本研究介绍了一种通过呼吸测定法和酶学检测来研究异源物质对线粒体功能影响的方法。该方法考察了不同物种中电子传递链的调节作用，为针对昆虫传播疾病的靶向生物杀虫剂开发提供了见解。
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摘要
摘要
线粒体常被称为细胞的“动力工厂”，因其在通过电子传递链（ETC）产生能量的过程中发挥关键作用。然而，其重要性远不止于能量生成。线粒体生物能量学的失调可触发影响健康与细胞功能的细胞内级联反应。鉴于其重要的生理功能，人们日益关注探索线粒体功能的药理学潜力，以开发新的治疗方法和生物产品。调控线粒体生物能量学可能为应对神经退行性疾病、代谢性疾病和癌症等挑战提供创新策略，同时也可用于开发控制害虫及虫媒传播疾病的生物产品。
本研究介绍了一种利用多种底物评估外源性物质对电子传递链（ETC）影响的方法，所用底物包括用于复合物I的谷氨酸和NADH、用于复合物II的琥珀酸，以及用于复合物III和IV的细胞色素c（包括氧化型和还原型）。该方法可借助呼吸计和分光光度计，评估线粒体复合物中电子传递的激活或抑制情况。线粒体可来源于分离的线粒体、破碎的细胞，或来自多种物种的匀浆组织。
在实验室中，已对埃及伊蚊（Aedes aegypti）和Wistar大鼠的线粒体功能进行了分析，但该方法也适用于其他物种，例如微小牛蜱（Rhipicephalus microplus）和长红锥蝽（Rhodnius prolixus）。该方法为推测解偶联蛋白的存在以及由不同物种独特的能量需求所决定的可氧化底物偏好性提供了理论基础。近期的研究结果为靶向线粒体功能的新型生物杀虫剂设计策略提供了有价值的见解，在有效控制虫媒传播疾病和害虫侵染方面具有重要意义。
引言
线粒体因其在氧化磷酸化过程中产生化学能，一直被称为细胞的“动力工厂”1,2。除了其核心的代谢功能外，线粒体还参与多种其他细胞过程，包括细胞内 Ca2+ 水平调节、炎症反应、活性氧的生成以及细胞死亡的诱导过程3。线粒体生物能量学及其功能失调已被证实与影响细胞功能和整体健康的细胞内过程密切相关。这激发了人们日益增长的研究兴趣，致力于探索以线粒体功能为靶点的药物开发潜力，以研制创新疗法和安全的生物产品4,5,6。此外，深入理解线粒体过程之间复杂的相互作用及其对细胞功能的影响，对于开发靶向治疗策略以及设计用于控制虫媒传播疾病和害虫侵扰的生物产品具有重要意义7,8。
利用外源性化合物靶向电子传递链的特定组分，已成为一种通过调控线粒体功能来开发生物杀虫剂的策略。已有的农药制剂中包含的天然或合成化合物，例如基于纳米颗粒的线粒体靶向杀虫剂，已被证明可通过降低斜纹夜蛾（S. frugiperda9）的线粒体膜电位和ATP合成来影响其线粒体功能。
此外，大多数氨基甲酸酯类和拟除虫菊酯类化合物已被报道为蚊虫线粒体复合体I的抑制剂；然而，长期暴露导致冈比亚按蚊（Anopheles gambiae）中出现了一些对拟除虫菊酯类具有抗性的种群，这通常与细胞色素P450酶（P450s）水平升高有关，后者能够代谢这些底物10,11。类似地，植物及其精油、提取物和次生代谢产物也被证实具有潜在的杀虫活性，可在不同昆虫发育阶段引起广泛的致死效应12,13。这些天然化合物的杀虫作用可能与干扰线粒体呼吸链中特定位点的电子传递有关，通过调节活性氧的产生、线粒体膜电位ΔΨm以及ATP合成，进而触发细胞死亡过程6,8。
天然化合物作为农药制剂的来源，其对线粒体的影响在新型安全生物农药的设计中起着关键作用。在此背景下，本文描述了一种用于鉴定外源性化合物激活或抑制线粒体复合物电子传递能力的方法。该综合性方法利用多种底物，结合呼吸测定法和分光光度法，精确测量外源性化合物对线粒体功能的影响。该方法已应用于分析包括重要媒介物种在内的线粒体功能 埃及伊蚊，从而推测存在解偶联蛋白以及不同物种特有的可氧化底物偏好。
