通过可灵活调整的分子克隆课程型本科研究实践提升学生学习成效

摘要

在分子生物学实验课程中，采用基于课程的本科研究体验（CURE）模式，实施了一种可灵活调整的吉布森组装分子克隆模块。对学生学习成果的评估显示，完成CURE后，学生对分子克隆的理解程度和自信心均有提高，并成功克隆了用于天然产物生物合成研究的新型质粒。

摘要

分子生物学技术的持续进步要求分子生物学课程 必须定期更新，以有效培养学生具备现代职业能力。特别是Gibson Assembly技术的出现，作为一种高度可定制且适应性强的分子克隆方法，已在众多研究环境中推动了分子克隆领域的发展。因此，我们在加州理工州立大学圣路易斯-奥比斯波分校的分子生物学实验课程中开发并实施了一个Gibson Assembly克隆教学模块，并对学生的课程学习成果进行了评估。在该课程的三次教学迭代中，学生参与了一项基于实验的独立研究项目，涉及构建三个独特的质粒文库，以支持天然产物生物合成领域的研究。学生在课程前后填写了问卷，以评估他们对分子克隆的理解程度以及对分子生物学术语和技术的信心。学生的反馈结果显示，他们在掌握分子克隆概念以及自我报告的分子克隆术语与技术应用信心方面均有显著提升。该教学模块框架可推广用于教授Gibson Assembly在不同应用场景中的使用，为教师提供了一套教学工具包，既能教授一种灵活且前沿的克隆技术，又能推动其科研项目的进展。

引言

在分子生物学基本概念和实验技术方面对本科生进行培训，对其科学和职业发展至关重要，因为这些方法在学术界和工业界等多种研究环境中均被广泛应用。因此，加州州立理工大学圣路易斯奥比斯波分校（Cal Poly）的生物学（分子与细胞生物学方向）和生物化学专业本科生必须修读一门高年级分子生物学实验课程，以学习和应用相关知识（CHEM/BIO 475）。该课程此前已建立基础教学大纲，学生通过拓扑异构酶介导（TOPO）克隆技术，利用酵母互补DNA（cDNA）模板构建含有肌动蛋白基因的质粒¹。学生根据模拟真实科研假设的问题自主设计实验，从而加深对实验操作和探究式学习的理解。鉴于分子生物学领域的持续发展，相应的课程内容也需不断更新，以培养学生具备适应现代科研需求的能力。特别是，Gibson Assembly技术在科学界的应用日益广泛；尽管该方法最初用于人工染色体的合成²，但截至本报告撰写时，已有超过5,000篇出版物引用了Gibson等人的原始研究。与传统克隆方法相比，Gibson Assembly具有独特优势：高度可定制化，能够无需依赖限制性酶切位点，直接连接多个线性DNA片段形成连接区域。因此，我们抓住这一契机，对CHEM/BIO 475课程内容进行全面更新，引入现代分子克隆技术，并优化基于探究的教学模式。

已有研究表明，学生参与科研实践有助于提升对科学概念的理解、技能发展以及在科学领域的持续投入³，然而并非所有本科生都有机会直接进入科研实验室参与研究。为应对科研实验室学生容纳能力有限的挑战，课程整合型本科科研实践（CUREs）被开发并应用于教学中，以在课堂环境中提供真实的科研经历，从而提高科学教育的可及性。尽管CUREs在实施方式上各有不同，但已确立了一些共同实践，以体现科学研究的五个核心原则。在一个设计良好的CURE中，学生将：1）运用科学实践方法，2）在研究项目中进行协作，3）尝试做出新发现，4）贡献具有课堂之外实际意义的工作，以及5）在实验失败的情况下重新评估并修正假设与方法⁴。与传统的实验室学生科研经历类似，CUREs已被证明能够增强学生在科学领域的自信心、科学技能、对项目的归属感，以及在科学、技术、工程和数学（STEM）领域的持续投入⁵。尽管已有文献报道过涉及分子克隆的CUREs^{6,7,8,9,10,11,12,13}，但我们尚未发现任何强调利用Gibson Assembly的可适应性来构建一系列真实科研质粒文库的课程案例。

本文报道了加州州立理工大学圣路易斯奥比斯波分校现有的探究式 CHEM/BIO 475 课程的扩展内容，包含两项主要改进：学生通过吉布森组装（Gibson Assembly）获得动手实验经验，并参与课程相关本科研究经历（CURE），从而为美国国家科学基金会资助的研究项目（NSF-1708919 和 NSF-2300890）提供了原创质粒构建体。在该课程的三次实施过程中，学生参与了两项独立的研究项目，重点研究放线菌门（Actinomycetota）产生的生物活性分子的天然产物生物合成。天然产物通常含有具有抗生素、抗真菌和/或抗癌活性的药效团，因此这些小分子在药物发现工作中具有重要意义，并具备潜在的临床应用价值¹⁴。该研究需要构建质粒文库，以探究细菌生物合成酶的功能及其工程化潜力。在此项 CURE 中，学生设计并实施了吉布森组装实验，克隆出与这些研究项目相关的特异性质粒文库（图 1）。此外，该教学模块的形式与设计具有独特性，因其可轻松调整，用于生成其他研究项目所需的任意质粒。

图1：Gibson组装技术在本实验室研究中的作用概述。 放线菌门（Actinomycetota）利用编码生物合成酶的基因簇产生具有临床相关生物活性的小分子天然产物。在本研究中，我们通过Gibson组装法构建包含生物合成基因的质粒，用于后续对所编码酶功能的研究。科学图标来自Biorender.com。 请点击此处查看该图的高清版本。

