本文介绍了一种利用ADCC生物检测试剂盒进行抗体依赖性细胞介导的细胞毒性（ADCC）实验的方案。该方法为阐明ADCC机制以及评估抗体在癌症免疫治疗中的治疗潜力提供了有力的工具。
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方法文章
使用抗体依赖性细胞介导的细胞毒性报告基因生物测定法评估癌细胞中的抗体依赖性细胞介导的细胞毒性
* These authors contributed equally
本文内容
摘要
摘要
抗体依赖性细胞介导的细胞毒性（ADCC）方法是评估治疗性抗体在癌症免疫治疗中疗效的重要工具。在癌细胞中评估ADCC活性对于基于抗体的治疗方法的开发与优化至关重要。本文提出一种利用ADCC生物检测试剂盒定量评估ADCC反应的方法学方案，以甲状腺癌细胞作为效应细胞。该方案包括在治疗性抗体存在的条件下，将效应细胞与靶向癌细胞以不同比例共培养。本实验所用的ADCC生物检测试剂盒包含经基因工程改造的效应细胞，这些细胞携带受活化T细胞核因子（NFAT）反应元件调控的荧光素酶报告基因。当靶细胞表面抗原与抗体及效应细胞结合后，效应细胞释放荧光素酶，从而可通过检测发光信号定量细胞毒性。与传统的ADCC检测方法相比，该方法能够验证靶抗原与抗体及效应细胞之间的结合，可在较短时间内获得可靠结果。
引言
抗体依赖性细胞介导的细胞毒性（ADCC）是抗体发挥免疫介导杀伤细胞作用的重要机制1,2,3。免疫细胞通过与治疗性抗体结合而被激活，该抗体可与靶细胞表面抗原相互作用，进而释放颗粒酶和穿孔素，导致靶细胞死亡。参与此过程的免疫细胞包括自然杀伤（NK）细胞和中性粒细胞2,3,4,5,6,7。ADCC 检测已成为评估治疗性抗体功效的重要工具8,9。
在传统的ADCC检测中，通常使用外周血单个核细胞（PBMCs）或自然杀伤细胞作为效应细胞，通过定量靶细胞的死亡率来评估治疗性抗体的效力。我们的方法采用一种ADCC生物检测试剂盒，该试剂盒包含经过基因工程改造....
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方案
1. 检测靶细胞中EGFR和VEGFR的表达
注意：使用蛋白质印迹法检测目标细胞中目标抗原的表达。
- 样品制备
- 使用添加10%胎牛血清（FBS）、1% L-谷氨酰胺和1%抗生素（青霉素-链霉素）的RPMI（Roswell Park Memorial Institute）培养基，在T75培养瓶中培养细胞（BHT-101和SW-1736人甲状腺癌细胞系）。
- 当细胞融合度达到80%时，吸除培养基，并用PBS洗涤细胞。加入5 mL PBS，使用细胞刮刀刮取细胞以从培养瓶中收集细胞，将细胞悬液转移至15 mL锥形管中。
- 使用细胞计数仪对细胞进行计数。
- 将5 × 106个BHT-101和SW-1736细胞分别分装至15 mL锥形管中。
- 在室温下以135 × g离心5分钟，沉淀细胞，弃去上清PBS。
- 加入含蛋白酶-磷酸酶抑制剂的100 µL RIPA裂解缓冲液，冰上裂解5分钟。将裂解液转移至2 mL离心管中，以15,000 × g离心15分钟，将上清液转移至新的2 mL离心管中。
- 使用BCA（二辛可宁酸）蛋白定量试剂盒测定细胞裂解液中的蛋白浓度。
- 从每个样品的细胞裂解液中取70 µg蛋白，加入含10% ....
