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使用CIRCLE-Seq检测基因编辑脱靶效应

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DOI：

10.3791/67069

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2024年11月1日

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1Department of Dermatology, University of Colorado School of Medicine, Anschutz Medical Campus, 2Gates Institute, University of Colorado School of Medicine, Anschutz Medical Campus, 3Department of Biochemistry and Molecular Genetics, University of Colorado School of Medicine, Anschutz Medical Campus

本文内容

摘要

CRISPR等技术面临的一个重大障碍是脱靶效应，其可能破坏重要基因。“环化用于 体外 通过测序报告切割效应（CIRCLE-seq）是一种用于鉴定非预期切割位点的技术。该方法能够以高灵敏度且无偏倚地绘制CRISPR-Cas9的全基因组活性图谱。

摘要

环化处理用于 体外 通过测序报告切割效应（CIRCLE-seq）是一种新型技术，旨在通过靶向测序CRISPR-Cas9切割的DNA，无偏倚地识别CRISPR-Cas9的非预期切割位点。该方案包括将基因组DNA（gDNA）环化，随后用Cas9蛋白和特定的向导RNA（gRNA）进行处理。处理后，纯化被切割的DNA并构建Illumina测序文库。测序过程产生成对末端读段，为每个切割位点提供全面的数据。相较于其他方法，CIRCLE-seq具有多项优势 体外 方法包括最低测序深度要求、低背景信号以及对Cas9切割的基因组DNA的高富集度。这些优势提高了检测CRISPR-Cas9预期和非预期切割事件的灵敏度。本研究提供了利用CIRCLE-seq全面分析CRISPR-Cas9脱靶活性的逐步实验流程。作为示例，本方案通过在全基因组范围内绘制CRISPR-Cas9在修饰特定基因过程中产生的非预期切割位点进行验证 AAVS1 位点。整个CIRCLE-seq流程可在两周内完成，足以留出充分时间进行细胞培养、DNA纯化、文库构建及Illumina测序。将测序数据输入CIRCLE-seq分析流程，有助于对切割位点进行高效、系统的解读与分析。

引言

过去二十年中，基因组工程取得了显著进展，其中一个重要里程碑是2012年发现成簇规律间隔短回文重复序列（CRISPR）-Cas9系统1。利用细菌DNA内切酶的可编程特性，CRISPR-Cas9技术能够精确靶向并修饰几乎任何DNA序列。自问世以来，该系统已优化为仅依赖Cas9内切酶和一条向导RNA（gRNA）即可编辑特定基因组区域。CRISPR-Cas9作为治愈性疗法的潜力已在多项临床试验中得到验证，涉及的疾病包括莱伯先天性黑蒙症、转甲状腺素蛋白淀粉样变性、镰状细胞贫血等2,3,4。

CRISPR-Cas9 会诱导产生双链断裂（DSBs），这类断裂通常通过两种机制之一进行修复：易错的非同源末端连接（NHEJ）或更精确的同源定向修复（HDR），后者需要提供模板DNA。CRISPR-Cas9 倾向于引发与 NHEJ 相关的插入和缺失（indels），并可能在非预期的基因组位点发生切割，这限制了其在临床环境中的应用5,6,7,8,9,10。此外，非预期的基因组修饰可能导致隐蔽性剪接位点的产生、无义或错义突变、诱导染色体碎裂，或赋予细胞致癌潜能——这些结果已在多项基因组编辑试验中被观察到11,12,13,14,15。综上所述，准确识别 CRISPR-Cas9 的脱靶活性对其临床应用至关重要，特别是在可能改变数十亿细胞的全身性基因治疗中。

可采用多种方法来鉴定CRISPR-Cas9的脱靶切割位点，其中包括全基因组无偏双链断裂识别技术（Genome-wide Unbiased Identification of Double-stranded breaks, GUIDE-seq16），该方法利用双链寡脱氧核苷酸在活细胞中标记双链断裂（DSB）。然而，该方法的一个缺点是可能因随机产生的双链断裂或PCR伪影而出现假阳性结果，因此需通过排除与靶上位点相似性较差的捕获位点来剔除这些干扰。基于整合酶缺陷型慢病毒载体（Integrase-Defective Lentiviral Vector, IDLV）的方法灵敏度较低，很可能遗漏大量脱靶位点17。其他原位（in situ）方法如DSBCapture、BLESS和BLISS18,19,20涉及固定细胞并直接标记双链断裂，但受限于必须立即捕获双链断裂且无法引入外源DNA。Digenome-seq21是一种体外（in vitro）方法，而通过测序选择性富集和鉴定标记基因组DNA末端（Selective enrichment and Identification of Tagged genomic DNA Ends by sequencing, SITE-seq）22则均提供基于测序的解决方案，但分别存在背景噪声较高和仅支持单端测序分析的局限性。通过测序发现原位Cas脱靶并进行验证（Discovery of in situ Cas off-targets and verification by sequencing, Discover-Seq）23可通过MRE11结合实现Cas9活性的体内（in vivo）和原位（in situ）检测，但仅能识别样本制备时刻存在的双链断裂24。最后，CRISPR编辑推断法（Inference of CRISPR Edits, ICE）采用生物信息学方法，利用Sanger测序数据对CRISPR编辑进行稳健分析25。

