通过高维流式细胞术进行高效的扁桃体 T 滤泡辅助细胞处理和功能分析

Summary

在这里，我们提出了一种用于收集和处理扁桃体样本、使用高维光谱流式细胞术进行表型分析以及进行无监督分析的方案。

Abstract

滤泡辅助性 T 细胞 （Tfh） 是 CD4⁺ 辅助性 T 细胞的一个亚群，有助于 B 细胞同种型转换、生发中心 （GC） 形成、体细胞超突变和亲和力成熟，从而有助于在感染、自身免疫和疫苗接种期间协调次级淋巴组织中的适应性体液免疫反应。了解 Tfh 细胞的发育和功能对于设计有效的疫苗和为涉及该人群的疾病制定靶向治疗策略至关重要。人扁桃体细胞是可接近的粘膜淋巴器官。它们提供了一个独特的机会来分析不同的免疫群体，如 Tfh 和 GC 细胞，研究细胞间相互作用，评估动态细胞功能，并在器官水平上揭示它们的调节机制。此外，扁桃体细胞的 体外 培养物易于处理，并且能够在各种条件下评估 Tfh 细胞生物学。在这里，我们介绍了一种用于收集、分离、保存和培养人扁桃体细胞的方案。我们还描述了两种优化的光谱流式细胞术面板，旨在深入表征 Tfh 细胞。最后，以磷酸酶蛋白 2A （PP2A） 抑制剂治疗为例，我们展示了高维流式细胞术数据无监督分析的效率和力量，有效地揭示了高维尺度上治疗诱导的差异。

Introduction

滤泡辅助性 T 细胞 （Tfh） 是 CD4⁺ 辅助性 T 细胞的一个独特亚群，对生发中心 （GC） 的形成和功能以及 B 细胞抗体的产生至关重要。Tfh 细胞通过与抗原呈递细胞的相互作用以及内源性和外源因子的整合，包括 T 细胞受体信号转导、与 B 细胞的共刺激相互作用、细胞因子和趋化因子¹，源自幼稚的 CD4⁺ T 细胞。Tfh 细胞表达 CXCR5 和 PD-1，它们指导它们在 GC 内或附近的位置。BCL-6 是对 Tfh 发育、维持和功能至关重要的主转录因子 ^1,2。Tfh 细胞对于增加体液免疫反应至关重要，尤其是在疫苗反应以及防御细菌和病毒病原体方面。异常的 Tfh 细胞反应与各种疾病有关，包括自身免疫性疾病、免疫缺陷和可能的某些形式的癌症 3,4,5,6。因此，了解它们的功能和调节对于开发有效的疫苗和治疗策略非常重要⁷。

与其他 CD4⁺ T 辅助细胞（如 Th1、Treg 和 Th17）相比，体外分化系统已建立⁸，而 Tfh 细胞的研究更复杂，因为它们的发育涉及动态细胞间相互作用和专门的解剖结构⁷。因此，Tfh 细胞的研究在很大程度上依赖于人外周循环 Tfh 细胞 （cTfh） 和体内小鼠模型的离体表型。因此，研究特定分子对 Tfh 细胞的调节具有挑战性，尤其是对于人类 Tfh 细胞⁹。因此，对来自淋巴组织的 Tfh 细胞进行深入的离体研究对于增强我们对人类 Tfh 细胞的理解至关重要。

扁桃体作为次级淋巴器官，含有外周血中不存在的独特细胞群，例如 pre-Tfh （CXCR5^intPD-1^int CD4⁺） 和 GC-Tfh （CXCR5^hiPD-1^hi CD4⁺） 细胞，这两种细胞都有助于形成 GC。此外，腭扁桃体是儿科手术中最常切除的组织之一，并且很容易获得，使其成为探索涉及 Tfh 细胞的复杂免疫机制的宝贵人体组织来源。因为它们位于上气道，而上气道是呼吸道病毒感染的主要部位，所以扁桃体为研究对此类病毒感染的免疫反应提供了有利的组织。例如，我们的实验室之前对从 COVID-19 中康复的儿童的扁桃体和腺样体中的 Tfh 细胞进行了表征，并将这些组织与未感染对照的组织进行了比较¹⁰。在这里，我们概述了处理和储存扁桃体细胞的方案。以 PP2A 抑制剂处理的扁桃体为例，我们详细介绍了如何通过高维光谱流式细胞术表征这些细胞，并使用无监督分析分析数据。

