使用小脑器官型培养物可视化浦肯野细胞中的 DNA 损伤反应

摘要

小脑浦肯野细胞 （PC） 对 DNA 损伤反应的缺陷特别敏感。提出了一种方案，用于视觉评估 PC 对 DNA 损伤的反应动力学，其中包括对小脑器官型培养物中的蛋白质结合多聚 （ADP-核糖） 链进行染色。

摘要

小脑浦肯野细胞 （PC） 表现出高代谢率、特异性染色质结构和广泛转录活性的独特相互作用，使它们特别容易受到 DNA 损伤。这需要有效的 DNA 损伤反应 （DDR） 来防止小脑变性，这通常是由 PC 功能障碍或丢失引起的。一个值得注意的例子是基因组不稳定综合征，共济失调-毛细血管扩张症 （A-T），其特征是进行性 PC 耗竭和小脑恶化。研究 PC 中的 DDR 机制对于阐明导致它们在此类疾病中退化的途径至关重要。然而，体外分离和培养 PC 的复杂性长期以来 一直阻碍着研究工作。小鼠小脑器官型（切片）培养物提供了一种可行的替代方案，与 体内 组织环境非常相似。然而，该模型仅限于适合显微镜成像的 DDR 指标。我们改进了器官型培养方案，证明蛋白质结合的聚 （ADP-核糖） （PAR） 链的荧光成像是一种快速和早期的 DDR 指标，可有效揭示这些培养物中 PC 中的 DDR 动力学，以响应遗传毒性应激。

引言

细胞 DNA 的完整性不断受到 DNA 损伤剂的威胁，主要是活性氧等代谢副产物，每天每个细胞都会造成数以万计的 DNA 损伤¹。持续维持基因组稳定性对于细胞稳态至关重要 ^2,3。这种维持的基石是 DNA 损伤反应 （DDR） - 一个复杂的分层信号转导网络，可启动特定的 DNA 修复途径，同时仔细调整许多其他细胞过程 ^4,5。DDR 缺陷通常表现为"基因组不稳定综合征"，其特征是染色体不稳定、进行性组织恶化、生长或发育受损、癌症易感性以及对特定 DNA 损伤剂的敏感性增加 6,7,8,9。值得注意的是，神经退行性变（通常包括小脑萎缩）是许多基因组不稳定综合征的一个显著特征 7,10,11,12。

常染色体隐性遗传病，共济失调-毛细血管扩张症 （A-T），是基因组不稳定性疾病的一个有据可查的例子 13,14,15。这种情况是由 ATM（A-T，突变）基因的无效突变引起的，该基因负责编码关键蛋白激酶 ATM，ATM 主要被称为响应 DNA 双链断裂 （DSB） 的 DDR 动员剂^16,17。A-T 表现为一种多系统疾病，主要以进行性小脑变性为特征，导致急性运动障碍、免疫缺陷、性腺萎缩、癌症易感性和对电离辐射的极度敏感。来自 A-T 个体的培养细胞显示出染色体不稳定和对遗传毒性物质的敏感性增加，尤其是那些导致 DSB 的物质 15,18,19。重要的是，ATM 还在修复其他 DNA 损伤中发挥作用，强调了它在维持基因组稳定性方面的广泛意义 20,21,22。

尽管对 ATM 的众多作用进行了深入研究，但导致 A-T 小脑变性的具体机制仍然是一个激烈争论的话题，提出了各种模型来阐明这一过程 23,24,25,26,27,28,29,30。我们的模型²⁸ 表明，A-T 患者的小脑变性始于浦肯野细胞 （PC） 的功能障碍和最终丢失。考虑到 ATM 在面对持续的 DNA 损伤时在保持基因组稳定性方面的关键作用，PC 特别容易受到 ATM 缺失的影响。我们将这种脆弱性归因于它们的高代谢活性、独特的染色质结构和广泛的转录活性的组合。最终，有人认为 PC 功能的丧失以及它们的退化是由于基因的随机功能失活，这是产生有缺陷的转录本的结果²⁸。

