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方法文章

利用纤连蛋白黏附与迁移实验分离软骨细胞和软骨祖细胞

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DOI：

10.3791/67160

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2024年10月4日

 ,  ,  ,  , 
1Department of Physiology, Christian Medical College, 2Centre for Stem Cell Research (A unit of InStem, Bengaluru), Christian Medical College, 3Department of Orthopedics, Christian Medical College, 4Faculty of Health and Medical Sciences, The University of Adelaide, 5Department of Orthopedics and Trauma, Royal Adelaide Hospital

本文内容

摘要

本方案详细描述了从人关节软骨中分离软骨细胞、纤维连接蛋白黏附实验衍生的软骨祖细胞（FAA-CPs）以及迁移性软骨祖细胞（MCPs）的方法。内容涵盖用于分离和鉴定这些细胞的酶消化、纤维连接蛋白黏附以及基于迁移的实验方法。

摘要

软骨祖细胞（CPCs）最近被鉴定为一种独特的亚群，因其间充质特性、增强的软骨形成能力以及有限的肥大特征而展现出良好的应用前景。通过差异性纤连蛋白黏附和基于迁移的组织块实验可实现祖细胞的富集，其中通过纤连蛋白黏附实验获得的软骨祖细胞（FAA-CPs）和迁移型软骨祖细胞（MCPs）相较于软骨细胞表现出更优越的潜能。本文深入探讨了来源于软骨的驻留细胞——即软骨细胞和软骨祖细胞的分离细节。尽管软骨细胞研究提供了有关软骨修复的重要见解，当前的研究重点正逐步转向软骨祖细胞，并探索其作为替代性治疗策略的潜力。此外，本方法学文章提供了从软骨中分离三种特定细胞类型的详细分步操作方案：软骨细胞、FAA-CPs 和 MCPs。通过遵循标准化的操作流程，该方案有助于成功提取这些细胞亚群。基于大量研究，本文聚焦于分离不同细胞亚群所采用的精细技术，以及扩增和维持这些细胞培养所需的优化培养条件。该方法包括人关节软骨来源软骨细胞的酶消化分离、连续酶消化后的差异性纤连蛋白黏附分离，以及基于迁移的组织块实验以获取软骨驻留细胞。

引言

基于细胞的再生治疗作为一种重要的治疗手段，可用于治疗骨关节炎（OA）和软骨缺损等软骨相关疾病1。这些疾病以关节内软骨的退变或损伤为特征，在治疗过程中面临巨大挑战。据报道，由于关节软骨缺乏神经支配、无血管结构以及细胞分裂活性较低，其自我修复能力十分有限2。

用于软骨组织再生最常用的细胞是间充质干细胞（MSCs）和软骨细胞3然而，多项研究报道了在再生医学中使用这些细胞存在局限性4。这些局限性包括软骨细胞在长期培养过程中发生的终末分化 体外 扩增至所需细胞数量以及间充质干细胞（MSCs）的肥大倾向。这些因素可能导致修复组织形成纤维软骨与透明软骨的组合不佳5,6,7,8.

软骨祖细胞（CPCs）的发现源于对关节软骨替代细胞的探索9由于它们与间充质干细胞（MSCs）具有相似性，且表现出更强的软骨形成潜能，同时伴有较低的肥大化倾向，因此引起了广泛关注——这种特性组合正是研究者所追求的理想特征10,11与软骨细胞相比，这些祖细胞群体据报表现出更强的复制能力和端粒酶活性，以及神经源性位点 notch 同源物蛋白 1（NOTCH-1）和 SRY-box 转录因子 9（SOX-9）表达水平的升高12,13,14,15有两种标准方法可用于从软骨和半月板中分离软骨祖细胞（CPCs），一种基于其整合素受体（CD49e/CD29）的表达，通过纤连蛋白黏附实验进行分离——即纤连蛋白黏附实验来源的软骨祖细胞（Fibronectin Adhesion Assay-derived Chondroprogenitors, FAA-CPs）；另一种则基于其从软骨组织块中较强的迁移潜能——即迁移性软骨祖细胞（Migratory Chondroprogenitors, MCPs）。11,13,16,17,18,19. 大量的 体外 研究结果表明，与软骨细胞和骨髓间充质干细胞（BM-MSCs）相比，FAA-CPCs和MCPs均表现出更优的软骨形成能力及更低的肥大倾向20,21,22,23.