Protocol

本研究的所有人体研究都遵循世界医学协会道德准则（赫尔辛基宣言）。人扁桃体标本购自导致睡眠呼吸障碍或阻塞性睡眠呼吸暂停的腺样体扁桃体肥大患者，来源于美国华盛顿特区国家儿童医院小儿耳鼻喉科。这项研究获得了国家儿童医院机构审查委员会 （IRB） 的批准 （IRB 协议编号 00009806）。所有登记参与者的父母或监护人签署了知情同意书，并获得了 7 岁及以上未成年参与者的同意。

1. 人扁桃体采集和单细胞分离储存

1. 扁桃体单细胞的分离
   1. 手术标本采集
      1. 从接受扁桃体切除术的患者身上获取扁桃体，并在手术室中将新鲜组织块收集在装有 25-35 mL 冰冷无菌扁桃体培养基的 50 mL 离心管中：补充有 5% 热灭活胎牛血清 （FBS）、0.05 mg/mL 庆大霉素、10 mM 谷氨酰胺和抗生素-抗真菌混合物（100 单位/mL 链霉素、100 单位/mL 青霉素、 和 0.25 μg/mL 两性霉素 B）。
         注意：上述培养基中的扁桃体可以在 4 °C 下储存过夜，并在第二天处理。与当天处理相比，过夜储存的细胞活力损失最小（图 1A）。扁桃体也可以在冰上隔夜运输。
   2. 扁桃体加工
      注意：所有培养基、缓冲液和手术工具必须是无菌的，扁桃体细胞分离应在生物安全罩中的冰上进行。
      1. 将扁桃体放在含有 5 mL 冷冻扁桃体培养基的 60 mm 塑料细胞培养皿上。在冰上工作。使用无菌镊子和剪刀或手术刀，小心去除任何可见的血凝块、脂肪和结缔组织（图 1B、C）。
      2. 将扁桃体移至装有 5 mL 冰冷扁桃体培养基的新的 60 mm 细胞培养皿中。将扁桃体块切成 3-5 毫米的碎片。
      3. 用 10 mL 冷扁桃体培养基制备新的 60 mm 细胞培养皿，并在培养皿中放置 70 μm 细胞过滤器。
      4. 将扁桃体碎片移动到过滤器上，并使用无菌 3 mL 注射器的柱塞端穿过过滤器粉碎扁桃体碎片。
      5. 将含有细胞的培养基收集到培养皿中过滤器外，并转移到 50 mL 锥形管中。
      6. 在带有过滤器的培养皿中再加入 10 mL 扁桃体培养基，用柱塞捣碎扁桃体碎片，然后将培养基收集在锥形管中。对于大扁桃体，重复此步骤 2-3 次以上，直到过滤器中只剩下结缔组织碎片。将剩余的组织和用过的板放入生物危害袋和医疗废物中。
      7. 用扁桃体培养基将 50 mL 锥形管填充至顶部。
      8. 在 4 °C 下以 400 × g 离心 5 分钟。
         注：将离心时间延长至 20 分钟可能会提高产量。
      9. 小心吸出或移液去除上清液，并在室温 （RT） 下将沉淀重悬于 5 mL 氯化铵钾 （ACK） 裂解缓冲液中以裂解红细胞。在 RT 中孵育 5 分钟，然后加入 35 mL 冷冻 PBS 以防止进一步裂解。在 4 °C 下以 400 × g 离心 5 分钟。
      10. 用 50 mL 冷冻 PBS 洗涤一次并离心。用 10 mL PBS 重悬，并通过 70 μm 塑料过滤器过滤细胞。计数细胞。
2. 扁桃体细胞的冻存
   1. 准备冷冻培养基（90% 热灭活 FBS 和 10% 二甲基亚砜 （DMSO））。
      注意：这可以在 4 °C 下储存长达 1 个月。
   2. 将细胞悬液（步骤 1.1.2.10）在 4 °C 下以 400 × g 离心 5 分钟。 弃去上清液，用冷冻培养基重悬细胞沉淀。
      注：我们建议以 10 ×^{10 6} 至 50 × 10⁶ 个细胞/mL 冻存培养基¹¹ 的密度冻存细胞。
   3. 将 0.5-1 mL 细胞悬液分装到无菌冷冻管中。将样品瓶冷冻在 -80 °C 冰箱中的速率控制冷冻容器中。在一周内将样品瓶转移到含有液氮的储存罐中，以便长期保存。
3. 解冻冷冻细胞
   注：下面概述了单细胞 RNA 测序样品制备方案中引用的连续稀释解冻方法¹²。其他解冻方法也可能有效，但我们发现与立即将细胞放入温解冻缓冲液中相比，这种方法的细胞活力更高（图 1D）。洗涤缓冲液可以提前制备。解冻缓冲液由洗涤缓冲液加 0.1 mg/mL DNase I（DNase I 应在开始解冻前添加）组成。可以选择将离心时间增加到 1 min/mL（对于 15 mL 试管）以提高细胞产量。
   1. 将水浴加热至 37 °C。 在 37 °C 水浴中预热解冻和洗涤缓冲液。
      注：所有细胞洗涤均在 RT 下进行。
   2. 从储存中取出后立即在 37 °C 水浴中解冻管 2-3 分钟。避免将样品瓶完全浸入水浴中。从水浴中取出小瓶，同时仍然可以看到一个小冰晶。
   3. 使用生物安全罩中的大口径移液器吸头轻轻转移解冻的细胞到 15 mL 锥形管中。用 0.5 mL 预热的解冻缓冲液冲洗冷冻管，然后逐滴（每 5 秒 1 滴）向 15 mL 锥形管中加入漂洗液，轻轻摇动试管以混合。
   4. 在 15 mL 锥形管中依次稀释细胞，先增加 2 mL，然后依次加入 4 mL 培养基，两次添加之间等待 ~1 分钟。以每 3-5 秒 1 mL 的速率向试管中加入培养基，轻轻旋转混合。
   5. 在 RT 下以 400 × g 离心 5 分钟。
   6. 去除上清液;将细胞沉淀重悬于 300 μL 解冻缓冲液中;并在 RT 下孵育 5 分钟。
   7. 加入 10 mL 洗涤缓冲液（无 DNase I）。在 RT 下再次以 400 × g 离心 5 分钟。
   8. 再洗涤一次：去除上清液，将细胞沉淀重悬于 10 mL 洗涤缓冲液中。在 RT 下以 400 × g 离心 5 分钟。
   9. 通过 70 μm 过滤器过滤细胞。在 RT 下以 400 × g 再次离心 5 分钟并计数细胞。在培养基中重悬。

