通过高维流式细胞术实现扁桃体滤泡辅助性T细胞的高效分离与功能分析

摘要

本文介绍了一种收集和处理扁桃体样本、利用高维光谱流式细胞术进行表型分析以及开展无监督分析的实验方案。

摘要

滤泡辅助性T细胞（Tfh）是CD4⁺ T细胞的一个亚群，主要定位于次级淋巴器官的B细胞滤泡内，在生发中心的形成、B细胞分化为浆细胞和记忆B细胞、以及高亲和力抗体的产生过程中发挥关键作用。⁺ 辅助性T细胞，可促进B细胞的同种型转换、生发中心（GC）形成、体细胞高频突变及亲和力成熟，从而在感染、自身免疫及疫苗接种过程中协助协调次级淋巴组织中的适应性体液免疫应答。深入理解滤泡辅助性T细胞（Tfh细胞）的发育与功能，对于设计高效疫苗及开发针对涉及该细胞群体疾病的靶向治疗策略至关重要。人类扁桃体细胞属于可获取的黏膜相关淋巴组织，为分析Tfh细胞与生发中心细胞等不同免疫细胞亚群、探究细胞间相互作用、评估动态细胞功能以及揭示其在器官水平上的调控机制提供了独特的机会。此外， 体外 扁桃体细胞培养易于处理，可实现对不同条件下Tfh细胞生物学特性的评估。本文介绍了一种用于人扁桃体细胞的采集、分离、保存及培养的实验方案。同时描述了两种优化的光谱流式细胞术检测方案，适用于Tfh细胞的深入表征。最后，以蛋白磷酸酶2A（PP2A）抑制剂处理为例，展示了非监督分析方法在该体系中的高效性与强大分析能力 高维流式细胞术数据，有效揭示治疗诱导的高维尺度差异。

引言

滤泡辅助性T细胞（Tfh）是CD4⁺ T细胞中一个独特的亚群，主要定位于次级淋巴器官的B细胞滤泡内，其特征是高表达C-X-C趋化因子受体3（CXCR5）、程序性死亡分子-1（PD-1）和诱导性共刺激分子（ICOS）。Tfh细胞在生发中心的形成、B细胞的亲和力成熟以及长效体液免疫应答的建立中发挥关键作用。其分化过程依赖于转录因子Bcl-6的上调，并受到多种细胞因子（如IL-6、IL-21）和共刺激信号的调控。Tfh细胞功能异常与自身免疫病、慢性感染及疫苗应答低下密切相关。研究Tfh细胞的发育、功能及其调控机制，对于理解适应性免疫应答及开发新型免疫治疗策略具有重要意义。 关键词：滤泡辅助性T细胞，Tfh，CD4⁺ T细胞，B细胞，生发中心，体液免疫，Bcl-6，CXCR5，IL-21，自身免疫病⁺ 对于生发中心（GCs）的形成与功能以及B细胞抗体产生至关重要的辅助性T细胞。Tfh细胞起源于初始CD4⁺ T细胞通过与抗原呈递细胞的相互作用，以及整合内在和外在因素（包括T细胞受体信号、与B细胞的共刺激相互作用、细胞因子和趋化因子）而发挥作用¹Tfh 细胞表达 CXCR5 和 PD-1，这些分子引导其定位在生发中心内或附近。BCL-6 是 Tfh 细胞发育、维持和功能所必需的关键转录因子^1,2Tfh 细胞对于 介导体液免....

方案

本研究中的所有人体研究均遵循世界医学协会的《伦理准则》（赫尔辛基宣言）。人类扁桃体标本来自因腺样体和扁桃体肥大导致睡眠呼吸障碍或阻塞性睡眠呼吸暂停的患者，标本采集自美国华盛顿特区儿童国家医院儿科耳鼻喉科。本研究已获得儿童国家医院机构审查委员会（IRB）的批准（IRB方案编号：00009806）。所有参与研究的受试者家长或监护人均签署了知情同意书，且年龄在7岁及以上的未成年受试者本人也提供了知情同意。

1. 人扁桃体采集及单细胞分离与保存

1. 扁桃体单细胞的分离
   1. 手术标本采集
      1. 从接受扁桃体切除术的患者中获取扁桃体组织，在手术室中将新鲜组织块收集至装有25–35 mL冰上预冷的无菌扁桃体培养基的50 mL离心管中：RPMI培养基添加5%热灭活胎牛血清（FBS）、0.05 mg/mL庆大霉素、10 mM谷氨酰胺以及抗生素-抗真菌素混合液（100单位/mL链霉素、100单位/mL青霉素和 0.25 µg/mL 两性霉素B
         注意：上述培养基中的扁桃体可在 4 °C 过夜保存并于次日处理。与当天处理相比，过夜保存的细胞活力损失极小。图1A扁桃体也可在冰上过夜运输。
   2. 扁桃体处理
      注意：所有培养基、缓冲液和手术器械必须无菌....