近期 体外 比较FAA-CPCs与MCPs的研究表明，在正常氧浓度条件下，后者祖细胞群体具有更强的软骨再生能力24。这些乐观的 体外 结果展示了类似透明软骨的再生，鼓励进一步研究 体内 实验表明，尽管如此，这两种CPC群体均被证实可在动物模型中有效修复和再生骨关节炎（OA）及其他骨软骨疾病中的软骨25,26,27,28,29.

本实验室积极参与了软骨祖细胞（CPC）分离技术的标准化工作，并将其表型特征与软骨细胞及间充质干细胞（MSCs）进行了比较。本文将提供一份详细的实验方案，阐述分离和培养软骨组织驻留细胞（即软骨细胞、FAA-CPCs和MCPs）的具体步骤。

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方案

本方案已获得机构审查委员会（研究与伦理委员会）的批准，并符合相应的法规和指南要求。在取得书面知情同意后，从因治疗需要而接受全膝关节置换术的骨关节炎（OA）患者（Kellgren-Lawrence 放射学评分 4 分）30 中获取胫股关节组织。患有肿瘤、感染或炎性关节炎（如类风湿性关节炎或痛风）迹象的患者的关节组织被排除在研究之外。确保所有操作均在无菌条件下进行，并在整个实验过程中遵循标准的实验室操作规程。

1. 获取胫股关节

  1. 从因治疗需要而进行膝上截肢的供体或患有四度骨关节炎的供体中获取膝关节（胫股关节）30 （放射学证据显示关节间隙明显减少并伴有软骨下硬化）接受全膝关节置换术。
    注意：应根据《赫尔辛基宣言》的原则，确保已从患者处获得知情同意。确保遵守伦理委员会和机构审查委员会的规定。
  2. 排除任何表现出感染或炎症症状的关节。

2. 处理收获的关节

  1. 在无菌条件下，将获取的胫股关节置于1×磷酸盐缓冲液（PBS）溶液中。
  2. 在超净台内铺设无菌垫，建立无菌操作区域，并将获取的关节转移至无菌垫上。
  3. 固定切割后的胫股关节，用手持住软骨下骨，使软骨面朝上。
  4. 使用手术刀片（22号），在获取关节后1–2小时内，从骨关节炎（OA）患者关节的非负重区域采集矩形软骨碎屑。
  5. 从表层至深层获取大小为8 mm × 10 mm的软骨组织片。
  6. 用1× PBS溶液清洗软骨片，并将其置于含有1–2 mL普通DMEM培养基的培养皿中。
  7. 用手术刀片（22号）将软骨片仔细切碎至小于1 mm × 1 mm × 1 mm的大小。
    注意：确保软骨片或切碎的软骨不干燥；应将其置于不含血清的培养基或PBS中。

3. 软骨细胞的分离

  1. 将切碎的软骨放入直立的 T-25 培养瓶中，加入 10 mL 含 0.15% II 型胶原酶的 Dulbecco 改良 Eagle 培养基 F12（DMEM-F12），进行酶消化。将培养瓶置于 CO2 培养箱中静置 12–14 小时，确保标准培养条件31。
    注意：应使用不含血清痕迹的普通 DMEM-F12 培养基，因为血清会抑制酶的活性。
  2. 过夜消化后，使用细胞筛网将含有释放细胞的培养基转移至新的无菌离心管中，离心管内预先加入等体积的含 10% 胎牛血清（FBS）的 DMEM-F12 培养基，以分离细胞与碎片。所获得的释放细胞即为"软骨细胞"。
  3. 在 37 °C 条件下，以 1200 × g 的转速离心过滤后的细胞 5 分钟。
  4. 弃去上清液，注意不要扰动沉淀。将所得沉淀重悬于 1 mL 培养基中，并使用台盼蓝排斥法计数活细胞数量。
  5. 以 10,000 个细胞/cm² 的浓度将软骨细胞接种至 T-25 培养瓶中，使用含 10% FBS 的 DMEM-F12 培养基扩增至所需代次。培养基中的其他添加成分包括抗坏血酸（62 µg/mL）、L-谷氨酰胺（2.5 mM/L）、青霉素-链霉素（100 IU/mL）和两性霉素 B（2 µg/mL）。
  6. 每 3 天更换一次培养基，并在细胞达到亚融合状态时，使用含乙二胺四乙酸（EDTA）的 0.125% 胰蛋白酶消化收集细胞。

