通过高维流式细胞术实现扁桃体滤泡辅助性T细胞的高效分离与功能分析

Qin Xu; Lihong Shi; Brian L. P. Dizon; Rylee J. Beam; Pamela Mudd; Pamela L. Schwartzberg; Kalpana Manthiram

doi:10.3791/67188

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通过高维流式细胞术实现扁桃体滤泡辅助性T细胞的高效分离与功能分析

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DOI：

10.3791/67188

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2025年7月11日

Qin Xu¹ , Lihong Shi¹ , Brian L. P. Dizon²^,³ , Rylee J. Beam² , Pamela Mudd⁴^,⁵ , Pamela L. Schwartzberg¹ , Kalpana Manthiram¹

¹Cell Signaling and Immunity Section, Laboratory of Immune System Biology, National Institute of Allergy and Infectious Diseases, National Institutes of Health, ²Laboratory of Immunogenetics, National Institute of Allergy and Infectious Diseases, National Institutes of Health, ³Rheumatology Fellowship Training Program, National Institute of Arthritis and Musculoskeletal and Skin Diseases, National Institutes of Health, ⁴Division of Pediatric Otolaryngology, Children's National Hospital, ⁵Division of Otolaryngology, Department of Surgery, George Washington University School of Medicine and Health Sciences

本文内容

摘要

本文介绍了一种收集和处理扁桃体样本、利用高维光谱流式细胞术进行表型分析以及开展无监督分析的实验方案。

摘要

滤泡辅助性T细胞（Tfh）是CD4⁺ T细胞的一个亚群，主要定位于次级淋巴器官的B细胞滤泡内，在生发中心的形成、B细胞分化为浆细胞和记忆B细胞、以及高亲和力抗体的产生过程中发挥关键作用。⁺ 辅助性T细胞，可促进B细胞的同种型转换、生发中心（GC）形成、体细胞高频突变及亲和力成熟，从而在感染、自身免疫及疫苗接种过程中协助协调次级淋巴组织中的适应性体液免疫应答。深入理解滤泡辅助性T细胞（Tfh细胞）的发育与功能，对于设计高效疫苗及开发针对涉及该细胞群体疾病的靶向治疗策略至关重要。人类扁桃体细胞属于可获取的黏膜相关淋巴组织，为分析Tfh细胞与生发中心细胞等不同免疫细胞亚群、探究细胞间相互作用、评估动态细胞功能以及揭示其在器官水平上的调控机制提供了独特的机会。此外，体外扁桃体细胞培养易于处理，可实现对不同条件下Tfh细胞生物学特性的评估。本文介绍了一种用于人扁桃体细胞的采集、分离、保存及培养的实验方案。同时描述了两种优化的光谱流式细胞术检测方案，适用于Tfh细胞的深入表征。最后，以蛋白磷酸酶2A（PP2A）抑制剂处理为例，展示了非监督分析方法在该体系中的高效性与强大分析能力高维流式细胞术数据，有效揭示治疗诱导的高维尺度差异。

引言

滤泡辅助性T细胞（Tfh）是CD4⁺ T细胞中一个独特的亚群，主要定位于次级淋巴器官的B细胞滤泡内，其特征是高表达C-X-C趋化因子受体3（CXCR5）、程序性死亡分子-1（PD-1）和诱导性共刺激分子（ICOS）。Tfh细胞在生发中心的形成、B细胞的亲和力成熟以及长效体液免疫应答的建立中发挥关键作用。其分化过程依赖于转录因子Bcl-6的上调，并受到多种细胞因子（如IL-6、IL-21）和共刺激信号的调控。Tfh细胞功能异常与自身免疫病、慢性感染及疫苗应答低下密切相关。研究Tfh细胞的发育、功能及其调控机制，对于理解适应性免疫应答及开发新型免疫治疗策略具有重要意义。关键词：滤泡辅助性T细胞，Tfh，CD4⁺ T细胞，B细胞，生发中心，体液免疫，Bcl-6，CXCR5，IL-21，自身免疫病⁺ 对于生发中心（GCs）的形成与功能以及B细胞抗体产生至关重要的辅助性T细胞。Tfh细胞起源于初始CD4⁺ T细胞通过与抗原呈递细胞的相互作用，以及整合内在和外在因素（包括T细胞受体信号、与B细胞的共刺激相互作用、细胞因子和趋化因子）而发挥作用¹Tfh 细胞表达 CXCR5 和 PD-1，这些分子引导其定位在生发中心内或附近。BCL-6 是 Tfh 细胞发育、维持和功能所必需的关键转录因子¹^,²Tfh 细胞对于介导体液免疫应答，尤其在疫苗应答以及抗细菌和抗病毒病原体防御中发挥重要作用。Tfh细胞应答异常与多种疾病相关，包括自身免疫性疾病、免疫缺陷病以及某些类型的癌症。³^,⁴^,⁵^,⁶因此，了解其功能与调控机制对于开发有效的疫苗和治疗策略至关重要。⁷.

