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杂合组装与单分子检测技术用于成像完全重建的CMG的运动

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DOI：

10.3791/67076

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2024年7月26日

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1Department of Bionanoscience, Kavli Institute of Nanoscience, Delft University of Technology, 2Chromosome Replication Laboratory, Francis Crick Institute, 3Department of Physics and Kavli Institute of Nanoscience Discovery, University of Oxford

本文内容

摘要

我们报道了一种混合的群体与单分子检测方法，可直接成像并定量荧光标记的、完全重建的Cdc45/Mcm2-7/GINS（CMG）解旋酶在由光镊固定的线性DNA分子上的运动。

摘要

真核生物具有一种称为CMG的复制解旋酶，它在复制叉前端起主导作用，是复制体的核心组织者和驱动力。深入理解CMG动态的分子机制，对于阐明细胞如何在每个细胞周期中高效而准确地完成整个基因组的复制至关重要。单分子技术因其无与伦比的时间和空间分辨率，特别适用于量化CMG的动态行为。然而，迄今为止对CMG运动的单分子研究均依赖于从细胞中纯化得到的预先形成的CMG复合物，这限制了对CMG激活前各步骤的研究。本文中，我们描述了一种混合的群体与单分子检测方法，该方法通过从36种不同的纯化酿酒酵母（S. cerevisiae）多肽完全重建CMG的组装与激活过程，实现了对荧光标记CMG在单分子水平上的运动成像。该检测方法依赖于线性DNA底物两端的双重功能化修饰，即引入两种正交的连接基团，可用于在单分子水平上研究类似复杂的DNA加工机制。

引言

真核生物中的DNA复制由一种称为复制体（replisome）的动态蛋白复合物完成1。该复合物的一个关键组分是真核复制解旋酶Cdc45/Mcm2-7/GINS（CMG），它驱动并核心组织复制体，在复制叉前沿发挥引领作用1,2。因此，深入定量地理解CMG的动力学对于揭示复制体的动力学至关重要。单分子技术因其无与伦比的空间和时间分辨率，特别适用于研究CMG等分子马达，能够为我们提供对其功能、随机性和动力学前所未有的定量认识2,3,4,5,6,7,8,9。

在体，CMG 以时间上分离的方式被加载和激活，以确保每个细胞周期中复制仅发生一次1,10,11首先，在细胞周期的G1期，一组被称为加载因子的蛋白质将CMG复合物的第一个组分——Mcm2-7六聚体复合物——加载到双链DNA上。12,13,14,15,16 以双六聚体的形式 头对头配置15,17,18在酵母的特定情况下，这一初始过程发生在被称为复制起点的特定DNA序列上1尽管Mcm2-7是复制解旋酶的马达核心，但其自身无法解旋DNA19 没有两种解旋酶激活因子Cdc45和GINS，它们需要被招募到已加载的Mcm2-7上，才能形成完全有活性的CMG11,19,20,21解旋酶的激活过程发生在S期 细胞周期的阶段，起始于细胞周期调控激酶DDK对Mcm2-7双六聚体的选择性磷酸化22,23,24这些磷酸化事件促进了Cdc45和GINS招募至Mcm2-7双六聚体10,22,23,24,25,26 由另一组称为起始因子的蛋白质10,11,26Cdc45与GINS的结合形成两个姐妹CMG解旋酶，它们最初包裹着亲本DNA的两条链，并仍处于头对头的构型中11,27在最后的激活步骤中，起始因子Mcm10催化依赖于ATP水解的单链DNA从每对姐妹CMG复合物中挤出11链挤出后，姐妹CMG解旋酶通过沿单链DNA以依赖ATP水解的方式易位，从而相互绕过并分离。11,20,21,28，通过空间排阻非易位链来解旋DNA29该整个过程已实现完全重建 体外 从最少36种纯化的 S. cerevisiae 多肽10,11.

