在分子生物学实验课程中，采用基于课程的本科研究体验（CURE）模式，实施了一种可灵活调整的吉布森组装分子克隆模块。对学生学习成果的评估显示，完成CURE后，学生对分子克隆的理解程度和自信心均有提高，并成功克隆了用于天然产物生物合成研究的新型质粒。
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研究文章
通过可灵活调整的分子克隆课程型本科研究实践提升学生学习成效
* These authors contributed equally
本文内容
摘要
摘要
分子生物学技术的持续进步要求分子生物学课程 必须定期更新，以有效培养学生具备现代职业能力。特别是Gibson Assembly技术的出现，作为一种高度可定制且适应性强的分子克隆方法，已在众多研究环境中推动了分子克隆领域的发展。因此，我们在加州理工州立大学圣路易斯-奥比斯波分校的分子生物学实验课程中开发并实施了一个Gibson Assembly克隆教学模块，并对学生的课程学习成果进行了评估。在该课程的三次教学迭代中，学生参与了一项基于实验的独立研究项目，涉及构建三个独特的质粒文库，以支持天然产物生物合成领域的研究。学生在课程前后填写了问卷，以评估他们对分子克隆的理解程度以及对分子生物学术语和技术的信心。学生的反馈结果显示，他们在掌握分子克隆概念以及自我报告的分子克隆术语与技术应用信心方面均有显著提升。该教学模块框架可推广用于教授Gibson Assembly在不同应用场景中的使用，为教师提供了一套教学工具包，既能教授一种灵活且前沿的克隆技术，又能推动其科研项目的进展。
引言
在分子生物学基本概念和实验技术方面对本科生进行培训，对其科学和职业发展至关重要，因为这些方法在学术界和工业界等多种研究环境中均被广泛应用。因此，加州州立理工大学圣路易斯奥比斯波分校（Cal Poly）的生物学（分子与细胞生物学方向）和生物化学专业本科生必须修读一门高年级分子生物学实验课程，以学习和应用相关知识（CHEM/BIO 475）。该课程此前已建立基础教学大纲，学生通过拓扑异构酶介导（TOPO）克隆技术，利用酵母互补DNA（cDNA）模板构建含有肌动蛋白基因的质粒1。学生根据模拟真实科研假设的问题自主设计实验，从而加深对实验操作和探究式学习的理解。鉴于分子生物学领域的持续发展，相应的课程内容也需不断更新，以培养学生具备适应现代科研需求的能力。特别是，Gibson Assembly技术在科学界的应用日益广泛；尽管该方法最初用于人工染色体的合成2，但截至本报告撰写时，已有超过5,000篇出版物引用了Gibson等人的原始研究。与传统克隆方法相比，Gibson Assembly具有独特优势：高度可定制化，能够无需依赖限制性酶切位点，直接连接多个线性DNA片段形成连接区域。因此，我们抓住这一契机，对CHEM/BIO 475课程内容进行全面更新，引入现代分子克隆技术，并优化基于探究的教学模式。
已有研究表明，学生参与科研实践有助于提升对科学概念的理解、技能发展以及在科学领域的持续投入<....
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方案
本研究涉及人类参与者，已由加州州立理工大学研究机构审查委员会（Cal Poly Research Institutional Review Board，批准编号：2022-113-CP (IRB)）审查并批准。所有参与者均已签署书面知情同意书，同意参加本研究。
以下方案概述了教师准备工作（步骤1.1–1.3），学生’ 一个包含三组实验的教学模块的操作步骤，其中涉及通过PCR获取线性片段（步骤2.1）–2.7）、吉布森组装、转化及克隆筛选（步骤 3.1–3.5）、质粒提取与筛选（步骤 4.1–4.4）以及学习成果的评估（5.1–5.2）教师准备工作描述了一个典型的引物设计及目的质粒图谱制备的示例 in silico本方案的所有步骤均可根据所需质粒进行调整。每次学生实验分为两次实验课，每次3小时。
1. 教师准备
- 使用 Benchling 组装向导进行 Gibson 组装引物设计
- 确定基因插入片段的 DNA 模板来源，例如基因组 DNA、质粒或合成 DNA。
注意： 对于需从复....
- 确定基因插入片段的 DNA 模板来源，例如基因组 DNA、质粒或合成 DNA。
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结果
学生在克隆实验中的成功率
在每次吉布森组装模块的教学实施中（2019年、2022年和2023年），学生均被要求提交一份总结其研究结果的报告。2019年，44名学生中有36名（81.8%）报告称，根据他们为实验C设计的筛选结果，成功完成了质粒克隆。2022年，20名学生中有14名（70.0%）报告成功克隆了指定的构建体；而在2023年的团队项目中，27名学生中有12名（44.4%，即8个小组中的4个）根据其筛选分析结果报告了克隆成功。学生报告中的结论由授课教师或学生研究人员进行审核；若发现筛选结果不支持其结论，则对学生的解释进行纠正。每种不同的质粒各取一个样本进行Sanger测序分析，结果证实2019年所有15种目标质粒以及2022年所有12种质粒的插入片段序列均正确无误。2023年则采用Oxford纳米孔全质粒测序技术对全部8种质粒进行分析，但仅有8种中的1种质粒序列与预期一致。
基于内容的分子生物学概念评估
问卷的内容部分包含10道多项选择题，用于测试学生对分子生物学和分子克隆概念的理解。对全部1.......
