小脑浦肯野细胞（PCs）对DNA损伤应答缺陷尤为敏感。本文介绍了一种用于直观评估小脑器官型培养物中浦肯野细胞对DNA损伤应答动态过程的实验方案，该方法涉及对蛋白质结合的多聚（ADP-核糖）链进行染色。
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摘要
摘要
小脑浦肯野细胞（PCs）表现出高代谢率、特异性染色质结构与高度转录活性之间的独特相互作用，使其特别容易受到DNA损伤的影响。因此，必须依赖高效的DNA损伤应答（DDR）机制，以防止小脑退行性病变，这类病变通常由PC功能障碍或丢失引发。一个典型的例子是基因组不稳定性综合征——共济失调毛细血管扩张症（A-T），其特征为进行性浦肯野细胞减少和小脑功能退化。研究PC中的DDR机制对于阐明此类疾病中细胞退变的分子通路至关重要。然而，由于浦肯野细胞的分离与培养过程复杂 体外 长期以来阻碍了研究工作的进展。小鼠小脑器官型（切片）培养提供了一种可行的替代方案，能够高度模拟 体内 组织微环境。然而，该模型仅限于适用于显微成像的DNA损伤应答（DDR）指标。我们优化了类器官培养方案，证明对蛋白结合的多聚（ADP-核糖）（PAR）链进行荧光成像——一种快速且早期的DDR指标——可有效揭示此类培养体系中浆细胞（PC）在基因毒性应激下的DDR动态变化。
引言
细胞DNA的完整性 constantly 受到DNA损伤因子的威胁，其中主要是活性氧等代谢副产物，这些物质每天在每个细胞中造成数以万计的DNA损伤1。持续维持基因组稳定性对于细胞稳态至关重要2,3。这一维持过程的核心是DNA损伤应答（DDR）——一个复杂且多层次的信号网络，它在启动特定DNA修复通路的同时，精细调控许多其他细胞过程4,5。DDR功能缺陷通常表现为“基因组不稳定性综合征”，其特征包括染色体不稳定、进行性组织退化、生长或发育障碍、癌症易感性以及对特定DNA损伤因子的高度敏感6,7,8,9。值得注意的是，神经退行性病变（常伴有小脑萎缩）是许多基因组不稳定性综合征的显著特征之一7,10,11,12。
常染色体隐性遗传病共济失调毛细血管扩张症（A-T）是基因组不稳定性疾病中一个已有充分文献记载的典型例子13,14,15。该疾病由ATM（共济失调毛细血管扩张症突变）基因的无效突变引起，该基因编码关键的蛋白激酶ATM，后者主要作为DNA双链断裂（DSBs）发生后DNA损伤应答（DDR）的激活因子而被认知16,17。A-T表现为一种多系统受累的疾病，主要特征为进行性小脑变性，导致严重的运动功能障碍，同时还伴有免疫缺陷、性腺萎缩、癌症易感性以及对电离辐射的高度敏感性。来源于A-T患者的培养细胞表现出染色体不稳定性和对基因毒性试剂的敏感性增加，尤其是那些可引起DNA双链断裂的试剂15,18,19。重要的是，ATM还参与其他类型DNA损伤的修复，进一步凸显其在维持基因组稳定性中的广泛重要性20,21,22。
尽管对ATM的多种功能已有广泛研究，但阿特综合征（A-T）中导致小脑变性的具体机制仍存在争议，目前已有多种模型试图阐明这一过程23,24,25,26,27,28,29,30。我们的模型28认为，A-T患者的小脑变性始于浦肯野细胞（Purkinje cells, PCs）的功能障碍并最终导致其丢失。鉴于ATM在持续DNA损伤情况下维持基因组稳定性中的关键作用，浦肯野细胞特别容易受到ATM缺失的影响。我们将这种易损性归因于其高代谢活性、独特的染色质结构以及高度活跃的转录活动。最终，浦肯野细胞功能的丧失及其变性被认为是基因发生随机性功能性失活的结果，而这种失活源于缺陷转录本的产生28。
在实验室中研究浦肯野细胞（PC）生物学受到分离培养PC的困难限制，因为这些细胞的存活和功能高度依赖其天然微环境及邻近细胞，导致它们无法适应解离后的培养生长。然而，PC在脑片培养中可长期保持活性。小脑器官型培养（即通常从小鼠小脑获取的组织切片）能够维持组织的结构完整性，并支持多种类似于培养细胞所能进行的实验操作。因此，这类培养体系可在受控条件下开展小脑相关研究31,32,33,34,35,36,37,38,39,40,41,42,43。特别是针对共济失调毛细血管扩张症（A-T），小鼠小脑器官型培养已被证明在探索Atm缺陷型PC中DNA损伤应答（DDR）方面具有重要作用40,41,42,43。尽管Atm缺陷小鼠仅表现出轻微的小脑表型44,45,46,47，这可能源于人类与小鼠小脑生理之间的差异，但普遍认为ATM的功能在这两个物种间高度保守。这一观点得到了我们观察结果的支持：Atm-/-小鼠PC对DNA双链断裂（DSB）的应答缺陷，与其他小鼠及人类ATM/Atm缺陷细胞类型的反应一致40,41,42,43。
