血浆来源的细胞外囊泡的分离、表征和蛋白质组学分析用于心血管生物标志物的发现

Summary

本文介绍了一种分离、表征和定量人血浆衍生的细胞外囊泡 （EV） 的方法，并介绍了一种使用液相色谱-串联质谱 （LC-MS/MS） 对 EV 蛋白质组进行无标记分析的工作流程。

Abstract

细胞外囊泡 （EV） 是细胞来源的、脂质双层封闭的、不可复制的纳米颗粒。EV 目前在心血管研究中受到关注，因为它们在调节细胞间通讯中的作用，可能作为心血管疾病的有价值的生物标志物。然而，EV 蛋白质组及其作为心血管诊断生物标志物的潜力仍然知之甚少。该协议提出了一种标准化方法，用于分离和定量血浆衍生的 EV 以及使用来自大型大学医院胸痛科的患者的血浆样本分析其蛋白质货物。常规静脉切开术后，通过差速超速离心从血浆中分离 EV。通过免疫印迹可视化 EV 分离株中特异性 EV 标志蛋白的富集，并通过纳米颗粒跟踪分析量化平均尺寸分布和血浆 EV 浓度。最后，采用超高效液相色谱-串联质谱法对 EV 蛋白质组进行无标记分析。因此，该协议提供了一种全面的方法来研究和使用血浆衍生的 EV 作为关键生物信息的潜在载体，以及探索它们作为新型生物标志物的潜力。

Introduction

细胞外囊泡 （EV），根据命名法没有统一定义，是被脂质双层包围并被各种细胞类型释放的纳米颗粒，缺乏复制能力¹.这个多样化的组包括外泌体，外泌体是内体来源的 EV 亚群，直径通常约为 40 nm 至 160 nm2^。EV 可在多种体液中检测到³，通过转移各种活性生物分子（如蛋白质、mRNA、microRNA 和脂质）来促进细胞间通讯。因此，EV 通过细胞特异性表面标志物和生物分子提供有关其起源细胞的信息，其特性受亲本细胞状况及其环境的强烈影响⁴。这些特性导致人们对 EV 作为生物标志物的潜在作用越来越感兴趣，尤其是在心血管疾病的背景下。

大量体外和体内研究表明，心肌低氧应激导致 EV 释放增加 ^5,6,7。当代对 EV 货物的研究主要集中在 EV 结合的 microRNA 上，它有可能作为各种心血管疾病诊断的生物标志物 ^8,9,10。相比之下，关于循环 EV 蛋白质组的证据仍然相对稀少，调查心血管患者血浆 EV 的研究更少。在对心肌梗死患者血浆衍生 EV 的两项综合研究中，作者确定了一种具有潜在诊断相关性的缺血诱导的特异性 EV 蛋白质组谱 ^6,11。

EV 的方法处理历来被证明具有挑战性，目前，没有关于 EV 分离、表征和定量的最佳方法的明确建议。EV 分离的常用方法包括差速超速离心、密度梯度离心和过滤方法，例如体积排阻色谱¹。根据目前的共识指南，EV 分离株的表征应包括至少三种典型 EV 表面蛋白标志物的证据，例如四跨膜蛋白或膜联蛋白，并结合成像方式¹。为了在蛋白质水平上检查 EV 货物，最常使用基于抗体的方法，例如 Western blot 或 ELISA。

鉴于与循环 EV 的分离和处理相关的方法学挑战，该方案提出了从患者招募和样本采集到随后的 EV 分离、表征和血浆 EV 分离物定量的综合途径。此外，本研究还展示了一种从德国西南部一家三级医疗中心急诊科（胸痛科）就诊的患者中立即分离血浆衍生 EV 的工作流程，然后使用液相色谱-串联质谱法 （LC-MS/MS） 对疾病特异性血浆 EV 蛋白质组进行无标记分析。目的是促进高通量分析，以在初始诊断以及整个疾病进展和/或消退过程中，在患有各种缺血性、先天性或（自身）免疫性心血管疾病的大量患者中识别差异富集的 EV 结合蛋白。这种蛋白质组学筛选方法旨在确定与不同疾病通路相关的 EV 特异性蛋白富集模式，最终目标是发现新的 EV 结合蛋白生物标志物，以加强当前心血管疾病的诊断和治疗监测。