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讨论
本文提出了一项可在本科教学实验室中灵活实施的研究型课程项目，旨在通过Gibson组装技术向学生教授分子克隆。在课堂教学环境中，本科生共成功构建了28种新型质粒。在三个教学批次中，学生个体报告的实验成功率介于44.4%至81.8%之间，总体克隆成功率为80%（共分配35个质粒，其中28个成功克隆）。2023年的克隆成功率较低，可能由两个叠加因素导致。首先，模板DNA样本管的标签名称极为相似，可能导致学生研究人员在准备DNA模板时发生混淆，进而在教学实验室的Gibson组装反应中引入了不兼容的线性片段。在该项目未来的实施中，应在将模板DNA提供给学生前，先通过测序或限制性酶切进行验证，以确认其正确性。其次，2023年的项目采用了四片段组装（一个载体和三个插入片段），而此前年份均为两片段组装（一个载体和一个插入片段）。由于Gibson组装中片段数量增加会降低反应效率22，这可能也导致了本次项目成功率的下降。在未来的项目迭代中，可通过增加冗余设计来提高成功率，例如安排多个小组克隆同一质粒，或让各小组在不同插入片段与载体比例下设置多个Gibson组装反应，以提高质粒连接与转化成功的可能性。此外，在片.......
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披露
作者声明不存在相互竞争的经济利益或其他利益冲突。
致谢
作者们衷心感谢Andrea Laubscher提供的技术支持，以及Michael Black、Sandi Clement和Javin Oza在教学实验课程实施和学习效果评估方面给予的有益讨论。作者们诚挚感谢2019年、2022年和2023年各届参与学习效果研究的所有学生，同时也感谢研究学生Nathan Kuhn和Aayushi Adettiwar在教学实验课程试剂制备过程中提供的协助。作者们还感谢来自William和Linda Frost基金、生物技术应用中心的Chevron生物技术应用研究捐赠基金，以及美国国家科学基金会（NSF-1708919和NSF-2300890）提供的经费支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 脱氧核糖核苷三磷酸（dNTPs，10 mM） | Fisher Scientific | FERR0191 | 自制 MasterMix 组分 |
| 二硫苏糖醇（DTT） | Fisher Scientific | FERR0861 | 自制 MasterMix 组分 |
| DpnI | 新英格兰生物实验室（New England Biolabs） | R0176S | 1000 单位 |
| Fisherbrand Isotemp 微生物培养箱 | Fisher Scientific | 15-103-0513 | |
| FisherBrand Isotemp 水浴锅 | Fisher Scientific | S28124 | |
| GelRed 核酸凝胶染料 | Biotium | NC9594719 | 10,000X |
| GeneJET 凝胶回收与DNA纯化微量试剂盒 | Thermo Scientific | FERK0831 | 100 次 |
| GeneRuler 1 kb DNA Marker | Fisher Scientific | FERSM0314 | 100 次应用 |
| LB 培养基（Miller配方） | Fisher BioReagents | BP9723-500 | 500 g |
| 六水合氯化镁 | Fisher Scientific | BP214-500 | 自制 MasterMix 组分 |
| Mastercycler nexus X2 梯度PCR仪 | Eppendorf | 6337000027 | |
| Microfuge 16 离心机 | Beckman Coulter | A46474 | |
| Micromonospora echinospora 菌株 | 美国模式培养物集存库（American Type Culture Collection） | ATCC 15837 | |
| 微波炉 | 通用电气（General Electric ） | 2440640 | |
| 分子生物学级琼脂糖 | Fisher BioReagents | BP160-100 | 100 g |
| Nanodrop One 微量分光光度计 | Thermo Scientific | 13-400-518 | |
| NEB 5-alpha 感受态大肠杆菌 | New England Biolabs | C2987H | 20 × 0.05 mL |
| NEBuilder HiFi DNA Assembly Master Mix | New England Biolabs | E2621S | 10 次反应 |
| New Brunswick Innova 40 台式轨道摇床 | New Brunswick | M1299-0090 | |
| 无核酸酶水 | Fisher BioReagents | BP248450 | 50 mL |
| PEG-8000 | Fisher Scientific | BP233-100 | 自制 MasterMix 组分 |
| Phusion DNA 聚合酶 | New England Biolabs | M0530 | 自制 MasterMix 组分 |
| 便携式天平 | Ohaus | SKX123 | |
| pUC19 载体 | New England Biolabs | N3041S | |
| Q5 高保真 2x Master Mix | New England Biolabs | M0492S | 100 次反应 |
| T5 核酸外切酶 | Epicentre | T5E4111K | 自制 MasterMix 组分 |
| Taq DNA 连接酶 | New England Biolabs | M0208 | 自制 MasterMix 组分 |
| Tris-HCl | Fisher Scientific | AAA1137918 | 自制 MasterMix 组分 |
| TriTrack DNA 上样缓冲液（6x） | Thermo Scientific | FERR1161 | 5 × 1 mL |
| Zyppy 质粒小提试剂盒 | Zymo Research | D4019 | 100 次 |
| β-烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD+） | New England Biolabs | B9007S | 自制 MasterMix 组分 |
参考文献
- Black, M. W., Tuan, A., Jonasson, E. Cloning yeast actin cDNA leads to an investigative approach for the molecular biology laboratory. Biochem Mol Biol Educ. 36 (3), 217-224 (2008).
- Gibson, D. G., Young, L., Chuang, R. -Y., Venter, J. C., Hutchison, C. A., Smith, H. O.
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重印与许可