实验室中 PC 生物学的研究受到培养分离 PC 的挑战的阻碍，因为这些细胞严重依赖其自然环境和邻近细胞进行生存和功能，使它们与解离的培养生长不相容。尽管如此，PC 可以在组织切片培养物中长时间保持活力。小脑器官型培养物是通常来源于啮齿动物大脑的组织切片，可维持组织的结构组织并支持类似于培养细胞的各种实验操作。因此，这些培养物允许在受控环境中进行小脑研究 31,32,33,34,35,36,37,38,39,40,41,42,43.具体来说，在 AT 的背景下，小鼠小脑器官型培养物已被证明有助于探索 ATM 缺陷型 PC^{40、41、42、43} 中的 DDR。虽然 ATM 缺陷小鼠只表现出微妙的小脑表型 44,45,46,47，这可能是由于人类和小鼠小脑生理学之间的差异，但假设 ATM 的作用在这些物种中在很大程度上是保守的。我们的观察结果支持了这一观点，即 Atm^-/- 小鼠 PC 中对 DNA DSB 的缺陷反应与其他小鼠和人 ATM/Atm 缺陷细胞类型中观察到的反应一致 40,41,42,43。

分析 PC 对器官型培养物中各种刺激或应激的反应的一个局限性是必须依靠显微镜成像来获得读数。DDR 通常使用大量生化读数进行研究，但也使用常见的免疫荧光标记物，例如跟踪磷酸化组蛋白 H2AX （γH2AX） 和 53BP1 蛋白的核病灶的形成和消退动力学，这被认为是 DSB^{的指标 48,49}。更广泛的测量方法是蛋白质上聚 （ADP-核糖） （PAR） 链形成的荧光成像，这是一种快速而强大的早期 DNA 损伤反应，尤其是对链断裂 ^7,50。我们修改了 Komulainen 等人 ⁵¹ 在小脑器官型培养物中进行 PAR 染色的方案。我们在 PC 的相当大的细胞核中观察到明显的 PAR 反应。这里介绍的是我们用于建立小鼠小脑器官型培养物和可视化遗传毒性应激下 PAR 反应的改进方案。

方案

有关材料、设备和抗体的详细信息，请参阅 材料表 。批准后，根据特拉维夫大学伦理委员会的伦理准则采用动物程序。该程序在 10 天大的小鼠幼崽上进行，无论它们的性别如何。如果需要，在前一天使用尾部活检和标准方法进行基因分型。除非另有说明，否则溶液是无菌的，并储存在 4 °C 下;请参阅 表 1。

