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方法文章

通过中性彗星实验检测分裂中人类细胞的DNA断裂

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DOI：

10.3791/67110

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2024年8月23日

 , 
1Department of Molecular Biosciences, University of South Florida, Tampa

本文内容

摘要

本方案旨在研究DNA复制过程中发生的DNA损伤程度。在中性条件下，可在较短时间内快速评估DNA断裂的诱导情况。此外，该方案可适用于其他细胞类型及多种复制应激试剂。

摘要

DNA复制持续受到多种内源性和外源性应激因素的挑战，这些因素可能造成DNA损伤。在基因组复制过程中遇到的此类损伤可能导致复制体停滞，并将复制叉转化为双链断裂。如果这些有毒的DNA断裂未被修复，可能引发染色体重排，导致基因组不稳定性增加，并提高细胞转化的风险。此外，癌细胞表现出持续的复制应激，因此靶向肿瘤细胞中复制叉的脆弱性成为一种有吸引力的化疗策略。一种研究复制过程中DNA断裂的高通用性和强大技术是彗星试验。这种凝胶电泳技术能够在单细胞水平上可靠地检测DNA断裂的诱导与修复。本文概述了一种实验方案，使研究人员能够在多种细胞类型中，利用复制叉阻滞剂检测有丝分裂中人细胞的DNA损伤程度。将该方法与自动彗星评分相结合，可实现快速分析，并提高研究DNA断裂诱导过程的可靠性。

引言

彗星试验是一种凝胶电泳方法，用于在单细胞水平上检测DNA断裂。该方法基于以下原理：在电泳条件下，具有游离末端的DNA断裂片段会发生迁移，而完整的DNA则基本保持静止。DNA断裂会导致超螺旋DNA结构的松弛，从而使其在电泳槽中逐渐向阳极方向发生空间位移，通过免疫荧光观察可呈现出类似彗星的形态1,2。随后，通过定量迁移的断裂DNA相对于紧凑型DNA的比例，来评估DNA损伤的程度。

最常用的两种彗星试验方法是碱性彗星（AC）试验和中性彗星（NC）试验。AC试验在变性条件下进行，使用高碱性pH溶液，而NC试验则在中性pH溶液中进行。NC和AC试验均可可靠地检测细胞核中发生的DNA断裂。然而，碱性版本还可用于检测碱不稳定位点3。这两种试验形式均需使用裂解条件，以确保在电泳前DNA完全去除蛋白质。

该检测方法是一种用于检测DNA断裂的简单技术，在确定细胞DNA损伤方面具有多项独特优势。该方法建立起来相对简便，所需试剂既可在实验室自行制备，也可从商业供应商处购买。作为一种具有单细胞分辨率的技术，该检测所需起始材料极少。值得注意的是，NC检测具有很高的灵敏度，据报道可检测每细胞50至10,000个断裂4。该技术的通用性体现在其广泛的应用范围，包括生态毒理学5、人类生物监测6和遗传毒性研究7。该检测还可稳定地应用于多种细胞类型，并可适用于高通量检测8以及特定基因组区域断裂的评估9。因此，该检测是一种在单细胞水平上研究断裂形成的快速且可靠的技术。

DNA复制过程 constantly受到多种内源性和外源性应激因素的挑战10,11。由于这些损伤导致复制体停滞，可能引发DNA断裂，从而导致基因组不稳定性升高。DNA断裂也常作为复制中间产物出现，以促进DNA修复12。此外，多种化疗药物可诱导复制依赖性的双链断裂（DSBs），例如喜树碱（camptothecin, CPT）13,14,15和PARP抑制剂16,17。因此，该检测方法是一种强大的研究工具，可用于研究DNA损伤的性质、评估复制叉的加工过程，并探究DNA损伤剂的治疗潜力。通过BrdU标记新合成DNA的该检测方法改良版本，已被用于研究与复制相关的应激表型18,19,20,21。值得注意的是，NC检测法是一种可靠的方法，可用于研究复制背景下的DNA断裂诱导，这一点已在涉及复制叉蛋白表征22,23、复制中间产物分析24,25以及基因组维持中转录-复制冲突研究26,27的研究中得到证实。本文中，我们概述了一种NC检测方案，旨在定量人类细胞中复制过程中的DNA断裂。该方案可被广泛应用于各类增殖性人类细胞中复制应激相关损伤评估的研究人员快速实施。