实验室概述

分子生物学实验室是一门高年级必修课程，面向生物化学专业以及主修分子与细胞生物学方向的生物学专业学生。满足先修条件的其他学生也可选修本课程作为高年级选修课。本课程由加州州立理工大学（Cal Poly）化学与生物化学系和生物学系联合开设。两个系的教师轮流在每学期授课（其中两个季度由生物学系授课，一个季度由化学与生物化学系授课）。

该课程每周在实验室进行两次，每次170分钟，另加一次50分钟的讲座。每个实验班最多容纳16名学生，每季度开设2至3个实验班。课程持续10周，期末考试在第10周最后一次课上进行。讲座时间主要用于讲解实验中所用多种实验技术的理论基础，以及实验室未涵盖的分子生物学当前热点话题。实验课的核心教学内容包括从酵母中克隆肌动蛋白基因的全过程¹，该过程耗时约7周（13至14次实验课）。涉及的技术包括微量移液、酵母RNA提取、利用反转录-聚合酶链式反应（RT-PCR）扩增酵母基因、TOPO克隆、蓝白斑筛选、质粒提取及通过限制性酶切和PCR验证插入片段、in silico克隆分析以及DNA序列分析。课程最后3周的教学内容由授课教师自行决定，但要求学生完成一个结果未知的“独立项目”。

实验概述

我们研究团队的一个重点是放线菌门（Actinomycetota）中的生物合成途径。在设计独立研究项目时，我们设想让学生通过吉布森组装（Gibson Assembly）构建质粒，用于我们正在进行的天然产物生物合成研究项目。尽管本课程模块的评估版本主要针对可用于操控生物合成途径的质粒，但吉布森组装的工作流程在其他分子克隆项目中也具有极强的适应性（图2）。该工作流程分为三个不同的实验（A、B 和 C），在两次讲座课和六次实验课（共计3周）内完成（参见 补充文件1 和 补充文件2）。每次实验前均配有练习工作表，以帮助学生预习并评估其理解程度（补充文件3、补充文件4 和 补充文件5）。该工作流程的设计灵活，可根据授课教师的具体需求和兴趣进行调整。

图 2：Gibson 组装模块工作流程。 第1天和第4天为授课时间，学生在此期间完成in silico序列分析和实验设计。第2–3天和第5–8天为实验课时间，学生在此期间进行通过Gibson组装克隆新型质粒的各个步骤，随后进行质粒的分离与筛选。图示流程图按照学生执行的三个实验（A、B和C）进行分组。更详细的说明和实验方案见作为补充文件1和补充文件2提供的教师手册和学生手册。科学图标来自 Biorender.com。请点击此处查看此图的放大版本。

Gibson Assembly 独立项目模块最初于 2019 年春季学期在 CHEM/BIO 475 课程中试点实施。2020 年和 2021 年，由于 SARS-CoV-2 疫情，该课程转为线上授课。当 2022 年和 2023 年恢复线下教学后，课程中的学生受邀参与了一项研究，以评估 Gibson Assembly 独立项目的学习成效，该项目涉及克隆具有原始性且与研究相关的质粒。2019 年，学生构建了一个质粒文库，其中包含来自 Micromonospora echinospora ATCC 15837 基因组的基因盒，这些基因盒被克隆至 pKC1132 载体中（图 3）。该质粒文库正被用于我们的研究实验室中，以失活天然产物 TLN-05220 的假定生物合成基因簇中的目标基因¹⁵。为补充我们的基因失活研究，2022 年的学生将假定 TLN-05220 基因簇中的一组小规模基因克隆至 pUC19 载体中（Fi图 3）；我们的研究团队已利用这些质粒将基因亚克隆至包括 pET28b 在内的表达载体中，用于蛋白质的过表达与纯化。2023 年的学生群体则参与了关于环氧酶素合酶的生物合成工程项目的持续工作¹⁶。学生以 3–4 人为一组，将非核糖体肽合酶¹⁷ 模块中的工程化结构域克隆至多种蛋白表达载体中，以优化这些酶在我们研究实验室中的过表达与纯化（Figure 3）。每个学生群体的克隆计划均设计有冗余。例如，2019 年的学生群体共有 44 人，课程分配了 15 个质粒进行克隆，因此每个质粒的克隆尝试了两到三次。

图3：2019年、2022年和2023年独立项目轮次中克隆的质粒及学生参与情况概览。 Gibson组装项目已开展三次。在每一轮次中，参与的学生均克隆了不同的质粒文库，用于探索生物合成通路的研究项目。2019年和2022年的项目支持了我们对天然产物TLN-05220¹⁵的持续研究，采用了两种片段（一个基因盒或一个基因与载体）的Gibson组装反应。2023年的项目涉及在参与表皮霉素（epoxomicin）生物合成的非核糖体肽合成酶（NRPS）酶的模块1和模块2内进行结构域互换¹⁶。斜线填充的片段代表互换结构域的两种不同突变体，实色填充的片段代表未发生互换的结构域。总共生成了八个不同的基因片段（模块1和模块2各四个），其末端具有与Gibson组装兼容的突出末端。对于每个模块，将三种基因片段的两种不同组合分别与两种不同载体（pBAD33和pET28，每种组装包含四个片段）之一进行组装，理论上可构建出八种经改造的NRPS质粒。科学图标来源于Biorender.com。请点击此处查看此图的放大版本。