4. 纤连蛋白黏附实验来源的软骨祖细胞（FAA-CPs）的分离

  1. 在释放软骨细胞前12小时，配制10 mL含1 mM MgCl2（10 µL）和1 mM CaCl2 （10 µL）以及100 µL纤连蛋白（10 µL/mL）的1×PBS溶液32。
  2. 用上述配制的溶液对6孔板中所需数量的孔进行包被（每孔1.5 mL/9.3 cm2）。
  3. 将板密封严密，并于4 °C冰箱中过夜冷藏。
  4. 此外，以与软骨细胞分离相似的方法（步骤2.1–2.5）获取软骨碎屑。
  5. 将软骨碎屑置于37 °C振荡水浴中，依次进行过夜酶消化处理（0.2% Pronase消化3小时；随后0.04% II型胶原酶消化12小时），以获得单个软骨细胞。
  6. 次日，从冰箱中取出经纤连蛋白包被的6孔板，并去除多余的纤连蛋白。
    注意：去除多余纤连蛋白时应缓慢轻柔操作，避免破坏孔底的包被层。MgCl2（10 µL）和1 mM CaCl2 的存在对于确保细胞贴附至关重要。
  7. 向已包被的孔中加入2–3 mL普通DMEM-F12培养基。
  8. 以每孔4000个细胞的接种密度将释放的软骨细胞接种至包被孔中，并静置20分钟，期间勿扰动培养板。
  9. 孵育结束后，移除多余培养基及未贴壁细胞，加入2–3 mL用于软骨细胞的标准生长培养基（DMEM-F12 + 10% FBS）。
  10. 在标准培养条件下维持贴壁细胞培养10–12天，以获得CPC克隆（即含>32个细胞的细胞集落）。
  11. 使用0.125%胰蛋白酶-EDTA消化180秒后分离克隆，按1个克隆/5 cm²的比例重新接种，并扩增富集后的多克隆CPs至所需汇合度。所获得的细胞称为"FAA-CPCs"。
  12. 进一步在DMEM-F12培养基 + 10% FBS + 转化生长因子β2（TGFβ2: 1 ng/mL）+ 成纤维细胞生长因子（FGF2: 5 ng/mL）中培养细胞。
    注意：细胞在纤连蛋白包被板上的孵育时间不应超过20分钟，否则软骨细胞也可能开始贴附。在20分钟贴附期间，培养基中必须不含血清。随后，形成克隆的贴壁细胞必须在额外含有FBS的培养基中继续培养。克隆的分离必须在确认每个克隆含有超过32个细胞后进行，以避免过渡性扩增细胞的干扰。胰酶消化后对克隆的进一步扩增应包含上述额外添加的生长因子。在纤连蛋白包被板上以4000个软骨细胞/9.3 cm2的接种密度接种，经20分钟孵育后洗涤，最终可使总共80–100个细胞贴附。其中约有20个克隆可继续生长，并在10–12天内达到5次群体倍增。