1. 培养物的制备

注意:在无菌环境中执行该程序，并使用 70% 乙醇提前对工作台面进行消毒。

1. 向 6 孔板的每个孔中加入 1 mL 的 BME。使用无菌镊子，将单个细胞培养插入物放入每个孔中，并在解剖程序之前将板在 37 °C/5% CO₂ 培养箱中孵育至少 2 小时。
2. 在生物罩内设置一个解剖区域，包含组织切碎器、30 毫米培养板、双目显微镜和光源。
3. 在整个过程中将手术工具浸入 70% 乙醇中。使用装有 70% 乙醇的尿杯浸泡，并使用装有 1x PBS 的单独尿杯洗去乙醇。
4. 对于每次解剖（即对于每个小脑），准备两个装满冷解剖培养基的 30 mm 培养板，并将它们放在冰上。
5. 用 70% 乙醇喷洒动物。
6. 使用锋利的剪刀，迅速将动物斩首。要暴露大脑，请用剪刀在远离小脑的地方做一个小切口。使用圆头镊子轻轻剥下头骨。将颅骨切成小块，以免损伤小脑组织。
7. 立即将大脑转移到冷解剖培养基中或直接从颅骨内取出小脑。为此，使用细弯曲的虹膜刮刀断开三对花梗，暴露小脑并将小脑皮层与脑干分开。要识别花梗，从喙部到尾部观察:成对的小脑上部花梗将中脑与小脑的每一侧连接起来;成对的小脑中蒂将脑桥连接到小脑的每一侧;成对的小脑下蒂连接到小脑两侧的延髓。一旦小脑可见，使用相同的刮刀将其与大脑分开:将刮刀滑到小脑、上丘和脑干之间。
   注意:不要特别努力去除脑膜，因为它们在小脑切片后很容易脱落。
8. 将组织切碎机设置为 350 μm 的切片厚度。
9. 在将小脑定位在切碎机的基座上之前，从组织中去除多余的解剖缓冲液。这将提高组织与切碎机基底的粘附性。
10. 将小脑以垂直方向放置在切割平台上，并以 350 μm 的切片厚度进行矢状旁切片。用细鸢尾刮刀轻轻分离切片，然后放入冷解剖培养基中。
11. 将切片的组织转移回新鲜的冷解剖缓冲液中。使用 1,000 μL 吸头将组织切片巧妙地引导至含有冷解剖缓冲液的培养皿中。
12. 在双筒望远镜下，使用两个弯曲的虹膜刮刀小心地将组织切片彼此分开。对于培养物，使用来自位于器官内侧皮质核区的小脑蚓的切片。
13. 使用宽刮刀将每个组织切片转移到培养小室上，然后将每个携带组织切片的小室移动到含有预热培养基的 6 孔板中的孔中。将板留在培养箱中。
14. 每隔一天更换一次培养基:使用无菌玻璃移液管吸出用过的培养基，然后用 5 mL 血清移液管加入 1 mL 新鲜的 MBE，移液器的尖端靠在孔壁上。确保不要将介质流引导到组织上。
    注:组织切片在培养的前 5-7 天内会表现出类似炎症的外观，一旦这种现象消失，就可以在培养建立后 2 周内进行实验。

2. DNA 损伤剂处理、固定、染色和显微镜成像

1. 将 DNA 损伤化学物质以适当的最终浓度直接添加到培养基中，持续预定持续时间。暴露期过后，用新鲜培养基替换培养基以去除化学物质。
2. 如果 DDR 读数涉及 PAR 染色，则在固定前 30 分钟向培养基中加入终浓度为 10 μM 的聚（ADP-核糖）糖水解酶 （PARG） 抑制剂。
   注意:这种处理至关重要，因为 PAR 修饰是短暂的并且会不断被 PARG 降解。
3. 固定前，吸出培养基并在室温下用 1 mL 的 0.1 M 磷酸盐缓冲液替换。
   注:冷缓冲液可能会导致组织切片与插入片段分离。
4. 立即用预冷 （-20 °C） 的丙酮:甲醇混合物 （1:1） 替换缓冲液来固定切片，使组织切片浸没在该混合物中并在 -20 °C 下放置 20 分钟。
   注意:可以在此阶段停止，稍后再进行免疫染色。为此，用预冷至 4 °C 的 0.1 M 磷酸盐缓冲液洗涤组织 3 次，确保组织浸没在缓冲液中。组织现在可以在 0.1M 磷酸盐缓冲液中在 4 °C 下储存长达 2 周。
5. 将组织切片转移到 48 孔板中的孔中。
6. 使用手术刀和砧板去除插入物的边缘，在组织切片周围切割。将每个切片放入 48 孔板的孔中。加入 100 μL 的 0.1 M 磷酸盐缓冲液。
7. 对于透化，吸出缓冲液，向孔中加入 100 μL 含有 1% Triton X-100 的 0.1 M 磷酸盐缓冲液，并在室温下放置 5 分钟。
8. 吸出溶液，每孔加入 100 μL 封闭溶液（见 表 1）。在室温下轻轻摇晃 2 小时。
9. 在封闭步骤中，在封闭溶液中稀释一抗或抗 PAR 试剂 （1:800）。
10. 去除封闭溶液（无需洗涤），并向每个孔中加入 100 μL 一抗混合物。在室温下轻轻摇动 2 小时。
11. 在含有 0.2% Triton X-100 （1:500） 的 0.1 M 磷酸盐缓冲液中稀释二抗，同时尽量减少其暴露于光线下。
12. 吸出一抗溶液，并在室温下用含有 0.2% Triton X-100 的 0.1 M 磷酸盐缓冲液洗涤切片 3 x 5 分钟，同时轻轻摇晃。
13. 用 100 μL 二抗溶液（1:500 稀释）替换洗涤液。在室温下在黑暗中继续轻轻摇动 2 小时（用铝箔覆盖板）。
14. 要制备 DAPI 溶液，请在 1x PBS 中将储备溶液 （2 mg/mL） 稀释至 1 μg/mL。
15. 在与二抗孵育 2 小时结束前 20 分钟，向每个孔中加入 20 μL 最终 DAPI 溶液，并继续振荡 20 分钟。吸出液体，用洗涤液洗涤 3 x 5 分钟，轻轻摇动。
16. 封固时，将组织放在显微镜载玻片上，组织朝上，添加封固剂，并盖上盖玻片。将载玻片放在平坦的表面上，让它们在室温下避光干燥过夜（避免使用含有 DAPI 的封固剂以防止模糊）。
17. 将载玻片存放在 4 °C 的避光盒中。
18. 使用共聚焦显微镜和适当的滤光片捕获显微图像。