本文描述了一种用于环化的详细步骤 体外 通过测序报告切割效应（CIRCLE-seq）：一种 体外 一种灵敏且无偏倚的技术，可全面绘制Cas9核酸酶在与目标gRNA形成复合物时的全基因组脱靶活性26该方法首先培养目标细胞并分离DNA，随后通过聚焦超声处理进行随机剪切，再经过外切酶和连接酶处理。此过程最终生成环状双链DNA分子，接着通过质粒安全型DNase处理进行纯化。所得环状DNA随后与Cas9-gRNA复合物孵育，该复合物在预期和非预期的切割位点均进行切割，暴露出可作为Illumina接头连接底物的DNA末端。该过程产生一个包含每个核酸酶诱导的双链断裂（DSB）两端序列的多样化基因组DNA（gDNA）文库，确保每条测序读段均包含每个切割位点所需的全部信息。这使得CIRCLE-seq能够使用Illumina测序技术，并对测序覆盖度要求较低，从而区别于上述其他类似方法。需要指出的是，尽管CIRCLE-seq在脱靶检测灵敏度方面优于其他现有方案，但其 体外 该方法的缺点是由于缺乏其他方法（如 GUIDE-seq）中存在的表观遗传环境，导致假阳性率较高16此外，CIRCLE-seq 中不存在双链断裂（DSB）DNA 修复及其相关机制，因此不会出现通常可观察到的插入缺失（indels）或正确的修复结果。

除了描述执行 CIRCLE-seq 的逐步实验方案外，本方案还通过鉴定 CRISPR-Cas9 在修饰 AAVS1 位点过程中产生的全基因组范围内的非预期切割位点，对该方法进行验证。这一易于遵循的实验流程提供了从诱导性多能干细胞（iPSCs）培养和基因组 DNA（gDNA）提取，到 gDNA 环化、Cas9-gRNA 切割、文库构建、测序及分析流程的详细操作说明。由于对测序覆盖深度的要求较低，任何具备二代测序条件的实验室均可开展 CIRCLE-seq 实验。

方案

本研究中所用试剂、耗材和设备的详细信息见材料表。

1. 细胞培养（5 天）

  1. 在整个实验方案中设置阴性对照。准备足够的细胞，以获得额外的 25 μg 基因组 DNA（每个样本约 2.0e7 个细胞）。
  2. 根据既定方案培养诱导多能干细胞（iPSCs）27。收集细胞并将其重悬于 10 mL 磷酸盐缓冲液（PBS）中。取 6 μL 细胞样品，按 1:1 比例与台盼蓝混合。使用自动细胞计数仪对样品进行计数。
  3. 将 2 × 107 个细胞分装至每根离心管中，在 25 °C（室温，RT）下以 300 × g 离心 3 分钟。此步骤适用于多个重复样本。用移液器吸除并弃去上清液。

2. 基因组DNA提取（1天）

  1. 按照制造商的说明，使用市售的DNA纯化试剂盒分离基因组DNA（gDNA）：
    1. 向含有细胞沉淀的15 mL锥形管中加入200 µL PBS并重悬。然后，用移液器加入3 mL细胞裂解缓冲液和15 µL蛋白酶K。颠倒混匀25次，充分混合。将管子置于设定为55 °C、150 rpm的水浴摇床中孵育3小时，或过夜以获得最佳DNA得率。
    2. 加入15 μL RNase A，颠倒混匀25次。在37 °C水浴中孵育1小时。
    3. 将样品在冰上冷却5分钟。然后加入1 mL蛋白质沉淀溶液，高速涡旋振荡20秒，并在室温下以2000 x g离心10分钟。蛋白质应在管底形成可见的致密沉淀。若沉淀不可见，则将样品在冰上再孵育5分钟，并再次离心。
    4. 在新的15 mL锥形管中加入3 mL 100%异丙醇。小心地将步骤2.1.3中的上清液移入该管中。颠倒混匀50次，然后在室温下以2000 x g离心3分钟。使用连接真空泵的巴斯德吸管小心吸除上清液，避免扰动DNA沉淀，并将管子倒置在干净无绒的擦拭纸上。
    5. 向DNA沉淀中加入3 mL 70%（v/v）乙醇，颠倒10次进行洗涤。在室温下以2,000 x g离心3分钟，然后小心倾去上清液。
    6. 保持管口敞开，使所得DNA沉淀在空气中干燥30分钟，确保所有乙醇完全挥发。加入50 μL DNA水合溶液，通过轻柔移液充分混匀。
    7. 将样品置于65 °C水浴摇床中1小时以溶解DNA，随后在室温下静置过夜。在室温下以2,000 x g离心1分钟，并使用dsDNA BR检测试剂盒及配套离心管，结合荧光计对分离的DNA进行定量。

3. gRNA 的制备（7 天）

  1. 从商业来源订购所需的合成gRNA（参见材料表）。本方案也适用于crRNA/tracrRNA。

4. gRNA 体外 裂解试验

注意：此处以 AAVS1 基因为靶点。若要靶向其他目的基因，请设计引物（表1）以扩增目标区域，并在后续步骤中用自定义引物替换相应引物。

  1. 准备PCR反应：将25 μL Phusion Hot Start Flex 2x Master Mix（终浓度1x）、0.5 μL AAVS1 F引物（终浓度0.1 μM）、0.5 μL AAVS1 R引物（终浓度0.1 μM）、5 μL基因组DNA（100 ng，20 ng/μL，来自步骤2.1.6）以及19 μL无核酸酶水（H2O），混合均匀，总体积为50 μL。
  2. 使用以下热循环仪程序：变性：98 °C 2分钟（1个循环）；变性：98 °C 10秒（10个循环）；退火：72–62 °C（每循环降低1 °C）15秒（10个循环）；延伸：72 °C 30秒（10个循环）；变性：98 °C 10秒（30个循环）；退火：65 °C 15秒（30个循环）；延伸：72 °C 30秒（30个循环）；最终延伸：72 °C 5分钟（1个循环）；保存：4 °C长期保存。
  3. 使用AMPure XP磁珠纯化PCR产物。首先，向PCR产物中加入1.8倍体积（即90 μL）的XP磁珠，用移液器吹打混匀10次，室温孵育5分钟。
  4. 将PCR反应板置于磁力架上3分钟，使磁珠与溶液分离。小心吸除上清液并弃去。向磁珠中加入200 µL 80%乙醇（v/v），孵育30秒后吸除乙醇。重复此洗涤步骤两次，以确保乙醇完全去除。
  5. 将反应板继续置于磁力架上，让样品自然干燥3分钟。从磁力架上取下反应板，加入40 µL TE缓冲液（pH 8.0），上下吹打10次混匀。室温静置2分钟。
  6. 将PCR反应板再次置于磁力架上静置1分钟。1分钟后，将上清液转移至新的反应板中。使用分光光度计测定纯化后PCR产物的产量，并按照制造商说明，使用TapeStation系统配合光学管条、光学管条盖、High Sensitivity D1000 ScreenTape及High Sensitivity D1000试剂（包括标准品和缓冲液）进行分析。将制备好的样品于-20 °C保存，可稳定数月。
  7. 将Cas9核酸酶蛋白稀释至1 μM：在总体积20 μL中，混合2 μL 10x Cas9缓冲液（终浓度1x）、1 μL Cas9 Nuclease（S. pyogenes，终浓度1 μM）以及17 μL无核酸酶水（H2O）。
  8. 操作过程中需保持无RNase环境，以防止gRNA降解。将gRNA（来自步骤3.1）用H2O稀释至3 μM，总体积为10 μL。
    注意：可使用以下公式估算gRNA的分子量：单链RNA分子量（g/mol）=（单链RNA长度（nt）× 321.47 g/mol）+ 18.02 g/mol。作为参考，长度为104 nt、浓度为3 µM的gRNA，其浓度约为100 ng/µL。