在类器官培养物中分析浦肯野细胞（PC）对各种刺激或应激反应的一个局限性在于，必须依赖显微成像作为检测手段。DNA损伤应答（DDR）通常通过整体生化检测方法进行研究，尽管也常使用常见的免疫荧光标记物，例如检测磷酸化组蛋白H2AX（γH2AX）和53BP1蛋白在细胞核内焦点形成与消退的动力学过程，这些被认为是DNA双链断裂（DSB）的指标48,49。更广泛的检测方法是通过荧光成像观察蛋白质上多聚（ADP-核糖）（PAR）链的形成，这是一种快速而强烈的早期DNA损伤应答，尤其针对DNA链断裂7,50。我们改进了Komulainen等人51报道的在小脑类器官培养物中进行PAR染色的实验方案，观察到在PC较大的细胞核中存在显著的PAR应答。本文展示了我们优化后的小鼠小脑类器官培养建立方法，以及在基因毒性应激条件下可视化PAR应答的实验流程。
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方案
材料、设备和抗体的详细信息见材料表。动物实验在获得特拉维夫大学伦理委员会批准后，依照其伦理指南进行。实验对象为出生10天的小鼠幼崽，不分性别。如有需要，可在前一天通过尾部活检及标准方法进行基因分型。溶液均经过无菌处理，除非另有说明，否则储存于4 °C；详见表1。
1. 培养物的制备
注意：在无菌环境中进行操作，并提前使用70%乙醇对工作台面进行消毒。
- 向6孔板的每个孔中加入1 mL BME。使用无菌镊子将单个细胞培养小室放入每个孔中，并将培养板置于37 °C、5% CO₂条件下孵育。2 在解剖操作前，将样本置于培养箱中孵育至少2小时。
- 在生物安全柜内设置解剖区域，配备组织切片机、30 mm培养皿、双目显微镜和光源。
- 在整个过程中将手术器械浸入70%乙醇中。使用一个装有70%乙醇的尿杯进行浸泡，另用一个装有1×PBS的尿杯在使用前清洗去除乙醇。
- 每次解剖（即每个小脑）需准备两块含冷解剖液的30 mm培养皿，并置于冰上。
- 用70%乙醇喷洒动物。
- 使用锋利的剪刀迅速将动物断头。为暴露脑组织，用剪刀从远离小脑的位置做一小切口。使用圆头镊子轻轻剥离颅骨，分小块移除颅骨以避免损伤小脑组织。
- 立即将脑组织转移至冰冷的解剖液中，或直接从颅腔内取出小脑。操作时，暴露小脑，并使用精细的弯头虹膜刮匙分离小脑皮层与脑干，切断三对小脑脚。为辨认小脑脚，应从头侧向尾侧观察：成对的上小脑脚连接中脑与小脑两侧；成对的中小脑脚连接脑桥与小脑两侧；成对的下小脑脚连接延髓与小脑两侧。当小脑完全暴露后，使用同一刮匙将其与大脑分离：将刮匙插入小脑、上丘及脑干之间的间隙并轻轻滑动，完成分离。
注意：无需特意去除脑膜，因为在小脑被切片后，脑膜会自然脱落。 - 将组织切片机设置为切片厚度350 µm。
- 在将小脑放置于切片机底座上之前，去除组织上多余的解剖缓冲液。这将增强组织与切片机底座之间的黏附性。
- 将小脑垂直放置在切片平台上，进行厚度为350 µm的旁矢状面切片。使用精细虹膜铲轻轻分离切片，并将其放入冷的解剖液中。
- 将切好的组织重新转移至新鲜的冷解剖缓冲液中。使用1,000 µL枪头小心地将组织片引导至盛有冷解剖缓冲液的培养皿中。
- 在双目镜下，使用两把弯虹膜分离器小心地将组织切片彼此分离。对于培养，应使用来自小脑蚓部的切片，该区域位于器官的内侧皮质-核质区。
- 使用宽口刮铲将每片组织切片转移至培养插件上，然后将带有组织切片的插件移入盛有预热培养基的6孔板中的孔内。将培养板置于培养箱中。
- 每隔一天更换一次培养基：使用无菌玻璃移液管吸除旧培养基，并用 使用一支5 mL血清移液管，沿孔壁加入1 mL新鲜MBE，避免将培养基直接冲向组织。