2. 测量离体 处理后细胞内细胞因子和转录因子的表达

注意：在这里，我们详细介绍了使用两个高维流式细胞术面板对扁桃体 Tfh 细胞进行表型表征的方法。鉴于 PP2A 活性对于最佳 BCL-6 蛋白表达和 Tfh 分化⁴ 至关重要，我们通过检查用 PP2A 抑制剂斑蝥素 （CAN） 处理的扁桃体细胞来说明我们对 Tfh 细胞维持和功能的评估。

1. 流式细胞术染色
   1. 细胞内细胞因子染色
      注意：孵育在黑暗中进行。 材料表中列出了两种检测组合中使用的试剂、抗体及其每孔的相应数量。为了评估 T 细胞脱颗粒，在处理步骤中加入抗 CD107a 抗体，以最大限度地减少其内化引起的假阴性结果¹³。
      1. 在 96 孔 U 形板孔中，用 200 μL 培养基（1 × 10⁷ 个细胞/mL）接种 2 ×⁶ 个扁桃体细胞，并加入以下量的 PP2A 抑制剂 CAN，持续 16 小时：载体对照、3 μM 和 6 μM。
         注：CAN 在 0.1 M 下用 1% DMSO 重构。
      2. 向每个孔中加入莫能菌素 （0.7 μL/mL）、布雷菲德菌素 （1：1,000）、佛波肉豆蔻酸酯（50 ng/mL，PMA）、离子霉素 （1,000 ng/mL） 和 2 μL 抗 CD107a，在 37 ^°C 的 5% CO₂ 培养箱中放置 2.5 小时。总培养物体积为每孔 200 μL。
      3. 在 4 °C 下以 ~16,000 × g 离心染色抗体 3-5 分钟以去除抗体聚集体。为步骤 2.1.1.8 准备表面抗体混合物，其中包括除趋化因子受体、Brilliant Stain Buffer Plus 和 FACS 缓冲液之外的所有表面抗体（ 材料表中记录的每种体积，每个反应总共 112 μL 混合物）。
      4. 培养完成 2.5 小时后，在 4 °C 下以 400 × g 离心 2 分钟，用 200 μL 冰冷的 PBS 洗涤细胞 2 次。 在洗涤之间，通过快速倒置板来丢弃上清液。在同一板中进行染色。
      5. 在 RT 下，将细胞在 100 μL/孔的 1：800 稀释的 LIVE/DEAD Blue 染料的 PBS 中孵育 15 分钟。用 200 μL FACS 缓冲液洗涤 2 次。
      6. 在 RT 下，用 True Stain 单核细胞阻滞剂（每孔 5 μL 单核细胞阻滞剂 + 45 μL FACS 缓冲液）重悬细胞 5 分钟。
      7. 依次将趋化因子受体抗体直接添加到染色反应中（首先，抗 CXCR3 和抗 CCR7 各 10 分钟，然后是抗 CXCR5 和抗 CCR6 的混合物以及 10 μL Brilliant Stain Buffer Plus，在 RT 下 5 分钟）。每次添加后，通过上下吹打数次充分混合。有关抗体体积，请参见 材料表 。
      8. 将步骤 2.1.1.3 中制备的表面抗体混合物直接添加到染色反应中，并在室温下孵育 30 分钟。每个反应的总染色体积为 180 μL：缓冲液中的 50 μL 单核细胞阻滞剂（参见步骤 2.1.1.6）+ 18 μL 抗趋化因子受体抗体（参见步骤 2.1.1.7）+ 112 μL 表面抗体混合物（参见步骤 2.1.1.3）。
      9. 用 200 μL 冷 FACS 缓冲液洗涤 2 次。
      10. 重悬细胞，并在室温下与 80 μL/孔的基于多聚甲醛的固定缓冲液孵育 20 分钟。
      11. 向每个孔中加入 160 μL 的 1x 透化缓冲液，其中已经包含固定缓冲液。在 RT 下以 400 × g 离心板 2 分钟，然后用 200 μL 透化缓冲液洗涤 1 次。
      12. 制备细胞内细胞因子 （ICS） 抗体混合物，包括抗细胞因子抗体、Brilliant Stain Buffer Plus 和透化缓冲液（总体积 50 μL/孔， 材料表）。将细胞与这种细胞内细胞因子抗体混合物在 RT 下孵育 30 分钟。
      13. 用 200 μL/孔透化缓冲液洗涤 2 次。用 200 μL/孔的 FACS 缓冲液重悬。
      14. 将染色的细胞在 4 °C 下避光储存，并在 24 小时内在光谱流式细胞仪上获取数据，以尽量减少染色强度的损失¹⁴。
   2. 核转录因子染色
      1. 如步骤 2.1.1.1 所示，用 CAN 培养细胞（不刺激细胞）。
      2. 向培养基中加入抗人 CD40 抗体 （0.5 μg/mL），并与细胞一起培养 15 分钟，然后开始染色。如果细胞受到刺激，请在开始刺激前 15 分钟添加该抗体，以防止 CD40L 在激活时内化^15,16。
      3. 离心染色抗体并制备类似于步骤 2.1.1.3 的表面抗体混合物： 材料表中的表面抗体、10 μL/孔的 Brilliant Stain Buffer Plus 和 54.1 μL/孔的 FACS 缓冲液。
         注：每孔的总染色体积为 180 μL：缓冲液中的 50 μL 单核细胞阻滞剂 + 13 μL 趋化因子受体抗体 + 117 μL 表面抗体混合物。
      4. 洗涤细胞并进行 LIVE/DEAD Blue 染色和表面染色，并按照步骤 2.1.1.5-2.1.1.8 进行洗涤。
         注：抗 CXCR3 抗体不包含在此检测组合中。
      5. 用来自 FoxP3/Transcription Factor Staining Buffer Set 的 80 μL 核转录因子固定缓冲液固定细胞。在 RT 孵育 30 分钟。
      6. 如步骤 2.1.1.11 所示，用透化缓冲液洗涤细胞。
      7. 制备细胞内转录因子 （TF） 抗体混合物，其中包括 材料表中列出的抗转录因子抗体、10 μL Brilliant Stain Buffer Plus 和 16 μL 透化缓冲液（总体积 40 μL/孔）。将细胞与该混合物在 4 °C 下孵育 1 小时。
      8. 如步骤 2.1.1.13-2.1.1.14 所示，在光谱细胞仪上洗涤和采集。