与其他CD4⁺ Th1、Treg和Th17等辅助性T细胞体外分化系统已得到充分建立⁸，Tfh 细胞更难研究，因为其发育过程涉及动态的细胞间相互作用和特殊的解剖结构⁷因此，对Tfh细胞的研究在很大程度上依赖于离体人类外周循环滤泡辅助性T细胞（cTfh）的表型分析体内小鼠模型。因此，研究特定分子对Tfh细胞的调控具有挑战性，尤其是对于人类Tfh细胞而言⁹因此，深入地离体研究来自淋巴组织的Tfh细胞对于深入理解人类Tfh细胞至关重要。

扁桃体作为次级淋巴器官，含有外周血中不存在的独特细胞群体，例如前体滤泡辅助性T细胞（pre-Tfh，CXCR5^intPD-1^intCD4⁺）和生发中心滤泡辅助性T细胞（GC-Tfh，CXCR5^hiPD-1^hi CD4⁺），这两类细胞在生发中心（GC）的形成过程中发挥关键作用。此外，腭扁桃体是儿科手术中最常切除的组织之一，且易于获取，因此成为研究涉及Tfh细胞的复杂免疫机制极为宝贵的人体组织来源。由于扁桃体位于上呼吸道——呼吸道病毒感染的主要部位，这使其成为研究针对此类病毒感染免疫应答的理想组织。例如，我们实验室此前曾对从COVID-19康复的儿童的扁桃体和腺样体中的Tfh 细胞进行了表征，并将这些组织与未感染对照组的组织进行了比较¹⁰。本文中，我们概述了处理和保存扁桃体细胞的实验方案。以经PP2A抑制剂处理的扁桃体为例，我们详细说明如何通过高维光谱流式细胞术对这些细胞进行表型分析，并利用无监督分析方法对数据进行解析。

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方案

本研究中的所有人体研究均遵循世界医学协会的《伦理准则》（赫尔辛基宣言）。人类扁桃体标本来自因腺样体和扁桃体肥大导致睡眠呼吸障碍或阻塞性睡眠呼吸暂停的患者，标本采集自美国华盛顿特区儿童国家医院儿科耳鼻喉科。本研究已获得儿童国家医院机构审查委员会（IRB）的批准（IRB方案编号：00009806）。所有参与研究的受试者家长或监护人均签署了知情同意书，且年龄在7岁及以上的未成年受试者本人也提供了知情同意。

