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方法文章

使用抗体依赖性细胞介导的细胞毒性报告基因生物测定法评估癌细胞中的抗体依赖性细胞介导的细胞毒性

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DOI：

10.3791/67077

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2024年9月13日

 ,  ,  ,  , 
1Institute of Molecular and Cell Biology (IMCB), A*STAR 61 Biopolis Drive, 2Department of Radiation Oncology, Affiliated Hangzhou Cancer Hospital, 3Key Laboratory of Head and Neck Cancer Translational Research of Zhejiang Province, Zhejiang Cancer Hospital, 4Department of Thyroid Surgery of Zhejiang Cancer Hospital

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

本文介绍了一种利用ADCC生物检测试剂盒进行抗体依赖性细胞介导的细胞毒性（ADCC）实验的方案。该方法为阐明ADCC机制以及评估抗体在癌症免疫治疗中的治疗潜力提供了有力的工具。

摘要

抗体依赖性细胞介导的细胞毒性（ADCC）方法是评估治疗性抗体在癌症免疫治疗中疗效的重要工具。在癌细胞中评估ADCC活性对于基于抗体的治疗方法的开发与优化至关重要。本文提出一种利用ADCC生物检测试剂盒定量评估ADCC反应的方法学方案，以甲状腺癌细胞作为效应细胞。该方案包括在治疗性抗体存在的条件下，将效应细胞与靶向癌细胞以不同比例共培养。本实验所用的ADCC生物检测试剂盒包含经基因工程改造的效应细胞，这些细胞携带受活化T细胞核因子（NFAT）反应元件调控的荧光素酶报告基因。当靶细胞表面抗原与抗体及效应细胞结合后，效应细胞释放荧光素酶，从而可通过检测发光信号定量细胞毒性。与传统的ADCC检测方法相比，该方法能够验证靶抗原与抗体及效应细胞之间的结合，可在较短时间内获得可靠结果。

引言

抗体依赖性细胞介导的细胞毒性（ADCC）是抗体发挥免疫介导杀伤细胞作用的重要机制1,2,3。免疫细胞通过与治疗性抗体结合而被激活，该抗体可与靶细胞表面抗原相互作用，进而释放颗粒酶和穿孔素，导致靶细胞死亡。参与此过程的免疫细胞包括自然杀伤（NK）细胞和中性粒细胞2,3,4,5,6,7。ADCC 检测已成为评估治疗性抗体功效的重要工具8,9。

在传统的ADCC检测中，通常使用外周血单个核细胞（PBMCs）或自然杀伤细胞作为效应细胞，通过定量靶细胞的死亡率来评估治疗性抗体的效力。我们的方法采用一种ADCC生物检测试剂盒，该试剂盒包含经过基因工程改造的效应细胞，这些细胞携带一种荧光素酶报告基因，该基因受活化T细胞核因子（NFAT）反应元件的调控。随后我们定量检测抗体与靶细胞表面抗原结合后，效应细胞与靶细胞之间的相互作用。该方法基于短时间内发生的ADCC反应，无需使用人源PBMC细胞。实验步骤包括在治疗性抗体存在下将效应细胞与靶细胞进行共培养。

孵育过程中，治疗性抗体与靶细胞表面的靶抗原结合，从而介导效应细胞与抗体的Fc片段结合。这会激活NFAT反应元件，并释放发光信号，用于定量评估ADCC反应。

在进行实验之前，必须通过流式细胞术或蛋白质印迹法确认目标抗原在靶细胞中的表达。靶细胞在实验前24小时接种并传代至96孔板中。将不同浓度的治疗性抗体与不同数量的效应细胞共同加入，以达到计算好的效应细胞与靶细胞比例。

本方法的关键步骤包括：（1）靶细胞和效应细胞的制备，（2）效应细胞与靶细胞的比例设置，（3）抗体不同浓度的配制，以及（4）孵育时间的调整。孵育结束后，使用发光仪检测发光信号，从而定量读取ADCC活性。与其他检测ADCC的方法相比，该方法操作相对简便，且结果准确可靠。

