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方法文章

用于心血管生物标志物发现的血浆来源细胞外囊泡的分离、表征及蛋白质组学分析

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DOI：

10.3791/67083

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2025年1月31日

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1Department of Cardiology, Angiology and Pulmonology, University Hospital Heidelberg, 2Heart and Vascular Center, Semmelweis University, 3Core Facility for Mass Spectrometry and Proteomics, Centre for Molecular Biology at Heidelberg University (ZMBH), 4German Centre for Cardiovascular Research (DZHK), Partner site Heidelberg/Mannheim

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

本文介绍了一种分离、表征和定量人血浆来源的细胞外囊泡（EV）的方法，并提供了一个利用液相色谱-串联质谱法（LC-MS/MS）对EV蛋白质组进行无标记分析的工作流程。

摘要

细胞外囊泡（EV）是一类由细胞产生、具有脂质双分子层结构且不可复制的纳米颗粒。由于EV在调控细胞间通讯中发挥重要作用，并可能作为心血管疾病的有价值生物标志物，目前其在心血管研究领域受到广泛关注。然而，EV的蛋白质组及其在心血管诊断中作为生物标志物的潜力仍不甚明确。本实验方案提供了一种标准化的方法，用于从大型大学医院胸痛门诊患者血浆样本中分离和定量血浆来源的EV，并分析其携带的蛋白质成分。在常规静脉采血后，通过差速超速离心法从血浆中分离EV。利用免疫印迹技术检测EV分离物中特异性EV标志蛋白的富集情况，并通过纳米颗粒追踪分析法测定EV的平均粒径分布及血浆中EV的浓度。最后，采用超高效液相色谱-串联质谱技术对EV蛋白质组进行非标记定量分析。因此，本方案为研究血浆来源EV作为关键生物学信息载体的潜力，以及探索其作为新型生物标志物的应用提供了全面的技术路径。

引言

细胞外囊泡（EV）尚无统一命名标准，是一类由脂质双分子层包裹的纳米级颗粒，可由多种细胞类型释放，且不具备自我复制能力1。该类囊泡包含多种亚群，其中外泌体（exosomes）来源于内体系统，是EV的一个亚群，直径通常在约40 nm至160 nm之间2。EV可在多种体液中被检测到3，通过传递蛋白质、mRNA、微小RNA（microRNA）和脂质等多种活性生物分子，介导细胞间通讯。因此，EV可通过其表面特异性标记物及所携带的生物分子反映来源细胞的信息，其特性受母体细胞状态及其微环境的显著影响4。这些特征使得EV作为生物标志物的潜力日益受到关注，尤其在心血管疾病领域具有重要研究价值。

大量体外（in vitro）和体内（in vivo）研究表明，心肌缺氧应激会导致细胞外囊泡（EV）释放增加5,6,7。目前关于EV内容物的研究主要集中在EV结合的微小RNA（microRNA），其在多种心血管疾病诊断中具有作为生物标志物的潜力8,9,10。相比之下，关于循环EV蛋白质组的研究仍相对较少，针对心血管疾病患者血浆EV的研究则更为有限。在两项针对心肌梗死患者血浆来源EV的综合性研究中，作者鉴定出一种由缺血诱导的、具有潜在诊断价值的EV蛋白质组特征谱6,11。

细胞外囊泡（EV）的方法学处理历来具有挑战性，目前尚无关于EV分离、表征和定量最佳方法的明确建议。常用的EV分离方法包括差速超速离心、密度梯度离心以及过滤法，如尺寸排阻色谱法1。根据当前的共识指南，EV分离物的表征应至少包含三种典型EV表面蛋白标志物（如四跨膜蛋白或膜联蛋白）的证据，并结合成像技术1。在蛋白质水平上检测EV内容物时，最常使用基于抗体的方法，如蛋白质印迹（Western blot）或酶联免疫吸附测定（ELISA）。