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方案
本方案中描述的所有方法均已获得桑坦德工业大学科学研究中心伦理委员会"Comité de ética en investigación científica CEINCI"的批准。此外，这些实验符合ARRIVE指南，并遵循1989年哥伦比亚第84号法律（第四章，第23-26条）以及1993年第8430号决议（第四章，第83-93条）中关于动物研究的相关规定。
注意：建议在开始本实验方案之前，先阅读任何一本生物化学教材中关于氧化磷酸化的章节。
1. 试剂与溶液
- 为分离大鼠肝脏线粒体，配制 250 mL 线粒体分离缓冲液：250 mM D-甘露醇、10 mM HEPES（pH 7.2）和 1 mM EGTA。取出 50 mL 分离缓冲液（此液称为不含 BSA 的分离缓冲液），其余 200 mL 中加入 0.2 g BSA（此液称为含 BSA 的分离缓冲液）。
- 为匀浆埃及伊蚊（Aedes aegypti）幼虫，配制 100 mL 缓冲液：250 mM 蔗糖、10 mM HEPES、1 mM EGTA（pH 7.2）。
- 配制反应缓冲液：80 mM 磷酸钠缓冲液（pH 7.4）、50 µM EDTA。
- 按以下说明配制用于酶活性检测的试剂储备液（pH 7.2）：25 mM NADH（每次测定前新鲜配制）、2 M 琥珀酸钠、4 mM 细胞色素 c（每次测定前新鲜配制）、200 µM 鱼藤酮、0.5 mM 氰化钾（KCN）、6 mM 2,6-二氯酚靛酚（DCPIP）、100 mM 酚嗪甲基硫酸盐（PMS）和 60 mM 铁氰化钾。
注意：所有实验及试剂配制均使用超纯水（25 °C 时电阻率为 18.2 MΩ·cm）。该水通过 Milli-Q 纯化系统制备，可将有机物、无机物及微生物污染物去除至低于检测限水平，适用于高灵敏度的生物化学与分子生物学实验。
2. 大鼠肝脏解剖、匀浆及线粒体分离
- 开始前，将所有材料和缓冲液置于冰上，确保整个实验过程中所有材料保持冰冻状态，以避免线粒体受损。
- 将10 mL线粒体分离缓冲液加入预冷的锥形管中。
- 通过颈椎脱位法处死雄性Wistar大鼠，避免使用可能干扰呼吸测定的CO2。本方法已获得桑坦德工业大学科学研究中心伦理委员会（CEINCI）2022年第13号决议批准。
注意：大鼠体重不应超过170 g；脂肪也可能影响呼吸分析。 - 使用无菌手术刀在大鼠腹部区域做一切口（约4-5 cm）。
- 暴露腹腔后，完整解剖出肝脏。大鼠肝脏为多叶状器官，呈深红色，大小约为10 cm × 5 cm。
- 小心将肝脏放入预冷的分离缓冲液中，并用该介质冲洗两次。
- 在含有10 mL分离介质的培养皿中，用锋利的剪刀将肝脏精细剪碎（尺寸小于1 cm）。
- 将溶液转移至Potter-Elvehjem组织匀浆器管中，缓慢匀浆至少十次（转速约390 rpm）。
- 将溶液转移至锥形管中，在4 °C条件下以600 × g离心10分钟。
- 离心后，小心将上清液倒入新的锥形管中。弃去沉淀物（含部分组织、血液及完整细胞组分）。
- 向管中补充更多分离缓冲液（约35 mL），在4 °C条件下以6000 × g离心10分钟。
- 离心后，弃去上清液，小心地将沉淀物（线粒体）重悬于不含BSA的新鲜分离缓冲液中。