尽管极其精细 体内 CMG组装与激活的调控，如上所述， 体外 CMG 重构单分子运动研究2,30,31,32,33,34 迄今为止依赖于从细胞中纯化的预激活CMG复合物20,21，遗漏了其激活前的所有步骤及其运动的双向性。这种预激活的CMG方法之所以成为单分子研究领域的金标准，部分原因在于完全重建的CMG组装反应具有复杂的生物化学特性10,11这一生化反应从整体生化水平转化为单分子水平面临诸多挑战，原因如下。首先，为了最大化反应效率，CMG组装与激活所必需的装载因子和起始因子需要达到10–200 nM浓度范围。10,11,27这些浓度范围对应大多数单分子技术可耐受的上限，尤其是在使用荧光标记组分时35最后，CMG 已经进化到能够在细胞中连续移动数千个碱基对36,37,38,39因此，为了在生物学相关的空间尺度上研究其运动，需要使用较长的DNA底物（通常长度在数十千碱基对的量级）30,31,34,40,41,42使用这类长链DNA底物会带来额外的挑战：DNA底物越长，其上潜在的非特异性蛋白结合位点以及蛋白聚集体的结合位点就越多。对于CMG复合物而言，这一点尤为关键，因为参与CMG组装与激活的多种装载和启动因子均含有内在无序区域。43 且易于聚集。

本文报道了一种混合的群体与单分子检测方法，该方法在完全从36种纯化的酿酒酵母（S. cerevisiae）多肽中重建其组装和激活后，实现了对CMG运动的观察与定量28。该检测方法依赖于在DNA底物两端分别进行两种正交连接基团的双功能化修饰：脱硫生物素（desthiobiotin）和地高辛（digoxigenin）2（图1A）。其中第一个基团脱硫生物素用于将DNA底物可逆地结合到链霉亲和素包被的磁珠上44（图1B）。随后，在磁珠结合的DNA上组装并激活荧光标记的CMG，并使用磁力架纯化和洗涤所形成的磁珠结合的DNA:CMG复合物（图1C）。该步骤可去除可能在DNA底物上聚集的过量蛋白，从而获得几乎无聚集的DNA:CMG复合物。接着通过加入摩尔过量的游离生物素将完整的复合物从磁珠上洗脱下来，游离生物素可竞争性地取代脱硫生物素与链霉亲和素的结合（图1D）。随后，单个DNA:CMG复合物被固定在两个包被有抗地高辛抗体（anti-Dig）的光学捕获聚苯乙烯微球之间；此步骤利用DNA另一端的地高辛基团，因其即使在含有过量游离生物素的缓冲液中仍可与抗-Dig特异性结合（图1E）。一旦DNA:CMG复合物被稳定固定在光镊中，即可使用共聚焦扫描激光显微镜对荧光标记的CMG的运动进行成像（图1F）。我们预计，该检测方法可轻松拓展应用于其他类似复杂的DNA:蛋白质相互作用的单分子水平研究。