ADCC 报告基因生物检定法用于指示 ADCC 通路激活过程中靶抗原、治疗性抗体与免疫细胞之间的结合。这种结合通过效应细胞中 NFAT 通路激活基因转录，效应细胞为经基因工程改造、稳定表达 FcγRIIIa 受体 V158（高亲和力）变异体的 Jurkat 细胞。NFAT 反应元件介导效应细胞中荧光素酶的表达10,11。通过 NFAT 通路产生的荧光素酶信号，可定量检测抗体在 ADCC 作用机制（MOA）中的生物学活性。在表达 FcγRIIIa 受体的 Jurkat 效应细胞中，荧光素酶信号使用发光检测仪进行定量（图 1）。该检测方法的信噪比高。

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方案

1. 检测靶细胞中EGFR和VEGFR的表达

注意：使用蛋白质印迹法检测目标细胞中目标抗原的表达。

  1. 样品制备
    1. 使用添加10%胎牛血清（FBS）、1% L-谷氨酰胺和1%抗生素（青霉素-链霉素）的RPMI（Roswell Park Memorial Institute）培养基，在T75培养瓶中培养细胞（BHT-101和SW-1736人甲状腺癌细胞系）。
    2. 当细胞融合度达到80%时，吸除培养基，并用PBS洗涤细胞。加入5 mL PBS，使用细胞刮刀刮取细胞以从培养瓶中收集细胞，将细胞悬液转移至15 mL锥形管中。
    3. 使用细胞计数仪对细胞进行计数。
    4. 将5 × 106个BHT-101和SW-1736细胞分别分装至15 mL锥形管中。
    5. 在室温下以135 × g离心5分钟，沉淀细胞，弃去上清PBS。
    6. 加入含蛋白酶-磷酸酶抑制剂的100 µL RIPA裂解缓冲液，冰上裂解5分钟。将裂解液转移至2 mL离心管中，以15,000 × g离心15分钟，将上清液转移至新的2 mL离心管中。
    7. 使用BCA（二辛可宁酸）蛋白定量试剂盒测定细胞裂解液中的蛋白浓度。
    8. 从每个样品的细胞裂解液中取70 µg蛋白，加入含10% 2-巯基乙醇的2× Laemmli上样缓冲液，于100 °C煮沸5分钟以使蛋白变性。
  2. 凝胶电泳与膜转移
    1. 使用去离子水（4.7 mL）、30%丙烯酰胺（2.7 mL）、1.5 M Tris缓冲液（pH 8.8，2.5 mL）、10%十二烷基硫酸钠（0.1 mL）、10%过硫酸铵（100 µL）和TEMED（10 µL）配制8% SDS（十二烷基硫酸钠）聚丙烯酰胺凝胶。
    2. 将70 µg变性样品上样至8% SDS-聚丙烯酰胺凝胶中，先以80 V电泳20分钟，再以120 V电泳100分钟。
    3. 将凝胶中的蛋白在100 V条件下转移至PVDF（聚偏二氟乙烯）膜上，持续90分钟。
    4. 转膜完成后，用含7%脱脂奶粉的TBS-T缓冲液（20 mM Tris，pH 7.6，140 mM NaCl，0.2% Tween-20）封闭膜1小时。
  3. 抗体孵育
    1. 将封闭后的膜与小鼠抗表皮生长因子受体（EGFR）单克隆抗体和兔抗血管内皮生长因子受体（VEGFR）单克隆抗体（均用7%脱脂奶粉按1:1,000稀释）在4 °C孵育过夜。
    2. 孵育结束后，用TBS-T缓冲液（20 mM Tris，pH 7.6，140 mM NaCl，0.2% Tween-20）彻底洗涤膜，每次7分钟，重复4次。
    3. 将膜与HRP标记的二抗（用含7%脱脂奶粉的TBS-T缓冲液按1:4,000稀释）室温孵育1小时。
    4. 孵育结束后，用TBS-T缓冲液彻底洗涤膜，每次7分钟，重复4次。
  4. 蛋白检测
    1. 将膜与化学发光HRP底物孵育2分钟，该底物由1 mL HRP底物过氧化物溶液与1 mL HRP底物鲁米诺试剂（均来自化学发光底物试剂盒）混合而成。
    2. 使用成像系统对膜进行显影检测。