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结果
采用蛋白质印迹法检测靶细胞BHT-101和SW-1736中EGFR和VEGFR的表达。在BHT-101和SW-1736细胞中均检测到EGFR的表达，但未检测到VEGFR的表达（图3）。
使用ADCC生物测定试剂盒，我们检测了抗EGFR抗体西妥昔单抗（cetuximab）在EGFR阳性细胞系BHT-101和SW-1736中诱导的ADCC反应，以这两种细胞系作为靶细胞。贝伐珠单抗（bevacizumab，一种VEGF抑制剂）被用作阴性对照抗体。将不同浓度的抗体和效应细胞与靶细胞共同孵育，随后使用酶标仪检测发光信号（图2）。结果显示，西妥昔单抗（抗EGFR抗体）组均表现出更高的ADCC活性诱导倍数，而贝伐珠单抗（VEGF拮抗剂）在两种细胞系中均未检测到ADCC活性。该结果表明，针对EGFR细胞外膜抗原的ADCC效应在两种细胞系中均存在。通过本方法，验证了西妥昔单抗在两种未分化型甲状腺癌细胞系（BHT101和SW1736）中可诱导ADCC反应（
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讨论
本文介绍了用于评估治疗性抗体ADCC反应的ADCC生物测定方法。该方法操作简便，采用简单的“加入-混匀-检测”模式进行测量。
在进行实验之前，必须通过流式细胞术或蛋白质印迹法确认目标抗原在目标细胞中的表达。流式细胞术是检测细胞表面抗原的更佳工具。然而，使用流式细胞术可能对细胞造成应激，引发细胞凋亡，影响细胞活力，从而干扰整体分析结果。此外，其成本高于蛋白质印迹法。在本实验中，由于目标抗原为已知的细胞表面抗原，我们采用蛋白质印迹法作为更快且更具成本效益的方法。
使用经基因工程改造的Jurkat细胞作为效应细胞，该细胞稳定表达FcγRIIIa受体的V158（高亲和力）变异体，以及驱动萤光素酶表达的NFAT反应元件。NFAT通路的激活可导致萤光素酶的产生，其活性通过发光信号进行定量检测。该信号也代表了抗体依赖性细胞介导的细胞毒性（ADCC）的活性。
首先，在37 °C、湿润的CO2培养箱中，将靶细胞（T）与效应细胞（E）在96孔板中共同孵育6小时，同时加入.......
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披露
所有作者均声明无利益冲突。
致谢
感谢曾教授（新加坡A*STAR研究所分子与细胞生物学研究院）对本工作的支持。本研究得到了中国国家自然科学基金青年基金（NSFC）（82202231）以及中国浙江省医药卫生科技计划项目（2021KY110，2024KY824）的资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 0.5% 胰蛋白酶-EDTA | Gibco | 15400-054 | 用 PBS 稀释 10 倍，配制成 0.05% 胰蛋白酶 |
| 1x Tris 缓冲盐溶液 (TBS) | 1st BASE | BUF-3030-1X1L | 用于 Western 印迹中的膜洗涤 |
| 1.5 M Tris 缓冲液，pH 8.8 | 1st BASE | BUF-1419-1L-pH8.8 | 用于 SDS 凝胶制备 |
| 2-巯基乙醇 | Sigma Aldrich | M7522-100ML | 用于 Western 印迹样品制备 |
| 30% 丙烯酰胺/Bis 溶液 | Bio-Rad | #1610158 | 用于 SDS 凝胶制备 |
| 4x Laemmli 缓冲液 | Bio-Rad | #1610747 | 用于 Western 印迹样品制备 |
| 96 孔白色聚苯乙烯微孔板，透明平底 | Corning Incorporated | 3610 | 用于 ADCC 检测 |
| ADCC 生物检测试剂细胞 (0.65 mL) | Promega | G7011 | 包含于 ADCC 报告基因生物检测试剂盒核心套装 (Promega G7010) 中，1 瓶 × 1 瓶 |
| ADCC 报告基因生物检测试剂盒核心套装 | Promega | G7010 | 本实验中提及的 ADCC 检测试剂盒，用于 ADCC 检测 |
| 过硫酸铵 | Sigma Aldrich | A3678-25G | 用于 SDS 凝胶制备 |
| 贝伐珠单抗（人源化抗 VEGF 抗体） | MVASI | - | 在 ADCC 检测中用作阴性对照抗体 |
| BHT-101 | Leibniz Institute DSMZ | ACC279 | 人未分化乳头状甲状腺癌细胞系 |
| Bio-Glo 荧光素酶检测试剂缓冲液 | Promega | G7941 | 包含于 ADCC 报告基因生物检测试剂盒核心套装 (Promega G7010) 中，1 × 10 mL |