注意：组织切片在培养的最初5-7天内会呈现类似炎症的外观，待此现象消失后即可用于实验，最迟可在建立培养后2周内使用。
2. DNA损伤剂处理、固定、染色及显微成像
- 将DNA损伤性化学物质直接加入培养基中，使其达到适当的终浓度，并作用预定的时间。暴露结束后，更换新鲜培养基以去除化学物质。
- 若DDR检测涉及PAR染色，则在固定前30分钟向培养基中加入聚ADP核糖水解酶（PARG）抑制剂，终浓度为10 µM。
注意：此步骤至关重要，因为PAR修饰具有短暂性，会持续被PARG降解。 - 固定前立即吸除培养基，并替换为1 mL室温的0.1 M磷酸盐缓冲液。
注意：低温缓冲液可能导致组织切片从插入物上脱落。 - 立即用预冷（-20 °C）的丙酮:甲醇混合液（1:1）替换缓冲液，确保组织切片完全浸没于该混合液中 ，并在-20 °C下静置20分钟。
注意：可在本步骤暂停，后续再进行免疫染色。若需延迟操作，应用预冷至4 °C的0.1 M磷酸盐缓冲液洗涤组织3次，每次确保组织完全浸没于缓冲液中。组织现可保存于0.1 M磷酸盐缓冲液中，在4 °C下最长可保存2周。 - 将组织切片转移至48孔板中的一个孔内。
- 使用手术刀和切割板切除插入物边缘，沿组织切片周围进行切割。将每一片组织切片放入48孔板的一个孔中，并加入100 µL的0.1 M磷酸盐缓冲液。
- 进行通透处理时，吸除缓冲液，向孔中加入含1% Triton X-100的0.1 M磷酸盐缓冲液100 µL，在室温下静置5分钟。
- 吸除溶液，每孔加入100 µL封闭液（见表1），室温下轻柔振荡孵育2小时。
- 封闭期间，用封闭液将一抗或抗PAR试剂按1:800比例稀释。
- 移除封闭液（无需洗涤），每孔加入100 µL一抗混合液，室温下轻柔振荡孵育2小时。
- 将二抗用含0.2% Triton X-100的0.1 M磷酸盐缓冲液按1:500比例稀释，操作过程中尽量避免光照。
- 吸除一抗溶液，用含0.2% Triton X-100的0.1 M磷酸盐缓冲液在室温下轻柔振荡洗涤组织切片，每次5分钟，共洗3次。
- 弃去洗涤液，每孔加入100 µL二抗溶液（1:500稀释），继续在室温下避光振荡孵育2小时（可用铝箔包裹培养板）。
- 配制DAPI溶液时，将储备液（2 mg/mL）用1×PBS稀释至终浓度1 µg/mL。
- 在二抗孵育结束前20分钟，向每孔加入20 µL稀释后的DAPI溶液，继续振荡染色20分钟。随后吸除液体，用洗涤液在轻柔振荡条件下洗涤3次，每次5分钟。
- 封片时，将组织切片正面朝上置于显微镜载玻片上，滴加封片剂，盖上盖玻片。将载玻片平放于避光处，室温下过夜干燥（避免使用含DAPI的封片剂，以防图像模糊）。
- 将载玻片置于4 °C避光盒中保存。
- 使用共聚焦显微镜及适当的滤光片采集显微图像。
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结果
图1展示了小脑器官型培养物的一般形态。图1A的上排显示了在培养过程中得以维持的小脑叶片结构，下排则显示了浦肯野细胞（PCs）经Calbindin D-28k（绿色）染色以及神经元细胞核经NeuN（红色）染色的结果。图1B中，浦肯野细胞层（PCs）中的星形胶质细胞（红色）经GFAP（绿色）染色标记，GFAP是一种III型中间丝蛋白。图2和图3展示了使用两种强氧化性DNA损伤剂——溴酸钾（终浓度10 mM，处理12小时）和百草枯——处理这些培养物后观察到的PAR染色结果。与对照组相比，处理组小脑叶片中的浦肯野细胞显示出明显的PAR反应。
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讨论
一般性说明
器官型培养系统的主要优势在于能够利用小脑皮层组织进行研究，可在培养皿中维持其结构组织数周之久。该系统适用于对浦肯野细胞（Purkinje cells, PCs）进行深入的形态学分析，包括对树突棘及超微结构特征的详细观察52,53,54,55,56,57,58,59。我们的观察表明，在此类培养体系中，浦肯野细胞内的DNA损伤应答（DNA damage response, DDR）显著活跃。然而，该系统的主要局限性包括使用时间有限，以及依赖显微成像技术来监...