评估概述

在2022年和2023年批次的学生开始进行Gibson Assembly独立项目至少一周前，他们被邀请参与一项学习成果调查，该调查的设计类似于加州理工学院（Cal Poly）一项生物化学实验课程调查中所采用的方法¹⁸。参与的学生在独立项目开始前的实验课会议上完成了一份选择题形式的前测问卷，并在最后一次实验课会议期间（即完成Gibson Assembly模块后）完成了一份选择题形式的后测问卷。前测和后测问卷共包含28道完全相同的问题，后测问卷额外增加了两道问题，共计30道题。其中10道内容题用于评估学生对分子克隆相关酶及其作用机制的知识掌握情况（例如聚合酶链式反应[PCR]、Gibson Assembly、转化、蓝白斑筛选）。接下来的7道题要求学生自我评估对分子克隆术语的熟悉程度（例如DNA聚合酶、外切核酸酶、连接酶）。随后的10道题允许学生自我评估执行分子克隆技术的能力（例如DNA序列分析、限制性酶切反应、琼脂糖凝胶电泳）。学生还需报告基于其对分子克隆技术的了解，是否愿意从事分子生物学相关的职业。后测问卷中还额外包含两道题，用于让学生自我评估其在课程中的学习投入程度以及该课程是否是一次有价值的学习体验（补充文件6和补充文件7）。2022年和2023年学生前后测问卷的所有数据已合并用于分析，详见补充表S1。

方案

本研究涉及人类参与者，已由加州州立理工大学研究机构审查委员会（Cal Poly Research Institutional Review Board，批准编号：2022-113-CP (IRB)）审查并批准。所有参与者均已签署书面知情同意书，同意参加本研究。

以下方案概述了教师准备工作（步骤1.1–1.3），学生’ 一个包含三组实验的教学模块的操作步骤，其中涉及通过PCR获取线性片段（步骤2.1）–2.7）、吉布森组装、转化及克隆筛选（步骤 3.1–3.5）、质粒提取与筛选（步骤 4.1–4.4）以及学习成果的评估（5.1–5.2）教师准备工作描述了一个典型的引物设计及目的质粒图谱制备的示例 in silico本方案的所有步骤均可根据所需质粒进行调整。每次学生实验分为两次实验课，每次3小时。

1. 教师准备

1. 使用 Benchling 组装向导进行 Gibson 组装引物设计
   1. 确定基因插入片段的 DNA 模板来源，例如基因组 DNA、质粒或合成 DNA。
      注意： 对于需从复杂的基因组 DNA 模板中扩增的基因，建议首先使用美国国家生物技术信息中心（NCBI）的基本局部比对搜索工具（BLAST）²¹ 确定基因组 DNA 模板中针对目标基因的特异性唯一结合位点，具体方法详见 补充文件 1。对于质粒或合成 DNA 等简单模板，可直接进入下一步。
   2. 获取基因插入片段和载体的 DNA 序列（例如，参见 补充文件 8 中以 GenBank 文件格式提供的聚酮羟化酶基因序列和 pUC19 序列）。将所需的插入片段序列和载体序列分别作为新的 DNA 序列文件导入 Benchling。打开每个将用于 Gibson 组装反应的已导入序列。
      注意： 可以以多种格式导入 DNA 序列文件，包括 GenBank 和 FASTA 格式。也可以通过登录号直接从数据库导入序列，或粘贴从其他文件或查看器中复制的核苷酸序列。
   3. 在屏幕底部找到 组装向导 工具。点击 组装向导，然后选择 创建新组装。在提供的选项中选择 Gibson，然后点击 开始 以启动组装。
   4. 在 载体序列 窗口中，从载体骨架中选择所有将包含在组装中的碱基。从插入基因 3'’ 端的核苷酸位置开始选择（例如 pUC19 的第 657 位），并选择所有后续需包含的核苷酸（例如至第 656 位以包含完整的 pUC19 序列）。选择完成后，点击屏幕底部的 骨架 标签 | 设置片段。
      注意： 可在载体的 序列图谱 和 质粒 视图之间切换，以选择环状模板中的所有目标碱基。或者，若计划通过限制性酶切（而非 PCR）制备用于 Gibson 组装的载体片段，可使用限制性酶切位点（例如 XbaI）将骨架序列线性化。操作方法为：点击 酶切位点，按住 Shift 键，再次点击 酶切位点，然后点击 设置片段 以设定骨架。请注意，若在 组装向导 中使用限制性酶切使骨架线性化，Benchling 将不会为该骨架生成特异性引物。
   5. 在 插入片段序列 窗口中，选择所有将包含在组装中的插入片段碱基。选择完成后，点击屏幕底部的 插入 标签 | 设置片段。
   6. 若存在多个基因插入片段，点击 组装向导 右侧的 + 按钮。在 插入片段序列 窗口中，选择所有将包含在组装中的插入片段碱基。选择完成后，点击屏幕底部的 插入 标签 | 设置片段。
   7. 所有片段设置完成后，将组装命名为所需的质粒名称，并点击 组装向导 右侧的 组装。为 序列文件夹 和 引物文件夹 选择期望的存储位置。点击 创建 以生成重组质粒序列。
   8. 打开组装完成的质粒，点击 组装历史，查看基本的质粒图谱以及其来源序列的概览。确保每个片段的核苷酸位置与预期设计一致。
   9. 在 组装参数 标签页中，查看为组装设计的引物名称。注意每个插入片段将设计两条引物（正向和反向），引物名称将基于 DNA 序列文件的标题生成。同时确保在此窗口中引物的熔解温度和建议退火温度相容（参见 补充文件 8，代表性引物）。
      1. 若引物的熔解温度或退火温度不理想，可在引物序列文件中手动调整引物序列（例如，删除核苷酸以降低熔解温度）。或者，点击 重新打开，然后在 组装向导 中点击 组装 按钮旁的 酶/引物设置 按钮，调整引物设置。随后重复组装步骤并重新检查引物序列。
      2. 若需将多个不同基因克隆至同一载体骨架以构建质粒文库，
      3. 可在每种情况下使用相同的载体引物对。为此，手动删除载体引物中用于安装插入片段特异性突出端的全部核苷酸。这些核苷酸位于引物的 5'’ 端。删除后，确保引物的熔解温度和退火温度相容（参见 补充文件 8，代表性引物）。
      4. 确保所有插入片段引物对的熔解温度和退火温度非常接近。
         注意： 这将减少每对引物退火温度优化的需求，并允许所有学生的 PCR 反应在同一热循环仪程序下同时进行。
   10. 完成目标质粒的引物设计后，点击 组装向导 中的 完成。向 DNA 合成公司订购引物，并获取插入片段和载体的 DNA 模板样品。
   11. 使用 DNA 模板通过梯度 PCR 实验测试插入片段和载体特异性引物对的最佳退火温度。初始测试时，采用 Benchling 推荐的退火温度 ± 3 °C 范围。
   12. 确定退火温度后，为学生准备引物溶液、DNA 模板和 PCR 反应所需试剂的分装样品。
2. 实验开始前，向学生提供工作表以支持其准备并评估其理解程度（补充文件 4、补充文件 5 和 补充文件 6）。
3. 学习成果数据收集
   注意： 若有意收集 Gibson 组装模块的学习成果数据并发表结果，需根据所在机构的政策获得涉及人类受试者研究的批准。
   1. 在 Gibson 组装独立项目开始前至少 1 周，邀请学生参与学习成果调查。
   2. 要求参与学生在独立项目开始前的实验课会议上完成多项选择题前测问卷（补充文件 6）。