方案

1. 双功能化线性DNA底物的合成及其与磁珠的结合

  1. 用脱硫生物素和地高辛基团对DNA底物进行双重功能化修饰
    1. 在最终体积为200 µL的1×缓冲液（50 mM醋酸钾，20 mM Tris-醋酸盐，10 mM醋酸镁，100 µg/mL BSA，pH 7.9）中，使用200单位限制性内切酶AflII于37 °C孵育16小时，将20 µg的23.6 kb质粒pGL50-ARS1（包含一个天然复制起点ARS1，为实验室克隆，可根据要求提供）线性化。
      注意：若更方便，此步骤可缩短至4小时，且不会降低产率。
    2. 通过在65 °C孵育20分钟使AflII失活。向200 µL线性化反应体系中加入60单位Klenow片段（3'至5'外切酶缺陷型）聚合酶、17 µL 10×缓冲液（500 mM NaCl，100 mM Tris-HCl，100 mM MgCl2，10 mM DTT，pH 7.9）、33 µM D-脱硫生物素-7-dATP、33 µM 地高辛-11-dUTP、33 µM dCTP、33 µM dGTP，并用超纯水补足至最终体积370 µL，以填补产生的4个核苷酸TTAA粘性末端。在37 °C孵育反应30分钟。
      注意：在此步骤中，Klenow片段通过在每条线性化DNA末端各掺入两个D-脱硫生物素-7-dATP和两个地高辛-11-dUTP核苷酸，实现末端的平端化。
    3. 向反应体系中加入EDTA至终浓度10 mM，并在75 °C孵育20分钟以使Klenow片段失活。用超纯水将反应体积调整至400 µL。
    4. 取四根S-400离心柱，涡旋振荡至少30秒以重悬树脂，然后在735 × g离心1分钟以去除保存液。将离心柱转移至洁净的1.5 mL离心管中。
    5. 立即向每根柱中加入100 µL DNA溶液，并在735 × g离心2分钟。此时DNA位于穿流液中，离心柱可丢弃。
    6. 合并四根柱的穿流液，用移液器测量体积，并用分光光度计测定DNA浓度。该数据将用于计算结合到磁珠上的DNA量。
  2. 将双重功能化的线性DNA结合至链霉亲和素包被的磁珠
    1. 涡旋振荡M-280链霉亲和素包被的磁珠30秒以重悬。
    2. 将4 mg重悬的M-280链霉亲和素包被磁珠转移至洁净的1.5 mL离心管中。将离心管置于磁力架上，静置1分钟使磁珠聚集，然后去除保存液。
    3. 向磁珠中加入1 mL 1×缓冲液A（5 mM Tris-HCl pH 7.5，0.5 mM EDTA，1 M NaCl），通过涡旋振荡5秒重悬。室温孵育5分钟。
      注意：所有缓冲液均应经过无菌过滤。建议预先配制大量2×缓冲液A、1×缓冲液B（见下文）和1×缓冲液C（见下文）以节省时间。这些缓冲液为磁珠制造商推荐使用，可于-20 °C保存。
    4. 将离心管置于磁力架上，静置1分钟使磁珠聚集，然后去除缓冲液A。
    5. 用移液器将磁珠重悬于400 µL 2×缓冲液A中，然后加入400 µL功能化DNA溶液（注意：此操作将2×缓冲液A稀释至终浓度1×，此浓度最有利于DNA与磁珠的结合）。通过移液轻轻混匀。
    6. 将磁珠/DNA混合物在4 °C下以翻转混匀方式孵育过夜，使功能化DNA充分结合至磁珠。
    7. 使用磁力架去除上清液（在丢弃前需先用移液器测量其体积，并用分光光度计测定未结合DNA的浓度），然后用500 µL缓冲液B（10 mM HEPES-KOH pH 7.6，1 mM EDTA，1 M KOAc）洗涤磁珠两次，以去除非特异性结合的DNA。再用500 µL缓冲液C（10 mM HEPES-KOH pH 7.6，1 mM EDTA）洗涤两次，该缓冲液为制造商推荐的保存缓冲液。
      1. 通过比较加入磁珠的总DNA量与上清液中残留的DNA量，计算结合至磁珠的DNA总量。每毫克磁珠的DNA结合量应在2.3–2.9 mg（约150–190 fmol）范围内。若产率较低，请检查S400柱在使用前是否已干燥。应持续通过凝胶电泳监测DNA完整性，以确保初始质粒DNA底物未发生降解。
    8. 将磁珠重悬于300 µL缓冲液C中，于4 °C保存。为防止切刻产生，建议将磁珠分装为4份单次使用的1 mg等分试样，且DNA保存时间不应超过2周。