注意：建议使用软毛刷进行线粒体重悬。 - 随后，在4 °C条件下以7000 × g离心10分钟，弃去上清液，并将分离得到的线粒体重悬于2 mL不含BSA的分离缓冲液中。
- 采用Bradford法或类似方法测定蛋白浓度14。
3. 埃及伊蚊 菌落和幼虫匀浆。
注意：本实验中，埃及伊蚊（Ae. aegypti）种群在昆虫饲养室条件下（湿度 70% ± 5%，光周期 12:12，温度 27 ± 5 °C）饲养于繁殖笼（40 cm × 40 cm × 40 cm）中。卵收集于滤纸上。
- 实验前一周，确保将卵置于含有过滤且脱氯水的托盘中孵化。通过幼虫生命周期中的蜕皮过程来确定龄期。观察每次蜕皮过程，确认其为L1、L2或L3阶段。当幼虫进入L3阶段后，最多等待12小时即收集样品。
- 在无氯水（约30 mL）中收集至少100只处于L3-L4龄期的Ae. aegypti幼虫。使用巴斯德移液管吸取幼虫。
- 用滤纸过滤幼虫，冲洗收集的幼虫，并将其重悬于Aedes aegypti匀浆缓冲液中（约2 mL）。
- 将含有幼虫的溶液转移至Potter-Elvehjem组织匀浆器管中，在约390 rpm条件下小心匀浆至少10次。
- 将匀浆后的组织转移，并通过玻璃棉注射器过滤，以去除较大的外骨骼残留物。
- 采用Bradford法或类似方法测定蛋白质浓度15。
注意：无需从蚊虫幼虫中分离线粒体；使用本步骤获得的蛋白质提取物即可评估外源性物质的影响。
4. 外源性物质对线粒体电子传递链影响的测定
注意：本方案旨在评估外源性物质对大鼠肝脏和昆虫组织匀浆中分离的线粒体的线粒体生物能量学的影响。
这些检测分为两类：极谱法（NADH和琥珀酸氧化酶）和分光光度法（NADH脱氢酶-复合物I、琥珀酸脱氢酶-复合物II、细胞色素c还原酶-复合物III和细胞色素c氧化酶-复合物IV）。
- 极谱法测定：采用高分辨率呼吸测定法，测量NADH和琥珀酸由O₂完全氧化的过程2 消耗，并将结果报告为NADH和琥珀酸氧化酶活性。
- 每天开始检测前校准仪器。此步骤可能因所使用的氧电极仪型号而异，请遵循制造商的说明。
- 对于 Oroboros 校准，向检测室中加入反应介质，加入量需比实验检测室体积（2 mL）至少多出 0.2 mL，以确保检测室及注射毛细管均被介质充满。
- 添加培养基后开启搅拌器。
- 等待氧气浓度信号稳定后记录。
- 进行零氧校准，加入可耗尽氧气的线粒体、细胞悬液、面包酵母或连二亚硫酸盐（推荐使用面包酵母），并记录数据。等待信号降至背景水平（O2k系统通常为 ± 2 pmol/mL/s）。
- 通过向反应室中加入反应缓冲液、0.1 mg 蛋白质（线粒体或幼虫匀浆）及底物（0.17 mM NADH 或 10 mM 琥珀酸钠），监测氧气消耗，测定 NADH 和琥珀酸氧化酶活性。
- 使用电子传递蛋白抑制剂来确认所观察到的氧气消耗源于线粒体呼吸链。常用的抑制剂包括1 µM的鱼藤酮和1 mM的氰化钾。16在氧电极细胞中，按照顺序加入试剂 表1 （顺序很重要）。
- 每天开始检测前校准仪器。此步骤可能因所使用的氧电极仪型号而异，请遵循制造商的说明。
- 分光光度法测定
注意：为评估电子在线粒体复合物中的传递，采用分光光度计并结合人工电子受体（如PMS、DCPIP和细胞色素c）进行酶学测定。建议每天测定一种酶。至少在测定前一天配制好所需缓冲液和试剂。部分化合物具有光敏感性；参见 表 2 有关更多建议。- NADH脱氢酶活性检测的反应体系包含50 mM磷酸盐缓冲液（pH 7.4）、2 mM EDTA、0.1 mg/mL线粒体蛋白、1 µM鱼藤酮和1 mM KCN。在分光光度计比色杯中，按以下顺序加入试剂： 表2 （顺序很重要）17推荐步骤如下：