鉴于循环细胞外囊泡（EV）的分离与处理在方法学上存在诸多挑战，本实验方案提供了一条从患者招募和样本采集，到后续EV的分离、表征及血浆EV分离物定量的完整技术路径。此外，本研究展示了一种工作流程：针对就诊于德国西南部一家三级医疗中心急诊科（胸痛门诊）的患者，立即分离其血浆来源的EV，并采用非标记液相色谱-串联质谱法（LC-MS/MS）分析疾病特异性血浆EV蛋白质组。该方法旨在实现高通量分析，以识别在大规模患者队列中，不同缺血性、先天性或（自身）免疫性心血管疾病患者初诊时以及疾病进展或缓解过程中，EV结合蛋白的差异富集情况。这一蛋白质组学筛查策略致力于发现与特定疾病通路相关的EV特异性蛋白富集模式，最终目标是揭示新型的EV结合蛋白生物标志物，从而提升当前心血管疾病的诊断能力及治疗监测水平。

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方案

本方案纳入了一个示例性患者队列，包括三名无明显或潜在心血管疾病迹象的健康对照者，以及两名非ST段抬高型心肌梗死（NSTEMI）患者。研究已获得海德堡大学医学院机构审查委员会的批准（IRB批准号：S-351/2015），所有患者在入组前均签署了书面知情同意书。患者根据初始临床表现、病史及诊断检测结果，从海德堡大学医院心内科胸痛门诊招募。

健康对照组的纳入标准包括非典型或非特异性临床表现、心脏生物标志物水平在正常范围内、无心血管疾病病史，以及任何进一步诊断检查结果正常。排除标准包括过去五年内有恶性肿瘤或细胞毒性治疗史、血液透析史、家族性高脂血症综合征，以及任何心血管疾病病史。非ST段抬高型心肌梗死（NSTEMI）的诊断依据现行指南进行。12，通过冠状动脉造影证实存在血流动力学显著的冠状动脉狭窄。每位患者从肘前静脉采集最多36 mL血液，置于含柠檬酸盐的采血管中 通过 标准静脉采血13，并将血液样本立即在4 °C条件下运输以进行后续处理。本研究中所用试剂和设备的详细信息列于下文 材料表.

1. 使用差速离心法分离细胞外囊泡

注意：采用差速离心法从人血浆样本中分离细胞外囊泡（EV）。通过两次超速离心（UC）步骤，逐步增加离心力，以最大程度提高所得EV沉淀物的纯度。

  1. 血浆分离
    1. 采集全血样本后，需在120分钟内开始处理，并保持样本在4 °C冷藏，以确保血浆中细胞外囊泡（EV）的完整性。使用含柠檬酸盐的采血管（0.106 mol/L 柠檬酸盐）以防止血液凝固。
    2. 将9 mL抗凝全血与预冷的磷酸盐缓冲液（PBS）按1:1体积比稀释，以降低黏度。随后加入5 mL密度梯度介质（1.077 g/mL），用于离心过程中的分离。
    3. 在4 °C条件下，以600 × g离心25–30分钟。小心吸取每根离心管上层的血浆部分，转移至专用离心管中。可继续进行后续步骤，或于-80 °C冷冻保存。
  2. 去除细胞碎片和凋亡小体
    1. 使用配备固定角转子的超速离心机，在4 °C条件下以20,000 × g离心血浆15分钟，过程中不启用刹车。离心后，管底应可见由细胞碎片和凋亡小体形成的沉淀。
  3. EV分离
    1. 将上清液转移至新管中。在4 °C条件下以100,000 × g超速离心2小时（不启用刹车），以分离EV，EV将在管壁形成可见沉淀。
    2. 使用电子移液器小心吸走上清液，保留约1 mL去除了EV的血浆。对剩余液体改用1000 µL移液器，缓慢吸取，避免扰动EV沉淀。吸取过程中逐渐倾斜离心管，确保管内无残留血浆。
  4. 下游分析前准备
    1. 根据下游分析需求重悬分离得到的EV沉淀：如用于纳米颗粒追踪分析，将来自9 mL全血的EV沉淀重悬于200 µL PBS中；如用于LC-MS/MS分析，将来自36 mL全血的EV沉淀重悬于50 µL含1%蛋白酶/磷酸酶抑制剂的1× RIPA缓冲液中。
    2. 将重悬后的EV沉淀转移至1.5–2 mL离心管中。可于-80 °C保存直至进一步分析，或根据需要立即进行后续操作。