结果

图 1 说明了小脑器官型培养物的一般外观。 图 1A 中的第一行显示了在培养物中保持的小脑叶状，而底行显示了钙结合蛋白 D-28k（绿色）染色的 PC 和 NeuN（红色）染色的神经元核。在 图 1B 中，PC 中的星形胶质细胞（红色）对 GFAP（绿色）进行染色，GFAP 是一种中间丝 III 型蛋白。 图 2 和 图 3 显示了用两种 DNA 损伤剂处理这些培养物后观察到的 PAR 染色，这两种物质都是强氧化剂:溴酸钾（终浓度为 10 mM，持续 12 小时）和百草枯。与对照相比，在小脑叶中处理的 PC 中标记了 PAR 反应。

图 1:小鼠小脑器官型培养物概述。 （A） 顶行说明了小脑叶状，这在培养物中得以维持。底行侧重于 PC 层。PC 用钙结合蛋白 D-28k（绿色）突出显示。NeuN 染色（红色）可识别各层的神经元核。（B） 仔细观察 PC（红色）。GFAP（绿色），一种中间丝 III 型蛋白，突出显示星形胶质细胞。比例尺 = 968.8 μm（A，顶行）、42.1 μm（A，第二行）、72.7 μm（B，顶行）、18.2 μm（B，第二行）。缩写: PC = 浦肯野细胞;GFAP = 神经胶质纤维酸性蛋白;DAPI = 4'，6-二脒基-2-苯基吲哚。 请单击此处查看此图的较大版本。

图 2:用溴酸钾处理的小脑切片中的 PAR 染色。 用溴酸钾 （KBrO₃） - 一种强效氧化剂处理小脑切片，终浓度为 10 mM，持续 12 小时。比例尺 = 775 μm。缩写:PAR = 聚（ADP-核糖）;DAPI = 4'，6-二脒基-2-苯基吲哚。 请单击此处查看此图的较大版本。

图 3:暴露于百草枯的小脑切片中的 PAR 反应，百草枯是超氧阴离子的强产地。 （A） 小脑叶的一般视图。请注意，与对照相比，PC 具有稳健的 PAR 响应，尤其是在 PC 中。（B） 仔细检查显示 PC 和其他细胞类型的 PAR 反应。比例尺 = 193.8 μm （A），18.2 μm （B）。缩写:PAR = 聚（ADP-核糖）;DAPI = 4'，6-二脒基-2-苯基吲哚。 请单击此处查看此图的较大版本。