- 配制100 mL含EDTA的磷酸盐缓冲液，并仔细检查pH值是否保持不变。将缓冲液保存在冰箱中，但在实验过程中必须置于室温（RT；约25 °C）下使用。
- 配制鱼藤酮、氰化钾（KCN）、NADH 和铁氰化钾的新鲜储备液（可稳定保存 4 小时）。建议配制体积为 1 mL 浓缩溶液（见下表第一列）。
- 如果待测化合物在水中的溶解度较低，在实验设计中应增加一个仅含该化合物溶剂的酶活性对照组。
- 首先，在420 nm处通过监测铁氰化钾的还原反应来检测NADH脱氢酶活性。根据其摩尔消光系数1.04 mM计算其浓度。-1·cm-1分光光度计具有计算反应中最大活性的选项；请查阅用户手册。随后，将报告的活性除以所用蛋白质的浓度，以获得酶的比活性。
- 通过添加20 mM琥珀酸钠、1 mM吩嗪甲基硫酸盐（PMS）和60 µM 2,6-二氯酚靛酚（DCPIP）作为人工电子受体，测定琥珀酸脱氢酶活性。在分光光度计比色皿中，按以下顺序加入试剂： 表3 （顺序很重要）17建议如下：
- 制备与NADH脱氢酶实验所用相同的缓冲液，并在相同条件下保存。
- 配制新鲜的琥珀酸盐、PMS 和 DCPIP 储存液。建议配制体积为 1 mL 浓缩溶液。PMS 和 DCPIP 溶液需在测定当天配制。
- 如果待测化合物在水中的溶解度较低，应在实验设计中增加一个酶活性的额外对照。
- 通过在600 nm处监测DCPIP的还原反应来检测琥珀酸的氧化。根据其摩尔消光系数21.0 mM⁻¹·cm⁻¹计算其浓度−1·cm−1，应用比尔定律。随后，将报告的酶活性除以所用蛋白质的浓度，以获得该酶的比活性。
- 使用NADH或琥珀酸作为可氧化底物，测定细胞色素c还原酶（复合体III）活性。在此酶促反应中，电子从复合体I（使用NADH）或复合体II（使用琥珀酸）传递至泛醌，再传递至复合体III，随后由复合体III将电子传递给细胞色素c。该过程通过监测细胞色素c的还原反应进行跟踪。配制反应体系，包含50 mM磷酸盐缓冲液（pH 7.4）、2 mM EDTA、0.1 mg线粒体蛋白、50 µM NADH和0.1 mM KCN。在分光光度计比色杯中，按顺序加入试剂 表4 （顺序很重要）18建议如下：
- 制备与NADH脱氢酶实验所用相同的缓冲液，并在相同条件下保存。
- 使用来自NADH脱氢酶实验的相同NADH和KCN。
- 如果待测化合物在水中的溶解度较低，应在实验设计中增加一个酶活性的额外对照。
- 在550 nm处监测细胞色素c的还原情况，并利用其摩尔消光系数19.8 mM⁻¹cm⁻¹计算其浓度−1·cm−1, 应用比尔定律。随后，将报告的活性除以所用蛋白质的浓度，以获得酶的比活性。
- 测定细胞色素c氧化酶（复合体IV）活性，以细胞色素c氧化酶活性表示。为此，配制反应体系，其中包含50 mM磷酸盐缓冲液（pH 7.4）、2 mM EDTA和0.1 mg线粒体蛋白。表5）。对于这些酶学测定，通过混合等摩尔量的细胞色素c与连二亚硫酸钠来还原细胞色素c，确保细胞色素c完全被还原。
- 然后，使用相同的磷酸盐缓冲溶液作为流动相，将所得混合物通过交联葡聚糖凝胶柱。随后，在550 nm波长下用分光光度计对收集的组分进行定量。19建议如下：
- 使用与NADH脱氢酶相同的缓冲液，并保持相同的条件。
- 如果待测化合物在水中的溶解度较低，则应在实验设计中额外设置酶活性对照。
- 在550 nm处监测细胞色素c的氧化，并利用其摩尔消光系数19.8 mM⁻¹·cm⁻¹计算其浓度−1·cm−1，应用比尔定律。随后，将报告的酶活性除以所用蛋白质的浓度，以获得该酶的比活性。
注意：随附一个电子表格文件，展示了通过氧气消耗法和分光光度法测定酶的比活性的计算过程 补充文件 1.