2. 结合群体与单分子实验，利用相关双光束光镊和共聚焦显微镜成像并定量完全重建的CMG的运动

  1. 荧光标记的CMG在磁珠结合DNA上的组装与激活图1C).
    注意：CMG 组装与激活反应分两个阶段进行：Mcm2-7 加载与磷酸化，以及 CMG 组装与激活。除非另有说明，所有缓冲液置换步骤均借助磁力架完成，即将磁珠置于磁力架上静置 1 分钟以收集磁珠，随后移除上清液。所有孵育步骤均在带盖的温控金属浴中进行，以防止 荧光蛋白的光漂白。如果无盖子可用，应将试管用锡箔纸包裹。本方案中所使用的所有蛋白质的纯化及荧光标记均按先前所述方法进行。10,11,28.
    1. Mcm2-7 的加载与磷酸化
      1. 取1 mg DNA结合的链霉亲和素包被磁珠，去除保存缓冲液（缓冲液C）。
      2. 用200 µL上样缓冲液（25 mM HEPES-KOH pH 7.6，100 mM K谷氨酸盐，10 mM MgOAc，0.02% NP40替代物，10%甘油，2 mM DTT，100 µg/mL BSA和5 mM ATP）洗涤珠子。
      3. 去除上样缓冲液，将磁珠重悬于 75 µL 上样缓冲液中，用移液器轻轻混匀。
      4. 向珠子结合的 DNA 中加入 ORC，使其终浓度为 37.5 nM，30 °C、800 rpm 振荡孵育反应 5 分钟。
      5. 加入 Cdc6 至终浓度为 50 nM 在30 °C、800 rpm振荡条件下孵育反应5分钟。
      6. 加入Mcm2-7/Cdt1（或荧光标记的Mcm2-7）JF646-Halo-Mcm3/Cdt1) 至终浓度为 100 nM，于 30 °C、800 rpm 振荡条件下孵育反应 20 分钟。
      7. 加入DDK至终浓度为100 nM，在30 °C、800 rpm振荡条件下孵育反应30分钟。
      8. 移除上清液，用200 µL高盐洗涤缓冲液（HSW缓冲液，含25 mM HEPES-KOH pH 7.6、300 mM KCl、10 mM MgOAc、0.02% NP40替代物、10%甘油、1 mM DTT和400 µg/mL BSA）洗涤磁珠结合的DNA（现含有磷酸化的Mcm2-7六聚体）。通过移液充分混匀，确保磁珠在缓冲液中完全重悬，无可见团块。
      9. 移除 HSW 缓冲液，加入 200 µL CMG 缓冲液（25 mM HEPES-KOH pH 7.6、250 mM K glutamate、10 mM MgOAc、0.02% NP40 替代物、10% 甘油、1 mM DTT 和 400 µg/mL BSA）重悬珠子，洗涤一次。
    2. 荧光标记CMG的组装与激活
      1. 移除 CMG 缓冲液，并将结合 DNA 的磁珠重悬于 50 µL 含 5 mM ATP 的 CMG 缓冲液中。
      2. 加入50 nM Dpb11、200 nM GINS、30 nM Polɛ、20 nM S-CDK、50 nM Cdc45LD555，将30 nM Sld3/7、55 nM Sld2和10 nM Mcm10加入到珠子结合的DNA中。在此步骤中，将所有蛋白质在加样前立即混合于同一管中，并置于冰上。将重悬的珠子结合DNA加入蛋白质混合物中。在30 °C下以800 rpm振荡孵育反应15分钟。
      3. 用200 µL HSW缓冲液洗涤磁珠3次，再用200 µL CMG缓冲液洗涤1次。
    3. 从磁珠中洗脱完整的DNA:CMG复合物图1D)
      1. 去除CMG缓冲液，并洗脱DNA:CMG复合物：将结合有DNA并含有CMG的磁珠重悬于200 µL洗脱缓冲液（在CMG缓冲液中添加10 mM生物素）中，以洗脱DNA:CMG复合物。在室温下以800 rpm振荡孵育1小时。
      2. 将离心管置于磁力架上，静置5分钟以收集磁珠。小心吸取上清液（现含有洗脱的DNA:CMG复合物），避免扰动已沉淀的磁珠，并将其转移至新的离心管中。
      3. 为确保溶液中无残留微珠（因溶液中残留的磁珠可能干扰检测的光镊捕获步骤），将收集的上清液再次置于磁力架上，使任何残留的微珠继续吸附5分钟。小心收集上清液并转移至新离心管中。
      4. 向200 µL上清液中加入1400 µL CMG缓冲液。样品现可用于单分子成像。
  2. 使用相关联的双光束光镊与共聚焦显微镜对完全重建的CMG进行单分子成像图1E- G).
    注意：该检测的单分子部分是在一种商业装置中进行的，该装置结合了双光束光镊、共聚焦显微镜和微流控技术。45,46 (图1E- G），但也可在自制装置中进行。此处使用的商用装置配备了一个具有五个入口（分别称为通道1-5）和一个出口的微流控流动池图1E）。以下步骤中，所有按钮和/或面板名称均特指此商业设备配套提供的软件。