2. 靶细胞的制备

  1. 将靶向T细胞、BHT-101细胞和SW-1736细胞在添加了10%胎牛血清（FBS）、1% L-谷氨酰胺和1%抗生素（青霉素-链霉素）的RPMI培养基中培养至指数生长期，直至在T-75培养瓶中达到80%融合度。
  2. 吸去培养基后，用PBS洗涤细胞一次。加入1 mL非酶细胞解离缓冲液，孵育5分钟以使贴壁细胞脱落。加入PBS终止非酶细胞解离缓冲液的反应。在135 × g 条件下离心5分钟，弃上清，加入5 mL PBS。
    注意：此处使用非酶细胞解离缓冲液以保持细胞膜表面蛋白的完整性。
  3. 对细胞进行计数，并以每孔15,000个细胞的密度接种于96孔白色聚苯乙烯微孔板中，微孔板底部透明且平整。

3. 制备不同浓度的治疗性抗体

  1. 按照本方案，使用西妥昔单抗（嵌合型抗EGFR抗体）结合EGFR，并使用贝伐珠单抗（人源化抗VEGF-A抗体）作为阴性对照。
  2. 通过将1.4 mL低IgG血清加入33.6 mL RPMI-1640培养基（试剂盒中提供）中，配制ADCC生物检测试剂缓冲液。
  3. 使用ADCC生物检测试剂缓冲液对抗体进行稀释。每种抗体分别配制400 µL三种不同浓度：30 µg/mL、3 µg/mL和0.3 µg/mL（3倍浓度），以获得最终浓度分别为10 µg/mL、1 µg/mL和0.1 µg/mL，覆盖宽浓度范围，用于检测最佳剂量。
    注意：最终抗体浓度基于每孔加入25 µL培养的靶细胞、25 µL效应细胞和25 µL抗体，适用于96孔板。

4. 效应细胞的制备

  1. 使用前将效应细胞保存在 -80 °C。
  2. 使用前将 ADCC 生物检测试剂缓冲液置于 37 °C 水浴中预热至少 30 分钟。
  3. 将 ADCC 生物检测试剂效应细胞从 -80 °C 冷冻储存条件下取出，放入 37 °C 水浴中解冻（约 2-3 分钟）。轻轻摇动并目视检查冻存管，但在解冻过程中不得倒置。
  4. 将 630 µL 效应细胞转移至含有 3.6 mL ADCC 检测缓冲液的 15 mL 离心管中。通过轻轻倒置混匀 2 次，充分混匀。

5. 效应细胞与抗体及靶细胞的孵育

  1. 过夜孵育后，移除靶细胞（每孔15,000个癌细胞）的培养基，向每孔加入25 µL ADCC 生物检测试剂缓冲液以及25 µL 西妥昔单抗（EGFR拮抗剂）和贝伐珠单抗（VEGF拮抗剂），根据图2，使每孔中抗体终浓度分别为0.1 µg/mL、1 µg/mL或10 µg/mL。
  2. 向含有靶细胞的96孔微孔板中每孔加入25 µL ADCC 生物检测试剂缓冲液中的75,000个效应细胞。标记为“无mAb”的孔作为无抗体对照（图2）。
  3. 向标记为“AB”（ADCC 生物检测试剂缓冲液）的孔中加入ADCC 生物检测试剂缓冲液，作为空白对照。
  4. 将微孔板孵育6小时。