Protocol

对于该方案，招募了一个示例患者队列，包括 3 名没有明显或潜在心血管疾病迹象的健康对照患者和 2 名非 ST 段抬高型心肌梗死 （NSTEMI） 患者。海德堡大学医学院机构审查委员会事先批准（IRB 批准 #S-351/2015），并在招募前获得所有患者的书面同意。患者是根据最初的临床表现、病史和诊断检测结果从海德堡大学医院心脏病科胸痛科招募的。

健康对照患者的纳入标准包括非典型或非特异性临床表现、心脏生物标志物水平在正常范围内、无心血管疾病史以及任何进一步诊断性检查结果正常。排除标准包括过去五年内恶性肿瘤或细胞抑制治疗史、血液透析、家族性高脂血症综合征以及任何心血管疾病史。根据现行指南¹² 诊断为 NSTEMI，通过冠状动脉造影证实血流动力学相关的冠状动脉狭窄。对于每位患者， 通过 标准静脉切开术¹³ 从肘前静脉收集多达 36 mL 血液到补充柠檬酸盐的收集管中，并立即在 4 °C 下运输血样进行进一步处理。本研究中使用的试剂和设备的详细信息列在 材料表中。

1. 使用差压离心法进行 EV 隔离

注:采用差速离心方案从人血浆样品中分离 EV。进行两个超速离心 （UC） 循环，离心力增加，以最大限度地提高所得 EV 颗粒的纯度。

1. 血浆分离
   1. 在采集后 120 分钟内开始处理在 4 °C 下冷却的全血样品，以确保血浆 EV 的完整性。使用补充柠檬酸盐的采血管（0.106 mol/L 柠檬酸盐）以防止凝血。
   2. 在冰冷的磷酸盐缓冲盐水 （PBS） 中以 1:1 的比例稀释 9 mL 柠檬酸盐全血以降低粘度。在离心过程中加入 5 mL 密度梯度培养基 （1.077 g/mL） 进行分离。
   3. 在 4 °C 下以 600 × g 离心 25-30 分钟。 小心地将每根色谱柱顶部的血浆馏分移出到专用离心管中。继续下一步或在 -80 °C 冷冻。
2. 去除细胞碎片和凋亡小体
   1. 使用带有固定角转子的超速离心机在 4 °C 下以 20,000 × g 离心血浆 15 分钟，不要制动。在试管底部应形成可见的细胞碎片和凋亡小体沉淀。
3. EV 隔离
   1. 将上清液转移到新试管中。在 4 °C 下以 100,000 × g 超速离心 2 小时，不制动，以分离 EV，这将在管壁上形成可见的颗粒。
   2. 使用电动移液器小心吸出上清液，留下约 1 mL EV 耗尽的血浆。对于剩余的血浆，改用 1000 μL 移液器，缓慢移液以避免干扰 EV 沉淀。移液时逐渐倾斜试管，以确保试管中没有血浆残留。
4. 下游分析的准备工作
   1. 根据下游分析要求重悬分离的 EV 沉淀:对于纳米颗粒追踪，将 9 mL 全血中的 EV 沉淀重悬于 200 μL PBS 中;对于 LC-MS/MS，将从 36 mL 全血中分离的 EV 重悬于 50 μL 含 1% 蛋白酶/磷酸酶抑制剂的 1x RIPA 缓冲液中
   2. 将重悬的 EV 沉淀转移到 1.5-2 mL 试管中。储存在 -80 °C 直至进一步分析或根据需要进行。