- NADH脱氢酶活性检测的反应体系包含50 mM磷酸盐缓冲液（pH 7.4）、2 mM EDTA、0.1 mg/mL线粒体蛋白、1 µM鱼藤酮和1 mM KCN。在分光光度计比色杯中，按以下顺序加入试剂： 表2 （顺序很重要）17推荐步骤如下：
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结果
在分析本方案获得的结果之前，有必要简要回顾线粒体中电子传递链的生物化学过程。首先，NADH 将一对电子提供给位于复合物 I 中的氧化还原中心。电子由此开始传递，从复合物 I 传递至泛醌，随后进入复合物 III，再由复合物 III 将电子传递给细胞色素 c，最终到达复合物 IV，在此氧气作为最终的电子受体被还原为水。另一方面，琥珀酸将电子提供给复合物 II（也称为琥珀酸脱氢酶）。电子从复合物 II 传递至泛醌，之后沿上述相同路径进行传递。泛醌将电子传递至复合物 III，随后电子再传递至复合物 IV，从而还原氧气20。
本研究中所述方案有助于评估异源物质对大鼠肝脏及匀浆中线粒体生物能量学的影响 Aedes aegypti 幼虫，并允许将该方法外推至其他多种物种。该方案首先研究外源性物质（包括精油（EO）和植物次生代谢物）对线粒体复合体电子传递过程的影响，该过程从NADH氧化到氧气还原。如图所示 图1A，香芹酚在9.7 ppm（均质样品中具有统计学显著效应的最低浓...
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讨论
采用高分辨率O2分光光度法和极谱法研究了外源性物质对线粒体功能的影响。该研究特别利用两种不同的生物模型——大鼠肝线粒体分离物和埃及伊蚊（Aedes aegypti）幼虫匀浆，评估了香茅草（Cymbopogon flexuosus）精油及香芹酚对NADH和琥珀酸氧化以及线粒体电子传递链中电子传递的作用。此外，通过使用人工电子受体（如DCPIP和铁氰化钾），并结合分光光度法监测细胞色素c的氧化与还原，进一步考察了电子传递链中特定部位可能发生的电子阻断16,19,21。
大鼠肝脏线粒体的分离已被广泛使用并有大量报道22,23,24，但该方法也可根据需要调整用于来...
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披露
所有作者声明不存在利益冲突。
致谢
作者感谢 "研究与推广副校长办公室 VIE" 桑坦德工业大学为资助项目编号3739提供了经费支持 "实验室研制并经田间验证的蜱类杀灭剂与驱避剂配方，用于预防牛只蜱虫侵扰。"
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 2,6-二氯酚靛酚 | Merck | 119814 | 需在使用当天配制。 |
| 考马斯亮蓝试剂 | Merck | B6916 | |
| 牛血清白蛋白 | Merck | A7030 | |
| 香芹酚 | Merck | W224511 | |
| 细胞色素 c | Merck | C2506 | 避光保存，用铝箔包裹。溶液应储存于冷冻室中。 |
| D-甘露醇 | Merck | M4125 | |
| EGTA | Merck | >E3889 | |
| 乙二胺四乙酸四钠盐二水合物 | Merck | E6511 | |
| HEPES | Merck | H3375 | |
| KCN | Merck | 60178 | 溶液在两周内保持良好活性。 |
| KH2PO4 | Merck | P5655 | |
| Multiskan FC 微孔板光度计 | Thermo Scientific | 51119100 | |
| Na2HPO4 | Merck | 567550 | |
| Oroboros O2k | Oroboros Instruments | 10203-03 | https://www.oroboros.at/index.php/product/o2k-startup/ |
| 吩嗪硫酸甲酯 | Merck | P9625 | 需在使用当天配制。 |
| 铁氰化钾 | Merck | 244023 | 需在使用当天配制。 |
| Potter-Elvehjem 组织匀浆器管 | |||
| 鱼藤酮 | Merck | 557368 | 可溶于乙醇。避光保存，用铝箔包裹。溶液应储存于冷冻室中。 |
| 琥珀酸钠 | Merck | S9637 | 溶液应储存于冷冻室中。 |
| 蔗糖 | Merck | S0389 | |
| β-烟酰胺腺嘌呤二核苷酸还原型二钠盐水合物 | Merck | N8129 | 避光保存，用铝箔包裹。溶液应储存于冷冻室中。 |
参考文献
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