2. 纳米颗粒示踪分析

注意：采用纳米颗粒跟踪分析（NTA）对人血浆样本中细胞外囊泡（EV）的平均大小分布进行定量分析。NTA 是一种基于激光的检测方法，通过分析纳米颗粒的布朗运动来实现检测。

  1. NTA 工作液的稀释
    1. 将 EV 储存液（用 200 μL PBS 重悬的 EV 沉淀）用预冷的 PBS 按 1:10、1:50、1:100 和 1:200 的比例稀释。制备多种工作稀释液，以确定在纳米颗粒追踪过程中每帧获得 10–100 个纳米颗粒的最适稀释倍数。
  2. 运行 NTA
    1. 打开 NTA 仪器，并在连接的计算机上启动相应的软件。将样品室放入激光腔内，点击 Start Camera 以启动摄像头。
    2. 用注射器吸取 1 mL PBS，将注射器插入前端管道，彻底冲洗管路系统，确保样品室中无残留气泡。通过摄像头监控是否存在气泡或污染颗粒。
    3. 用 1 mL 注射器吸取已制备的 EV 工作稀释液，并将其注入样品室中。
    4. 在 Capture 和 Process 选项卡中调节 Screen Gain，使其与显示器亮度匹配。调整 Camera Level，以便在屏幕上清晰区分纳米颗粒。
    5. 在 Process 选项卡中设置合适的 Detection Threshold，以调节区分颗粒与背景噪声的灵敏度。在同一实验的所有测量中保持该值恒定。
    6. 使用仪器两侧的调焦旋钮调节摄像头焦距，直至屏幕上的纳米颗粒图像清晰锐利。
    7. 在 Hardware 设置中为所有测量设定恒定温度（理想为 22 °C），因为布朗运动具有温度依赖性。
    8. 点击 Run 按钮开始测量。在弹出窗口中输入样品编号和溶剂信息。
    9. 每份样品至少记录三个 30 秒的视频。每次测量之间轻微推进样品，以获取纳米颗粒溶液的代表性数据。若配有注射泵，可设定恒定流速并进行连续记录。
    10. 记录完成后，软件将自动计算纳米颗粒的浓度和粒径分布。点击 Change 输入样品所用的稀释倍数，然后点击 Export 保存结果。
  3. 数据分析
    1. 使用统计分析软件对输出文件进行结果分析。

使用液相色谱-串联质谱法（LC-MS/MS）对细胞外囊泡蛋白质组进行无标记分析

注意：采用非标记法EV蛋白质组分析，首先通过凝胶电泳对膜裂解后的EV蛋白进行蛋白质分离。经胶内胰蛋白酶消化后，使用LC-MS/MS分析肽段，并将各质谱图与人类蛋白质组数据库进行比对。值得注意的是，若希望对EV裂解物进行非靶向分析，建议采用无需预先选择特定分子量范围的鸟枪法蛋白质组学，此时本方案中的步骤3.1.1–3.1.7可省略。