5. DNA 片段化（3 小时）

  1. 首先对 ME220 进行控制臂归位，然后向储液罐中加入纯化去离子 H2O。在控制台笔记本电脑上打开 Water Works 软件，点击 Fill。将温度调节至 4.5 °C。
  2. 将 25 μg gDNA 转移至微量离心管（microtube-130 AFA Fiber Screw-Cap）中，再用 1× TE 缓冲液定容至 130 μL。采用以下条件将 DNA 剪切至平均长度约为 300 bp：设置 Duration 为 10 s，Peak Power 为 70，Duty Factor % 为 20，Cycles/Burst 为 50；上述参数将自动使 Avg Power 设定为 14.0。

6. 纯化剪切的基因组DNA（1小时）

  1. 将剪切的基因组DNA均分为两份，每份65 µL。使用1.8倍体积的XP磁珠（117 µL）进行纯化，操作步骤参照4.3–4.6。将上清液转移至新的PCR板中，并使用分光光度计测定浓度。
  2. 取1 μL洗脱后的剪切gDNA，按照仪器制造商的说明在TapeStation上进行检测，以确认gDNA已剪切为约300 bp的较宽分布片段。如有需要，可将剪切后的gDNA在-20 °C保存数月。

7. CIRCLE-seq 文库的制备（3 天）

  1. 发夹接头退火
    1. 重悬 oSQT1288（表1），发夹接头，加入至1x TE缓冲液中，终浓度为100 μM。
    2. 按下述步骤进行接头退火：将40 μL oSQT1288（终浓度40 μM）、10 μL 10x STE（终浓度1x）和50 μL无核酸酶水混合2总体积为100 μL。
    3. 使用以下退火程序：95 °C 预变性 5 分钟，随后进行 70 个循环的每分钟降低 1 °C，最后在 4 °C 无限期保存。
  2. 进行末端修复。使用无PCR高通量文库制备试剂盒（PCR-Free HTP Library Preparation Kit），配制末端修复主混合液。
    1. 混合 8 μL 无核酸酶水2O，7 μL 10x末端修复缓冲液（终浓度1x），以及5 μL末端修复酶混合物（总体积20 μL的末端修复主混合液）。
    2. 将20 μL末端修复预混液加入步骤4.3–4.6中剪切后的gDNA样本中。将20 μL末端修复预混液与50 μL剪切后的gDNA混合，终体积为70 μL。
    3. 将混合物置于20 °C的PCR仪中孵育30分钟，随后在4 °C长期保存。
    4. 加入1.7倍体积（即120 μL）的XP磁珠，按照步骤4.3–4.6进行纯化操作。用42 μL TE缓冲液（pH 8.0）洗脱。确保磁珠保持在溶液中，用于下一步反应。
  3. 进行A尾修饰。使用HTP文库构建（无PCR）试剂盒配制A尾修饰主混合液。
    1. 将5 μL 10x A尾缓冲液（终浓度为1x）与3 μL A尾酶混合（A尾主混合液总体积为8 μL）。
    2. 将8 μL A-tailing主混合液移液至来自步骤7.2.4的每个含有磁珠的DNA样本中，使8 μL A-tailing主混合液与42 μL含有磁珠的末端修复DNA混合（最终总体积为50 μL）。置于热循环仪中，30 °C反应30分钟，随后无限期置于4 °C保存。
    3. 将1.8倍体积（即90 μL）的PEG/NaCl SPRI溶液（HTP文库构建试剂盒（无需PCR；96次反应）组分之一）加入A尾化DNA中。按照步骤4.3–4.6纯化A尾化DNA。用30 μL TE缓冲液（pH 8.0）洗脱A尾化DNA。保留磁珠悬液用于下一步。
  4. 进行接头连接。使用HTP文库构建（无PCR）试剂盒配制接头连接主混合液。
    1. 将10 μL 5x连接缓冲液（终浓度1x）、5 μL DNA连接酶和5 μL第7.1.3步中退火的发夹接头（40 μM）混合，确保接头终浓度为4 μM，总体积为20 μL的连接反应主混合液。
    2. 将20 μL接头连接主混合液加入到每个含有第7.3.3步磁珠的洗脱DNA样本中（每样本终体积为50 μL）。
    3. 置于20 °C的PCR仪中反应1小时，随后在4 °C长期保存。
    4. 将1倍体积（或50 μL）的PEG/NaCl SPRI溶液转移至接头连接的DNA中，按照步骤4.3–4.6进行纯化。用30 μL TE缓冲液（pH 8.0）洗脱，并将上清液转移至新的半裙边PCR板中。合并DNA样品，使用dsDNA BR检测试剂盒定量。如需保存，可将纯化的接头连接DNA在-20 °C条件下储存长达1个月。
  5. 准备Lambda外切酶/外切酶I（大肠杆菌（E. coli） 主混合液（用于消除两端未连接接头的单链或双链DNA）。