3. 高维流式细胞术数据的无监督分析

注：材料 表中列出了用于分析的软件、软件包及其版本。步骤 3.2 到 3.4 的屏幕截图位于 补充文件 1 中。步骤 3.5 到 3.7 的示例脚本位于 S补充文件 2 和 补充文件 3 中，步骤 3.8 到 3.9 位于 补充文件 4 和 补充文件 5 中。 补充文件 6 和 补充文件 7 中分别提供了脚本的 ICS 原始文件和 TF 原始文件。

1. 打开存储“.fcs”文件的流式细胞术分析软件工作区并完成门控，如图 1E 所示。
2. 右键单击目标节点（在本例中为 CD4 ⁺ T 细胞）。选择 Select Equivalent Nodes （选择等效节点）。
3. 再次右键单击目标节点。选择 Export/Concatenate Populations。
4. 等待 Populations： Export or Concatenate 窗口打开，选择 CSV 通道值，然后选择导出文件的目标。在 Include Events 框中包含所有单元格，然后在 Parameters 框中选择 All compensated parameters。展开 Advanced Options（高级选项），键入前缀以重命名文件，然后单击 export（导出）将文件导出到目标文件夹（为每个样本导出一个 .csv 文件）。
5. 使用 R 读取导出的 “*.csv” 文件（每个样品一个）。为每个单元格分配一个样本 ID，并将所有样本中的单元格合并到一个数据框中。
6. 将元数据（有关示例的其他信息）添加或合并到数据框中。
7. 对于每个样品随机下采样相同数量的细胞，以进行以下分析。此步骤是可选的。
   注：在此示例中，从每种条件的总 CD4 ⁺ T 细胞中下采样了 8,000 个 CD4 ⁺ T 细胞，至少占 CD4 ⁺ T 细胞总数的 1/7。
8. 创建 Seurat 对象：在创建 Seurat 对象时，将抗体标记物的 通道值 解释为基因表达水平。
   1. 使用步骤 3.6 生成的数据框创建 Seurat 对象。跳过 NormalizeData 步骤，将它们直接保存为 “data” 分析。
   2. 从流面板中选择表面标记，以用作非监督聚类中的 VariableFeatures 。
   3. 运行 ScaleData、RunPCA、FindNeighbors、FindClusters、RunUMAP 作为从 Seurat 引入的标准管道，但 NormalizeData 步骤¹⁷ 除外。
   4. 调整 FindClusters 步骤中的分辨率参数以修改聚类的数量，确保它们更准确地反映基础生物学背景。
9. 使用与 Seurat 软件包兼容的可视化工具，例如 DimPlot 和 FeaturePlot 。要比较每组包含多个样本的组，请计算每个主体每个聚类的百分比并执行统计比较。随后，使用数学模型进行更复杂的统计分析¹⁰.