结果

为了比较总体细胞活力，我们将扁桃体切成三个相似的组织块，并在三种条件下按照我们的方案进行处理：（1）当天处理，（2）4 °C 过夜保存，（3）冰上过夜保存。这三种条件下的细胞活力非常相似，无显著差异（图1A）。我们还评估了解冻过程对细胞活力的影响。与直接加入培养基解冻法相比，我们采用的逐滴解冻法在解冻同一位供体的冷冻扁桃体样本后，显著提高了细胞活力（图1D）。随后，我们使用包含32种颜色的细胞内细胞因子检测 panel 和包含28种颜色的转录因子检测 panel 对复苏的冷冻扁桃体细胞进行染色，以便通过光谱流式细胞术对Tfh细胞进行深入表征。染色结果使我们能够对两个panel的流式细胞术数据进一步进行无监督分析（图1E）。

基于流式细胞术数据对细胞内细胞因子表达进行的无监督分析鉴定出10个不同的细胞簇，如图2A所示。每个细胞簇均根据特征标记物的表.......

讨论

与先前报道中扁桃体组织应在术后3小时内处理的要求不同¹⁹，我们发现新鲜扁桃体样本在4 °C条件下保存并在24小时内处理仍可维持其细胞活性。为了优化从液氮冻存中复苏的扁桃体组织的细胞活力，我们采用了单细胞测序中推荐的逐滴复苏法，该方法高度重视高细胞存活率¹²。与常用的直接快速解冻方法相比，该方法显著提高了活细胞的回收率（图1D）。去除手术过程中产生的碎片和电灼组织，有助于提高可存活扁桃体细胞的得率。在扁桃体处理过程中延长离心时间可进一步提高细胞得率；然而，过长的操作时间，尤其是在同时处理多个样本时，可能会降低总体细胞活力。