5. 迁移性软骨祖细胞的分离

  1. 从获取的关节软骨组织中切取软骨外植体（10 mm × 5 mm × 1 mm），并将其置于含有DMEM-F12培养基（含10% FBS和10 mM Glutamax）的无菌6孔板中（每孔2-3个外植体）33。
  2. 将含有外植体的培养板在37 °C、CO2培养箱中静置培养48小时。
  3. 两天后，将外植体转移至含有10 mL 0.1%胶原酶溶液的离心管中进行酶消化。在37 °C下孵育2小时。
    注意：在酶消化前需用1×PBS冲洗外植体，因为残留的血清可能抑制酶活性。清洗时，将外植体浸入盛有2–3 mL 1×PBS的培养皿中；此举也可避免释放的软骨细胞造成交叉污染。操作外植体时应尽量减少扰动，以避免对已开始迁移的前体细胞造成应激。
  4. 消化完成后，用1×PBS冲洗外植体，并将其重新放回含有新鲜DMEM-F12培养基（含10% FBS和10 mM Glutamax）的原培养板孔中。
  5. 将培养板置于标准培养条件下继续在培养箱中培养，并在随后几天内观察软骨前体细胞的迁移情况。
  6. 当细胞达到亚汇合状态时，使用含EDTA的0.125%胰蛋白酶消化收集MCPs。
  7. 使用标准扩增培养基对MCPs进行扩增，该培养基包含DMEM-F12、10% FBS和10 mM Glutamax。

6. 软骨细胞、FAA-CPs 和 MCPs 的表型鉴定

  1. 流式细胞术分析（FACS）
    注意：以下步骤用于收获的细胞群的FACS分析。
    1. 使用0.125%胰蛋白酶按照标准操作对细胞进行消化，并在室温下以1200 × g 离心5分钟，获得细胞沉淀。
    2. 弃去上清液，用1× PBS洗涤并重悬细胞沉淀。
    3. 将细胞悬液转移至标记好的FACS管中。
    4. 将悬液均分至两管：一管为“未染色”管，作为对照（不含抗体的细胞悬液）；另一管为“染色”管，作为检测组（含抗体的细胞悬液）。
    5. 根据各抗体/分化簇（CD）标记物的技术说明书进行染色。用于比较的抗体包括CD105-FITC、CD73-PE、CD90-PE、CD106-APC（阳性表达标记物）；CD34-PE、CD45-FITC和CD14-FITC（阴性表达标记物）34,35；CD166-BB515和CD146-PE（潜在软骨生成标记物）36,37。
      注意：CD标记物对光敏感，所有操作需避光进行。
    6. 将细胞悬液与抗体在避光条件下孵育30分钟。
    7. 染色完成后，向各管中加入1 mL 1× PBS，并在室温下以1200 × g 离心5分钟，获得细胞沉淀。
    8. 弃去约四分之三的上清液，用剩余上清液通过轻柔吹打重悬细胞沉淀。
    9. 进行FACS分析。

7. qRT-PCR

注意：基因表达的qRT-PCR分析包括评估I型胶原（COL1A1）、X型胶原（COL10A1）和Runt相关转录因子（RUNX2）的肥大表达，以及SOX-9、聚集蛋白聚糖（ACAN）和II型胶原（COL2A1）的软骨形成表达。

  1. 按照制造商说明，使用市售试剂盒从细胞群中提取RNA。
  2. 提取后，测定A260/A280比值及RNA浓度。
  3. 使用280 ng提取的RNA构建互补DNA（cDNA）。
  4. 采用Sybr Green进行qRT-PCR，每个反应体系中cDNA终浓度为7 ng，并在热循环仪上进行扩增。
  5. 将每个基因的相对mRNA表达量归一化至GAPDH参考管家基因（ΔCt）。
  6. 通过2-ΔΔCt法计算每个基因的相对表达量，即将各基因的ΔCt值与FAA-CPs组的ΔCt值进行比较，得到ΔΔCt值37。

8. 多向分化

注意：市售的分化培养基可诱导三系分化，生成脂肪细胞系、成骨细胞系和软骨细胞系。

  1. 进行成脂分化时，将细胞以1000个细胞/cm2的接种密度接种于细胞培养板中，并使用成脂分化培养基培养（每3天更换一次培养基），持续培养3周，直至细胞融合度达到80%。
  2. 进行成骨和成软骨分化时，采用28天的细胞团（pellet）培养体系38。
  3. 在37 °C条件下，将0.5 × 106个细胞以400 × g离心12分钟，形成细胞团，并使用成骨和成软骨分化培养基启动分化。
  4. 对细胞团进行固定、包埋和切片，用于后续确认性染色（步骤9）。