| Bio-Glo 荧光素酶检测试剂底物（冻干粉） | Promega | G7941 | 包含于 ADCC 报告基因生物检测试剂盒核心套装 (Promega G7010) 中，1 瓶 × 1 瓶 |
| 细胞刮刀 | GenFollower | GD00235 | 用于从培养瓶中刮取细胞 |
| 西妥昔单抗（嵌合型抗 EGFR 抗体） | ERBITUX | - | 在 ADCC 检测中用作治疗性抗体 |
| 化学发光 HRP 底物 | Merck Millipore | WBKLS0500 | 用于 Western 印迹中的蛋白检测 |
| 蒸馏水 | Gibco | 15230-162 | 用于 SDS 凝胶制备 |
| 胎牛血清 (FBS) | Gibco | 10270-106 | 培养基补充剂 |
| iBright CL1500 成像系统 | Thermo Scientific | 2462621100038 | 用于 Western 印迹中的蛋白检测 |
| L-谷氨酰胺，200 mM | Gibco | 25030-081 | 培养基补充剂 |
| 低 IgG 血清 | Promega | G7110 | 包含于 ADCC 报告基因生物检测试剂盒核心套装 (Promega G7010) 中，1 × 4 mL |
| Megafuge 8R | Thermo Scientific | 42876589 | 离心机 |
| 小鼠抗 EGFR 单克隆抗体 | BD Biosciences | 610016 | Western 印迹中的一抗 |
| 小鼠抗 VEGFR 单克隆抗体 | BD Biosciences | 571194 | Western 印迹中的一抗 |
| 非酶解细胞解离缓冲液 | Sigma Aldrich | C5789-100ML | 用于从 T75 培养瓶中收获细胞 |
| 青霉素-链霉素 | PAN Biotech | P06-07100 | 培养基中的抗菌剂 |
| 磷酸盐缓冲液 (PBS)，pH 7.2，无菌过滤 | 1st BASE | CUS-2048-1x1L | 用作细胞洗涤液 |
| Pierce BCA 蛋白定量检测试剂盒 | Thermo Scientific | 23225 | 用于测定蛋白浓度 |
| 蛋白酶和磷酸酶抑制剂 | Thermo Scientific | A32959 | 用于 Western 印迹样品制备中的蛋白降解抑制 |
| PVDF 膜 (Immobilin-P) | Merck Millipore | IPVH00010 | 用于 Western 印迹中的蛋白转膜 |
| 兔抗小鼠 IgG Fcγ HRP 标记二抗 | Jackson ImmunoResearch | 315-035-046 | Western 印迹中的二抗 |
| 罗斯韦尔帕克纪念研究所 (RPMI) 培养基 | Capricorn Scientific | RPMI-XA | 细胞培养基 |
| RPMI-1640 | Promega | G7080 | 包含于 ADCC 报告基因生物检测试剂盒核心套装 (Promega G7010) 中，1 × 36 mL |
| 脱脂奶粉 | Merck Millipore | 70166-500G | 用于 Western 印迹中的膜封闭 |
| 十二烷基硫酸钠 | 1st BASE | BIO-2050-500g | 用于 SDS 凝胶制备 |
| SW-1736 | Cytion | 300453 | 人甲状腺鳞状细胞癌细胞系 |
| T75 培养瓶 | SPL Lifesciences | 70075 | 细胞培养瓶 |
| Tecan Spark 10M 多功能酶标仪 | Tecan | 1607000294 | 用于发光信号定量 |
| TEMED | Bio-Rad | #1610801 | 用于 SDS 凝胶制备 |
| Tween-20 | Promega | H5151 | 用于 Western 印迹中的膜洗涤 |
| Vi-cell XR 细胞活力分析仪 | Beckman Coulter | AL15072 | 细胞计数仪 |
参考文献
- Zahavi, D., AlDeghaither, D., O'Connell, Enhancing antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity: a strategy for improving antibody-based immunotherapy. Antib Ther. 1 (1), 7-12 (2018).
- Fenis, A., Demaria, O., Gauthier, L., Vivier, E. New immune cell engag....
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