6. ADCC 活性的定量读数

  1. 在测量前4小时，将荧光素酶检测试剂缓冲液加入荧光素酶检测试剂底物（冻干粉）中，配制荧光素酶检测试剂。
  2. 靶细胞、抗体和效应细胞共孵育6小时后，向每孔加入75 µL荧光素酶检测试剂，孵育30分钟。
  3. 孵育结束后，使用发光仪测定每孔的发光信号，以定量检测ADCC活性。
  4. 数据分析时，按以下公式计算诱导倍数：
    诱导倍数 = RLU（抗体诱导信号 - 背景）/ RLU（无抗体对照 - 背景）。
    其中RLU为相对发光单位；抗体诱导组为B3至B8孔及C3至C8孔；无抗体对照组为B2和C2孔；背景为A2至A5孔的平均RLU值（图2）。

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结果

采用蛋白质印迹法检测靶细胞BHT-101和SW-1736中EGFR和VEGFR的表达。在BHT-101和SW-1736细胞中均检测到EGFR的表达，但未检测到VEGFR的表达（图3）。

使用ADCC生物测定试剂盒，我们检测了抗EGFR抗体西妥昔单抗（cetuximab）在EGFR阳性细胞系BHT-101和SW-1736中诱导的ADCC反应，以这两种细胞系作为靶细胞。贝伐珠单抗（bevacizumab，一种VEGF抑制剂）被用作阴性对照抗体。将不同浓度的抗体和效应细胞与靶细胞共同孵育，随后使用酶标仪检测发光信号（图2）。结果显示，西妥昔单抗（抗EGFR抗体）组均表现出更高的ADCC活性诱导倍数，而贝伐珠单抗（VEGF拮抗剂）在两种细胞系中均未检测到ADCC活性。该结果表明，针对EGFR细胞外膜抗原的ADCC效应在两种细胞系中均存在。通过本方法，验证了西妥昔单抗在两种未分化型甲状腺癌细胞系（BHT101和SW1736）中可诱导ADCC反应（

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讨论

本文介绍了用于评估治疗性抗体ADCC反应的ADCC生物测定方法。该方法操作简便，采用简单的“加入-混匀-检测”模式进行测量。

在进行实验之前，必须通过流式细胞术或蛋白质印迹法确认目标抗原在目标细胞中的表达。流式细胞术是检测细胞表面抗原的更佳工具。然而，使用流式细胞术可能对细胞造成应激，引发细胞凋亡，影响细胞活力，从而干扰整体分析结果。此外，其成本高于蛋白质印迹法。在本实验中，由于目标抗原为已知的细胞表面抗原，我们采用蛋白质印迹法作为更快且更具成本效益的方法。

使用经基因工程改造的Jurkat细胞作为效应细胞，该细胞稳定表达FcγRIIIa受体的V158（高亲和力）变异体，以及驱动萤光素酶表达的NFAT反应元件。NFAT通路的激活可导致萤光素酶的产生，其活性通过发光信号进行定量检测。该信号也代表了抗体依赖性细胞介导的细胞毒性（ADCC）的活性。

首先，在37 °C、湿润的CO2培养箱中，将靶细胞（T）与效应细胞（E）在96孔板中共同孵育6小时，同时加入...