Results

为了比较整体细胞活力，我们将扁桃体切成三个相似的块，并在三种条件下使用我们的方案进行处理：（1） 当天处理，（2） 在 4 °C 下过夜储存，以及 （3） 在冰上过夜储存。这三种情况的活力非常相似，没有任何显着差异（图 1A）。我们还评估了解冻过程对细胞活力的影响。在解冻来自同一供体的冷冻扁桃体样本后，与直接培养基解冻方法相比，我们使用的滴解方法导致细胞活力显着升高（图 1D）。然后，我们使用 32 色细胞内细胞因子面板和 28 色转录因子面板对回收的冷冻扁桃体细胞进行染色，以便使用光谱流式细胞术对 Tfh 细胞进行深入表征。染色使我们能够进一步对来自两个面板的流式细胞术数据进行无监督分析（图 1E）。

对流式细胞术数据中的细胞内细胞因子表达进行无监督分析，确定了 10 个不同的簇，如图 2A 所示。每个簇都由特征标记的表达模式进行注释，详细说明...

Discussion

与之前报道的新鲜扁桃体应在手术后 3 小时内处理¹⁹ 相比，我们发现新鲜扁桃体样本在 4 °C 下储存并在 24 小时内处理时可以保持其活力。为了优化从液氮储存中解冻后扁桃体组织的细胞活力，我们采用了单细胞测序中推荐的逐滴解冻方法，其中高细胞活力受到高度重视¹²。与常用的直接、快速解冻方法相比，这种方法可以优化活细胞的回收率（图 1D）。去除手术产生的碎片和烧灼组织可以提高活扁桃体细胞的产量。在扁桃体加工过程中延长离心时间可以进一步提高细胞产量;然而，长时间的处理，特别是同时处理多个样品时，可能会影响整体细胞活力。