    1. 使用商业装置中的五个进样口，具体如下：从左侧注入通道1至通道3，分别用于微珠捕获（通道1）、DNA-蛋白质复合物结合（通道2）以及检测CMG的存在（通道3）。将通道4和通道5用作蛋白质储存通道及缓冲液置换位置。每次实验前，先用1 mg/mL牛血清白蛋白对微流控流动池进行至少30分钟的钝化处理，随后使用溶于超纯水的0.5% Pluronic F-127处理。
      1. 确保每次实验中各通道的内容均如所述图1E):
        通道1：用抗地高辛素包被的聚苯乙烯微珠（2.06 µm 直径），按1:50比例用PBS稀释；
        通道2：从磁珠上洗脱的DNA:CMG复合物；
        通道3：成像缓冲液（在CMG缓冲液中添加2 mM 1,3,5,7-环辛四烯、2 mM 4-硝基苄醇和2 mM Trolox）；
        ​通道4和5：成像缓冲液中添加25 nM RPA、10 nM Mcm10，以及5 mM ATP、5 mM ATPγS或无核苷酸。
    2. 实验前，调节捕获激光功率，使两个光镊的刚度均达到 0.3 pN/nm33,46 通过点击软件中“功率控制”面板中的“重新校准”按钮进行校准。在软件的“图像扫描”面板中，将共聚焦像素大小设置为 50 × 50 nm，图像尺寸设置为 160 × 18 像素，每个像素的照射时间为 0.2 ms，帧速率为 5 s。在“温度”面板中将温度控制设置为 30 °C。
      注意：此外，我们建议将最大载物台速度（用于在通道间移动）设置为 0.2 mm/s，以尽量减少拖拽力导致 CMG 从 DNA 上解离。
    3. 以恒定压力 0.5 bar 将所有溶液注入进样口的流通池（可在软件的压力条面板中设置）。随后，关闭通道 4 和 5 的流体流动。在初始阶段所有溶液流过后，将压力降至 0.2 bar。
    4. 将捕获激光移至通道1，直至每个光镊中捕获一个微珠。按住触发器的同时移动操纵杆，将已捕获的微珠移至通道2。 然后，钓取DNA:CMG复合物 通过操纵操纵杆将右侧小球移向或远离左侧小球（不按压触发器），直至捕获DNA连接链（通过监测被捕获DNA的力-延伸曲线可确认）47 在软件的 FD 查看器面板中）。
      1. 进行DNA拴系时，需在参考模型面板中输入DNA长度和正确的温度值，这将在力-伸展图面板中自动绘制出该DNA结构的理论可延展蠕虫状链模型。若两个微珠之间捕获了单个DNA分子，则DNA的力-伸展行为应与所绘制的可延展蠕虫状链模型高度吻合。通过监测软件自动叠加在理论曲线之上的实验力-伸展曲线，确保二者相符。
        注意：与理论模型的偏差可能表明存在多个DNA分子连接在微珠之间和/或存在结合在DNA上并使其压缩的蛋白质聚集体。为防止蛋白质在受力作用下从DNA上解离，在此初始测试中施加的张力不得超过10 pN。
    5. 将珠子移至通道3，并立即停止所有通道的流动。在通道3中进行单帧测试扫描，使用物镜处测量功率为4 µW的561 nm激光照射，以确认CMG的存在。在“激发激光”面板中调整成像激光功率。若存在CMG，其将呈现为二维衍射极限的光点，如图所示 图1G 和 图2A.
      1. 若无法捕获DNA，请检查通道2中是否存在气泡，气泡可能导致通道2的流速减慢（相较于通道1和通道3）。若发现气泡，可将通道2的压力增加至1 bar，以尝试将气泡冲洗排出。
    6. 如果存在CMG，则将DNA tether转移至通道4或5进行成像；否则，重新开启流体，弃去磁珠，并返回步骤2.2.4。
    7. 在第4或第5通道中，调节磁珠之间的距离，使DNA连接链的初始张力达到2 pN。为此，在“力谱学”面板中输入2 pN，然后点击“启用”按钮以启动力钳。当初始张力达到2 pN后，在成像前点击“力谱学”面板中的“启用”按钮以关闭力钳。
    8. 图像 CMGCdc45-LD555 每5秒用561 nm激光以物镜处测得的4 µW功率照射一次（图1F）。为此，请点击图像扫描面板中的“开始扫描”按钮。在此类扫描中，CMG 将显示为二维衍射极限点，如示例所示 图1G.
      1. 若观察到CMG但其在漂白前似乎未发生移动，则需检测所用的所有蛋白质的核酸酶活性，因为DNA上的切口会导致CMG从DNA上解离41严重降低其表观持续合成能力。
        注意：若使用本文所述的商用显微镜，激光功率为4 µW时应可获得稳定的结果。若使用自行搭建的实验装置，建议通过实验经验法估算最佳激光功率。最佳激光功率应能从荧光分子获得足够信号，以实现所需精度的定位，同时使荧光分子寿命接近实验所需的时间范围。
        注意：尽管本出版物重点介绍混合集成与单分子检测技术，我们此前已发表过对该检测方法所产生的数据进行分析的全面描述48.