1. 人扁桃体采集及单细胞分离与保存

扁桃体单细胞的分离
1. 手术标本采集
  1. 从接受扁桃体切除术的患者中获取扁桃体组织，在手术室中将新鲜组织块收集至装有25–35 mL冰上预冷的无菌扁桃体培养基的50 mL离心管中：RPMI培养基添加5%热灭活胎牛血清（FBS）、0.05 mg/mL庆大霉素、10 mM谷氨酰胺以及抗生素-抗真菌素混合液（100单位/mL链霉素、100单位/mL青霉素和 0.25 µg/mL 两性霉素B
    注意：上述培养基中的扁桃体可在 4 °C 过夜保存并于次日处理。与当天处理相比，过夜保存的细胞活力损失极小。图1A扁桃体也可在冰上过夜运输。
2. 扁桃体处理
  注意：所有培养基、缓冲液和手术器械必须无菌，扁桃体细胞分离应在生物安全柜中的冰上进行。
  1. 将扁桃体置于含有5 mL冷扁桃体培养基的60 mm塑料细胞培养皿中。操作过程保持在冰上进行。使用无菌镊子和剪刀或解剖刀，仔细去除所有可见的血凝块、脂肪和结缔组织。图1B, C).
  2. 将扁桃体转移至新的60 mm细胞培养皿中，加入5 mL冰冻的扁桃体培养基。将扁桃体组织切成3-5 mm大小的碎片。
  3. 准备一个新的60 mm细胞培养皿，加入10 mL冷的扁桃体培养基，并放置 70 μm 将细胞滤网放入培养皿中。
  4. 将扁桃体组织碎片转移至滤筛中，使用无菌3 mL注射器的活塞端通过滤筛碾压破碎扁桃体组织碎片。
  5. 收集滤网外含有细胞的培养基至培养皿中，并转移至50 mL锥形管。
  6. 向装有滤网的培养皿中再加入10 mL扁桃体培养基，用研磨杵碾碎扁桃体组织碎片，并将液体收集至锥形管中。对于较大的扁桃体，重复此步骤2–3次，直至滤网上仅剩结缔组织碎片。将剩余组织和使用过的培养板放入生物危害袋，并置于医疗废物中。
  7. 用扁桃体培养基将50 mL离心管加至管口。
  8. 400离心 × g 5 分钟 4 °C.
    注意：将离心时间延长至20分钟可能会提高得率。
  9. 通过小心吸除或移液去除上清液，将沉淀重悬于5 mL室温（RT）的氯化铵钾（ACK）裂解缓冲液中，以裂解红细胞。在室温下孵育5分钟，然后加入35 mL预冷的PBS以终止裂解反应。在400 × g下离心 × g 5 分钟 4 °C.
  10. 用50 mL预冷的PBS洗涤一次，离心。用10 mL PBS重悬细胞，并通过滤膜过滤细胞 70 μm 塑料滤网。计数细胞。
扁桃体细胞的冷冻保存
1. 配制冻存液（90% 热灭活胎牛血清和 10% 二甲基亚砜（DMSO））。
  注意：可将其保存于 4 °C 长达1个月。
2. 将细胞悬液（步骤 1.1.2.10）在 400 ×g 离心 × g 5 分钟 4 °C弃去上清液，用冻存液重悬细胞沉淀。
  注意：建议以 10 的密度冻存细胞 × 10⁶ 至 50 × 10⁶ 每毫升冻存液中的细胞数¹¹.
3. 将0.5–1 mL细胞悬液分装至无菌冻存管中。使用程序降温冻存盒将冻存管于-80 °C条件下冷冻。80 °C 冻存管应在一周内转移至装有液氮的储存罐中，以进行长期保存。
解冻冻存细胞
注意：以下概述了一种参考自单细胞RNA测序样品制备方案的梯度稀释解冻方法¹². 其他解冻方法也可能有效，但与直接将细胞放入温热的解冻缓冲液相比，我们发现采用此方法细胞活力更高图1D). 洗涤缓冲液可预先配制。解冻缓冲液由洗涤缓冲液添加0.1 mg/mL DNase I组成（DNase I应在开始解冻前立即加入）。为提高细胞得率，可选择将离心时间延长至每毫升1分钟（适用于15 mL离心管）。
1. 将水浴加热至 37 °C. 将解冻和洗涤缓冲液预热至 37 °C 水浴锅
  注意：所有细胞洗涤步骤均在室温下进行。
2. 在37℃水浴中解冻冻存管 37 °C 水浴 2-3 分钟，取出后立即进行。避免将小瓶完全浸入水浴中。当小瓶中仍可见少量冰晶时，即从水浴中取出。
3. 在生物安全柜中，使用宽口移液器吸头将解冻的细胞轻柔转移至15 mL锥形管中。用0.5 mL预热的解冻缓冲液冲洗冻存管，并将冲洗液逐滴（每5秒1滴）加入15 mL锥形管中，轻轻振荡混匀。
4. 在15 mL离心管中，逐步稀释细胞：先加入2 mL培养基，等待约1分钟，再加入4 mL培养基。添加培养基时，以每3–5秒1 mL的速度加入，并轻轻旋转混匀。
5. 400离心 × g 室温下孵育5分钟。
6. 去除上清液；将细胞沉淀重悬于 300 μL 加入解冻缓冲液；室温孵育5分钟。
7. 加入10 mL洗涤缓冲液（不含DNase I）。再次在400 × g离心 × g 室温下孵育5分钟。
8. 再洗涤一次：移除上清液，将细胞沉淀重悬于10 mL洗涤液中缓冲液。在400 × g下离心 × g 室温下孵育5分钟。
9. 通过滤器过滤细胞 70 μm 筛网。再次以400 × g离心5分钟 × g 室温下计数细胞，用培养基重悬细胞。