  1. 凝胶内胰蛋白酶消化
    1. 按照制造商说明，将细胞外囊泡（EV）重悬于1× RIPA缓冲液中，并加入Laemmli上样缓冲液（参见材料表）。将样品在95 °C下煮沸5分钟。
    2. 将添加了上样缓冲液的EV样品与蛋白ladder一同上样至4%–12% Bis-Tris凝胶，进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）14。用考马斯亮蓝染色1–4小时以观察蛋白条带。随后用水浸泡过夜进行脱色。
    3. 使用手术刀片从凝胶中切下含有目标蛋白的考马斯亮蓝染色条带区域。
    4. 用60 µL体积比为1:1（v/v）的50 mM三乙基铵碳酸氢盐缓冲液（TEAB）和乙腈（ACN），pH 8.5，洗涤凝胶块10分钟。再用60 µL ACN分三次、每次10分钟使凝胶块脱水收缩。随后用60 µL 50 mM TEAB（pH 8.5）再次洗涤。
    5. 在100 mM TEAB中加入10 mM二硫苏糖醇（DTT），于57 °C孵育30分钟以还原蛋白，然后将凝胶块脱水。
    6. 在100 mM TEAB中加入10 mM碘乙酰胺（IAA），于25 °C避光孵育20分钟以烷基化蛋白。
    7. 用60 µL 100 mM TEAB洗涤凝胶块，并用60 µL ACN分两次、每次10分钟进行脱水收缩。
    8. 向干燥的凝胶块中加入适当浓度的50 mM TEAB胰蛋白酶溶液。37 °C孵育4小时。加入20 µL 0.1%三氟乙酸（TFA）终止反应。
    9. 用30 µL体积比为1:1（v/v）的0.1% TFA和ACN孵育30分钟，提取生成的肽段。用20 µL ACN脱水20分钟，再用30 µL 100 mM TEAB洗涤20分钟。
    10. 用20 µL ACN分两次、每次20分钟对凝胶块进行脱水收缩。
    11. 将每次提取步骤收集的上清液在真空离心浓缩仪中浓缩，并将样品溶解于15 µL 0.1% TFA中。
  2. 液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）分析
    1. 使用高分辨率液相色谱-质谱仪联用电喷雾离子阱分析器进行纳流液相色谱-串联质谱分析。
    2. 以0.1%甲酸（FA）/1%乙腈（ACN）作为流动相A，0.1%甲酸/89.9%乙腈作为流动相B。
    3. 在25分钟线性梯度中分离肽段：从3%流动相B开始，21分钟内升至23% B，再用4分钟升至38% B，最后以95% B冲洗。
    4. 质谱仪采用数据依赖性采集模式，自动在MS和MS2之间切换。在m/z 400处分辨率为60,000的条件下采集MS谱图（m/z 400–1600），对最多15个前体离子进行MS2分析，归一化碰撞能量设为27，隔离宽度为1.4 m/z。
  3. 蛋白质数据库搜索
    1. 使用Proteome Discoverer 2.5软件中的Sequest HT算法，将MS/MS谱图搜索比对至Swiss-Prot Homo sapiens蛋白数据库（UP000005640，2020年6月版）以及一个自定义污染物数据库（MaxQuant软件组成部分，MPI Martinsried15,16）。
    2. 程序参数设置如下：碎片离子质量容差设为0.02 Da，母离子质量容差设为5 ppm。指定胰蛋白酶为消化酶，半胱氨酸的固定修饰为羧甲基化，甲硫氨酸的氧化、天冬酰胺和谷氨酰胺的脱酰胺作为可变修饰。同时将乙酰化、甲硫氨酸丢失及其组合设为蛋白质末端的可变修饰。
    3. 采用前体离子定量模式进行肽段定量，使用Top N平均法（n = 3）计算蛋白质丰度17。

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结果

采用既定的差速超速离心法，从无明显心血管疾病的患者血浆样本（n = 3）以及非ST段抬高型心肌梗死（NSTEMI；n = 2）患者中分离出细胞外囊泡（EV）。通过免疫印迹检测EV富集蛋白TSG-101、膜联蛋白5（Anx5）和CD9在EV分离物中的表达，并与同一患者的去EV血浆进行比较，证实了血浆EV的有效分离（图1A）。转铁蛋白作为阴性对照，在去EV的血清样本中可检测到，但在EV分离物中不可见，进一步确认了不同组分的有效分离。对分离后的血浆样本进行整合素β3（血小板常见标志物）和载脂蛋白A1（ApoA1，脂蛋白污染标志物）的免疫印迹检测，结果显示血液处理后无明显污染（补充图1）。

通过纳米颗粒追踪分析，基于布朗运动对细胞外囊泡（EV）进行鉴定和可视化（图1B）。在我们的健康患者队列中，测得每毫升血浆中平均颗粒浓度为 1.2 × 1010 ± 6.0 × 109 个颗粒（

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讨论

本方案提供了一种贴近实际应用的、逐步详述且可直接使用的血浆细胞外囊泡（EV）分离与表征方法，并介绍了适用于整合到常规临床实践中的无标记蛋白质组分析技术。对血浆样本中EV的分离采用统一且详细的描述并严格遵循标准化操作流程，对于确保实验结果的可重复性至关重要。现有文献表明，分析前条件会显著影响后续对EV分离物的测量及下游分析。因此，必须及时启动来源于血浆的EV分离流程，理想情况下应在采血后120分钟内开始处理，并在样品操作过程中尽量减少震荡18。采集的血液可在4 °C下短期保存；然而，除了时间和机械扰动外，较低温度也可能促进血小板活化，从而导致血小板来源的EV释放19,20。尽管这些EV可能构成总体EV产量中的丰富组分，但通过特定的分析前控制措施可有效避免其污染21,22,23。在血液采集管中...

