本文介绍了一种分离、表征和定量人血浆来源的细胞外囊泡（EV）的方法，并提供了一个利用液相色谱-串联质谱法（LC-MS/MS）对EV蛋白质组进行无标记分析的工作流程。
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方法文章
用于心血管生物标志物发现的血浆来源细胞外囊泡的分离、表征及蛋白质组学分析
* These authors contributed equally
本文内容
摘要
摘要
细胞外囊泡（EV）是一类由细胞产生、具有脂质双分子层结构且不可复制的纳米颗粒。由于EV在调控细胞间通讯中发挥重要作用，并可能作为心血管疾病的有价值生物标志物，目前其在心血管研究领域受到广泛关注。然而，EV的蛋白质组及其在心血管诊断中作为生物标志物的潜力仍不甚明确。本实验方案提供了一种标准化的方法，用于从大型大学医院胸痛门诊患者血浆样本中分离和定量血浆来源的EV，并分析其携带的蛋白质成分。在常规静脉采血后，通过差速超速离心法从血浆中分离EV。利用免疫印迹技术检测EV分离物中特异性EV标志蛋白的富集情况，并通过纳米颗粒追踪分析法测定EV的平均粒径分布及血浆中EV的浓度。最后，采用超高效液相色谱-串联质谱技术对EV蛋白质组进行非标记定量分析。因此，本方案为研究血浆来源EV作为关键生物学信息载体的潜力，以及探索其作为新型生物标志物的应用提供了全面的技术路径。
引言
细胞外囊泡（EV）尚无统一命名标准，是一类由脂质双分子层包裹的纳米级颗粒，可由多种细胞类型释放，且不具备自我复制能力1。该类囊泡包含多种亚群，其中外泌体（exosomes）来源于内体系统，是EV的一个亚群，直径通常在约40 nm至160 nm之间2。EV可在多种体液中被检测到3，通过传递蛋白质、mRNA、微小RNA（microRNA）和脂质等多种活性生物分子，介导细胞间通讯。因此，EV可通过其表面特异性标记物及所携带的生物分子反映来源细胞的信息，其特性受母体细胞状态及其微环境的显著影响4。这些特征使得EV作为生物标志物的潜力日益受到关注，尤其在心血管疾病领域具有重要研究价值。
大量体外（in vitro）和体内（in vivo）研究表明，心肌缺氧应激会导致细胞外囊泡（EV）释放增加5,6,7。目前关于EV内容物的研究主要集中在EV结合的微小RNA（microRNA），其在多种心血管疾病诊断中具有作为生物标志物的潜力8
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方案
本方案纳入了一个示例性患者队列，包括三名无明显或潜在心血管疾病迹象的健康对照者，以及两名非ST段抬高型心肌梗死（NSTEMI）患者。研究已获得海德堡大学医学院机构审查委员会的批准（IRB批准号：S-351/2015），所有患者在入组前均签署了书面知情同意书。患者根据初始临床表现、病史及诊断检测结果，从海德堡大学医院心内科胸痛门诊招募。
健康对照组的纳入标准包括非典型或非特异性临床表现、心脏生物标志物水平在正常范围内、无心血管疾病病史，以及任何进一步诊断检查结果正常。排除标准包括过去五年内有恶性肿瘤或细胞毒性治疗史、血液透析史、家族性高脂血症综合征，以及任何心血管疾病病史。非ST段抬高型心肌梗死（NSTEMI）的诊断依据现行指南进行。12，通过冠状动脉造影证实存在血流动力学显著的冠状动脉狭窄。每位患者从肘前静脉采集最多36 mL血液，置于含柠檬酸盐的采血管中 通过 标准静脉采血13，并将血液样本立即在4 °C条件下运输以进行后续处理。本研究中所用试剂和设备的详细信息列于下文 材料表.
1. 使用差速离心法分离细胞外囊泡
注意：采用差速离心法从人血浆样本中分离细胞外囊泡（EV）。通过两次超速离心....
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结果
采用既定的差速超速离心法，从无明显心血管疾病的患者血浆样本（n = 3）以及非ST段抬高型心肌梗死（NSTEMI；n = 2）患者中分离出细胞外囊泡（EV）。通过免疫印迹检测EV富集蛋白TSG-101、膜联蛋白5（Anx5）和CD9在EV分离物中的表达，并与同一患者的去EV血浆进行比较，证实了血浆EV的有效分离（图1A）。转铁蛋白作为阴性对照，在去EV的血清样本中可检测到，但在EV分离物中不可见，进一步确认了不同组分的有效分离。对分离后的血浆样本进行整合素β3（血小板常见标志物）和载脂蛋白A1（ApoA1，脂蛋白污染标志物）的免疫印迹检测，结果显示血液处理后无明显污染（补充图1）。
通过纳米颗粒追踪分析，基于布朗运动对细胞外囊泡（EV）进行鉴定和可视化（图1B）。在我们的健康患者队列中，测得每毫升血浆中平均颗粒浓度为 1.2 × 1010 ± 6.0 × 109 个颗粒（
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讨论
本方案提供了一种贴近实际应用的、逐步详述且可直接使用的血浆细胞外囊泡（EV）分离与表征方法，并介绍了适用于整合到常规临床实践中的无标记蛋白质组分析技术。对血浆样本中EV的分离采用统一且详细的描述并严格遵循标准化操作流程，对于确保实验结果的可重复性至关重要。现有文献表明，分析前条件会显著影响后续对EV分离物的测量及下游分析。因此，必须及时启动来源于血浆的EV分离流程，理想情况下应在采血后120分钟内开始处理，并在样品操作过程中尽量减少震荡18。采集的血液可在4 °C下短期保存；然而，除了时间和机械扰动外，较低温度也可能促进血小板活化，从而导致血小板来源的EV释放19,20。尽管这些EV可能构成总体EV产量中的丰富组分，但通过特定的分析前控制措施可有效避免其污染21,22,23。在血液采集管中.......