2. 学生实验 A：通过 PCR 获得线性片段

1. 从指导教师处获取用于 PCR 的引物和模板 DNA 溶液。
2. 根据学生手册中的说明（参见 补充文件 2），用移液器配制 25 µL 反应体系，包含 DNA 聚合酶预混液（MasterMix）、DNA 模板、正向与反向引物以及无核酸酶水。
3. 按照 补充文件 2 中学生手册的说明，在热循环仪中进行扩增反应。确保反应的退火温度适合所用引物，延伸时间适合目标扩增片段的长度。详细操作步骤请参阅 补充文件 2 和 补充文件 3。
4. 将 PCR 反应产物在 4 °C 或 −20 °C 保存，直至下一次实验课。
5. 通过琼脂糖凝胶电泳分析每个反应中的 5 µL 产物。在凝胶电泳运行期间，向使用质粒 DNA 作为模板的每个反应体系中加入 1 µL DpnI 限制性内切酶。将该混合物在 37 °C 下孵育 1 小时。
   注意：DpnI 将降解残留的环状质粒 DNA 模板，从而降低转化步骤中出现假阳性的可能性。
6. 成像凝胶以确认 PCR 成功并实现了正确的扩增。使用市售的 PCR 产物纯化试剂盒对成功的 PCR 产物进行纯化。使用微量分光光度计测定纯化后 PCR 产物的浓度（ng/µL），用于后续 Gibson 组装的计算。
7. 在下次上课前，设计 Gibson 组装反应的配方（参见 补充文件 2 和 补充文件 4）。

3. 学生实验 B：Gibson 组装、转化与克隆筛选

1. 根据设计的配方移取Gibson Assembly反应液。将反应在50℃孵育 °C 反应 15 分钟。在反应孵育的同时，通过解冻感受态细胞来准备转化 大肠杆菌 冰上的细胞
2. 将2 µL Gibson Assembly产物通过热激法转化至感受态细胞中。取100 µL转化后的细胞，分别接种于两块选择性培养板上，并用灭菌玻璃珠涂布均匀。准备10^-4, 10^-5，和10^-6 将剩余细胞在LB（Luria-Bertani）琼脂培养基上进行系列稀释。取每种梯度稀释液100 µL接种于LB平板（无筛选压力）上，并用灭菌玻璃珠涂布均匀。
   注意： 此步骤可用于计算转化效率。
3. 37℃下将培养板孵育过夜 °C. 将培养板置于 4℃ 保存 °直至下一次上课时间。
4. 计数所有平板上的菌落，并按照说明计算转化效率 补充文件 2. 从任一选择性平板上挑取四个菌落，重新划线接种于一个新的选择性平板上，并将该平板在37℃下培养 °C 过夜。
   注意： 这可作为您阳性克隆的备份培养物。
5. 使用记号笔，与学生一起在选择平板上选取、圈出并标记四个不同的菌落’s 的首字母和一个数字（例如 ABC1）。取一个新的含抗生素的 LB 琼脂平板，用记号笔将平板分为四个象限（即四等分），然后用每个菌落的大约一半在相应标记的象限上重新划线，另一半用于接种 5 mL 液体 LB 培养基，每种挑选的四个菌落各一管。务必在试管上标记对应的菌落编号（例如 ABC1），并加入正确浓度的抗生素用于筛选。将液体培养物置于 37℃ 摇床培养箱中培养 °C，将琼脂平板置于37℃恒温培养箱中静置培养 °C；将液体培养物和培养皿置于 4℃ 保存 °直至下一节课开始。

4. 学生实验 C：质粒提取与筛选

1. 使用质粒小提试剂盒从实验B的液体培养物中提取质粒DNA。测定所提取质粒的浓度（单位：ng/µL）。
2. 设计限制性酶切或PCR检测方法，用于分析提取的质粒（详见补充文件2中的详细说明，以及补充文件5中的报告要求）。
3. 按照预先设计的反应体系配制限制性酶切反应或其他反应体系，并在先前设计的温度和时间条件下进行孵育。
4. 通过琼脂糖凝胶电泳分析结果。