    1. 取第7.4.4步中1 μg接头连接的DNA，稀释至40 μL。加入5 μL 10x外切酶I反应缓冲液（终浓度1x）、4 μL λ外切酶（终浓度0.4 U/μL）和1 μL外切酶I，混匀。E. coli)（终浓度 0.4 U/μL），总体积为 10 μL 的 Lambda 核酸外切酶/核酸外切酶 I 混合液。
    2. 将10 μL的Lambda外切酶/外切酶I预混液加入40 μL（1 μg）接头连接的DNA中（总体积为50 μL）。置于热循环仪中，37 °C反应1小时，然后75 °C加热10分钟，最后在4 °C长期保存。
    3. 移液1.8倍体积（或90 μL）的XP磁珠至经Lambda外切酶/外切酶I处理的DNA中。按照步骤4.3–4.6中的说明进行纯化。用40 μL TE缓冲液（pH 8.0）洗脱。确保磁珠保持在溶液中，以用于下一步酶促反应。
  6. 用USER酶和T4多核苷酸激酶（PNK）处理。配制USER/T4 PNK混合液（用于释放4 bp突出端，并制备后续连接反应所需的可连接DNA末端）。
    1. 将5 μL的10x T4 DNA连接酶缓冲液（终浓度1x）、3 μL的USER酶（终浓度0.05 U/μL）和2 μL的T4 PNK（终浓度0.4 U/μL）混合，总体积为10 μL的USER/PNK预混液。
    2. 将10 μL的USER酶/T4 PNK主混合液加入到步骤7.5.3中经λ和外切酶I处理并含有磁珠的40 μL DNA样本中，总体积为50 μL。置于PCR仪中37 °C反应1小时，随后在4 °C长期保存。
    3. 将1.8倍体积（或90 μL）的PEG/NaCl SPRI溶液加入经USER/T4 PNK处理的DNA中，按照步骤4.3–4.6进行纯化。用35 μL TE缓冲液（pH 8.0）洗脱。将上清液转移至新的半裙边PCR板中。使用dsDNA HS检测试剂盒合并并定量DNA。
  7. 进行分子内环化。 配制环化主混合液。
    1. 加入8 μL无核酸酶的H2O，10 μL 10x T4 DNA连接酶缓冲液（终浓度1x）和2 μL T4 DNA连接酶（终浓度8 U/μL），总体积为20 μL的环化主混合液。
    2. 将20 μL环化主混合液加入到500 ng经步骤7.6.3中USER/PNK处理的DNA中。用80 μL溶液稀释500 ng经USER/PNK处理的DNA，然后加入20 μL环化主混合液（总体积为100 μL）。在热循环仪中于16 °C孵育16小时（过夜）。
    3. 向环化DNA中加入等体积（1×体积）或100 μL的XP磁珠，按照步骤4.3–4.6进行纯化。用38 μL TE缓冲液（pH 8.0）洗脱。将上清液转移至新的半裙边PCR板中。
  8. 使用质粒安全型ATP依赖性DNase处理。 制备质粒安全型ATP依赖性DNase主混合液（用于降解残留的线性DNA）。
    1. 将5 μL 10x质粒安全反应缓冲液（终浓度1x）、2 μL ATP（终浓度1 mM）和5 μL 质粒安全ATP依赖性DNase（终浓度1 U/μL）混合，总体积为12 μL的质粒安全主混合液。
    2. 将12 μL ATP依赖性DNase主混合液加入步骤7.7.3中获得的38 μL环化DNA中（总体积为50 μL）。在PCR仪中37 °C孵育1小时，随后70 °C孵育30分钟，之后置于4 °C长期保存。
    3. 将1倍体积或50 μL XP磁珠加入经质粒安全型ATP依赖性DNase处理的DNA中，按照步骤4.3–4.6进行纯化。用15 μL TE缓冲液（pH 8.0）洗脱。将上清液转移至新的半裙边PCR板中。
    4. 将DNA混合并使用dsDNA HS检测试剂盒进行定量。如有需要，可将环化后的DNA在-20 °C保存数月。

8. 酶法纯化后环化基因组DNA的切割 体外 （2 小时）

  1. 执行 体外 利用Cas9:gRNA复合物进行切割。准备 体外 切割主混合液。将5 μL的10x Cas9缓冲液（终浓度为1x）与4.5 μL的 S. Pyogenes Cas9（终浓度90 nM）和1.5 μL gRNA（终浓度90 nM），总体积为11 μL的切割反应主混合液。
  2. 将切割主混合液在室温下放置10分钟，以形成Cas9:gRNA RNP复合物。
  3. 将步骤 7.8.3 中经质粒安全型 DNase 处理的 DNA 稀释至 125 ng，终体积为 39 μL。然后，向 39 μL 经质粒安全型 DNase 处理的 DNA 中加入 11 μL 切割反应主混合液，总体积为 50 μL。
    注意：此步骤中需包含一个阴性对照样本，该样本由环状DNA与Cas9缓冲液混合而成，不含Cas9:gRNA复合物。
  4. 在37 °C下于热循环仪中孵育1小时。随后无限期维持在4 °C。加入50 µL（1倍体积）的XP beads至反应体系中 体外-切割DNA，并按照步骤4.3-4.6纯化DNA。用42 µL TE缓冲液（pH 8.0）洗脱。确保磁珠保持在溶液中，用于下一步。

