑马鱼进行实验，最多实现四组同步研究），实验设置高度可控，每份样本可额外进行最多四项电生理记录，并具备自动化云端数据分析与数据存储功能。基于此，我们特别强调，本研究旨在解决斑马鱼药物筛选和心脏研究中所需耗时过长的问题，因为传统方法需逐一样本筛查，并需多次试验才能获得足够的数据信息22。此外，本方法还提供了一种更简便的多通道阵列心电图（ECG）记录方式，相较于使用微电极阵列（MEA）或柔性印刷电路板（FPCB）的方法18，无需复杂的电极制备步骤，也无需将电极附加到鱼体上的繁琐操作；而本方法同样依赖表面接触记录，但侵入性更小。
该系统的局限性与传统方法所存在的局限性并无不同19,20，但由于采用了多通道阵列，减少了研究所需的记录次数，因此局限性相对较小。这些局限性主要取决于电极的放置位置，因此建议遵循图2B中所示的推荐放置位置。此外，必须明确的是，用户不应期望在四个通道的首次试验中即获得完美的记录结果，因为鱼类的解剖学差异以及样本的预处理（如去鳞、开胸操作等）将直接影响测试的质量和成功率。
披露
Hung Cao 和 Michael Lau 是 Sensoriis 公司的创始人。Sensoriis 公司的 Zebra II 系统在 NIH 的支持下开发，获得 SBIR 第二阶段资助项目编号 R44OD024874。加州大学欧文分校已根据其利益冲突政策，审查并批准了 Hung Cao 与 Sensoriis 公司之间的关系。其他作者声明不存在利益冲突。
致谢
我们感谢美国国立卫生研究院（NIH）小型企业创新研究二期项目（SBIR Phase II #R44OD024874）对H.C.和M.P.H.L.的支持。作者还感谢墨西哥国家人文、科学与技术理事会（CONAHCYT）通过“海外博士学位奖学金”（Beca CONAHCYT Para Estudios de Doctorado en el Extranjero）提供的经济资助。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 盐酸胺碘酮 | Sigma-Aldrich | PHR1164-1G | 胺碘酮粉末 |
| 台式pH/mV计 | Sper Scientific | 10500308 | |
| 氨基苯甲酸乙酯甲磺酸盐，98%，ACROS Organics | Fisher Scientific | AC118002500 | 三卡因粉末 |
| Isotemp 加热磁力搅拌器 | Fisher Scientific | SP88854200 | |
| Zebra II 系统 | Sensoriis | N/A | 商用斑马鱼心电图记录系统 |
| 斑马鱼心电图系统 | iWorx | ZS-200 | 商用斑马鱼心电图记录系统 |
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