本方案介绍了一种利用人多能干细胞生成血管类器官的方法。
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摘要
摘要
由人诱导多能干细胞（hiPSCs）衍生的血管类器官重现了人类血管网络的细胞类型多样性和复杂结构。该三维（3D）模型在血管病理建模方面具有重要潜力 体外 药物筛选。尽管近年来取得了进展，但在生成具有稳定质量的类器官方面仍存在一个关键技术挑战，即如何实现可重复性，这对于后续的检测和应用至关重要。本文介绍了一种经过改进的方案，可提高血管类器官生成的均一性和可重复性。该改进方案采用微孔板结合CEPT鸡尾酒溶液（chroman 1、emricasan、多胺和整合应激反应抑制剂trans-ISRIB），以改善类胚体的形成和细胞存活率。利用该方案生成的已分化成熟血管类器官，可通过整体三维免疫荧光显微镜进行表征，以分析其形态结构和复杂的血管网络。该方案能够以可扩展的方式生产高质量的血管类器官，有望推动其在疾病建模和药物筛选中的应用。
引言
体外微生理系统模型，包括类器官和器官芯片系统，近十年来已逐步发展起来1,2,3。这些三维（3D）人源细胞系统分别克服了传统二维（2D）细胞培养和动物模型的局限性，例如传统模型缺乏生理微环境中的多种组分，以及不同物种间的遗传差异。与传统模型相比，这些系统能够提供更接近生理状态的信息，更适用于疾病建模和药物筛选。在各类微生理系统模型中，由人诱导多能干细胞（hiPSCs）衍生的类器官已被证实可有效模拟天然人组织的结构特征，并已成功用于模拟多种人体器官，包括脑4,5、肾6、肝7,8 和视网膜9。本文重点介绍由hiPSCs生成血管类器官的方法，并概述一种简化的实验流程，旨在最大限度减少不同类器官样本及批次间的变异，从而提高整体实验的可重复性。
血管系统在维持人体所有器官的生理稳态中起着至关重要的作用。血管系统的形成涉及血管发生（vasculogen....
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方案
图1展示了本实验方案所涉及步骤的概览。材料表中提供了本方案所用试剂和材料的详细信息。建议所有培养基在使用前均于37 °C预热，除非另有说明。所有细胞培养相关的材料和耗材均应经过高压灭菌或为无菌状态，细胞操作应在生物安全柜中进行。此外，应仔细调节I型胶原蛋白混合物的pH值至7.3，以避免可能出现的凝固问题。
1. 人iPSC的维持
- 将基底膜基质提取物置于冰上解冻，轻轻摇动瓶子以混匀溶液，并使用P1000移液器和预冷的吸头在1.5 mL微量离心管中分装成0.5 mL等份。将分装好的提取物于-20 °C保存，可保存长达1年。
- 在冰上解冻一份基质提取物（0.5 mL）。将其与49.5 mL预冷的DMEM/F12培养基在50 mL离心管中混合。将混合液分装至6孔板的每个孔中（1.5 mL/孔），然后轻轻摇动培养板，确保液体均匀覆盖整个孔底。用封口膜密封培养板，并于4 °C保存，可保存长达1周。
- 按照表1所述配制hiPSC扩增培养基。将完全培养基分装成40 mL/管，于-20 °C保存，可保存长达1年。
- 在进行hiPSC培养前1小时，将预先包被的培养板放入37 °C培养箱中预热。
- 将hiPSC扩增培养基（40 mL）在37 °....
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结果
图1A 展示了本实验方案的流程图，包括各阶段所使用的关键组分。分化过程始于拟胚体形成，随后进行中胚层诱导及血管谱系特化（图1B-D）。随着时间推移，聚集体逐渐增大且形状变得不规则。类器官在第5天开始出现粗糙的边缘。在嵌入I型胶原-基底膜基质混合物后，血管内皮细胞和周细胞最早于第7天出芽并向外生长，形成复杂的血管网络（图1E）。由于该改进方法的主要目的是尽量减少不同批次培养之间的差异，我们测量了两个独立批次的拟胚体（EB）大小，两次测量结果及统计分析均证实了该方法的一致性和均一性（图1F).
为验证血管分化，在包埋前第5天收集类器官，并使用血管标志物CD31、ERG1和PDGFRβ进行染色。类器官表达CD31、ERG1和PDGFRβ（图2<.......