9. 验证性染色

  1. 对于成脂系细胞，使用缓冲福尔马林固定细胞，洗涤后用油红O（0.5%）染色。同时对对照组（在含10%胎牛血清的标准DMEM培养基中培养）进行染色。
  2. 在显微镜下观察并采集图像。
  3. 对于已分化的成骨系细胞，使用茜素红（2%）染色。
    注意：软骨分化细胞可采用多种确证性染色方法。
  4. 阿利新蓝染色：将固定后的细胞用阿利新蓝染色5分钟，随后用中性红复染。
  5. 为评估糖胺聚糖（GAG）含量，进行番红O染色：先用维格特铁苏木精对切片染色，随后依次孵育酸性酒精（1%）、快绿溶液（0.05%）、乙酸（1%）和番红O溶液（1%）。
  6. 甲苯胺蓝染色：用甲苯胺蓝（0.1%）对切片染色5分钟。
  7. 苦味酸-天狼星红染色：用苦味酸-天狼星红（0.1%）对切片染色，并使用苏木精染料复染。
    注意：染色后，使用梯度酒精脱水，并用二甲苯透明。用Dibutylphthalate Polystyrene Xylene（DPX）封片剂封片，在显微镜下观察并采集图像。
  8. 对软骨分化细胞团块进行免疫组织化学染色（II型胶原）时，将团块切片进行酶法抗原修复，所用酶为蛋白酶K（1 mg/mL）和透明质酸酶（2.5 mg/mL）。
  9. 将切片与小鼠单克隆抗II型胶原一抗孵育，随后加入1:250稀释的HRP标记的山羊抗小鼠二抗。
  10. 使用3,3′-二氨基联苯胺（DAB）显色剂对切片染色，并用苏木精复染。
  11. 在显微镜下观察并采集图像。

10. 测定GAG/DNA含量

  1. 使用木瓜蛋白酶-半胱氨酸溶液在 65 °C 下消化软骨诱导分化的细胞团，持续 16 小时。
  2. 采用Picrogreen试剂38测定DNA浓度，并使用酶标仪在激发波长480 nm、发射波长520 nm条件下获取荧光强度。
  3. 采用二甲基亚甲蓝染色法38评估总糖胺聚糖（GAG）含量。
  4. 使用酶标仪在525 nm处测定吸光度。
  5. 将GAG值归一化至DNA值，并计算总GAG/DNA比值。

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结果

从86.9 mg软骨片中获得软骨细胞产量为1.72 x 105 细胞被注意到。接种后，软骨细胞迅速贴壁，最初呈圆形的鹅卵石状，随着进一步扩增逐渐转变为成纤维细胞样状态（图1 A，B）。将这些软骨细胞接种到纤连蛋白包被的培养板上，通常可获得2%的贴壁率，且每个细胞均能进行克隆性增殖。图2 C，D)，在第10至12天达到5次群体倍增（每克隆32个细胞）。将10 cm²区域内的克隆合并后扩增至所需的传代次数以生成FAA-CPs。软骨外植体经胶原酶孵育后在培养中维持，表现出细胞外基质松解，细胞迁移通常在第7天即开始观察到th 天（图2E）。FAA-CPs 和 MCPs 均呈现纺锤形结构，这是与骨髓间充质干细胞（BM-MSCs）相关的典型特征，在达到汇合前会形成类似蜂窝的结构（图1E，...

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讨论

含有透明组织的关节软骨可能通过优化其两种天然细胞类型——软骨细胞和软骨祖细胞——实现潜在再生。尽管对软骨细胞的广泛研究已为理解其在软骨修复中的作用提供了宝贵见解，但关于再生组织性质的问题促使研究人员致力于增强其表型并探索替代疗法3。软骨祖细胞作为相对较新发现的细胞亚群，因其固有的间充质特性、更强的软骨形成能力以及有限的肥大特征而展现出良好前景12。获取和扩增祖细胞的两种主要技术包括差异纤连蛋白黏附法和基于迁移的组织块培养法18,32。已有研究利用半月板组织分离人源FAA-CPs，并报道其具有较高的增殖能力和多向分化潜能16,17。体外表征研究表明，与软骨细胞相比，FAA-CPs和MCPs表现出更强的软骨形成能力和更弱的肥大表型，体现出更有利的生物学特性，包括更高的糖胺聚糖（GAG）积累与合成能...