溶液和缓冲液
溶液	成分
解剖培养基	含 0.5% D-葡萄糖的汉克平衡盐溶液 （HBSS）。将 0.5 mL 的 50% D-葡萄糖溶液添加到 50 mL 不含 Mg2+ 和 Ca2+ 的 HBSS 中。
BME 培养基	将 100 mL 含酚红但不含 L-谷氨酰胺或 HEPES 的基础培养基 Eagle （BME） 与 50 mL 含酚红的 HBSS、50 mL 热灭活马血清、2 mL 50% D-葡萄糖和 1 mL 200 mM L-谷氨酰胺混合。在无菌环境中通过 0.22 μm 过滤器混合和过滤。储存在 4 °C
免疫染色的封闭液	在 0.1 M 磷酸盐缓冲液中:加入 0.5% Triton X-100、10% 山羊血清
二抗稀释缓冲液	0.1 M 磷酸盐缓冲液，0.2% Triton X-100
洗涤缓冲液	0.1 M 磷酸盐缓冲液，0.2% Triton X-100
固定液	Actenoe:甲醇 （1:1 v:v）
透化溶液	0.1 M 磷酸盐缓冲液，1% Triton X-100
DAPI 解决方案	在 1x PBS 中稀释至 1 μg/mL 的储备液 （2 mg/mL）
磷酸盐缓冲液	准备两个解决方案 A 和 B（见下文）。根据下面指定的比例混合溶液，制成 0.2 M 磷酸盐缓冲液。然后用 DDW （1:1） 稀释 0.2 M 溶液，制成 0.1 M 磷酸盐缓冲液（工作溶液）。
溶液 A（用于 0.2 M）	12 克无水磷酸二氢钠 （Na2HPO4 FW 141.96） 500 毫升 DDW
溶液 B（用于 0.2 M）	14.2 克无水磷酸二钠 （Na2HPO4 FW 141.96） 500 毫升 DDW
混合溶液制成 0.2 M	准备 1 L:230 mL 溶液 A 和 770 mL 溶液 B
0.1 M 磷酸盐缓冲液	用 DDW 稀释混合溶液 （1:1）

表 1:解决方案及其组成。

讨论

一般评论
器官型培养系统的主要优点是它有助于使用小脑皮层组织进行研究，在培养皿设置中将其结构组织保留数周。该系统可用于对浦肯野细胞 （PC） 进行深入的形态学分析，包括树突棘和超微结构特征的详细检查 52,53,54,55,56,57,58,59。我们的观察表明，DNA 损伤反应 （DDR） 在这些培养物的 PC 中特别活跃。然而，该系统的主要局限性包括其使用时间有限以及依赖显微成像来监测细胞过程，这凸显了开发或适应合适成像技术的持续需求。

另一个注意事项与为准备组织切片而解剖的小脑部分有关。我们观察到，不同的小脑叶可以产生内部组织和整体质量明显不同的培养物。因此，我们更喜欢从通过小脑蚓的中矢状切片获得的切片中建立培养物。在这些切片中，小脑皮层的叶子很容易看到。

建议使用从小脑蚓部获得的组织切片，这些组织切片表现出小脑皮层的特征性叶状。这些切片在文化中保持其组织结构数周。此外，建议在建立后约 7-12 天开始对培养物进行实验程序。旨在评估这些培养物中 DNA 损伤反应的典型实验包括通过辐照或向培养基中添加 DNA 损伤化学物质来引发损伤。随后，以不同的时间间隔进行组织固定和染色。为了评估从化学诱导的损伤中恢复，包括在新鲜培养基中孵育一段时间。建议尽早开始长期实验，最好在培养物建立后 7 天左右。