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披露

EG 收到了来自罗氏诊断（Roche Diagnostics）、BRAHMS 赛默飞世尔（BRAHMS Thermo Scientific）、拜耳维他有限公司（Bayer Vital GmbH）、阿斯利康（AstraZeneca）、礼来德国公司（Lilly Deutschland）和勃林格殷格翰（Boehringer Ingelheim）的讲课酬金；他获得了罗氏诊断和第一三共（Daiichi Sankyo）的机构研究资助，并在提交本研究之外担任罗氏诊断、BRAHMS 赛默飞世尔、阿斯利康、诺华（Novartis）和勃林格殷格翰的顾问。JBK 收到了德国心血管研究中心（DZHK）和罗氏诊断的项目相关资助。其余作者声明本项研究不存在利益冲突。

致谢

作者感谢Heidi Deigentasch、Amelie Werner和Elisabeth Mertz在本项目期间提供的组织支持。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
4x Laemmli 样品缓冲液Bio-rad1610747
10x RIPA 缓冲液Abcamab156034
26.3 mL 聚碳酸酯离心管（带盖组件），用于超速离心Beckman Coulter355654
5810R 台式离心机Eppendorf5811000015
乙腈（ACN）Biosolve0001204101BS
二硫苏糖醇（DTT）Sigma-Aldrich43816-10ML
Dulbecco 磷酸盐缓冲液（PBS）Sigma-AldrichD8537
99% 超纯级/质谱级甲酸 100Biosolve0006914143BS
Histopaque - 1077Sigma-Aldrich10771
碘乙酰胺（IAA）Sigma-AldrichI6125-5G
Orbitrap Q Exactive HF 质谱仪Thermo Fisher ScientificIQLAAEGAAPFALGMBDK
MOPS SDS 电泳运行缓冲液Thermo FisherB0001
NanoSight NS300Malvern Panalytical NS300
Nanosight NTA 3.2 软件Malvern Panalytical 
NuPAGE 4 –12 % Bis-Tris 蛋白凝胶InvitrogenNP0323
Optima XPN-80 立式超速离心机Beckman Coulter521-4180
PageRuler Plus 预染蛋白 MarkerThermo Fisher Scientific26619
蛋白酶/磷酸酶抑制剂混合物（100X）Cell Signaling Technology5872S
蛋白 MarkerThermo Fisher26616
Proteome Discoverer 2.5Thermo Fisher
Q Exactive Plus 混合四极杆-Orbitrap 质谱仪Thermo Fisher ScientificIQLAAEGAAPFALGMBDK
快速考马斯亮蓝染色液Serva35081.01
ReproSil-Pur 120 C18-AQ，1.9 µm，1 gDr. Maischr119.aq.0001
SDS-PAGE 商品化凝胶Thermo FisherNW00100BOX
S-Monovette 枸橼酸钠 9NC 0.106 mol/L 3.2%Sarstedt02.1067.001
真空离心浓缩仪Savant
Swiss-Prot（Uniprot）智人（UP000005640，2020 年 6 月）蛋白数据库UniProthttps://www.uniprot.org/proteomes/UP000005640
三乙基碳酸氢铵缓冲液（TEAB）Sigma-AldrichT7408
高效液相色谱用三氟乙酸（TFA）>99%，100 mLSigma-Aldrich302031-100ML
质谱级胰蛋白酶Thermo Fisher90058
50.2 Ti 固定角转子Beckman Coulter337901
UHPLC Dionex Ultimate 3000Thermo Fisher ScientificULTIM3000RSLCNANO
水Biosolve0023214102BS

参考文献

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用于心血管生物标志物发现的血浆来源细胞外囊泡的分离、表征及蛋白质组学分析
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