9. 下一代测序文库的制备（4 - 6 小时）

  1. 进行A尾添加。配制A尾添加主混合液。
    1. 将5 μL的10x A-tailing缓冲液（终浓度为1x）与3 μL的A-tailing酶混合（A-tailing预混液总体积为8 μL）。
    2. 将8 μL A-tailing预混液加入到42 μL含有第8.4步磁珠的洗脱DNA样本中（总体积为50 μL）。置于PCR仪中，30 °C反应30分钟，随后无限期保存于4 °C。
    3. 向A尾DNA中加入1.8倍体积的PEG/NaCl SPRI溶液（或90 μL），按照步骤4.3–4.6纯化DNA，用25 μL TE缓冲液（pH 8.0）洗脱。确保在后续步骤中保持磁珠处于溶液状态。
  2. 进行接头连接。配制接头连接主混合液。
    ​注意：必须制备NEB接头的单次使用分装 aliquot，以防止因反复冻融导致3' T'水解而形成接头二聚体。
    1. 将10 μL 5x连接缓冲液（终浓度1x）、5 μL DNA连接酶和10 μL测序接头（终浓度为3 μM）混合，总体积为25 μL。
    2. 将25 μL接头连接主混合液加入含有步骤9.1.3中磁珠的25 μL A尾化DNA样本中。放入恒温循环仪中，20 °C反应1小时，随后在4 °C长期保存。
    3. 将1倍体积或50 μL的PEG/NaCl SPRI溶液加入连接接头的DNA中，按照步骤4.3–4.6纯化DNA。用47 μL TE缓冲液（pH 8.0）洗脱。确保磁珠保持在溶液中，以用于下一步酶促反应。
  3. 使用USER酶进行处理（在尿嘧啶残基处产生单个核苷酸缺口）。
    1. 向步骤 9.2.3 中含有磁珠的接头连接 DNA 样本中加入 3 μL USER 酶（包含在双索引引物试剂盒中）。在 37 °C 下孵育 15 分钟。
    2. 向经过USER酶处理的DNA中加入35 µL（0.7倍体积）PEG/NaCl SPRI溶液，按照步骤4.3–4.6进行纯化。用20 µL TE缓冲液（pH 8.0）洗脱。将上清液转移至新的半裙边PCR板中，使用dsDNA HS检测试剂盒测定DNA浓度。预期浓度约为2–5 ng/µL。
  4. （可选）在进行下一步之前，可使用 PippinHT 进行 DNA 片段大小选择。请使用 1.5% 的 PippinHT 胶带，片段大小范围为 250–850 bp。所得样品可直接用于下一步的 PCR 反应。
  5. 进行PCR以添加条形码
    注意：确保每个样本所选的引物序列组合具有唯一性。如有可能，每个样本应具有独特的i5和i7标签序列。
    1. 配制用于添加成对索引条形码的PCR主混合液。混合5 μL无核酸酶水225 μL 的 2x HotStart Ready Mix（终浓度为 1x），5 μL 的 i5 引物（终浓度为 1 μM），以及 5 μL 的 i7 引物（终浓度为 1 μM）（总体积为 40 μL 的总混合液）。
    2. 将40 μL PCR预混液移液至第9.3.2步中经USER酶处理的10 μL纯化DNA（约20 ng）中（总体积为50 μL）。
    3. 请选择以下选项 PCR扩增循环条件：变性：98 °C，45秒，1个循环；变性：98 °C，15秒，20个循环；退火：65 °C，30秒，20个循环；延伸：72 °C，30秒，20个循环；最终延伸：72 °C，1分钟，1个循环；保存：4 °C，长期保存。
    4. 加入0.7倍体积（即35 μL）的XP磁珠至PCR产物中，按照步骤4.3–4.6进行纯化。用30 μL TE缓冲液（pH 8.0）洗脱。将上清液转移至新的半裙边PCR板中。如有需要，可将环化DNA在-20°C保存数月。
      注意：使用 Tapestation 对 PCR 样本进行检测，以控制文库质量并评估接头二聚体的形成情况。若检测到接头二聚体，请重复步骤 9.5.4。

10. 通过数字微滴PCR（dd_PCR）对CIRCLE-seq文库进行定量（6小时）

注意：定量也可通过 qPCR、Tapestation 或类似方法进行。

  1. 取5 μL来自文库（PCR步骤9.5.4）的DNA，与45 μL无核酸酶的TE缓冲液充分混合，然后在50 μL体积中对每个样本进行1:10系列稀释，稀释梯度从10-1至10-8。
    1. 配制dd_PCR主混合液储备液。将11 μL的2x dd_PCR探针混合液（终浓度为1x）、0.055 μL的探针oSQT1310（终浓度为250 nM）、0.055 μL的探针oSQT1311（终浓度为250 nM）、0.099 μL的引物oSQT1274（终浓度为450 nM）、0.099 μL的引物oSQT1275（终浓度为450 nM）以及6.292 μL无核酸酶水H2O混合，得到总体积为17.6 μL的dd_PCR主混合液。为所有样本配制主混合液，以确保移液体积足够并提高移液准确性。
    2. 对三个最低稀释度（10-6、10-7和10-8）的样本进行双复孔检测（使用96孔板）。必须设置无模板对照（NTC）。
    3. 按如下方式向每个样本孔中加入17.6 μL dd_PCR主混合液：将17.6 μL主混合液与4.4 μL样本混合（在NTC孔中加入等体积的无核酸酶H2O），最终反应体积为22 μL。密封反应板后，在室温下以2000 × g离心1分钟。
  2. 进行微滴生成、热循环及分析。使用微滴读取PCR系统，将DG8微滴生成卡盒（8孔）放入卡盒架中。在卡盒的油相孔行中加入70 μL探针用微滴生成油。
    ​注意：取步骤10.1.2中的20 μL样本加入8孔卡盒的样本孔行，盖上DG8橡胶垫圈，将卡盒放入微滴生成仪中并关闭盖子以启动自动微滴生成过程。完成后取出卡盒，将微滴孔行中的40 μL液体缓慢转移至半裙边96孔PCR板中，注意移液速度应缓慢。
    1. 将加热模块放入PX1 PCR板封膜机中。开启设备后，封膜机会自动加热至180 °C。将铝箔封膜贴在PCR板上，确保红色标记朝上。将PCR板放入PX1中，按下封膜按钮。
    2. 设置以下热循环程序：酶活化：95 °C孵育10分钟，1个循环；变性：94 °C孵育30秒，共40个循环；退火/延伸：60 °C孵育1分钟，共40个循环；酶失活：98 °C孵育10分钟，1个循环；保存：4 °C长期保存。
    3. 在微滴读取仪上打开配套软件，选择需要读取的孔位。实验类型选择ABS，探针检测选择dd_PCR Supermix。目标1选择Ch1 未知，目标2选择Ch2 未知。点击应用，然后点击确定。将PCR板放入微滴读取仪中，染料组选择FAM/HEX，点击运行。
  3. 分析dd_PCR结果。以阴性对照为参考，圈选双阳性微滴群体。计算双复孔数值的平均值，然后乘以稀释倍数和dd_PCR的5倍稀释因子。
    注意：每微升总拷贝数的计算公式如下：每微升总拷贝数 = 平均值 × 5 × 稀释倍数，其中“平均值”代表Ch1和Ch2的平均定量值。
  4. 将所有样本以等摩尔浓度合并为一个文库。合并后的1x文库应包含约4.5 × 109个分子，总体积为5 μL。