我们的无酶消化扁桃体加工方案针对淋巴细胞的提取和表征进行了优化，但它需要进一步优化才能有效地提取和表征髓系细胞。冻融样品还可以同时对多个样品进行染色，从而减少无监督分析中的批次效应。然而，我们的流式检测组排除了对解冻敏感的标志物，例如 CD138 和...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
<强>机器和仪器
3 mL 塑料注射器	BD	309657
96 孔 U 底板	Thermo Scientific	163320
1.2 mL 低温样品瓶	康宁	430487
细胞过滤器 70 和微量;m Nylon	Falcon	352350
细胞培养皿 （60 mm）	VWR	10062-890
离心机	Thermo Scientific	Sorvall Legend XTR
Benchmark B2000-2 MyBath 2L 数字水浴	Benchmark	B2000-2
细剪刀 - Sharp	F.S.T	14060-11
塑料仪器盒	F.S.T	20830-05
光谱流式细胞仪，Aurora	Cytek		5L 16UV-16V-14B-10YG-8R
标准型镊	FST	11000-13
标准型镊子	FST	11000-20
Vi-cell Blu 细胞活力分析仪	贝克曼库尔特	C19201
试剂
0.5 M EDTA pH 8.0	质量生物学	351-027-101
2-巯基乙醇	Gibco	21985-023
ACK 裂解缓冲液	Gibco	A10492-01
抗生素-抗真菌混合物（青霉素-链霉素-两性霉素 B 混悬液，100x）	Gibco	15240-062
Brilliant Stain Buffer Plus （RUO）	BD	566385
Cantharidin	Sigma	C7632-25MG
Cytofix 固定缓冲液	BD	554655
甲基亚砜 （DMSO）	Sigma	D8418-250ml
DNAase I	Roche	10104159001
Fetal牛血清 （FBS）	VWR	97068-085
FoxP3/转录因子染色缓冲液套装	eBioscience	00-5523-00
庆大霉素 （50 mg/mL）	Gibco	15750-060
高尔基塞	BD	555029
高尔基STOP	BD	554724
HEPES （1 M）	Gibco	15630-080
离子霉素	Sigma	I0634-1mg
L-谷氨酰胺 （200 mM）	Gibco	25030-081
MEM NEAA （100x）	Gibco	11140-050
多聚甲醛 16% 溶液，EM 级 （PFA）	电子显微镜  Science	15710	用 PBS 稀释
PBS，pH 7.4	Gibco	10010072
青霉素-链霉素 （10,000 U/mL）	Gibco	15140-122
佛波醇 12-肉豆蔻酸酯 13-乙酸酯 （PMA）	Sigma	P8139-1mg
速率控制冷冻容器	Millipore	Corning CoolCell FTS30
RPMI （+L-谷氨酰胺）	Gibco	11875-085
丙酮酸钠 （100 mM）	Gibco	11360-070
True-Stain 单核细胞阻滞剂	BioLegend	426103
缓冲液
培养基			10% 热灭活 FBS （VWR）， 2 nM 谷氨酰胺， 0.055 mM 2-巯基乙醇， 1% 青霉素/链霉素， 1 mM 丙酮酸钠， 10 mM HEPES， RPMI 中的 1% 非必需氨基酸 （+L-谷氨酰胺）
FACS 缓冲液			PBS 中的 2 mM EDTA 和 2% 热灭活 FBS
冻培养基			90% 热灭活 FBS 和 10% DMSO
解冻缓冲液			洗涤缓冲液 + 0.1 mg/mL DNaseI
扁桃体培养基			RPMI补充5%热灭活FBS， 10 mM谷氨酰胺， 0.05 mg/mL庆大霉素， 1%抗生素-抗真菌混合物  （青霉素、链霉素和两性霉素 B）。
洗涤缓冲液			RPMI（+L-谷氨酰胺）补充有10% 热灭活FBS和10 mM HEPES
细胞因子组 抗体和其他摄政因子;