2. 检测细胞内细胞因子和转录因子的表达水平离体治疗

注意：本文详细介绍了我们使用两个高维流式细胞术检测方案对扁桃体Tfh 细胞进行表型表征的方法。鉴于PP2A活性对BCL-6蛋白表达和Tfh细胞分化至关重要⁴，我们通过检测经PP2A抑制剂斑蝥素（CAN）处理的扁桃体细胞，展示对Tfh细胞维持状态和功能特性的评估方法。

流式细胞术染色
1. 细胞内细胞因子染色
  注意：所有孵育步骤均在避光条件下进行。两种染色方案中使用的试剂、抗体及其每孔用量详见材料表。为评估T细胞脱颗粒情况，需在处理步骤中加入抗CD107a抗体，以尽量减少因CD107a内化导致的假阴性结果¹³。
  1. 将2 × 10⁶个扁桃体细胞与200 µL培养基（浓度为1 × 10⁷个细胞/mL）加入96孔U型底板的每孔中，并分别加入以下浓度的PP2A抑制剂CAN处理16小时：溶剂对照组、3 μM和6 μM。
    注意：CAN以1% DMSO溶解并重悬至0.1 M。
  2. 向每孔中加入莫能菌素（0.7 μL/mL）、布雷菲德菌素（1:1,000）、佛波酯（50 ng/mL，PMA）、离子霉素（1,000 ng/mL）以及2 μL抗CD107a抗体，在37 ^oC、5% CO₂培养箱中孵育2.5小时。每孔总体积为200 μL。
  3. 将染色用抗体在4 °C条件下以约16,000 × g离心3–5分钟，以去除抗体聚集体。配制步骤2.1.1.8所需的表面抗体混合液，包含除趋化因子受体以外的所有表面抗体、Brilliant Stain Buffer Plus及FACS缓冲液（各成分体积见材料表，每反应总体积为112 μL）。
  4. 完成2.5小时培养后，用200 μL预冷PBS洗涤细胞两次，每次在4 °C下以400 × g离心2分钟。每次洗涤后通过快速倒置培养板弃去上清液。染色操作在原孔中进行。
  5. 每孔加入100 μL PBS中稀释1:800的LIVE/DEAD Blue染料，室温避光孵育15分钟。随后用200 μL FACS缓冲液洗涤两次。
  6. 用True Stain单核细胞阻断剂重悬细胞（每孔含5 μL单核细胞阻断剂 + 45 μL FACS缓冲液），室温孵育5分钟。
  7. 依次直接向染色反应体系中加入趋化因子受体抗体（先分别加入抗CXCR3和抗CCR7抗体，各孵育10分钟；随后加入抗CXCR5和抗CCR6抗体混合液，并加入10 μL Brilliant Stain Buffer Plus，室温孵育5分钟）。每次加入后通过反复吹打充分混匀。抗体用量详见材料表。
  8. 将步骤2.1.1.3中配制的表面抗体混合液直接加入染色反应体系中，室温孵育30分钟。每反应总体积为180 μL：含缓冲液中的50 μL单核细胞阻断剂（见步骤2.1.1.6）+ 18 μL抗趋化因子受体抗体（见步骤2.1.1.7）+ 112 μL表面抗体混合液（见步骤2.1.1.3）。
  9. 用200 μL预冷FACS缓冲液洗涤两次。
  10. 重悬细胞，并每孔加入80 μL基于多聚甲醛的固定缓冲液，室温避光固定20分钟。
  11. 向已含固定缓冲液的每孔中加入160 μL 1×通透缓冲液，在室温下以400 × g离心2分钟，并用200 μL通透缓冲液洗涤一次。
  12. 配制细胞内细胞因子（ICS）抗体混合液，包含抗细胞因子抗体、Brilliant Stain Buffer Plus及通透缓冲液（每孔总体积50 μL，详见材料表）。将细胞与此混合液在室温下孵育30分钟。
  13. 用每孔200 μL通透缓冲液洗涤两次，再用每孔200 μL FACS缓冲液重悬细胞。
  14. 将染色后的细胞避光保存于4 °C，并在24小时内使用光谱流式细胞仪采集数据，以尽量减少染色强度的损失¹⁴。
2. 核转录因子染色
  1. 按照步骤2.1.1.1的方法用CAN处理细胞（不进行细胞刺激）。
  2. 向培养基中加入抗人CD40抗体（0.5 μg/mL），并在开始染色前与细胞共同培养15分钟。若需刺激细胞，则应在刺激开始前15分钟加入该抗体，以防止CD40L在激活后发生内化¹⁵^,¹⁶。
  3. 离心染色抗体，并参照步骤2.1.1.3配制表面抗体混合液：包括材料表中列出的表面抗体、每孔10 μL Brilliant Stain Buffer Plus及每孔54.1 μL FACS缓冲液。
    注意：每孔总染色体积为180 μL：含50 μL单核细胞阻断剂缓冲液 + 13 μL趋化因子受体抗体 + 117 μL表面抗体混合液。
  4. 参照步骤2.1.1.5–2.1.1.8进行细胞洗涤、LIVE/DEAD Blue染色、表面染色及后续洗涤。
    注意：本方案中不包含抗CXCR3抗体。
  5. 使用FoxP3/转录因子染色缓冲液试剂盒中的核转录因子固定缓冲液，每孔加入80 μL对细胞进行固定，室温孵育30分钟。
  6. 参照步骤2.1.1.11使用通透缓冲液洗涤细胞。
  7. 配制细胞内转录因子（TF）抗体混合液，包含材料表中所列的抗转录因子抗体、10 μL Brilliant Stain Buffer Plus及16 μL通透缓冲液（每孔总体积40 μL）。将细胞与此混合液在4 °C下孵育1小时。
  8. 参照步骤2.1.1.13–2.1.1.14进行洗涤并在光谱流式细胞仪上采集数据。