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方案

本实验方案（图1）主要使用贴壁生长的U2OS癌细胞系，但也可适用于多种在组织培养中生长的贴壁细胞和悬浮细胞。本研究中使用的溶液和缓冲液详见表1。所用试剂和设备列于材料表中。

1. 材料准备

  1. 实验前一天，将提供的低熔点琼脂糖瓶（含1%低熔点琼脂糖的PBS溶液）放入热水浴中加热5-10分钟，确保琼脂糖完全融化。
    注意：切勿使用微波炉加热该瓶。
  2. 琼脂糖完全融化后，根据需要迅速分装100 µL至1.5 mL离心管中，并将离心管储存于4 °C。凝固后的琼脂糖可在4 °C保存长达1年。
  3. 实验当天，从4 °C冰箱中取出所需数量的离心管，将管子置于42 °C的金属浴或水浴中使琼脂糖融化。
    注意：应在收集细胞前将管子提前置于42 °C，以确保琼脂糖在重悬步骤（步骤3.7）中完全融化。
  4. 实验当天新鲜配制裂解缓冲液和TAE缓冲液，并分别在使用前置于室温和4 °C保存。此外，将1x PBS分装至15 mL锥形管中并放入冰箱冷藏，用于后续重悬步骤（步骤3.5）。
  5. 在2孔彗星电泳载玻片的磨砂端标记样品编号，并在使用前于室温下保存。

2. 样品制备

  1. 实验前一天，将细胞接种于6孔板中，并在37 °C、5% CO2条件下培养过夜。对于U2OS细胞，每个样品接种约2-3 × 105个细胞。
    注意：根据所用细胞类型的差异，可能需要调整细胞接种数量。
  2. 实验当天，按照实验设计对细胞进行相应处理。为证明复制依赖性断裂的产生，可使用1 µM CPT处理细胞1小时作为阳性对照。CPT是一种拓扑异构酶-1抑制剂，能够以复制依赖的方式诱导双链断裂14。

3. 细胞重悬与裂解

  1. 吸弃细胞培养基，并用 1× PBS 洗涤两次。
  2. 每孔加入 300 µL 胰蛋白酶。将培养皿置于组织培养箱中孵育 2–3 分钟。
    注意：胰蛋白酶中孵育时间过长可能导致彗星分析时出现非特异性结果。
  3. 每孔加入 700 µL 细胞培养基，轻轻重悬细胞后转移至 1.5 mL 离心管中。
    注意：建议在此步骤进行细胞计数，以便在步骤 3.6 中获得合适的细胞密度，从而减少分析过程中尾部重叠的发生频率。
  4. 将细胞悬液在室温下以 2400 × g 离心 5 分钟。
  5. 吸弃上清液，将细胞重悬于 1 mL 冷的 1× PBS 中。
  6. 重复步骤 3.4 和步骤 3.5 两次，最后将细胞重悬于冷的 1× PBS 中，细胞密度为每毫升 2 × 105 个细胞。
    注意：建议在此步骤评估细胞活力，以确保有足够的活细胞数量。建议细胞活力至少达到 90%。
  7. 取 10 µL 细胞悬液加入 100 µL 已融化的琼脂糖中，使用同一枪头轻轻混匀，并将混合物均匀铺展至载玻片的一个孔中。根据需要对所有样品重复此步骤。
    注意：避免一次性将所有琼脂糖 aliquot 从 42 °C 水浴中取出，以防琼脂糖过早凝固。此步骤最好在水浴旁操作，逐个样品依次进行重悬和铺片。在铺展琼脂糖时应避免产生气泡，因为气泡会在电泳步骤（步骤 4.5）中影响彗星尾部的迁移，并在干燥步骤（步骤 5.3）中导致裂纹。
  8. 将载玻片置于 4 °C 避光保存 15–20 分钟，确保琼脂糖完全凝固（图 2A）。
  9. 将载玻片放入考普林瓶中，并浸入裂解缓冲液中，在室温下孵育 1 小时。
  10. 用冷的 TAE 缓冲液冲洗载玻片一次，然后将其浸入冷的 TAE 缓冲液中，在 4 °C 下孵育 30 分钟。