5. 评估

1. 让参与的学生完成选择题课后问卷补充文件 7Gibson组装模块完成后召开实验室组会。
2. 合并所有前测和后测问卷的应答数据以进行分析。
   1. 通过使用双尾配对t检验，分析各问卷中每个单项内容问题平均得分增长的统计学显著性 t-测试与科恩’s d 效应量
   2. 评估学生对每个独立术语和技能的自信程度提升，以确定变化程度及其统计学显著性。
   3. 通过使用标准化学习增益（NLG）和非配对分析，确定学生背景和学术因素对学生学习的影响 t-测试。
   4.  评估学生’ 通过评估平均得分，了解对项目体验和分子生物学职业的态度。

结果

学生在克隆实验中的成功率
在每次吉布森组装模块的教学实施中（2019年、2022年和2023年），学生均被要求提交一份总结其研究结果的报告。2019年，44名学生中有36名（81.8%）报告称，根据他们为实验C设计的筛选结果，成功完成了质粒克隆。2022年，20名学生中有14名（70.0%）报告成功克隆了指定的构建体；而在2023年的团队项目中，27名学生中有12名（44.4%，即8个小组中的4个）根据其筛选分析结果报告了克隆成功。学生报告中的结论由授课教师或学生研究人员进行审核；若发现筛选结果不支持其结论，则对学生的解释进行纠正。每种不同的质粒各取一个样本进行Sanger测序分析，结果证实2019年所有15种目标质粒以及2022年所有12种质粒的插入片段序列均正确无误。2023年则采用Oxford纳米孔全质粒测序技术对全部8种质粒进行分析，但仅有8种中的1种质粒序列与预期一致。

基于内容的分子生物学概念评估
问卷的内容部分包含10道多项选择题，用于测试学生对分子生物学和分子克隆概念的理解。对全部10道内容题目的前后测平均得分进行比较，结果显示得分从63.7%显著提高到80.4%（p < 0.05，双侧配对t检验；图4），表明Gibson Assembly独立项目提升了学生对分子生物学和克隆概念的理解。Cohen’s d 检验结果显示，这一显著提升对应较大的效应量（d = 0.891），支持学生在内容题目上的前后回答之间存在显著差异。

图4：独立项目实施后学生对分子生物学与分子克隆理解能力的提升 独立项目完成前后学生对分子生物学与分子克隆知识测试问题回答情况的箱线图（样本量， n，共46项；Gibson Assembly 实验前后问卷 补充文件 6 和 补充文件 7，分别）。通过双尾配对t检验分析平均前后测分数 t检验，表明学生正确回答的比例显著增加（p < 0.5）。方框表示得分的中间50%（即25^th 至 75^th 百分位数），须线表示最低和最高得分（%）。 请点击此处以查看此图的放大版本。

接下来，我们分析了前后测问卷中每个单项内容问题的平均得分提升是否具有统计学显著性。采用双尾配对t检验的分析结果显示，学生在PCR反应、DpnI限制性酶切、Gibson Assembly酶、以及Gibson Assembly插入片段和载体序列相关问题上的回答得分在完成独立项目后均有显著提高（p < 0.05）。与整体内容平均得分63.7%相比，这些基于知识点的问题在前测问卷中的得分相对较低，其中关于DpnI酶切和Gibson Assembly酶的问题得分最低（分别为34.8%和47.8%）。完成项目后的后测平均得分分别提高至71.7%和89.1%，更接近整体内容部分的平均得分80.4%。这些数据表明，到项目结束时，学生对DpnI酶切和Gibson Assembly酶的理解程度提升明显，其效应量大于问卷中整体内容部分的平均水平（d = 0.982）。

分子生物学术语和实验技术态度评估
学生问卷中的态度问题分为两个部分。第一部分要求学生对七个分子生物学术语的知识掌握程度进行自我评估，评分范围为1–4分（1分表示“完全不知道该术语的含义”，4分表示“了解该术语的含义，并能轻松向他人解释”）。这些术语的平均自信评分从3.52显著提高到3.87，效应量大（p = 5.32 × 10^-15，d = 1.40；图5A）。第二部分态度评估要求学生针对“我能够熟练操作……”这一陈述，对十一种不同的分子生物学实验技术进行认同度评分，评分范围为1–5分（1分表示“强烈不同意”，5分表示“强烈同意”）。学生对这十一种技术的平均自信评分从3.82显著提升至4.33，效应量大（p = 2.08 × 10^-11，d = 1.09；图5B）。

图5：学生在完成独立项目后，对其分子生物学与克隆相关术语及技术的理解信心显著增强。 分子生物学学生信心的箱线图（A）术语和（B预问卷和后问卷中的技术（Gibson Assembly 预问卷和后问卷） 补充文件 6 和 补充文件 7，分别）。对于术语置信度（图示面板 A），学生在四点量表上选择其自信程度（1—“我完全不知道这个术语的含义”到4—“我知道这个术语的含义，并能轻松地向他人解释”；样本量 n 45）中。实验技术信心（面板 B) 采用五级评分法进行评估（1-强烈不同意到5-强烈同意；样本量 n 42）。平均前测与后测得分通过双尾配对检验进行分析 t-测试，表明学生在学期和实验技术数据集方面的自信心均有显著提升（p < 0.5）。方框表示中间50%的数据（即25^th 至 75^th 百分位数，须线表示最小值和最大值的主观信心评分。 请点击此处查看此图的放大版本。