2. 纳米粒子跟踪分析

注:使用纳米颗粒跟踪分析 （NTA） 对人血浆样品中的平均 EV 尺寸分布进行量化，NTA 是一种基于激光的检测方法，可分析纳米颗粒的布朗运动。

1. NTA 的工作稀释度
   1. 用冰冷的 PBS 以 1:10、1:50、1:100 和 1:200 的比例稀释 EV 储备液（EV 沉淀重悬于 200 μL PBS 中）。创建各种工作稀释度，以确定最合适的稀释度，以便在纳米粒子跟踪期间实现每帧 10-100 个纳米粒子的最终计数。
2. 运行 NTA
   1. 打开 NTA 仪器并在连接的计算机上启动适用的软件。将腔室放入激光棺材内，然后单击 开始相机 激活它。
   2. 将 1 mL PBS 吸入注射器中。将注射器插入前管并彻底冲洗管道系统，确保腔室中没有空气残留。监控摄像头以检测任何气泡或污染颗粒。
   3. 在 1 mL 注射器中吸取准备好的 EV 工作稀释液，然后将其注入腔室。
   4. 调整 Screen Gain 以匹配 Capture 和 Process 选项卡中的显示器亮度。修改 Camera Level 以在屏幕上清晰区分纳米颗粒。
   5. 在 Process 选项卡中设置合适的 Detection Threshold，以调整区分粒子与背景噪声的灵敏度。对于同一实验中的所有测量值，请保持该值恒定。
   6. 使用轮子将相机聚焦在仪器的每一侧，直到纳米颗粒在屏幕上出现清晰。
   7. 在 Hardware 设置中为所有测量设置一个恒定温度（理想情况下为 22 °C），因为 Brownian 运动与温度有关。
   8. 单击 Run 按钮开始测量。在弹出窗口中输入样品 ID 和溶剂。
   9. 每次样品运行至少录制三个 30 秒的视频。在两次测量之间推进样品，以捕获纳米颗粒溶液的代表性样品。如果有注射泵，请将其设置为恒定速度并连续记录。
   10. 记录后，软件会自动计算纳米颗粒的浓度和尺寸分布。单击 Change（更改 ）以输入用于样品的稀释因子，然后单击 Export（导出）保存结果。
3. 数据分析
   1. 使用统计软件程序中的输出文件分析结果。

使用液相色谱-串联质谱法 （LC-MS/MS） 对 EV 蛋白质组进行无标记分析

注意: 在膜裂解后，通过 EV 蛋白的凝胶电泳进行初始蛋白质分离，进行无标记 EV 蛋白质组分析。用胰蛋白酶进行凝胶内蛋白质消化后，使用 LC-MS/MS 分析肽，并将单个谱图与人蛋白质组数据库进行匹配。值得注意的是，如果需要对 EV 裂解物进行非靶向分析，建议在不事先选择特定分子量范围的情况下进行鸟枪法蛋白质组学，因此不需要该方案的步骤 3.1.1-3.1.7。