3. 高维流式细胞术数据的无监督分析

注意：用于分析的软件、程序包及其版本列在材料表中。步骤 3.2 至 3.4 的屏幕截图见补充文件 1。步骤 3.5 至 3.7 的示例脚本见补充文件 2和补充文件 3，步骤 3.8 至 3.9 的示例脚本见补充文件 4和补充文件 5。脚本所用的 ICS 原始文件和 TF 原始文件分别提供在补充文件 6和补充文件 7中。

打开存储“*.fcs”文件的流式细胞术分析软件工作区，并按照图1E所示完成设门。
右键单击目标节点（本例中为CD4⁺ T细胞），选择选择相同节点。
再次右键单击目标节点，选择导出/合并群体。
等待群体：导出或合并窗口打开后，选择CSV通道值，并指定导出文件的保存路径。在包含事件框中包含所有细胞，并在参数框中选择所有补偿参数。展开高级选项，输入文件前缀以重命名文件，然后点击导出按钮，将文件导出至目标文件夹（每个样本导出一个.csv文件）。
使用R读取导出的“*.csv”文件（每个样本对应一个文件）。为每个细胞分配样本ID，并将所有样本的细胞合并为一个数据框。
将元数据（有关样本的附加信息）添加或合并到数据框中。
为后续分析，对每个样本随机下采样相同数量的细胞。此步骤为可选。
注意：在本示例中，从每种条件下的总CD4⁺ T细胞中下采样8,000个CD4⁺ T细胞，该数量至少占总CD4⁺ T细胞数的1/7。
创建Seurat对象：在创建Seurat对象时，将抗体标记物的通道值解释为基因表达水平。
1. 使用步骤3.6生成的数据框创建Seurat对象。跳过NormalizeData步骤，直接将其保存为data检测数据。
2. 从流式面板中选择表面标记物，作为无监督聚类中的VariableFeatures。
3. 除跳过NormalizeData步骤外，按照Seurat标准流程执行ScaleData、RunPCA、FindNeighbors、FindClusters、RunUMAP¹⁷。
4. 调整FindClusters步骤中的分辨率参数，以改变聚类数量，确保其更准确地反映潜在的生物学背景。
使用与Seurat软件包兼容的可视化工具，如DimPlot和FeaturePlot。对于每组包含多个样本的组间比较，需基于每个受试者计算各聚类的百分比，并进行统计学比较。随后，可采用数学模型进行更复杂的统计分析¹⁰。