结果

若操作正确，本方案应能获得几乎不含聚集体的DNA:CMG复合物。无聚集的反应不会堵塞微流控流动池中的任何通道，且被捕获的DNA分子可被拉伸至其轮廓长度的90%以上，而不会发生断裂。相反，若反应中存在聚集现象，DNA分子有时会被聚集体压缩，导致在拉伸时经常发生DNA断裂。识别蛋白质聚集体的一个有效方法是观察DNA的二维扫描图像。在无聚集的反应中，CMG表现为离散、对称、衍射极限的斑点，稀疏地分布在DNA上，如图2A所示扫描图像中的情况。相反，聚集体则表现为不够离散、有时呈不对称的团块状结构，密集覆盖较长的DNA片段，如图2B所示扫描图像中的情况。此外，若实验成功实施且纯化的蛋白质具有高纯度，则可在ATP存在下观察到CMG的长距离运动，如图2C所示的时空图（kymograph）中所见。

DNA复制示意图；光镊方法；磁珠；CMG复合物；共聚焦扫描。
图1：用于成像和定量完全重建CMG运动的混合群体与单分子检测方法的示意图。（A）一条23.6 kb的线性DNA，包含一个天然存在的ARS1复制起点，其两端分别被去硫代生物素和地高辛分子双功能化修饰。（B）双功能化修饰的DNA通过其去硫代生物素基团与包被链霉亲和素的磁珠结合。（C）CMG在磁珠结合的DNA上逐步组装并被激活，过程中包含不同的洗涤步骤，以去除过量未结合的蛋白质及蛋白聚集体。（D）通过加入过量游离生物素，竞争性破坏去硫代生物素-链霉亲和素相互作用，从而将完整的DNA:CMG复合物从磁珠上洗脱下来。（E）在微流控流动池的帮助下，单个DNA:CMG复合物被固定在两个包被抗地高辛抗体的光镊捕获聚苯乙烯微球之间。需要注意的是，地高辛-抗地高辛相互作用与生物素-亲和素相互作用正交，因此不受游离生物素存在的影响。（F）一旦被光镊固定，DNA:CMG复合物即被转移至不同缓冲条件下，并利用共聚焦扫描激光对DNA平面进行扫描，以随时间成像CMG沿DNA的运动。（G）上图显示了一个DNA:CMG复合物被固定在两个光镊捕获的抗地高辛包被聚苯乙烯微球之间的示意图，并由共聚焦扫描激光进行扫描。下图显示了一个CMG结合于被光镊固定的DNA上的二维扫描实例。在这些实验中DNA未标记，但可将其视为穿过图像中央的一条水平线。本图已根据文献28修改。请点击此处查看此图的放大版本。