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披露
EG 收到了来自罗氏诊断（Roche Diagnostics）、BRAHMS 赛默飞世尔（BRAHMS Thermo Scientific）、拜耳维他有限公司（Bayer Vital GmbH）、阿斯利康（AstraZeneca）、礼来德国公司（Lilly Deutschland）和勃林格殷格翰（Boehringer Ingelheim）的讲课酬金；他获得了罗氏诊断和第一三共（Daiichi Sankyo）的机构研究资助，并在提交本研究之外担任罗氏诊断、BRAHMS 赛默飞世尔、阿斯利康、诺华（Novartis）和勃林格殷格翰的顾问。JBK 收到了德国心血管研究中心（DZHK）和罗氏诊断的项目相关资助。其余作者声明本项研究不存在利益冲突。
致谢
作者感谢Heidi Deigentasch、Amelie Werner和Elisabeth Mertz在本项目期间提供的组织支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 4x Laemmli 样品缓冲液 | Bio-rad | 1610747 | |
| 10x RIPA 缓冲液 | Abcam | ab156034 | |
| 26.3 mL 聚碳酸酯离心管（带盖组件），用于超速离心 | Beckman Coulter | 355654 | |
| 5810R 台式离心机 | Eppendorf | 5811000015 | |
| 乙腈（ACN） | Biosolve | 0001204101BS | |
| 二硫苏糖醇（DTT） | Sigma-Aldrich | 43816-10ML | |
| Dulbecco 磷酸盐缓冲液（PBS） | Sigma-Aldrich | D8537 | |
| 99% 超纯级/质谱级甲酸 100 | Biosolve | 0006914143BS | |
| Histopaque - 1077 | Sigma-Aldrich | 10771 | |
| 碘乙酰胺（IAA） | Sigma-Aldrich | I6125-5G | |
| Orbitrap Q Exactive HF 质谱仪 | Thermo Fisher Scientific | IQLAAEGAAPFALGMBDK | |
| MOPS SDS 电泳运行缓冲液 | Thermo Fisher | B0001 | |
| NanoSight NS300 | Malvern Panalytical | NS300 | |
| Nanosight NTA 3.2 软件 | Malvern Panalytical | ||
| NuPAGE 4 –12 % Bis-Tris 蛋白凝胶 | Invitrogen | NP0323 | |
| Optima XPN-80 立式超速离心机 | Beckman Coulter | 521-4180 | |
| PageRuler Plus 预染蛋白 Marker | Thermo Fisher Scientific | 26619 | |
| 蛋白酶/磷酸酶抑制剂混合物（100X） | Cell Signaling Technology | 5872S | |
| 蛋白 Marker | Thermo Fisher | 26616 | |
| Proteome Discoverer 2.5 | Thermo Fisher | ||
| Q Exactive Plus 混合四极杆-Orbitrap 质谱仪 | Thermo Fisher Scientific | IQLAAEGAAPFALGMBDK | |
| 快速考马斯亮蓝染色液 | Serva | 35081.01 | |
| ReproSil-Pur 120 C18-AQ，1.9 µm，1 g | Dr. Maisch | r119.aq.0001 | |
| SDS-PAGE 商品化凝胶 | Thermo Fisher | NW00100BOX | |
| S-Monovette 枸橼酸钠 9NC 0.106 mol/L 3.2% | Sarstedt | 02.1067.001 | |
| 真空离心浓缩仪 | Savant | ||
| Swiss-Prot（Uniprot）智人（UP000005640，2020 年 6 月）蛋白数据库 | UniProt | https://www.uniprot.org/proteomes/UP000005640 | |
| 三乙基碳酸氢铵缓冲液（TEAB） | Sigma-Aldrich | T7408 | |
| 高效液相色谱用三氟乙酸（TFA）>99%，100 mL | Sigma-Aldrich | 302031-100ML | |
| 质谱级胰蛋白酶 | Thermo Fisher | 90058 | |
| 50.2 Ti 固定角转子 | Beckman Coulter | 337901 | |
| UHPLC Dionex Ultimate 3000 | Thermo Fisher Scientific | ULTIM3000RSLCNANO | |
| 水 | Biosolve | 0023214102BS |
参考文献
- Thery, C., et al. Minimal information for studies of extracellular vesicles 2018 (misev2018): A position statement of the international society for extracellular vesicles and update of the misev2014 guidelines. J Extracell Vesicles. 7 (1), 1535750(2018).
- Kalluri, R., Lebleu, V. S.
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重印与许可