11. 下一代测序

  1. 提交样本进行 将测序工作外包给外部机构，并确保记录正确的接头序列。

12. CIRCLE-seq 数据分析（1 - 3 小时）

  1. 安装 Python 2.7 版本、Burrows-Wheeler Aligner (BWA) 和 SAMtools。从 http://hgdownload.cse.ucsc.edu/goldenPath/hg38/bigZips/hg38.fa.gz 下载参考基因组（例如 hg38）。
    注意：如果目标物种的基因组不可用，CIRCLE-seq 计算流程可以在无参考基因组模式下运行。在这种情况下，此步骤可以跳过。
  2. 使用以下命令下载并安装 CIRCLE-seq 分析流程：(1) git clone https://github.com/tsailabSJ/circleseq.git，(2) cd circleseq，(3) pip install -r requirements.txt。
  3. 创建一个 YAML 格式的清单文件（.yaml）。以下是一个示例清单，可用于 CIRCLE-seq 软件中提供的示例数据集，以测试该分析流程。
    注意：(1) 参考基因组：data/input/CIRCLEseq_test_genome.fa；(2) 分析文件夹：data/output；(3) bwa：bwa；(4) samtools：samtools；(5) read_threshold：<Value>；(6) window_size：<Value>；(7) mapq_threshold：<Value>；(8) start_threshold：<Value>；(9) gap_threshold：<Value>；(10) mismatch_threshold：<Value>；(11) merged_analysis: True；(12) samples: U2OS_EMX1；(13) target: GAGTCCGAGCAGAAGAAGAANGG；(14) read1: data/input/EMX1.r1.fastq.gz；(15) read2: data/input/EMX1.r2.fastq.gz；(16) controlread1: data/input/EMX1_control.r1.fastq.gz；(17) controlread2: data/input/EMX1_control.r2.fastq.gz；(18) description: U2OS。以下为所使用的清单参数值：read_threshold: 4，window_size: 3，mapq_threshold: 50，start_threshold: 1，gap_threshold: 3，mismatch_threshold: 6
  4. 定义参考基因组 FASTA 文件、分析输出目录，以及 BWA 和 SAMtools 命令的路径。定义靶序列，以及核酸酶切割样本和对照样本的去复用 FASTQ 文件路径。可通过在单个清单文件中包含多个实验，以批量模式同时处理多个实验。
  5. 执行以下命令进行标准的基于参考基因组的分析：(1) python /path/to/circleseq.py all - manifest；(2) /path/to/manifest.yaml。
  6. 或者，执行以下命令进行标准的无参考基因组分析：(1) Python /path/to/circleseq.py reference-free - manifest；(2) /path/to/manifest.yaml。
  7. 运行完整分析流程时，可在为每个特定步骤指定的独立 output_folder 中找到各步骤的输出结果。

结果

在此，利用 CIRCLE-seq 研究 Cas9 与靶向腺相关病毒整合位点 1（adeno-associated virus integration site 1）的 gRNA 结合后在复合物中诱导核酸酶切割的位点AAVS1) 使用诱导多能干细胞（iPSCs）中分离的DNA。该gRNA此前已在我们的出版物中描述过27从iPSCs中分离出约25 μg的gDNA，通过聚焦超声破碎，并使用AMPure XP磁珠纯化进行片段大小筛选，获得约300 bp的片段。从这25 μg DNA中，成功将约2–5 ng DNA环化用于后续实验。 体外 Cas9:gRNA 切割。整个流程如图所示 图1.

在完成CIRCLE-seq实验流程并利用我们的计算工作流进行分析后，图2A展示了所有检测到的靶上和脱靶切割位点的可视化结果。CIRCLE-seq分析流程还提供了“合并读段”，通过R统计软件进行分析，生成曼哈顿图，显示沿各条染色体分布的检测到的核酸酶诱导切割位点（图2B）。

CIRCLE-seq 方法流程图：细胞培养、基因组DNA提取、sgRNA克隆、PCR、Cas9切割、测序。
图1：CIRCLE-seq 实验流程示意图。 图中显示了本实验方案的主要步骤。请点击此处查看该图的放大版本。

测序比对与CIRCLE-seq数据；基因定位；DNA注释及染色体读段分布。
图2：CIRCLE-seq可视化图与曼哈顿图。（A）AAVS1位点的脱靶位点与预期靶点的比对结果。顶部显示靶序列，脱靶位点按读段数从高到低排序。原始靶序列中的差异以彩色核苷酸标出。图中展示了AAVS1位点部分排名靠前的非预期切割位点示例。（B）AAVS1位点检测到的非预期切割位点的曼哈顿图。每个柱状图的高度代表对应染色体位置的读段数。请点击此处查看该图的放大版本。