我们评估了学生对每个独立术语和技术的信心提升情况，发现除DNA聚合酶和转化（transformation）外，所有术语的信心均有统计学意义上的显著提高（p < 0.05，双尾配对t检验；表1）。除一名学生外，其余所有学生在前后两次问卷调查中均对“DNA聚合酶”这一术语选择了“我理解该术语的含义，并能轻松向他人解释”这一选项，因此该术语的信心评分无提升空间（表1）。对于“转化”这一术语，前测中有73.91%的学生选择了最高信心等级（量表上的4级），后测中该比例为80.4%。在评估的11项实验技术中，有9项显示出学生信心的显著提升，未达显著性的两项为摩尔浓度计算（molarity calculations）和凝胶电泳（gel electrophoresis）（表1）。平均而言，学生在这两项技术上的前测评分较高（分别为4.71和4.57，而技术平均分为3.81），表明学生在开展Gibson组装项目之前已对这些技术具备较高信心。评估学生在一般生物学问题（如DNA聚合酶、凝胶电泳、摩尔浓度计算）方面信心的问题，总体上未显示出统计学意义上的显著变化（表1）。然而，所有与Gibson组装相关的专门问题均表现出显著的信心提升，且效应量最大（d > 1.6），其中“Gibson组装”这一技术在学生信心提升方面变化最为显著（表1和图6）。

内容类型	术语/技术	平均问卷评分		统计显著性		效应量 (d)
		前测	后测	p 值	是/否
普通生物化学	DNA Polymerase Term	3.98	3.98	undefined	否	0
	Molarity Calculations Technique	4.71	4.77	4.45E-01	否	0.130
	Gel Electrophoresis Technique	4.57	4.68	1.68E-01	否	0.254
分子克隆	Designing Primers Technique	3.05	3.57	7.23E-04	是	0.536
	In silico cloning Technique	3.61	4.07	5.75E-04	是	0.533
	Blue-white screening Term	3.59	4.34	4.10E-06	是	0.655
	PCR Screening Term	3.78	4.31	1.02E-06	是	0.936
	Gibson Assembly Term	2.87	3.78	7.41E-13	是	1.69
	Gibson Assembly Technique	2.59	4.20	1.14E-15	是	1.61

表1：针对分子克隆相关态度问题的显著提升，而普通生物化学方面则无显著变化。 预问卷和后问卷的平均分（Gibson Assembly 预问卷和后问卷中的） 补充文件 6 和 补充文件 7，分别用于特定术语和术语问题。双尾配对 t-检验用于评估显著性（如果 p < 0.05，是；如果 p ≥ 0.05，无差异）。对于“DNA聚合酶”这一术语，学生在问卷前测与后测中的回答完全相同，因此 p 未定义。使用Cohen’s方法确定学生在每道前测与后测问题上回答差异的效应量 d 值（d ≥ 0.8 被认为是较大的效应量。效应量越大，样本集中干预前与干预后反应存在差异的可能性就越高。样本量 n 分别为45和42。缩写：AVG = 平均值。

图6：关于Gibson组装的态度类问题的提升情况。 学生在前测与后测问卷中对Gibson组装（A）术语和（B）技术的信心回应数量。术语信心的作答采用四分制量表（1-“我完全不知道这个术语的含义”到4-“我知道这个术语的含义，并能轻松向他人解释”）。实验技术信心的作答范围为1-强烈不同意到5-强烈同意。 请点击此处查看此图的放大版本。

接下来，我们评估了学生背景因素是否会影响其从独立项目中获得的学习效果。已有研究表明，在本科STEM课程中，由于性别的差异，学业成就认知¹⁹和实际表现²⁰的差距持续存在；因此，我们采用标准化学习增益（NLG）和非配对t检验，来判断在这些独立项目中是否也存在类似的性别差异。根据这些统计检验结果，我们未发现学生性别对其学习成果具有显著影响。我们还进一步检验了专业、GPA、先前课程成绩以及在BIO/CHEM 475课程中的最终成绩等学术因素是否与学生在独立项目中的学习成果存在显著关联。尽管主修生物化学的学生（补充表S1和补充表S2）具有更高的GPA和课程最终成绩，且各自的平均NLG也较高，但非配对t检验显示，这些个体背景因素与学习成果之间并无统计学上的显著差异。此外，我们还使用非配对t检验分析了2022年与2023年两届学生群体在NLG上的差异。结果显示，2023年学生群体在内容相关问题上的学习增益显著高于2022年群体（补充表S3）。这表明，尽管2023年学生群体的克隆实验成功率较低，但他们对分子生物学和分子克隆概念的理解程度却优于2022年群体。尽管造成这一差异的具体原因尚不明确，但这些数据表明，在本教学模块中，克隆实验的成功并非实现有效教学的必要条件。

除了评估学生对实验技术的掌握程度外，我们还考察了他们对项目体验以及分子生物学职业的态度。一个在项目开始前和结束后评估中均出现的问题，用于衡量学生对从事涉及分子生物学技术职业的接受程度。结果显示，该项目显著提升了学生对分子生物学职业的接受度（p = 8.46 × 10^-5），在1–5分的评分标准下，平均得分从3.60分提高到4.09分。此外，项目结束后的问卷还调查了学生为最大化学习效果所付出的努力程度，以及他们对项目价值的评价。受访者对其投入程度的平均评分为4.48分，认为该项目是一次极具价值的学习机会，平均评价得分为4.73分。综合来看，这些发现凸显了独立项目在促进学生学术成长、增强其对分子生物学领域热情与信心方面的价值。