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致谢

我们谨向 Bhavini Krishnan 女士和 Merin Mary Zachariah 女士致以谢意，感谢她们提供的学术贡献；同时感谢印度班加罗尔 inStem 所属的干细胞研究中心（Christian Medical College，Vellore 生理学系）提供的基础设施支持。本课题组目前开展的项目得到了印度政府生物技术部（BT/PR32777/MED/31/415/2019）、印度政府科学与工程研究委员会（CRG/2022/004277）以及 Christian Medical College，Vellore 流动研究基金的资助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
22号手术刀片 GLASS VAN
6孔板 CORNING3516
阿利新蓝THERMO SCIENTIFICJ6012
茜素红 SIGMA130223
两性霉素B（2 μg/mL）GIBCO15240062
抗坏血酸（62 μg/mL）SIGMA ALDRICHA4544-25G
BC CytoFLEX LX流式细胞仪 BECKMAN COULTERCYTExpert软件版本2.5
CaCl2SIGMA ALDRICH C34006
CD105-FITCBD BIOSCIENCE561443
CD106-APCBD BIOSCIENCE551147
CD14-FITCBD BIOSCIENCE555397
CD29-APCBD BIOSCIENCE559883
CD34-PEBD BIOSCIENCE348057
CD45-FITCBD BIOSCIENCE347463
CD49b-FITCMILTENYL BIOTEC MACS 130/100337
CD49e-PEBD BIOSCIENCE555617
CD73-PEBD BIOSCIENCE550257
CD90-PEBD BIOSCIENCE561970
细胞计数仪DE NOVIXCell Drop BF
细胞筛HIMEDIATCP024
离心机BECKMAN COULTERAllegra X-30R
CO2培养箱 THERMO SCIENTIFICMODEL-371
II型胶原（COL10A1）、Runt相关转录因子（RUNX2）、SRY-Box转录因子9（SOX-9）、聚集蛋白聚糖（ACAN）和II型胶原（COL2A1） EUROGENTEC, BELGIUM
II型胶原酶WORTHINGTONLS004176
DMEM F-12（Dulbecco改良Eagle培养基F-12）SIGMA ALDRICHD8900-1L
ELISA酶标仪MOLECULAR DEVICESSpectraMax i3x Reader
快绿FISHER SIENTIFIC2353459
胎牛血清GIBCO10270106
FGF2CLOUD CLONE CORPAPA551Hu01
纤连蛋白（10 µL/mL）SIGMA ALDRICHF1141
第一链合成系统TAKARA BIO6110A
GlutamaxGIBCO35050061
苏木精QUALIGENSQ39411
MgCl2 SIGMA ALDRICHM8787
油红OSIGMA1320065
PBS（磷酸盐缓冲液）GIBCO10010023
PCR扩增仪 APPLIED BIOSYSTEMSQuantstudio 12K Flex扩增仪 
青霉素-链霉素（100 IU/mL）GIBCO15240062
苦味酸天狼星红ALFA AESAR2610108
一抗（小鼠II型胶原）DSHBDSHB II II6B3
蛋白酶KROCHE10165913103
Quant-iT Picogreen双链DNA试剂THERMO SCIENTIFICP7589
冰箱ELANPRO
RNeasy MiniKitQIAGEN74104
沙黄OQUALIGENSQ39962
二抗（山羊抗小鼠IgG抗体，HRP标记）THERMO SCIENTIFIC31430
摇床水浴箱 REMI
StemPro诱导分化试剂盒 GIBCO1007201, A1007001, 和 A1007101
T-25培养瓶 CORNING430639
TakyonTM Low Rox SYBR Master Mix dTTP Blue EUROGENTECUF-LSMT-B0701
TGFβABCAMab277760
组织培养培养皿TARSONS960010
甲苯胺蓝QUALIGENS2040
台盼蓝 GIBCO15250061
胰蛋白酶EDTAGIBCO25200072

参考文献

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