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结果

为了比较总体细胞活力，我们将扁桃体切成三个相似的组织块，并在三种条件下按照我们的方案进行处理：（1）当天处理，（2）4 °C 过夜保存，（3）冰上过夜保存。这三种条件下的细胞活力非常相似，无显著差异（图1A）。我们还评估了解冻过程对细胞活力的影响。与直接加入培养基解冻法相比，我们采用的逐滴解冻法在解冻同一位供体的冷冻扁桃体样本后，显著提高了细胞活力（图1D）。随后，我们使用包含32种颜色的细胞内细胞因子检测 panel 和包含28种颜色的转录因子检测 panel 对复苏的冷冻扁桃体细胞进行染色，以便通过光谱流式细胞术对Tfh细胞进行深入表征。染色结果使我们能够对两个panel的流式细胞术数据进一步进行无监督分析（图1E）。

基于流式细胞术数据对细胞内细胞因子表达进行的无监督分析鉴定出10个不同的细胞簇，如图2A所示。每个细胞簇均根据特征标记物的表...

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讨论

与先前报道中扁桃体组织应在术后3小时内处理的要求不同¹⁹，我们发现新鲜扁桃体样本在4 °C条件下保存并在24小时内处理仍可维持其细胞活性。为了优化从液氮冻存中复苏的扁桃体组织的细胞活力，我们采用了单细胞测序中推荐的逐滴复苏法，该方法高度重视高细胞存活率¹²。与常用的直接快速解冻方法相比，该方法显著提高了活细胞的回收率（图1D）。去除手术过程中产生的碎片和电灼组织，有助于提高可存活扁桃体细胞的得率。在扁桃体处理过程中延长离心时间可进一步提高细胞得率；然而，过长的操作时间，尤其是在同时处理多个样本时，可能会降低总体细胞活力。

我们的无酶消化扁桃体处理方案已针对淋巴细胞的提取和表征进行了优化，但需要进一步优化以有效提取和表征髓系细胞。样本的冷冻与解冻还允许同时对多个样本进行染色，从而减少非监督分析中的批次效应。然而，我们的流式抗体组合排除了对解冻敏感的标记物，例如 CD138 和 CD62L。具体而言，已有报道显示 CD138 的表达...