荧光显微镜结果；蛋白质聚集动力学；延时成像；纳米尺度图像。
图2：成功与失败实验的数据示例。（A）不含聚集物的样品中含CMG的DNA的二维扫描示例。两次扫描中，CMG均沿DNA呈稀疏分布，表现为对称且离散的衍射极限斑点。（B）含聚集物的样品中含CMG的DNA的二维扫描示例。两次扫描中，CMG形成不对称的团块，密集分布在DNA上。（C）在ATP存在下，随时间变化的CMG衍射极限斑点在DNA上的位置的延时图像（kymograph），显示CMG复合物的长距离运动。请点击此处查看该图的高清版本。

讨论

关键步骤和重要试剂质量控制
本实验中的关键步骤及生物试剂的质量控制要点如下。首先，所用蛋白质的纯度至关重要，因为即使蛋白质样品中含有微量核酸酶污染物，也会导致DNA降解，从而对实验数据产生不利影响。其原因是只有完整（或部分切口）的DNA分子才能被双光束光镊捕获。 更重要的是，DNA上的切口会导致CMG解离41，从而干扰对CMG长距离运动的观察。我们强烈建议对每一批纯化的蛋白质进行核酸酶活性检测，同时持续监测起始质粒底物的完整性，以确保切口程度降至最低。第二个重要步骤是在洗脱DNA:CMG复合物后仔细去除磁珠。此步骤中的上清液移除应缓慢进行，以免扰动已收集的磁珠。若将磁珠残留于流入光镊系统的样品中，它们常常会撞击被光学捕获的聚苯乙烯微球，导致后者脱离光阱，进而影响数据采集。最后，在光镊操作过程中应谨慎处理DNA:CMG复合物。为此，我们建议不要将DNA的张力增加至10 pN以上，因为施加过大的力可能导致CMG从DNA上解离。此外，在微流控流动池中切换通道时应尽可能缓慢（约0.2 mm/s），以避免由此产生的拖拽力使CMG从DNA上脱落。

方法的改进
该检测方法中有多个步骤可以进行修改。例如，我们已证明，将洗脱时间从60分钟缩短至30分钟，对洗脱产率无显著影响。此外，我们建议在洗脱缓冲液中添加低浓度（低于1 mM）的ATP或ATPγS，以防止CMG从DNA末端扩散，并有助于整体稳定CMG28。同时，尽管本文所报告的缓冲液组成和蛋白质浓度基于先前群体生化和单分子研究中使用的方法11,18，但我们所描述的检测方法完全兼容其他CMG组装方案26,27。因此，任何已报道可提高CMG组装或激活效率的生化改进，均可且应应用于检测的批量部分，以提高产率。最后，增加帧间时间可延长CMG的总成像时间，有助于在荧光团漂白前观察CMG的长距离运动。

该方法的局限性
我们所描述的杂交方法存在一定的局限性，即只能在CMG整体激活后对其进行成像，尚需进一步研究以实现实时观察CMG的激活过程。另一个重要局限在于，尽管我们预期CMG会成对组装，17,26,27每条DNA上观察到的CMG复合物总数通常为一个28，表明CMG或至少Cdc45在处理敏感的DNA:CMG复合物过程中可能从DNA上解离。减少单分子成像前的操作步骤，以及开发更优的表面钝化策略，将有助于 微流控流动池的塑料管路和玻璃部件有望进一步提高这一产量。