补充表 S1：匿名原始数据。 2022年和2023年Gibson组装CURE模块实施过程中收集的所有学生的问卷前后测答案及其专业信息。请参考补充文件6和补充文件7分别查看对应的前测和后测问题。请点击此处下载该表格。

补充表 S2：不同专业学生在问卷各部分标准化学习增益上的差异。 非配对 t 检验结果显示，各类问题在不同专业间的标准化学习增益（NLG）均无显著差异（p < 0.05）。请点击此处下载该表格。

补充表 S3：问卷各部分不同队列的标准化学习增益差异。 非配对 t 检验显示，2023 年队列在内容相关问题上的标准化学习增益（NLG）显著高于 2022 年队列（p < 0.05）。请点击此处下载该表格。

补充文件1：Gibson组装CURE模块的教学指南 本指南为教师实施Gibson组装CURE模块提供指导。指南中逐步说明了教师如何根据感兴趣的模板设计并筛选Gibson组装引物，以完成课程准备工作。同时列出了教师在实验A–C的每次讲座和实验课期间应涵盖的主题与活动内容。请点击此处下载该文件。

补充文件2：Gibson组装CURE模块的学生手册。 提供给学生的手册，包含Gibson组装的相关背景信息以及每个实验（A–C）的分步操作方案。请点击此处下载该文件。

补充文件3：实验A规划工作表（个人与团队）。 供学生理解并准备用于Gibson组装片段的PCR扩增的个人及团队工作表。教师应根据独立项目的形式（个人或团队）选择其中一份工作表进行分配。请点击此处下载该文件。

补充文件4：实验B规划工作表。 学生用工作表，用于辅助完成Gibson组装反应设置所需的计算。工作表中片段的数量可根据目标质粒的克隆设计进行调整。请点击此处下载该文件。

补充文件5：实验C设计工作表。 学生用工作表，用于辅助设计限制性酶切或PCR实验，以筛选目标质粒。请点击此处下载该文件。

补充文件6：Gibson连接预调查问卷。 在Gibson连接CURE模块开始前提供给学生的28道问题的调查问卷。请点击此处下载该文件。

补充文件7：吉布森组装实验后问卷。在完成吉布森组装课程相关实验模块后发放给学生的三十道题问卷。请点击此处下载该文件

补充文件 8：包含聚酮羟化酶基因、pUC19 载体和 Gibson 组装质粒的 GenBank (.gb) 序列文件，以及代表性引物列表的压缩文件夹。 可参考这些文件在 Benchling 组装向导中进行示例性引物设计，并完成实验规划工作表。请点击此处下载该文件。

讨论

本文提出了一项可在本科教学实验室中灵活实施的研究型课程项目，旨在通过Gibson组装技术向学生教授分子克隆。在课堂教学环境中，本科生共成功构建了28种新型质粒。在三个教学批次中，学生个体报告的实验成功率介于44.4%至81.8%之间，总体克隆成功率为80%（共分配35个质粒，其中28个成功克隆）。2023年的克隆成功率较低，可能由两个叠加因素导致。首先，模板DNA样本管的标签名称极为相似，可能导致学生研究人员在准备DNA模板时发生混淆，进而在教学实验室的Gibson组装反应中引入了不兼容的线性片段。在该项目未来的实施中，应在将模板DNA提供给学生前，先通过测序或限制性酶切进行验证，以确认其正确性。其次，2023年的项目采用了四片段组装（一个载体和三个插入片段），而此前年份均为两片段组装（一个载体和一个插入片段）。由于Gibson组装中片段数量增加会降低反应效率²²，这可能也导致了本次项目成功率的下降。在未来的项目迭代中，可通过增加冗余设计来提高成功率，例如安排多个小组克隆同一质粒，或让各小组在不同插入片段与载体比例下设置多个Gibson组装反应，以提高质粒连接与转化成功的可能性。此外，在片段之间设计更长的重叠区域，并延长Gibson组装反应的孵育时间，可能有助于提高包含4–6个片段的组装成功率²³。

除了克隆新型质粒外，项目前后调查结果表明，学生对分子生物学和分子克隆概念的理解能力有所提高，其中对Gibson Assembly克隆相关问题的提升效果最为显著。此外，大多数参与评估的学生在完成项目后，自我报告的对分子生物学术语和实验技术的信心也显著增强。Gibson Assembly是一种在学术研究和生物技术行业中广泛应用的重要且灵活的分子克隆技术²。通过在实验课程中讲授这些概念和实践技能，所有本科生在进入职场或继续深造时，都有平等的机会以具备科研能力和就业所需技能毕业。

所述的Gibson组装课程包含了成功实施课程相关本科研究经历（CURE）的五个要素⁴。学生通过自主设计实验方案参与科学实践，方案内容包括基于PCR扩增片段大小和限制性酶切位点设定的目标与预期（补充文件3、补充文件4和补充文件5）。该独立项目通过将每个所需DNA片段的制备任务分配给小组内不同成员，最终将各成员制备的片段共同用于一次连接反应，从而促进学生之间的协作（见补充文件3中的实验A计划工作表（团队合作版））。这些独立项目旨在构建的质粒是具有课堂外研究相关性的新型表达质粒，有可能为可发表的研究提供数据支持。与更传统的科研经历类似，该CURE课程中的克隆成功率并非100%。学生被要求评估可能导致阴性结果的各种变量，并提出解释质粒未能成功克隆的假设，这为学生提供了关于科研结果真实性的一手学习体验。