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披露
作者声明本研究无任何利益冲突。
致谢
本实验室的工作由米尔亚姆和谢尔顿·阿德尔森医学研究基金会以及以色列抗击共济失调毛细血管扩张症协会提供支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 试剂与设备 | |||
| 150 x 30 cm 培养皿 | 康宁公司 | 3261 | |
| 35 x 10 mm 培养皿 | 康宁公司 | 3294 | |
| 丙酮 | Invitrogen | 25030081 | |
| 丙酮 | Sigma-Aldrich | 270725-1L | |
| 黏附性显微镜载玻片 | Marienfeld | 48187 | 76 × 26 × 1 毫米 |
| 切片刀片 | TED PELLA | 模型 TC752-1 | 样式剃须刀片 |
| BME | GIBCO | 41010-026 500ml | 无L-谷氨酰胺 |
| 细胞培养插件 | Millipore | PICM0RG50 | |
| D-葡萄糖 | 生物染料 | 02-015-1A | |
| 不含酚红的HBSS | Sigma-Aldrich | H-1138-500L | 无 Ca²⁺，无 Mg²⁺ |
| 含酚红的HBSS | Sartorius | 02-015-1A | |
| 马血清 | GIBCO | 26050088 | 热灭活 |
| 虹膜镊 | 细胞路径 | GZX-0100-00A | 130毫米钝头锯齿状 |
| 虹膜刮匙 | F.S.T | 10092-12 | |
| L-谷氨酰胺（200 mM） | Gibco | 41010026 | |
| 甲醇 | Sigma-Aldrich | 322412-1L | |
| 甲醇 | Sigma-Aldrich | G5767 | |
| 显微镜 | Olympus | ||
| 无封片剂 | GRIGENE. Ltd，以色列 | K239320A | |
| 百草枯 | Sigma-Aldrich | 856177-250MG | 百草枯二氯化物（甲基紫精） |
| PARG- 多聚(ADP-核糖)糖水解酶抑制剂 | Tocris Bioscience，英国 | PDD 00017273 | 对光敏感 |
| 磷酸盐缓冲液 | 生物染色 | 02-018-1A | |
| 剪刀，皮肤组织 | |||
| 六孔板 | 康宁公司 | CLS3516 | |
| 备用切片刀片 | TED PELLA | 模型 10180-01 | |
| 组织切片机 | McIlwain | 模型 TC752 | 10180-220 |
| 镊子，尖头 | |||
| 尿液杯 | |||
| 抗体 | |||
| Alexa Fluor 488 驴抗兔 IgG | Invitrogen | A21206 | 1:500；二抗；二抗稀释缓冲液 室温孵育2小时 |
| 抗胶质纤维酸性蛋白 | Milliphore | MAB3402 | 1:1500；一抗；封闭；宿主：mouse |
| 抗钙结合蛋白D-28K | 斯万特 | CB300 | 1:2000；一抗；封闭；宿主：兔 |
| 抗钙结合蛋白D-28K | 斯旺特 | CB-38a | 1:2000；一抗；封闭 |
| 抗-泛聚ADP-核糖试剂 | Milliphore | MABE1016 | 1:800；一抗；封闭；室温孵育2小时 |
| DAPI（4',6-二脒基-2'-苯基吲哚二盐酸盐） | 细胞信号传导 | 4084 | 1:1000；二抗稀释缓冲液；室温孵育20分钟 |
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