1. 凝胶内胰蛋白酶消化
   1. 根据制造商的说明，通过添加Laemmli上样缓冲液，制备重悬于1x RIPA缓冲液中的EV溶液（参见 材料表）。将样品在 95 °C 下煮沸 5 分钟。
   2. 将补充有上样缓冲液的 EV 样品以及蛋白质分子量标准加载到 4%-12% Bis-Tris 凝胶上，用于十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳 （SDS-PAGE）¹⁴。用考马斯蓝对凝胶染色 1-4 小时以观察蛋白质条带。孵育过夜，用水对凝胶进行脱色。
   3. 使用手术刀刀片从含有感兴趣蛋白质的凝胶区域切除考马斯染色条带。
   4. 用 60 μL 1:1 （v/v） 50 mM 碳酸氢三铵缓冲液 （TEAB） 和乙腈 （ACN），pH 8.5 洗涤凝胶块 10 分钟。在 60 μL ACN 中将凝胶块收缩 3 次，每次 10 分钟。用 60 μL 50 mM TEAB （pH 值 8.5） 再次洗涤。
   5. 在 57 °C 下用 100 mM TEAB 中的 10 mM 二硫苏糖醇 （DTT） 减少蛋白质 30 分钟，并使凝胶块脱水。
   6. 在 25 °C 下，在 100 mM TEAB 中用 10 mM 碘乙酰胺 （IAA） 烷基化蛋白质 20 分钟。
   7. 用 60 μL 的 100 mM TEAB 洗涤凝胶块，并在 60 μL 的 ACN 中收缩两次，每次 10 分钟。
   8. 向干燥的凝胶块中加入 50 mM TEAB 胰蛋白酶溶液，相应浓缩。在 37 °C 下孵育 4 小时。 加入 20 μL 0.1% 三氟乙酸 （TFA） 淬灭反应。
   9. 通过与 30 μL 1:1 （v/v） 0.1% TFA 和 ACN 孵育 30 分钟来提取所得肽。用 20 μL 乙腈脱水凝胶 20 分钟，然后再次用 30 μL 100 mM TEAB 洗涤 20 分钟。
   10. 用 20 μL 乙腈收缩凝胶两次，每次 20 分钟。
   11. 将每个提取步骤中收集的上清液浓缩在真空离心机中，并将样品溶解在 15 μL 0.1% TFA 中。
2. LC-MS/MS 分析
   1. 使用与静电离子阱分析仪联用的高分辨率液相色谱质谱仪进行纳流 LC-MS/MS 分析。
   2. 使用 0.1% 甲酸 （FA）/1% ACN 作为溶剂 A，使用 0.1% FA/89.9% ACN 作为溶剂 B。
   3. 以 25 分钟线性梯度分离肽:从 3% 溶剂 B 开始，在 21 分钟内将 B 增加到 23%，然后在 4 分钟内增加到 38%，然后在 95% B 下进行冲洗。
   4. 在数据依赖性采集模式下作质谱仪，在 MS 和 MS2 之间自动交替。在 m/z 400 处采集分辨率为 60,000 的 MS 谱图 （m/z 400-1600），使用归一化碰撞能量 27 和 1.4 m/z 的隔离宽度生成多达 15 个母离子的 MS2 谱图。
3. 蛋白质数据库搜索
   1. 使用带有 Sequest HT 的 Proteome Discoverer 2.5，对照 Swiss-Prot Homo sapiens（UP000005640,2020 年 6 月）蛋白质数据库和自定义污染物数据库（MaxQuant 的一部分，MPI Martinsried^15,16）搜索 MS/MS 谱图。
   2. 按如下方式配置程序设置:将碎片离子质量容差设置为 0.02 Da，将母离子质量容差设置为 5 ppm。指定胰蛋白酶作为用于消化的酶，并将脲甲基设置为半胱氨酸的固定修饰，其中氧化（蛋氨酸）和脱酰胺化（天冬酰胺、谷氨酰胺）作为可变修饰。包括乙酰化、蛋氨酸丢失及其组合作为蛋白质末端的可变修饰。
   3. 使用母离子定量模式定量肽，采用前 N 个平均值 （n = 3） 方法计算蛋白质丰度¹⁷。

Results

使用已建立的分类超速离心方案，从无明显心血管疾病患者和非 ST 段抬高型心肌梗死 （NSTEMI;n = 2） 患者的血浆样本 （n = 3） 中分离 EV。与来自同一患者的 EV 耗尽血浆相比，通过 EV 分离株中富含 EV 的蛋白 TSG-101、膜联蛋白 5 （Anx5） 和 CD9 的免疫印迹证实血浆 EV 的充分分离（图 1A）。转铁蛋白作为阴性对照，在 EV 耗尽的血清样品中发现，但在 EV 分离株中未检测到，证实了隔室的充分分离。在分离的血浆样品中对整合素 β3（一种常见的血小板标志物）和载脂蛋白 A1（一种脂蛋白污染标志物）进行免疫印迹显示，血液处理后没有明显的污染（补充图 1）。