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讨论
本方案包含两项关键改进，可实现高质量血管类器官的均一化和可重复性生成。第一项改进是使用微孔板，以更好地控制胚胎体（EB）的均一性。作为血管分化的起始点，EB的大小至关重要，因为它调控着干细胞的命运以及向不同谱系分化的效率。EB尺寸的差异通常会导致类器官结构和组织不一致，出现异质性16,17。传统的通过刮取hiPSC集落来生成EB的方法11,12难以控制每个EB的细胞数量，通常导致EB形成不均一。在本方案中，hiPSC被解离为单细胞悬液，并在微孔中重新聚集16,18。通过调节接种的细胞数量，可优化EB的大小，以确保中胚层分化的稳定性和高效性。进行微孔接种时，使用500–1,000个细胞 ，可获得相对较小的EB（直径为100–200 µm）。该方法可在不同批次之间（
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披露
作者声明不存在竞争性财务利益。
致谢
我们感谢哥伦比亚大学赫伯特·欧文综合癌症中心共聚焦和专业显微镜共享资源提供的技术支持，该资源部分由美国国立卫生研究院中心资助项目（P30CA013696）资助。本工作由美国国立卫生研究院资助（R21NS133635，Y.-H.L.；UH3TR002151，K. W. L.）。图1A使用BioRender绘制。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 2-巯基乙醇（1000倍） | Gibco | 21985023 | |
| Accutase | Sigma-Aldrich | A6964 | |
| Alexa Fluor 488 AffiniPure F(ab')2 片段驴抗兔IgG（H+L） | Jackson Immuno Research Labs | 711-546-152 | 用0.25 mL 50%甘油重悬， 于-20 °C保存不超过1年，使用时稀释比例为1:1000 |
| Alexa Fluor 647 AffiniPure F(ab')2 片段驴抗山羊IgG（H+L） | Jackson Immuno Research Labs | 705-606-147 | 用0.25 mL 50%甘油重悬， 于-20°C保存不超过1年，使用时稀释比例为1:1000 |
| B27补充剂（不含维生素A，50倍） | Gibco | 12587010 | 于4 °C解冻，分装后于-20 °C保存，避免反复冻融 |
| BMP4 | ProSpec | CYT-081 | 用无菌ddH2O重悬至浓度为100 ng/µL，分装后于-20 °C保存 |
| CD31抗体 | abcam | ab28364 | 稀释比例：1:400 |
| 离心机 | Eppendorf | 022626001 | |
| CHIR99021 | Tocris Bioscience | 4423/10 | 用DMSO配制成12 mM的储存液，于-20 °C保存不超过1年。 |
| Chroman 1 | Tocris | 7163/10 | 用DMSO配制成100 µM的储存液，于-20 °C保存不超过1年。 |
| 胶原蛋白I型 | Corning | 40236 | |
| 共聚焦显微镜 | Nikon | AXRMP/Ti2 | |
| Corning Elplasia培养板 | Corning | 4441 | |
| Countess II FL全自动细胞计数仪 | Thermo Fisher | AMQAF1000 | |
| DMEM/F-12，含GlutaMAX补充剂 | Gibco | 10565018 | |
| DMEM/F-12，粉末 | Gibco | 12500062 | 用生物级ddH2O配制成10倍储存液，并用0.2 µm滤器过滤除菌。4 °C保存。 |
| Edi042A | Cedars Sinai | ||
| Emricasan | Medchemexpress LLC | HY1039610MG | 用DMSO配制成1 mM的储存液，于-20 °C保存不超过1年。 |
| ERG抗体 | Cell Singali Technology | 97249 | 稀释比例：1:400 |
| 胎牛血清 - 优质 | Atlanta Biologicals | S11150 | 于4 °C 解冻并分装，于 -20 °C保存不超过五年，或于4 °C保存不超过一个月 |
| FGF2 | ProSpec | CYT557 | 用无菌ddH2O重悬至浓度为100 ng/µL，分装后于-20 °C保存 |
| Fluorodish细胞培养皿 | World Precision Instruments | FD35-100 | |
| Forskolin | Tocris Bioscience | 1099 | 用DMSO重悬至浓度为12 mM，分装后于-20 °C保存 |
| 庆大霉素（50 mg/mL） | Gibco | 15710064 | |
| GlutaMAX补充剂（100倍） | Gibco | 35050061 | |
| 肝素，100 kU | MilliporeSigma | 375095100KU | 用无菌ddH2O重悬至浓度为4 kU/mL |
| HEPES（1 M） | Gibco | 15630080 | |
| 培养箱 | Thermo Scientific | 13998123 | |
| Knockout血清替代物 | Gibco | 10828028 | 于4 °C解冻，分装后于-20°C保存，避免反复冻融 |
| Matrigel，GFR基底膜基质 | Corning | 356230 | 于4 °C解冻，分装后于-80°C保存，避免反复冻融 |
| MEM非必需氨基酸溶液（NEAA，100倍） | Gibco | 11140050 | |
| 分子生物学级水 | Corning | 46000CV | |
| mTeSR plus试剂盒 | STEMCELL Technologies | 1001130 | 于4 °C解冻，分装后于-20°C保存，避免反复冻融 |
| N2补充剂（100倍） | Gibco | 17502048 | 于4 °C解冻，分装后于-20°C保存，避免反复冻融 |
| NaOH溶液（1 M） | Cytiva HyClone | SH31088.01 | |
| NeuroBasal培养基 | Gibco | 21103049 | |
| NIS-Elements，版本5.42 | Nikon | ||
| 正常驴血清 | Jackson Immuno Research Labs | 17000121 | 用10 mL无菌ddH2O重悬，于4 °C保存不超过两周 |
| 多聚甲醛，20% | Electron Microscopy Sciences | 15713S | 用PBS稀释 |
| PBST，20倍 | Thermofisher | 28352 | |
| PDGFRβ抗体 | R&D | AF385 | 稀释比例：1:400 |
| 多胺补充剂（1000倍） | Sigma-Aldrich | P8483 | |
| Rapiclear透明试剂，1.49 | SUNJIN LAB | RC149001 | |
| 碳酸氢钠（7.5%） | Gibco | 25080094 | |
| 脱氧胆酸钠一水合物 | Thermofisher | J6228822 | 用ddH2O溶解配制成1%（wt/v）的储存液 |
| TBST，20倍 | Thermofisher | 28360 | |
| trans-ISRIB | Tocris Bioscience | 5284/10 | 用DMSO配制成1 mM的储存液，于-20°C保存不超过1年。 |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787-50ML | |
| 台盼蓝染液（0.4%） | Thermo Fisher | 15250061 | |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | P7949-100ML | |
| VEGF-A | ProSpec | CYT-116 | 用无菌ddH2O重悬至浓度为100 ng/µL，分装后于-20°C保存 |
参考文献
- Park, S. E., Georgescu, A., Huh, D. Organoids-on-a-chip. Science. 364 (6444), 960-965 (2019).
- Takebe, T., Wells, J. M. Organoids by design. Science. 364 (6444), 956-959 (2019).
- Griffith, L. G., Swartz, M. A.
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