引物序列 (5'-3')备注/描述
AAVS1 单链引导RNA (sgRNA)GGGGCCACUAGGGACAGGAU用于 AAVS1 位点的荧光蛋白敲入
AAVS1 正向引物GCTCTGGGCGGAGGAATATG用于 sgRNA 体外切割测试
AAVS1 反向引物ATTCCCAGGGCCGGTTAATG用于 sgRNA 体外切割测试
oSQT1288/5Phos/CGGTGGACCGATGATC /ideoxyU/ATCGGTCCACCGaTCIRCLE-seq 发夹接头
oSQT1274AATGATACGGCGACCACCGAGTruSeq F1
oSQT1275CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATTruSeqF2
oSQT1310/56-FAM/CCTACACGA/ZEN/CGCTCTTCCGATCT/3IABkFQ/TruSeq 探针
oSQT1311/5HEX/TCGGAAGAG/ZEN/CACACGTCTGAACT/3IABkFQ/TruSeq 探针

表1：用于AAVS1位点CIRCLE-seq分析的gRNA和引物序列。

讨论

本文展示了CIRCLE-seq是一种无偏且高度敏感的技术，可用于鉴定在源自iPSC的基因组DNA中靶向AAVS1位点后由核酸酶诱导产生的全基因组范围的双链断裂（DSBs）。iPSC中的AAVS1位点是公认的“安全港”位点，常被用作通过CRISPR-Cas9技术将外源基因整合到基因组中的插入位点28。我们近期的研究通过将组成性表达的EGFP报告基因利用CRISPR介导的方式整合至AAVS1位点，构建了EGFP标记的iPSC，从而能够在细胞谱系中持续表达EGFP，实现对iPSC及其分化后细胞的标记与追踪27。该iPSC细胞系可用于体内实验，以评估移植后iPSC来源细胞在有机体内的分布情况。由于该细胞系经过CRISPR修饰，并且正用于测试iPSC的临床应用，因此必须明确并检测潜在的AAVS1脱靶位点，以确保其安全性和有效性，这使得AAVS1成为一个理想的用于验证CIRCLE-seq技术的测试位点。

Butterfield 等人先前发表的研究之间存在显著差异 研究27 以及使用修饰的gRNA进行靶向 AAVS1 位点。可设计gRNA以提高基因组编辑的准确性24引导序列是影响靶上和脱靶效率的最关键因素。因此，所选用的gRNA经过与多个其他引导序列的比较测试，证实具有更高的保真度。此外，一篇关于重编程人成纤维细胞的方法学文章进一步证实，含有修饰核碱基的合成加帽mRNA可有效降低抗病毒反应的激活水平29,30. 虽然低免疫原性在某些情况下可能并不重要 体外 检测在最终目标是开发一种可在活细胞中使用的临床相关疗法时变得至关重要。

与类似方法相比，CIRCLE-seq 具有多项优势。例如，Digenome-seq 对核酸酶切割和未切割的基因组 DNA（gDNA）均进行测序，需使用约 4 亿条读长21。这导致背景信号较高，难以筛选出低频的真实切割位点。而 CIRCLE-seq 由于富集了核酸酶切割的 gDNA，仅需使用约 300 万至 500 万条读长，因而背景信号较低。此外，Digenome-seq 及其类似方法 SITE-seq 均依赖于对单个核酸酶切割的 DNA 末端进行测序。相比之下，CIRCLE-seq 的读长包含切割位点的两端序列，因此无需参考基因组即可识别脱靶位点21,22,26。

CIRCLE-seq 的一个优势是其相比依赖细胞培养的方法（如 GUIDE-seq）具有更高的灵敏度。当两种方法进行比较时，CIRCLE-seq 能够检测到 GUIDE-seq 发现的所有脱靶位点，并揭示出 GUIDE-seq 未能检测到的额外非预期切割位点。然而，一个显著差异在于，GUIDE-seq 可能受到表观遗传景观的限制，而 CIRCLE-seq 则能够访问整个基因组。

作为一个 体外 检测, CIRCLE-seq 存在若干局限性，其中第一项为假阳性结果的检出。而表观遗传学因素将在某些位点阻碍核酸酶的活性 体内，超声处理可消除这些障碍 体外，使得在细胞环境中通常无法接近的位点也可能出现脱靶活性。此外，Cas9 在此情况下以高浓度存在 体外 检测，允许发生原本无法进行的切割反应 体内该检测还需要相对大量的起始基因组DNA，根据可用资源的不同，这可能限制本方案的应用。最后，由于当前二代测序技术的局限性，某些脱靶位点可能无法被检测到。

最近一项研究采用了一种in silico方法，其算法识别出多个相关参数，可用于比较不同的核酸酶表征方法，包括CIRCLE-seq和GUIDE-seq31。其中两个关键参数为“切割位点富集度”和“假阳性率%”。有趣的是，CIRCLE-seq的假阳性率计算为88%，但其切割位点富集度却比其他in vitro方法高出数倍。对所有方法的比较分析显示，GUIDE-seq表现最佳，因其展现出最高的靶向特异性，且假阳性率仅处于中等水平32。这并不否定CIRCLE-seq的价值，反而提示可将CIRCLE-seq与GUIDE-seq联合使用，利用GUIDE-seq验证CIRCLE-seq的结果，因为前者具有更高的灵敏度，而后者是一种基于细胞的方法，且切割位点富集度高。数据还表明，基于扩增子的高通量测序（NGS）应作为识别潜在候选位点上真实脱靶修饰的首选方法31。这些数据提示一种潜在策略：先使用CIRCLE-seq，继而进行GUIDE-seq，最后采用基于扩增子的NGS来系统评估脱靶效应。