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

本研究由美国国立卫生研究院（NIH）下属的国家过敏与传染病研究所（NIAID）院内研究部资助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名	公司	目录编号	评论
机器与仪器
3 mL 塑料注射器	BD	309657
96孔U型底板	赛默飞世尔科技	163320
1.2 mL 冻存管	Corning	430487
细胞筛 70 µm 尼龙	Falcon	352350
细胞培养皿（60 mm）	VWR	10062-890
离心	赛默飞世尔科技	Sorvall Legend XTR
Benchmark B2000-2 MyBath 2L 数字水浴锅	基准测试	B2000-2
精细剪刀 - 锐利	F.S.T	14060-11
塑料仪器箱	F.S.T	20830-05
光谱流式细胞仪，Aurora	Cytek		5L 16UV-16V-14B-10YG-8R
标准型镊子	F.S.T	11000-13
标准型镊子	F.S.T	11000-20
Vi-cell Blu 细胞活力分析仪	贝克曼库尔特	C19201
试剂
0.5 M EDTA pH 8.0	优质生物学	351-027-101
2-巯基乙醇	Gibco	21985-023
ACK裂解缓冲液	Gibco	A10492-01
抗生素-抗真菌素混合液（青霉素-链霉素-两性霉素B溶液，100倍浓缩）	Gibco	15240-062
Brilliant Stain缓冲液Plus（仅供科研使用）	BD	566385
斑蝥素	Sigma	C7632-25MG
Cytofix 固定缓冲液	BD	554655
二甲基亚砜（DMSO）	Sigma	D8418-250ml
DNA酶I	罗氏	10104159001
胎牛血清（FBS）	VWR	97068-085
FoxP3/转录因子染色缓冲液套装	eBioscience	00-5523-00
庆大霉素（50 mg/mL）	Gibco	15750-060
Golgiplug	BD	555029
GolgiSTOP	BD	554724
HEPES (1 M)	Gibco	15630-080
Ionomycin	Sigma	I0634-1mg
L-谷氨酰胺（200 mM）	Gibco	25030-081
MEM 非必需氨基酸（100 倍）	Gibco	11140-050
16% 甲醛溶液，电镜级（PFA）	电子显微镜科学	15710	用 PBS 稀释
PBS，pH 7.4	Gibco	10010072
青霉素-链霉素（10,000 U/mL）	Gibco	15140-122
佛波醇-12-肉豆蔻酸酯-13-乙酸酯（PMA）	Sigma	P8139-1mg
程序降温盒	Millipore	Corning CoolCell FTS30
RPMI（含L-谷氨酰胺）	Gibco	11875-085
丙酮酸钠（100 mM）	Gibco	11360-070
True-Stain 单核细胞阻断剂	BioLegend	426103
缓冲液
培养基			10% 热灭活 FBS（VWR）， 2 nM 谷氨酰胺， 0.055 mM 2-巯基乙醇， 1% 青霉素/链霉素， 1 mM 溴化钠丙酮酸 10 mM HEPES 1% 非必需氨基酸在 RPMI（含 L-谷氨酰胺）中
FACS 缓冲液			PBS 中含 2 mM EDTA 和 2% 热灭活 FBS
冻存液			90% 热灭活 FBS 和 10% DMSO
解冻缓冲液			洗涤缓冲液 + 0.1 mg/mL DNase I
扁桃体培养基			RPMI 培养基添加 5% 热灭活的 FBS 10 mM 谷氨酰胺， 0.05 mg/mL 庆大霉素， 1% 抗生素-抗真菌剂混合液（青霉素、链霉素和两性霉素B）
洗涤缓冲液			RPMI（含L-谷氨酰胺）添加10% 热灭活胎牛血清和10 mM HEPES
抗体 & 细胞因子检测面板的其他试剂
生物素标记抗人CD107a（LAMP-1）抗体	BioLegend	328604	2 μL 在 200 μL 每孔加入完全培养基。该抗体在PMA/离子霉素刺激期间与细胞共同孵育。
活死染色	100 μL 每孔混合
LIVE DEAD Blue	赛默飞世尔科技	L23105	1 : 800, 0.125 μL 在 100 μL 每孔 PBS
单核细胞阻断	50 μL 每孔混合
单核细胞阻断缓冲液	BioLegend	426103	5 μL True Stain单核细胞阻断剂和 45 μL 每孔 FACS 缓冲液
细胞表面抗体用于细胞因子检测 panel
趋化因子受体混合			μL/well
抗人 CCR6-BV711	BioLegend	353436	1
抗人 CCR7-BV421	BioLegend	353208	1
抗人CXCR3-PE-Cy5	BD	551128	5
抗人 CXCR5-BV750	BD	747111	1
Brilliant Stain缓冲液Plus（RUO）	BD	566385	10
	18 μL 每孔混合用于趋化因子受体；加入单核细胞阻断缓冲液处理细胞
其他表面抗体混合物			μL/well
抗人 CD103-BUV661	BD	749993	2.5
抗人 CD14-Spark Blue 550	BioLegend	367148	2.5
抗人CD19-Spark NIR 685	BioLegend	302270	2.5
抗人 CD25-BB515	BD	564467	10
抗人CD27-超级亮436	赛默飞世尔科技	62-0279-42	5
抗人 CD3-BV510	BioLegend	344828	2.5
抗人 CD38 APC-Fire810	BioLegend	303550	1
抗人 CD4 CF YG584	Cytek	R7-20041	2.5
抗人 CD45RA-BUV395	BD	740315	0.6
抗人 CD56-BUV737	BD	612766	3.5
抗人CD57-FITC	BioLegend	359604	1.2
抗人 CD69-BUV563	BD	748764	1
抗人 CD8-BUV805	BD	612889	1.2
抗人 FAS-BB700	BD	566542	0.6