该方法的意义
迄今为止，对CMG的单分子运动研究主要采用从细胞中纯化得到的、预先激活的CMG复合物。尽管这种方法相对简单，但其局限性在于无法捕捉CMG激活前的任何步骤，也无法研究CMG及复制体运动的双向特性。相比之下，完全重建CMG的组装与激活过程，有望研究所有激活前的步骤，并实现对CMG双向运动的观察。然而，将这一方法从传统的生化批量实验推进到单分子水平面临更大挑战，因其涉及更多纯化的蛋白质因子和更复杂的步骤。本文所描述的检测方法克服了这些困难，使我们能够在单分子水平上对完全重建的CMG的运动进行成像，从而得以揭示此前未能观察到的激活前动态过程28。此外，尽管我们通常在每条DNA上仅观察到一个CMG，但仍多次观察到两个CMG复合物沿相反方向移动的现象，甚至能够捕捉到姐妹CMG最初彼此分离的瞬间28，这些结果为理解双向复制的建立机制提供了新的线索。

与先前的CMG运动实验相比，本实验的另一个优势在于我们所使用的DNA底物具有完全双链的特性（图1A）。在以往的预激活CMG研究中，将CMG结合到DNA底物上的最常见方式是通过一个3'单链DNA flap。这种方法导致所构建的DNA难以进行有效的扭转约束，从而无法研究超螺旋在复制体前进过程中的作用。相反，本文所描述的新方法有望被改进用于研究扭矩在此过程中的作用，因为我们所使用的DNA底物是完全双链的。

该方法的更广泛应用
本文所述的杂交检测方法将为完整真核生物复制体的全重建铺平道路，使我们及他人能够观察并量化复制体成功执行其各种不同任务所依赖的重要动态过程。除DNA复制外，我们报道的该检测方法代表了将复杂的生化反应从整体生化水平推进到单分子水平的重要进展。我们预计，该检测方法可轻松改造，用于研究参与不同DNA加工机制的类似复杂的DNA:蛋白质相互作用。

披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

作者感谢 Anne Early、Lucy Drury 和 Max Douglas 提供用于过表达未标记蛋白的酵母菌株，同时感谢 N.D. 实验室成员 Anuj Kumar、Katinka Ligthart 和 Julien Gros 在加载因子和 DDK 纯化过程中的协助。作者还感谢 Kaley McCluskey、Dorian Mikolajczak、Joseph Yeeles、Jacob Lewis、Alessandro Costa、Hasan Yardimci 和 Taekjip Ha 提供有益的科学讨论。D.R.M. 感谢 Boehringer Ingelheim Fonds 博士生奖学金提供的经费支持。  N.D. 感谢荷兰科学研究组织（NWO）通过Top项目资助714.017.002和Spinoza奖SPI 81-772，以及欧洲研究理事会通过高级资助项目（REPLICHROMA；资助编号789267）提供的经费支持。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
AflII NEBR0520L
抗地高辛包被的聚苯乙烯微珠 SpheroteckDIGP-20-2
ATP 溶液Thermo FisherR0441
ATPγSRoche11162306001
BSANEBB9000S
C-TrapLumicks
CutSmart 缓冲液NEBB6004S随 AflII 提供
dCTPPromegaU122B
D-脱硫生物素-7-dATPJena Bioscience NU-835-Desthiobio
dGTPThermo Fisher10218014
地高辛-11-dUTPJena BioscienceNU-803-DIGXL
Dynabeads M-280 链霉亲和素磁珠Invitrogen11205D
Klenow 片段 (3'→5' 外切酶缺陷型) NEBM0212L
Microspin S-400 HR 离心柱 GE HealthcareGE27-5140-01
NEBuffer2NEBB7002S随 Klenow 片段提供
Nonidet P 40 替代品Sigma74385
Pluronic F-127 SigmaP2443

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