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披露

所有作者均声明无利益冲突。

致谢

感谢曾教授（新加坡A*STAR研究所分子与细胞生物学研究院）对本工作的支持。本研究得到了中国国家自然科学基金青年基金（NSFC）（82202231）以及中国浙江省医药卫生科技计划项目（2021KY110，2024KY824）的资助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
0.5% 胰蛋白酶-EDTAGibco15400-054用 PBS 稀释 10 倍，配制成 0.05% 胰蛋白酶
1x Tris 缓冲盐溶液 (TBS)1st BASEBUF-3030-1X1L用于 Western 印迹中的膜洗涤
1.5 M Tris 缓冲液，pH 8.81st BASEBUF-1419-1L-pH8.8用于 SDS 凝胶制备
2-巯基乙醇Sigma AldrichM7522-100ML用于 Western 印迹样品制备
30% 丙烯酰胺/Bis 溶液Bio-Rad#1610158用于 SDS 凝胶制备
4x Laemmli 缓冲液Bio-Rad#1610747用于 Western 印迹样品制备
96 孔白色聚苯乙烯微孔板，透明平底Corning Incorporated3610用于 ADCC 检测
ADCC 生物检测试剂细胞 (0.65 mL)PromegaG7011包含于 ADCC 报告基因生物检测试剂盒核心套装 (Promega G7010) 中，1 瓶 × 1 瓶
ADCC 报告基因生物检测试剂盒核心套装PromegaG7010本实验中提及的 ADCC 检测试剂盒，用于 ADCC 检测
过硫酸铵Sigma AldrichA3678-25G用于 SDS 凝胶制备
贝伐珠单抗（人源化抗 VEGF 抗体）MVASI-在 ADCC 检测中用作阴性对照抗体
BHT-101Leibniz Institute DSMZACC279人未分化乳头状甲状腺癌细胞系 
Bio-Glo 荧光素酶检测试剂缓冲液PromegaG7941包含于 ADCC 报告基因生物检测试剂盒核心套装 (Promega G7010) 中，1 × 10 mL
Bio-Glo 荧光素酶检测试剂底物（冻干粉）PromegaG7941包含于 ADCC 报告基因生物检测试剂盒核心套装 (Promega G7010) 中，1 瓶 × 1 瓶
细胞刮刀GenFollowerGD00235用于从培养瓶中刮取细胞
西妥昔单抗（嵌合型抗 EGFR 抗体）ERBITUX-在 ADCC 检测中用作治疗性抗体
化学发光 HRP 底物Merck MilliporeWBKLS0500用于 Western 印迹中的蛋白检测
蒸馏水Gibco15230-162用于 SDS 凝胶制备
胎牛血清 (FBS)Gibco10270-106培养基补充剂
iBright CL1500 成像系统Thermo Scientific2462621100038用于 Western 印迹中的蛋白检测
L-谷氨酰胺，200 mMGibco25030-081培养基补充剂
低 IgG 血清PromegaG7110包含于 ADCC 报告基因生物检测试剂盒核心套装 (Promega G7010) 中，1 × 4 mL
Megafuge 8RThermo Scientific42876589离心机
小鼠抗 EGFR 单克隆抗体BD Biosciences610016Western 印迹中的一抗
小鼠抗 VEGFR 单克隆抗体BD Biosciences571194Western 印迹中的一抗
非酶解细胞解离缓冲液Sigma AldrichC5789-100ML用于从 T75 培养瓶中收获细胞
青霉素-链霉素PAN BiotechP06-07100培养基中的抗菌剂
磷酸盐缓冲液 (PBS)，pH 7.2，无菌过滤1st BASECUS-2048-1x1L用作细胞洗涤液
Pierce BCA 蛋白定量检测试剂盒Thermo Scientific23225用于测定蛋白浓度
蛋白酶和磷酸酶抑制剂Thermo ScientificA32959用于 Western 印迹样品制备中的蛋白降解抑制
PVDF 膜 (Immobilin-P)Merck MilliporeIPVH00010用于 Western 印迹中的蛋白转膜
兔抗小鼠 IgG Fcγ HRP 标记二抗Jackson ImmunoResearch315-035-046Western 印迹中的二抗
罗斯韦尔帕克纪念研究所 (RPMI) 培养基Capricorn ScientificRPMI-XA细胞培养基
RPMI-1640PromegaG7080包含于 ADCC 报告基因生物检测试剂盒核心套装 (Promega G7010) 中，1 × 36 mL
脱脂奶粉Merck Millipore70166-500G用于 Western 印迹中的膜封闭
十二烷基硫酸钠1st BASEBIO-2050-500g用于 SDS 凝胶制备
SW-1736Cytion300453人甲状腺鳞状细胞癌细胞系
T75 培养瓶SPL Lifesciences70075细胞培养瓶
Tecan Spark 10M 多功能酶标仪Tecan1607000294用于发光信号定量
TEMEDBio-Rad#1610801用于 SDS 凝胶制备
Tween-20PromegaH5151用于 Western 印迹中的膜洗涤
Vi-cell XR 细胞活力分析仪Beckman CoulterAL15072细胞计数仪

参考文献

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