抗人 HLA-DR APC-Fire 750	BioLegend	307658	2
抗人PD1-BV785	BioLegend	329929	1.2
抗人 CD45-PerCP	赛默飞世尔科技	MHCD4531	1.2
Brilliant Stain缓冲液Plus（RUO）	BD	566385	10
FACS 缓冲液			61
			112 μL 每孔加入其他表面抗体混合液；直接加入单核细胞阻断缓冲液中（50 μL）和趋化因子受体混合液（18 μL, 50+18+112 = 180 μL 每孔总量）
细胞内细胞因子抗体用于细胞因子检测 panel			μL/well
抗人颗粒酶B-PE	BD	561142	1
抗人IL10-PE-Dazzle 594	BioLegend	506812	1
抗人IL17A-BV605	BioLegend	512326	1
抗人IL2-BV650	BioLegend	500334	3
抗人IL21-Alexa Fluor 647	BD	560493	10
抗人IL4-PerCP Cy5.5	BD	561234	1
抗人穿孔素-APC	BioLegend	353312	2.5
抗人TNFα-PE-Cy7	BioLegend	502930	0.1
抗IFNγ-Pacific Blue	BioLegend	502522	1
SAv-BUV615	BD	613013	0.25
Brilliant Stain缓冲液Plus（RUO）	BD	566385	10
1× 透化缓冲液	eBioscience	00-5523-00	19.15
	(50 μL 每孔混合
抗体 & 转录因子检测面板的其他试剂
CD40 抗体，抗人	Miltenyi Biotec	130-094-133	0.5 μg/mL 工作浓度的培养基
活死染色	100 μL 每孔混合
LIVE DEAD Blue	赛默飞世尔科技	L23105	1 : 800, 0.125 μL 在 100 μL 每孔 PBS
单核细胞阻断缓冲液	BioLegend	426103	5 μL True Stain 单核细胞阻断剂和 45 μL 每孔FACS缓冲液
转录因子 panel 的表面抗体
趋化因子受体混合			μL/well
抗人 CCR6-BV711	BioLegend	353436	1
抗人 CCR7-BV421	BioLegend	353208	1
抗人 CXCR5-BV750	BD	747111	1
Brilliant Stain缓冲液Plus（RUO）	BD	566385	10
	13 μL 每孔混合
其他表面抗体混合物			μL/well
抗人4-1BB-PE-CY7	BioLegend	309818	2.5
抗人 CD14-Spark Blue 550	BioLegend	367148	2.5
抗人CD19-Spark NIR 685	BioLegend	302270	2.5
抗人 CD200-PerCP-eFluor 710	ThermoFisher	46-9200-42	2.5
抗人 CD25-PE-Cy5	BioLegend	302608	5
抗人 CD3-BV510	BioLegend	344828	2.5
抗人 CD38-APC-Fire810	BioLegend	303550	1
抗人CD4-太平洋蓝	BioLegend	317423	1
抗人CD40L-PE	BD	557299	15
抗人 CD45RA-BUV395	BD	740315	0.6
抗人 CD56-BUV737	BD	612766	3.5
抗人 CD69-BUV650	BioLegend	310934	2.5
抗人CD8-BUV805	BD	612889	1.2
抗人 HLA-DR APC-Fire 750	BioLegend	307658	2
抗人 ICOS-BUV563	BD	741421	1.2
抗人OX40-APC	BioLegend	350008	5
抗人PD1-BV785	BioLegend	329929	1.2
抗人 CD45-PerCP	赛默飞世尔科技	MHCD4531	1.2
Brilliant Stain缓冲液Plus（RUO）	BD	566385	10
FACS 缓冲液			54.1
			117 μL 每孔加入其他表面抗体混合液；直接加入单核细胞阻断液中缓冲液（50 μL）和趋化因子受体混合液（13 μL, 50+13+117 = 180 μL 每孔总量）
转录因子抗体用于转录因子检测 panel	μL/well
抗人 T-bet-BV605	BioLegend	644817	4
抗人 Bcl6-PE-CF594	BD	562401	4
抗人 FoxP3-Alexa Fluor 488	BD	560887	1.6
抗人 GATA3-BB700	BD	566642	2
抗人 Ki67-Alexa Fluor 700	BD	561277	0.4
抗人 RORγt-Alexa Fluor 647	BD	563620	2
Brilliant Stain缓冲液Plus（RUO）	BD	566385	10
1 × 破膜缓冲液	eBioscience	00-5523-00	16
			40 μL 每孔混合
用于无监督分析的软件与工具包
	软件/工具包	版本	来源
1	data.table	1.16.2	综合 R 存档网络
2	FlowJO	10.9.0	Becton, Dickinson and Company
3	pheatmap	1.0.12	综合 R 存档网络
4	R	4.3.2	综合R档案网络
5	readxl	1.4.3	综合 R 存档网络
6	Rstudio	2023.12.1+402	Posit PBC
7	Seurat	5.1.0	综合 R 存档网络
8	SeuratData	0.2.2.9001	综合 R 存档网络
9	SpectroFlo	3.0	Cytek
10	tidyverse	2.0.0	综合 R 存档网络
11	viridis	0.6.5	综合 R 存档网络

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通过高维流式细胞术实现扁桃体滤泡辅助性T细胞的高效分离与功能分析

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