生物素抗人CD107a（LAMP-1）抗体	BioLegend	328604	2 &L在200亩;每孔 L 个完全培养基。 在 PMA/离子霉素刺激期间将该抗体与细胞一起添加。
Live Dead染色	100 μ每孔
LIVE DEAD Blue	Thermo	L23105	1 ： 800， 0.125 &m;100亩中的L;L PBS/孔。
<强>单核细胞阻滞	50 μ每孔
核细胞阻滞剂缓冲液	BioLegend	426103	5 & μ;l True Stain 单核细胞阻滞剂和 45 &μ;L FACS 缓冲液
<强>细胞因子组表面抗体
趋化因子受体混合物			μL/井
抗人 CCR6-BV711	BioLegend	353436	1
抗人 CCR7-BV421	BioLegend	353208	1
抗人 CXCR3-PE-Cy5	BD	551128	5
抗人 CXCR5-BV750	BD	747111	1
Brilliant Stain Buffer Plus （RUO）	BD	566385	10
	18 &亩;趋化因子受体每孔 L 混合; 用单核细胞阻断缓冲液
其他表面抗体混合物			;L/井
抗人CD103-BUV661	BD		749993 2.5
抗人CD14-火花蓝550	BioLegend		367148 2.5
抗人CD19-Spark NIR 685	BioLegend	302270	2.5
人CD25-BB515	BD	564467	10
抗人 CD27- Super Bright 436	Thermo	62-0279-42	5
抗人 CD3-BV510	BioLegend	344828	2.5
抗人 CD38 APC-Fire810	BioLegend	303550	1
抗人 CD4 CF YG584	Cytek	R7-20041	2.5
抗人 CD45RA-BUV395	BD	740315	0.6
抗人 CD56-BUV737	BD	612766	3.5
抗人 CD57-FITC	BioLegend	359604	1.2
抗人 CD69-BUV563	BD	748764	1
抗人 CD8-BUV805	BD	612889	1.2
抗人 FAS-BB700	BD	566542	0.6
抗人 HLA-DR APC-Fire 750	BioLegend	307658	2
抗人 PD1-BV785	BioLegend	329929	1.2
抗人 CD45-PerCP	Thermo	MHCD4531	1.2
Brilliant Stain Buffer Plus （RUO）	BD	566385	10
FACS 缓冲液			61
			112 &亩;L每孔混合其他表面抗体; 直接添加到单核细胞块缓冲液中（50 &L）和趋化因子受体混合物（18&μ;L，50+18+112 = 180 &m;每孔总 L）
细胞因子组的细胞内细胞因子抗体			μL/井
抗人颗粒酶 B-PE	BD		561142 1
抗人 IL10-PE-Dazzle 594	BioLegend	506812	1
抗人 IL17A-BV605	BioLegend	512326	1
抗人 IL2-BV650	BioLegend	500334	3
抗人 IL21- Alexa Fluor 647	BD	560493	10
抗人 IL4-PerCP Cy5.5	BD	561234	1
抗人穿孔素-APC	BioLegend	353312	2.5
抗人 TNFa-PE-Cy7	BioLegend	502930	0.1
抗干扰素&γ;-Pacific Blue	BioLegend		502522 1
SAv-BUV615	BD		613013 0.25
Brilliant Stain Buffer Plus （RUO）	BD		566385 10
1x 透化缓冲液&NBSP;	eBioscience	00-5523-00	19.15
	（50 & 亩;L 混合每孔）
Antibodies & Other regents for transcription factor panel
CD40 Antibody， anti-human	Miltenyi Biotec	130-094-133	0.5 & mu;工作浓度培养基g/mL
<强>活死染色	100 &μ;每孔