使用纳米粒子跟踪分析，根据布朗运动识别和可视化 EV（图 1B）。在我们的健康患者队列中，测量到每毫升血浆 1.2 x 10¹⁰ ± 6.0 x 10⁹ 颗粒的平均颗粒浓度（

Discussion

该方案为血浆 EV 的分离和表征提供了一种真实世界的、循序渐进的、即用型的方法，并介绍了适合整合到常规临床实践中的未标记蛋白质组分析。从血浆样品中分离 EV 的详细描述和严格遵守统一的方法对于确保所获结果的可重复性非常重要。目前的文献表明，分析前条件会显著影响 EV 分离株的后续测量和下游分析。因此，及时开始血浆衍生的 EV 分离过程至关重要，最好在采血后 120 分钟内开始，同时以最小的搅拌处理样品¹⁸。在 4 °C 下可以实现采集血液的短期保存;然而，除了时间和搅拌之外，较低的温度也可能促进血小板活化，导致血小板衍生的 EV^19,20 的释放。虽然这些 EV 可以构成总 EV 产量的丰富组成部分，但通过特定的分析前考虑，可以充分避免它们的存在 21,22,23。

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
4x Laemmli 样品增益	Bio-rad	1610747
10x RIPA 缓冲液	Abcam	ab156034
26.3 mL 聚碳酸酯瓶，带盖组件，用于超速离心	Beckman Coulter	355654
5810R 台式离心机	Eppendorf	5811000015
乙腈 （ACN）	Biosolve	0001204101BS
二硫苏糖醇 （DTT）	Sigma-Aldrich	43816-10ML
Dulbecco's 磷酸盐缓冲盐水 （PBS）	Sigma-Aldrich	D8537
甲酸 99% ULC/MS 100	Biosolve	0006914143BS
组织曲醇 - 1077	Sigma-Aldrich	10771
碘乙酰胺 （IAA）	Sigma-Aldrich	I6125-5G
质谱仪 Orbitrap Q Exactive HF	Thermo Fisher Scientific	IQLAAEGAAPFALGMBDK
MOPS SDS 运行缓冲液	Thermo Fisher	B0001
NanoSight NS300	Malvern Panalytical	NS300
Nanosight NTA 3.2 软件	Malvern Panalytical
新页 4 bis 12 %， Bis-Tris 蛋白凝胶	Invitrogen	NP0323
Optima XPN-80 落地式超速离心机	Beckman Coulter	521-4180
PageRuler Plus 预染蛋白分子量标准	Thermo Fisher Scientific	26619
蛋白酶/磷酸酶抑制剂混合物 （100X）	Cell Signaling Technology	5872S
蛋白标记物	Thermo Fisher	26616
蛋白质组探测器 2.5	Thermo Fisher
Q Exactive Plus 混合型四极杆-Orbitrap 质谱仪	Thermo Fisher Scientific	IQLAAEGAAPFALGMBDK
快速染色 coomasssie	Serva	35081.01
ReproSil-Pur 120 C18-AQ， 1.9 µm 1 g	Dr. Maisch	r119.aq.0001
SDS-PAGE 商用凝胶	Thermo Fisher	NW00100BOX
S-Monovette Citrat 9NC 0.106 mol/l 3,2%	Sarstedt	02.1067.001
速真空浓缩器	Savant
Swiss-Prot （Uniprot） Homo sapiens（UP000005640,2020 年 6 月）蛋白质数据库	UniProt	https://www.uniprot.org/proteomes/UP000005640
碳酸氢三铵缓冲液 （TEAB）	Sigma-Aldrich	T7408
三氟乙酸 （TFA）用于 HPLC >99%、100 mL	Sigma-Aldrich	302031-100ML
胰蛋白酶 MS 级	Thermo Fisher	90058
型 50.2 Ti 固定角转子	Beckman Coulter	337901
UHPLC Dionex Ultimate 3000	Thermo Fisher Scientific	ULTIM3000RSLCNANO
Water	Biosolve	0023214102BS