4. 电泳

  1. 将电泳槽放置在平坦的表面上，并使用装置边缘的四个调平旋钮将系统调至水平。在下层腔室中放入冷包，以在电泳过程中保持溶液低温。
  2. 向装置中加入约 850 mL 冷的 1× TAE 缓冲液。
  3. 从 4 °C 取出载玻片，按正确方向放置于电泳托盘上，以便断裂的 DNA 能够正常迁移。
    注意：托盘可容纳十个双孔载玻片。若样本数量较少，应将载玻片置于托盘中央。若使用奇数个载玻片，需添加一个空白载玻片，使每个加样孔对应两个载玻片。
  4. 轻轻将配套的载玻片托盘盖板置于托盘上方，覆盖载玻片。
    注意：为确保装置正常运行，TAE 缓冲液的液面不应低于盖板的底面，也不应超过盖板的顶面。
  5. 连接电缆后，将电压设为 21 V，进行 40 分钟电泳（1 V/cm）。
    注意：电泳时间可能需要根据所分析的细胞类型进行调整。未处理样本中出现过长的尾部表明电泳时间过长；而阳性对照样本中尾部过短则可能表示电泳时间不足。

5. 染色

  1. 电泳完成后，从装置中取出载玻片，并将其浸入DNA沉淀液中，在室温下孵育30分钟。
  2. 弃去DNA沉淀液，将载玻片浸入70%乙醇溶液中，在室温下孵育30分钟。
  3. 弃去70%乙醇溶液。取出载玻片，在杂交炉中45 °C避光干燥30分钟（图2B）。
    注意：载玻片可在避光干燥处放置过夜以完成干燥步骤。
  4. 在避光条件下，向各孔中加入100 µL 1x SYBR Green溶液，在室温下孵育30分钟。
  5. 通过倾斜载玻片倾去SYBR Green溶液，并用无绒擦拭纸轻轻蘸拭孔边缘以去除残留液体。
  6. 将载玻片放入抽屉中，静置干燥30分钟。
  7. 进行载玻片的成像分析。

6. 成像与分析

  1. 为成像目的设置显微镜。
    注意：所有图像均使用落射荧光显微镜获取。采用10倍放大倍数、0.45数值孔径，曝光时间为1/40秒，增益为+6 dB。使用单色8位模式进行图像采集，配备2×2像素合并及黑平衡校正。
  2. 将载玻片置于显微镜载物台上，并使用FITC滤光片开始成像。
    注意：首先使用未经处理的样品测试曝光时间。大多数细胞不呈现彗尾，因为DNA结构更为紧密。随后切换至CPT处理的细胞样本，并使用相同的曝光时间成像。在此样本中，由于断裂DNA末端的迁移，可观察到长度增加的彗尾。
  3. 每个样本至少采集100个彗星图像，并在三个技术重复中保持相同的曝光时间。
    注意：盖玻片边缘的彗尾往往迁移不均，可能成为样本分布中的异常值。用于分析的大多数彗星位于盖玻片中心附近（图3）。
  4. 导出图像，并使用Image J手动分析彗星，或使用免费的彗星评分软件进行评分。选择在视野中可清晰分辨且完全包含在内的彗星进行评分。重叠或部分可见的彗星不纳入后续分析（图4）。
    注意：用户可使用以下插件在Image J中进行彗星评分：https://cometbio.org/index.html。使用CometScore软件进行彗星评分的详细信息见 图5。
  5. 将分析获得的尾矩数据以箱线图形式绘制，显示10–90百分位数值。进行正态性检验，以确定应采用参数检验还是非参数检验进行统计分析。
    注意：大多数情况下，若仅比较两个样本，则使用Mann-Whitney检验；若比较三个或更多样本，则采用Kruskal-Wallis检验结合Dunn多重比较校正。