在本迭代的Gibson组装CURE课程中，学生克隆了与放线菌门（Actinomycetota）天然产物研究相关的质粒；然而，该实验流程被设计为也可高度适配于其他项目。本文所呈现的实验方案具有通用性，使学生能够在六次实验课和两次讲座内完成可用于多种研究目的的质粒克隆。该教学框架既允许学生 individually 克隆全新的质粒，也支持以团队合作方式共同完成由 >2 个线性片段组成的单一质粒的克隆。总体而言，该方法可根据需要灵活调整，适用于各类需不同程度应用Gibson组装技术的研究项目。

本研究通过基于课程相关研究的（CURE）方法评估了学生在学习吉布森组装技术过程中的学习成效提升，但若进一步扩展研究范围，还可获得更深入的见解。尽管前后问卷的形式能够评估独立项目对学生学习成果的影响，但本研究尚未将该方法与基于课堂讲授的吉布森组装教学方式进行比较。若将基于实验的CURE模式与基于讲授或更传统的实验活动（即实验结果已为学生预先设计好）进行对比，将有助于进一步明确吉布森组装学习效果的提升是否特异于CURE课程模型。最后，尽管部分与吉布森组装相关的内容问题显示出学生理解程度的显著提高，但其他问题并未表现出类似改善。例如，关于吉布森组装中使用的同源重叠序列、其引入方式以及在吉布森组装克隆反应中如何发生重组的问题，学生掌握情况未见提升。这表明，在未来该课程的实施中，针对这些主题提供更详细的解释或增加额外的学习评估，可能有助于提升学生的理解水平。

Gibson 组装独立项目结构将继续在加州理工学院实施。在课程的后续迭代中，该项目将进行调整，以增强学生的自主性、假设提出能力和实验设计能力。加州理工学院即将进行的课程改革为延长独立项目提供了机会，使其涵盖由学生主导的引物设计、载体骨架选择、序列分析和/或质粒的下游检测（例如蛋白质表达）。此外，还可根据正在进行的研究项目需求，对独立项目进行定制，以教授其他相关的分子生物学技术，如定点突变或基因编辑。改变学生在独立项目中所使用的技术，有助于更清晰地判断哪些主题适用于课程相关本科研究体验（CURE）模式，哪些主题在实施中存在困难。

综上所述，本报告详细介绍了一种可灵活调整的吉布森组装（Gibson Assembly）教学模块，该模块采用课程相关本科研究经历（CURE）模式，旨在加深学生对新兴克隆技术的理解，并提升其在科学研究流程中的能力。独立科研项目显著改善了学生在大多数评估的分子生物学术语和技术方面的学习效果与自信心。我们鼓励对该教学模块进行使用和调整，不仅用于构建新的研究质粒，还可提高学生对科研技术的可及性与掌握程度，从而更好地为本科生未来在 STEM 领域的职业发展做好准备。理想情况下，本研究将推动分子生物学课程体系的改进，并促进 STEM 课程随着科学研究方法的不断发展而持续优化。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
脱氧核糖核苷三磷酸（dNTPs，10  mM）	Fisher Scientific	FERR0191	自制 MasterMix 组分
二硫苏糖醇（DTT）	Fisher Scientific	FERR0861	自制 MasterMix 组分
DpnI	新英格兰生物实验室（New England Biolabs）	R0176S	1000 单位
Fisherbrand Isotemp 微生物培养箱	Fisher Scientific	15-103-0513
FisherBrand Isotemp 水浴锅	Fisher Scientific	S28124
GelRed 核酸凝胶染料	Biotium	NC9594719	10,000X
GeneJET 凝胶回收与DNA纯化微量试剂盒	Thermo Scientific	FERK0831	100 次
GeneRuler 1 kb DNA Marker	Fisher Scientific	FERSM0314	100 次应用
LB 培养基（Miller配方）	Fisher BioReagents	BP9723-500	500 g
六水合氯化镁	Fisher Scientific	BP214-500	自制 MasterMix 组分
Mastercycler nexus X2 梯度PCR仪	Eppendorf	6337000027
Microfuge 16 离心机	Beckman Coulter	A46474
Micromonospora echinospora 菌株	美国模式培养物集存库（American Type Culture Collection）	ATCC 15837
微波炉	通用电气（General Electric ）	2440640
分子生物学级琼脂糖	Fisher BioReagents	BP160-100	100 g
Nanodrop One 微量分光光度计	Thermo Scientific	13-400-518
NEB 5-alpha 感受态大肠杆菌	New England Biolabs	C2987H	20 × 0.05 mL
NEBuilder HiFi DNA Assembly Master Mix	New England Biolabs	E2621S	10 次反应
New Brunswick Innova 40 台式轨道摇床	New Brunswick	M1299-0090
无核酸酶水	Fisher BioReagents	BP248450	50 mL
PEG-8000	Fisher Scientific	BP233-100	自制 MasterMix 组分
Phusion DNA 聚合酶	New England Biolabs	M0530	自制 MasterMix 组分
便携式天平	Ohaus	SKX123
pUC19 载体	New England Biolabs	N3041S
Q5 高保真 2x Master Mix	New England Biolabs	M0492S	100 次反应
T5 核酸外切酶	Epicentre	T5E4111K	自制 MasterMix 组分
Taq DNA 连接酶	New England Biolabs	M0208	自制 MasterMix 组分
Tris-HCl	Fisher Scientific	AAA1137918	自制 MasterMix 组分
TriTrack DNA 上样缓冲液（6x）	Thermo Scientific	FERR1161	5 × 1 mL
Zyppy 质粒小提试剂盒	Zymo Research	D4019	100 次
β-烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD+）	New England Biolabs	B9007S	自制 MasterMix 组分