披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

衷心感谢美国国立卫生研究院（R01AR078551 和 T32AR007411）、奥地利大疱性表皮松解症研究协会（DEBRA）、盖茨格鲁布斯塔克基金以及盖茨前沿基金提供的经费支持。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
0.2 mL 薄壁管及平盖ThermoFisher ScientificAB1114
1.5% PippinHT 胶条Sage ScienceHTC1510
10 mL 刻度移液管 FisherScientific12567603
15 mL 圆锥形离心管FisherScientific339651
150 x 25 mm 组织培养皿 FisherScientific877224
25 mL 试剂储液槽 FisherScientific2138127C
2x Kapa KiFi HotStart 即用型预混液 Kapa BiosystemsKK2602
5 mL 刻度移液管 FisherScientific170355
50 mL 圆锥形离心管FisherScientific339653
50x TAE 电泳缓冲液 ThermoFisher ScientificB49
6 孔细胞培养板Corning3516
Agencourt AMPure XP 磁珠试剂，60 mLBeckman CoulterA63881
台式微量离心机 Eppendorf5400002
BsaI-HF New England BioLabs
Buffer QX1Qiagen20912
Cas9 核酸酶，Streptococcus Pyogenes New England BioLabsM0386M
CIRCLE-seq 文库构建与高通量测序
Corning Matrigel hESC-合格基质Corning354277用于 iPSC 培养的细胞外基质（ECM）
ddPCR 探针用超级预混液 Bio-Rad1863010
DG8 微滴生成卡盒支架 Bio-Rad1863051
DG8 卡盒 Bio-Rad1864008
DG8 密封垫圈 Bio-Rad1863009
不含钙、镁的 DPBSThermoFisher Scientific14190144由 Invitrogen 生产
探针用微滴生成油 Bio-Rad1863005
微滴读取油 Bio-Rad1863004
EDTA（0.5 M）ThermoFisher Scientific15575020
EDTA（0.5 M），pH 8.0，无 RNaseThermoFisher ScientificAM9260G由 Invitrogen 生产
Eppendorf  ThermoMixer Eppendorf5384000020
设备
纯乙醇Sigma-AldrichE7023
外切酶 I New England BioLabsM0293LE. coli
滤器单元 FisherScientificFB0875713
带滤芯的无菌移液器吸头
聚焦式超声破碎仪 CovarisME220
基因组 DNA 分离
基因组 DNA 片段化
Gentra Puregene 细胞核心试剂盒 Qiagen158043
gRNASynthego
HClThermoFisher ScientificA144500
Heracell VIOS 三气加湿细胞培养箱ThermoFisher Scientific51030411用于 iPSC 的培养与扩增（37 °C/5% CO2/5% O2）
高灵敏度 D1000 DNA ScreenTapeAgilent5067-5584
高灵敏度 D1000 试剂Agilent5067-5585
HTP 文库构建试剂盒 Kapa BiosystemsKK8235
HyClone 抗生素-抗真菌溶液CytivaSV30079.01
IDTE pH 8.0（1x TE 溶液）Integrated DNA Technologies11050204
倒置显微镜用于明场及荧光通道下 iPS 克隆的成像
iPSC 培养
异丙醇Sigma-Aldrich190764
λ 外切酶 New England BioLabsM0262L
上样吸头，10 个装Agilent5067-5599
Magnum FLX 增强型通用磁力板 AlpaquaA00400
微量离心管Axygen31104051
预切口 AFA 纤维微管（Snap-Cap） Covaris520045
mTeSR-1 5x 补充剂StemCell Technology85852
mTeSR-1 基础培养基（400 mL）StemCell Technology85851用于维持 iPSC 培养的培养基
Nanodrop 8000 分光光度计 ThermoFisher ScientificND-8000-GL
NEBNext Illumina 多重寡核苷酸接头 New England BioLabsE7600S双索引引物组 1
光学管条盖，8联管Agilent401425
光学管条，8联管Agilent401428
其他试剂
PCR 板封膜 Bio-RadPX1型号 PX1
PEG/NaCl SPRI 溶液 Kapa Biosystems
Phusion Hot Start Flex 2x 预混液 New England BioLabsM0536L
可穿刺铝箔热封膜 Bio-Rad1814040
Plasmid-Safe ATP 依赖性 DNase EpicentreE3110K
引物、接头与探针IDT序列见表 1
蛋白酶 K Qiagen19131
QIAquick 凝胶回收试剂盒 Qiagen28704
QIAxcel 凝胶分析系统 Qiagen9001941
Qubit 检测管ThermoFisher ScientificQ32856
Qubit dsDNA BR 检测试剂盒 ThermoFisher ScientificQ32853
Qubit dsDNA BR 检测试剂盒 ThermoFisher ScientificQ32853
Qubit dsDNA HS 检测试剂盒 ThermoFisher ScientificQ32854
Qubit 荧光计 ThermoFisher ScientificQ33226
QX200 微滴数字 PCR 系统Bio-Rad1864001包含 QX200 微滴生成仪与 QX200 微滴读取仪
RNase AQiagen19101
半裙边 PCR 板 ThermoFisher Scientific14230244
SeqPlaque GTG 琼脂糖 Lonza50110
SYBR Safe DNA 凝胶染料 ThermoFisher ScientificS33102
T4 DNA 连接酶 New England BioLabsM0202L
T4 多核苷酸激酶（PNK）New England BioLabsM0201L
T-75 培养瓶 FisherScientific7202000
Tapestation 4150AgilentG2992AA
具有程序化温度梯度功能的 PCR 仪Bio-Rad C1000 Touch
Tris 碱ThermoFisher ScientificBP1521
Twin.tec PCR 板 EppendorfE95102034696 孔，半裙边，绿色
UltraPure 无 DNase/RNase 蒸馏水 ThermoFisher Scientific10977015
USER 酶 New England BioLabsM5505L

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CRISPR Cas9 DNA Illumina

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