LIVE DEAD Blue	Thermo	L23105	1 ： 800， 0.125 &m;100亩中的L;L PBS/孔。
单核细胞阻滞剂缓冲液	BioLegend	426103	5 & μ;l True Stain 单核细胞阻滞剂和 45 &μ;L FACS缓冲液<
转录因子组强>表面抗体组
<强>趋化因子受体混合物			μL/井
抗人 CCR6-BV711	BioLegend	353436	1
抗人 CCR7-BV421	BioLegend	353208	1
抗人 CXCR5-BV750	BD	747111	1
Brilliant Stain Buffer Plus （RUO）	BD		566385 10
	13 &亩;L混合每孔
其他表面抗体混合物			μL/井
抗人 4-1BB-PE-CY7	BioLegend		309818 2.5
抗人 CD14-Spark Blue 550	BioLegend		367148 2.5
抗人 CD19-Spark NIR 685	BioLegend	302270	2.5
抗人 CD200-PerCP-eFluor 710	ThermoFisher	46-9200-42	2.5
抗人 CD25-PE-Cy5	BioLegend	302608	5
抗人CD3-BV510	BioLegend	344828	2.5
抗人CD38-APC-Fire810	BioLegend	303550	1
抗人CD4-Pacific Blue	BioLegend	317423	1
抗人CD40L-PE	BD		557299 15
抗人CD45RA-BUV395	BD	740315	0.6
抗人CD56-BUV737	BD	612766	3.5
抗人 CD69-BUV650	BioLegend	310934	2.5
抗人 CD8-BUV805	BD	612889	1.2
抗人 HLA-DR APC-Fire 750	BioLegend	307658	2
抗人 ICOS-BUV563	BD	741421	1.2
抗人 OX40-APC	BioLegend	350008	5
抗人 PD1-BV785	BioLegend	329929	1.2
抗人 CD45-PerCP	Thermo	MHCD4531	1.2
Brilliant Stain Buffer Plus （RUO）	BD	566385	10
FACS 缓冲液			54.1
			117  μL每孔混合其他表面抗体; 直接添加到单核细胞块 缓冲液（50 &mU;L）和趋化因子受体混合物（13 &μ;L，50+13+117 = 180 μ每孔总 L）
转录因子组的转录因子抗体	μL/井
抗人 T-bet-BV605	BioLegend	644817	4
抗人 Bcl6-PE-CF594	BD	562401	4
抗人 FoxP3-Alexa Fluor 488	BD	560887	1.6
抗人 GATA3-BB700	BD	566642	2
抗人 Ki67-Alexa Fluor 700	BD	561277	0.4
抗人Rorgt-Alexa Fluor 647	BD	563620	2
Brilliant Stain Buffer Plus （RUO）	BD	566385	10
1 x 透化缓冲液	eBioscience	00-5523-00	16
			40 &亩;L 每口井混合<
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	Software/package	版本<	strong>Source
1	data.表	1.16.2	综合 R 档案网络
2	FlowJO	10.9.0	Becton，Dickinson and Company
3	热图	1.0.12	综合 R 档案网络
4	R	4.3.2	综合 R 档案网络
5	readxl	1.4.3	综合 R 档案网络
6	Rstudio	2023.12.1+402	Posit PBC
7	修拉	5.1.0	综合 R 档案网络
8	SeuratData	0.2.2.9001	综合 R 档案网络
9	SpectroFlo	3.0	Cytek
10	tidyverse	2.0.0	综合 R 档案网络
11	viridis	0.6.5	综合 R 档案网络