利用小脑器官型培养物在浦肯野细胞中可视化DNA损伤应答

摘要

小脑浦肯野细胞（PCs）对DNA损伤应答缺陷尤为敏感。本文介绍了一种用于直观评估小脑器官型培养物中浦肯野细胞对DNA损伤应答动态过程的实验方案，该方法涉及对蛋白质结合的多聚（ADP-核糖）链进行染色。

摘要

小脑浦肯野细胞（PCs）表现出高代谢率、特异性染色质结构与高度转录活性之间的独特相互作用，使其特别容易受到DNA损伤的影响。因此，必须依赖高效的DNA损伤应答（DDR）机制，以防止小脑退行性病变，这类病变通常由PC功能障碍或丢失引发。一个典型的例子是基因组不稳定性综合征——共济失调毛细血管扩张症（A-T），其特征为进行性浦肯野细胞减少和小脑功能退化。研究PC中的DDR机制对于阐明此类疾病中细胞退变的分子通路至关重要。然而，由于浦肯野细胞的分离与培养过程复杂 体外 长期以来阻碍了研究工作的进展。小鼠小脑器官型（切片）培养提供了一种可行的替代方案，能够高度模拟 体内 组织微环境。然而，该模型仅限于适用于显微成像的DNA损伤应答（DDR）指标。我们优化了类器官培养方案，证明对蛋白结合的多聚（ADP-核糖）（PAR）链进行荧光成像——一种快速且早期的DDR指标——可有效揭示此类培养体系中浆细胞（PC）在基因毒性应激下的DDR动态变化。

引言

细胞DNA的完整性 constantly 受到DNA损伤因子的威胁，其中主要是活性氧等代谢副产物，这些物质每天在每个细胞中造成数以万计的DNA损伤¹。持续维持基因组稳定性对于细胞稳态至关重要^2,3。这一维持过程的核心是DNA损伤应答（DDR）——一个复杂且多层次的信号网络，它在启动特定DNA修复通路的同时，精细调控许多其他细胞过程^4,5。DDR功能缺陷通常表现为“基因组不稳定性综合征”，其特征包括染色体不稳定、进行性组织退化、生长或发育障碍、癌症易感性以及对特定DNA损伤因子的高度敏感^6,7,8,9。值得注意的是，神经退行性病变（常伴有小脑萎缩）是许多基因组不稳定性综合征的显著特征之一^7,10,11,

方案

材料、设备和抗体的详细信息见材料表。动物实验在获得特拉维夫大学伦理委员会批准后，依照其伦理指南进行。实验对象为出生10天的小鼠幼崽，不分性别。如有需要，可在前一天通过尾部活检及标准方法进行基因分型。溶液均经过无菌处理，除非另有说明，否则储存于4 °C；详见表1。

1. 培养物的制备

注意：在无菌环境中进行操作，并提前使用70%乙醇对工作台面进行消毒。

1. 向6孔板的每个孔中加入1 mL BME。使用无菌镊子将单个细胞培养小室放入每个孔中，并将培养板置于37 °C、5% CO₂条件下孵育。₂ 在解剖操作前，将样本置于培养箱中孵育至少2小时。
2. 在生物安全柜内设置解剖区域，配备组织切片机、30 mm培养皿、双目显微镜和光源。
3. 在整个过程中将手术器械浸入70%乙醇中。使用一个装有70%乙醇的尿杯进行浸泡，另用一个装有1×PBS的尿杯在使用前清洗去除乙醇。
4. 每次解剖（即每个小脑）需准备两块含冷解剖液的30 mm培养皿，并置于冰上。
5. 用70%乙醇喷洒动物。
6. 使用锋利的剪刀迅速将动物断头。为暴露脑组织，用剪刀从远离小脑的位置做一小切口。使用圆头镊子轻轻剥离颅骨，分小块移除颅骨以避免损伤小脑组织。....

结果

图1展示了小脑器官型培养物的一般形态。图1A的上排显示了在培养过程中得以维持的小脑叶片结构，下排则显示了浦肯野细胞（PCs）经Calbindin D-28k（绿色）染色以及神经元细胞核经NeuN（红色）染色的结果。图1B中，浦肯野细胞层（PCs）中的星形胶质细胞（红色）经GFAP（绿色）染色标记，GFAP是一种III型中间丝蛋白。图2和图3展示了使用两种强氧化性DNA损伤剂——溴酸钾（终浓度10 mM，处理12小时）和百草枯——处理这些培养物后观察到的PAR染色结果。与对照组相比，处理组小脑叶片中的浦肯野细胞显示出明显的PAR反应。

讨论

一般性说明
器官型培养系统的主要优势在于能够利用小脑皮层组织进行研究，可在培养皿中维持其结构组织数周之久。该系统适用于对浦肯野细胞（Purkinje cells, PCs）进行深入的形态学分析，包括对树突棘及超微结构特征的详细观察^{52,53,54,55,56,57,58,59}。我们的观察表明，在此类培养体系中，浦肯野细胞内的DNA损伤应答（DNA damage response, DDR）显著活跃。然而，该系统的主要局限性包括使用时间有限，以及依赖显微成像技术来监.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
试剂与设备
150 x 30 cm 培养皿	康宁公司	3261
35 x 10 mm 培养皿	康宁公司	3294
丙酮	Invitrogen	25030081
丙酮	Sigma-Aldrich	270725-1L
黏附性显微镜载玻片	Marienfeld	48187	76 × 26 × 1 毫米
切片刀片	TED PELLA	模型 TC752-1	样式剃须刀片
BME	GIBCO	41010-026 500ml	无L-谷氨酰胺
细胞培养插件	Millipore	PICM0RG50
D-葡萄糖	生物染料	02-015-1A
不含酚红的HBSS	Sigma-Aldrich	H-1138-500L	无 Ca²⁺，无 Mg²⁺
含酚红的HBSS	Sartorius	02-015-1A
马血清	GIBCO	26050088	热灭活
虹膜镊	细胞路径	GZX-0100-00A	130毫米钝头锯齿状
虹膜刮匙	F.S.T	10092-12
L-谷氨酰胺（200 mM）	Gibco	41010026
甲醇	Sigma-Aldrich	322412-1L
甲醇	Sigma-Aldrich	G5767
显微镜	Olympus
无封片剂	GRIGENE. Ltd，以色列	K239320A
百草枯	Sigma-Aldrich	856177-250MG	百草枯二氯化物（甲基紫精）
PARG- 多聚(ADP-核糖)糖水解酶抑制剂	Tocris Bioscience，英国	PDD 00017273	对光敏感
磷酸盐缓冲液	生物染色	02-018-1A
剪刀，皮肤组织
六孔板	康宁公司	CLS3516
备用切片刀片	TED PELLA	模型 10180-01
组织切片机	McIlwain	模型 TC752	10180-220
镊子，尖头
尿液杯
抗体
Alexa Fluor 488 驴抗兔 IgG	Invitrogen	A21206	1:500；二抗；二抗稀释缓冲液  室温孵育2小时
抗胶质纤维酸性蛋白	Milliphore	MAB3402	1:1500；一抗；封闭；宿主：mouse
抗钙结合蛋白D-28K	斯万特	CB300	1:2000；一抗；封闭；宿主：兔
抗钙结合蛋白D-28K	斯旺特	CB-38a	1:2000；一抗；封闭
抗-泛聚ADP-核糖试剂	Milliphore	MABE1016	1:800；一抗；封闭；室温孵育2小时
DAPI（4',6-二脒基-2'-苯基吲哚二盐酸盐）	细胞信号传导	4084	1:1000；二抗稀释缓冲液；室温孵育20分钟