小脑器官型培养物维持在不含抗生素的培养基中;因此，在建立过程中保持无菌环境势在必行。收获小脑的幼崽的年龄很关键，推荐范围为 9-12 天。这个年龄范围是最佳的，因为小脑皮层已经充分发育，可以进行切片。值得注意的是，在老年动物中，组织往往会粘附在刀片上。将小脑浸入冷解剖溶液中直至解剖至关重要。

在培养的最初 5-7 天内，组织切片可能表现出让人联想到炎症的迹象，其特征是肿胀和乳白色变色。这些属性可能会影响生理参数的测量和免疫染色技术的有效性。

强烈建议不要将小脑切片细于 350 μm，以避免切片时厚度不一致。请记住，350 μm 切片的组织在培养 7 天后会变薄到 90 μm 左右（基于 Z 堆栈测量）。

在这里，我们将 PAR 染色 ^7,50 引入用于研究 PC 中 DDR 的工具包中。这种读数快速、灵敏，并捕获了 DDR 的动态性质，证明我们在分析野生型和 ATM 缺陷型 PC 中的 DDR 特别有用。此处概述的方案对于研究影响小脑的基因组不稳定综合征的研究人员应该特别有益。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
试剂和设备
150 x 30 cm 培养皿	Corning Inc.	3261
35 x 10 mm 培养皿	Corning Inc.	3294
丙酮	Invitrogen	25030081
丙酮	Sigma-Aldrich	270725-1L
粘性显微镜载玻片	Marienfeld	48187	76 x 26 x 1 毫米
切碎机刀片	TED PELLA	型号 TC752-1	风格 剃须刀片
BME	GIBCO	41010-026 500ml。	无 L-Glut
细胞培养插入片段	Millipore	PICM0RG50
D-Glucose	Biological Indo。	02-015-1A
不含酚红的 HBSS	Sigma-Aldrich	H-1138-500L	不含钙+，不含镁 +
含酚红的 HBSS	多利斯	02-015-1A
马血清	GIBCO	26050088	热灭活
虹膜镊子	CellPath	GZX-0100-00A	130mm 钝锯齿
鸢尾刮刀	F.S.T	10092-12
L-谷氨酰胺 （200 mM）	Gibco	41010026
甲醇	Sigma-Aldrich	322412-1L
甲醇	Sigma-Aldrich	G5767
显微镜	奥林巴斯
封固剂，不含	GRIGENE。Ltd， 以色列	K239320A
百草枯	Sigma-Aldrich	856177-250MG	百草枯二氯化物（甲基紫精）
PARG-聚（ADP-核糖）糖水解酶抑制剂	Tocris Bioscience，英国	PDD 00017273	光敏性
磷酸盐缓冲液	Biological Indo.	02-018-1A
剪刀，皮肤组织
宁	CLS3516		孔板
切碎盘	TED PELLA	型号 10180-01
组织切碎机	McIlwain	型号 TC752	10180-220
尖头镊
子 尿杯
抗体
Alexa fluor 488 驴抗兔 IgG	Invitrogen	A21206	1：500;次级抗体;二级稀释缓冲液; 在室温下孵育 2 小时
抗胶质纤维酸性蛋白	Milliphore	MAB3402	1：1500;原代抗体;封闭;宿主：小鼠
抗钙结合蛋白-D-28K	Swant	CB300	1：2000; 原发性抗体;阻断;宿主：兔子
抗钙结合蛋白-D-28K	Swant	CB-38a	1：2000;原发性抗体;阻断
抗泛 ADP 核糖试剂	Milliphore	MABE1016	1：800;一级抗体;封闭;室温下孵育 2 小时
DAPI（4'，6-二脒-2'-苯基吲哚二盐酸盐）	细胞信号转导	4084	1：1000;二级稀释缓冲液;室温下孵育 20 分钟