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结果

复制应激试剂诱导断裂的分析
U2OS 细胞分别用 DMSO、4 mM 羟基脲（HU）或 100 nM CPT 处理 4 小时，并通过 NC 检测法分析断裂的累积（图 6A）。CPT 通过抑制拓扑异构酶-1 在 S 期诱导断裂13，而 HU 通过耗竭核苷酸池导致复制叉停滞，并逐步转化为 DNA 双链断裂（DSBs）28。实验结果表明，无论是 HU 还是 CPT 处理，均可在 S 期触发断裂的产生，且该现象可通过 NC 检测法检测到。

通过在不同温度下裂解比较断裂诱导的分析
未经处理的U2OS细胞在进行断裂诱导分析之前，分别在室温（RT）或4 °C的裂解缓冲液中孵育（图6B）。结果表明，裂解操作的温度对该实验中尾部迁移的影响极小。

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讨论

本方案概述了一种用于评估正在进行活跃复制的人类细胞中DNA断裂的NC检测方法。该方案操作相对简单，研究人员可轻松将其调整用于高pH条件下的碱性分析8。方案包含两个关键步骤，分别在步骤3.7和4.5中描述。在步骤3.7中，必须将含有细胞的熔化琼脂糖均匀地铺展于加样孔中，以防止分析过程中彗星图像相互重叠。在将细胞重悬于琼脂糖之前，应确保细胞聚集体已完全溶解。在铺展琼脂糖时避免松开移液器吸头，有助于最大限度减少气泡的引入。电泳条件对于获得适合成像和分析的彗星尾部迁移至关重要。研究人员应考虑所用细胞系的特性，因为不同细胞类型之间的尾部迁移程度以及呈现彗星尾的细胞百分比存在差异（图9）。因此，建议在正式实验前通过实验确定最佳电泳运行时间。

如果在阳性对照样本（CPT处理的细胞）中未观察到彗尾现象，应使用其他方法平行验证药物的有效性，例如对DNA损伤标志物γH2AX进行免疫染色。过度的尾部迁移可能妨碍对断裂诱导的分析。缩短电泳时间并在分析前评估细胞形态，可避免产生过长的彗尾。载玻片干燥不...

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披露

作者声明无竞争利益。

致谢

感谢Dungrawala实验室成员提供的意见和反馈。本工作由美国国立卫生研究院（NIH）资助，项目编号为R35GM137800，授予HD。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
1x DPBSGibco14190144
喜树碱SelleckchemS1288
彗星低熔点琼脂糖（LMA）R&D systems4250-050-02
CometAssay 电泳系统 IIR&D systems4250-050-ES包含电泳槽、安全盖、电缆、2/20 孔载玻片托架及载玻片托架覆盖件
CometScore 软件TriTek开源
CometSlideR&D systems4250-050-03
DMEM，高糖Gibco11965092
DMEM/F12Gibco11320033
DMSO FisherSciD128-4
落射荧光显微镜KeyenceBZ-X810
胎牛血清 - 优质Bio-TechneS11150
Gibco 胰蛋白酶-EDTA（0.05%），含酚红Gibco25300054
GraphPad Prism 10.0GraphPad
HEK293T 细胞ATCCCRL-11268
hTERT-RPE-1 细胞ATCCCRL-4000
羟基脲Millipore SigmaH8627
PARP 抑制剂奥拉帕利SelleckchemS8096
PowerPac FisherSciFB300Q
表面处理无菌组织培养板FisherSciFB012927
SYBR Green I 核酸凝胶染料（10,000 倍稀释）FisherSciS7567
U2OS 细胞ATCCHTB-96
UVP HB-1000 杂交孵育箱FisherSciUVP95003001

参考文献

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