我们的无酶消化扁桃体处理方案已针对淋巴细胞的提取和表征进行了优化，但需要进一步优化以有效提取和表征髓系细胞。样本的冷冻与解冻还允许同时对多个样本进行染色，从而减少非监督分析中的批次效应。然而，我们的流式抗体组合排除了对解冻敏感的标记物，例如 CD138 和 CD62L。具体而言，已有报道显示 CD138 的表达.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
机器与仪器
3 mL 塑料注射器	BD	309657
96孔U型底板	赛默飞世尔科技	163320
1.2 mL 冻存管	Corning	430487
细胞筛 70 µm 尼龙	Falcon	352350
细胞培养皿（60 mm）	VWR	10062-890
离心	赛默飞世尔科技	Sorvall Legend XTR
Benchmark B2000-2 MyBath 2L 数字水浴锅	基准测试	B2000-2
精细剪刀 - 锐利	F.S.T	14060-11
塑料仪器箱	F.S.T	20830-05
光谱流式细胞仪，Aurora	Cytek		5L 16UV-16V-14B-10YG-8R
标准型镊子	F.S.T	11000-13
标准型镊子	F.S.T	11000-20
Vi-cell Blu 细胞活力分析仪	贝克曼库尔特	C19201
试剂
0.5 M EDTA pH 8.0	优质生物学	351-027-101
2-巯基乙醇	Gibco	21985-023
ACK裂解缓冲液	Gibco	A10492-01
抗生素-抗真菌素混合液（青霉素-链霉素-两性霉素B溶液，100倍浓缩）	Gibco	15240-062
Brilliant Stain缓冲液Plus（仅供科研使用）	BD	566385
斑蝥素	Sigma	C7632-25MG
Cytofix 固定缓冲液	BD	554655
二甲基亚砜（DMSO）	Sigma	D8418-250ml
DNA酶I	罗氏	10104159001
胎牛血清（FBS）	VWR	97068-085
FoxP3/转录因子染色缓冲液套装	eBioscience	00-5523-00
庆大霉素（50 mg/mL）	Gibco	15750-060
Golgiplug	BD	555029
GolgiSTOP	BD	554724
HEPES (1 M)	Gibco	15630-080
Ionomycin	Sigma	I0634-1mg
L-谷氨酰胺（200 mM）	Gibco	25030-081
MEM 非必需氨基酸（100 倍）	Gibco	11140-050
16% 甲醛溶液，电镜级（PFA）	电子显微镜  科学	15710	用 PBS 稀释
PBS，pH 7.4	Gibco	10010072
青霉素-链霉素（10,000 U/mL）	Gibco	15140-122
佛波醇-12-肉豆蔻酸酯-13-乙酸酯（PMA）	Sigma	P8139-1mg
程序降温盒	Millipore	Corning CoolCell FTS30
RPMI（含L-谷氨酰胺）	Gibco	11875-085
丙酮酸钠（100 mM）	Gibco	11360-070
True-Stain 单核细胞阻断剂	BioLegend	426103
缓冲液
培养基			10% 热灭活 FBS（VWR）， 2 nM 谷氨酰胺， 0.055 mM 2-巯基乙醇， 1% 青霉素/链霉素， 1 mM 溴化钠丙酮酸 10 mM HEPES 1% 非必需氨基酸 在 RPMI（含 L-谷氨酰胺）中
FACS 缓冲液			PBS 中含 2 mM EDTA 和 2% 热灭活 FBS
冻存液			90% 热灭活 FBS 和 10% DMSO
解冻缓冲液			洗涤缓冲液 + 0.1 mg/mL DNase I
扁桃体培养基			RPMI 培养基添加 5% 热灭活的 FBS 10 mM 谷氨酰胺， 0.05 mg/mL 庆大霉素， 1% 抗生素-抗真菌剂混合液  （青霉素、链霉素和两性霉素B）
洗涤缓冲液			RPMI（含L-谷氨酰胺）添加10%  热灭活胎牛血清和10 mM HEPES
抗体 & 细胞因子检测面板的其他试剂
生物素标记抗人CD107a（LAMP-1）抗体	BioLegend	328604	2 μL 在 200 μL 每孔加入完全培养基。 该抗体在PMA/离子霉素刺激期间与细胞共同孵育。
活死染色	100 μL 每孔混合
LIVE DEAD Blue	赛默飞世尔科技	L23105	1 : 800, 0.125 μL 在 100 μL 每孔 PBS
单核细胞阻断	50 μL 每孔混合
单核细胞阻断缓冲液	BioLegend	426103	5 μL True Stain单核细胞阻断剂和 45 μL 每孔 FACS 缓冲液
细胞表面抗体用于细胞因子检测 panel
趋化因子受体混合			μL/well
抗人 CCR6-BV711	BioLegend	353436	1
抗人 CCR7-BV421	BioLegend	353208	1
抗人CXCR3-PE-Cy5	BD	551128	5
抗人 CXCR5-BV750	BD	747111	1
Brilliant Stain缓冲液Plus（RUO）	BD	566385	10
	18 μL 每孔混合用于趋化因子受体； 加入单核细胞阻断缓冲液处理细胞
其他表面抗体混合物			μL/well
抗人 CD103-BUV661	BD	749993	2.5
抗人 CD14-Spark Blue 550	BioLegend	367148	2.5
抗人CD19-Spark NIR 685	BioLegend	302270	2.5
抗人 CD25-BB515	BD	564467	10
抗人CD27-超级亮436	赛默飞世尔科技	62-0279-42	5
抗人 CD3-BV510	BioLegend	344828	2.5
抗人 CD38 APC-Fire810	BioLegend	303550	1
抗人 CD4 CF YG584	Cytek	R7-20041	2.5
抗人 CD45RA-BUV395	BD	740315	0.6
抗人 CD56-BUV737	BD	612766	3.5
抗人CD57-FITC	BioLegend	359604	1.2
抗人 CD69-BUV563	BD	748764	1
抗人 CD8-BUV805	BD	612889	1.2
抗人 FAS-BB700	BD	566542	0.6
抗人 HLA-DR APC-Fire 750	BioLegend	307658	2
抗人PD1-BV785	BioLegend	329929	1.2
抗人 CD45-PerCP	赛默飞世尔科技	MHCD4531	1.2
Brilliant Stain缓冲液Plus（RUO）	BD	566385	10
FACS 缓冲液			61
			112 μL 每孔加入其他表面抗体混合液； 直接加入单核细胞阻断缓冲液中（50 μL）和趋化因子受体混合液（18 μL, 50+18+112 = 180 μL 每孔总量）
细胞内细胞因子抗体用于细胞因子检测 panel			μL/well
抗人颗粒酶B-PE	BD	561142	1
抗人IL10-PE-Dazzle 594	BioLegend	506812	1
抗人IL17A-BV605	BioLegend	512326	1
抗人IL2-BV650	BioLegend	500334	3
抗人IL21-Alexa Fluor 647	BD	560493	10
抗人IL4-PerCP Cy5.5	BD	561234	1
抗人穿孔素-APC	BioLegend	353312	2.5
抗人TNFα-PE-Cy7	BioLegend	502930	0.1
抗IFNγ-Pacific Blue	BioLegend	502522	1
SAv-BUV615	BD	613013	0.25
Brilliant Stain缓冲液Plus（RUO）	BD	566385	10
1× 透化缓冲液	eBioscience	00-5523-00	19.15
	(50 μL 每孔混合
抗体 & 转录因子检测面板的其他试剂
CD40 抗体，抗人	Miltenyi Biotec	130-094-133	0.5 μg/mL 工作浓度的培养基
活死染色	100 μL 每孔混合
LIVE DEAD Blue	赛默飞世尔科技	L23105	1 : 800, 0.125 μL 在 100 μL 每孔 PBS
单核细胞阻断缓冲液	BioLegend	426103	5 μL True Stain 单核细胞阻断剂和 45 μL 每孔FACS缓冲液
转录因子 panel 的表面抗体
趋化因子受体混合			μL/well
抗人 CCR6-BV711	BioLegend	353436	1
抗人 CCR7-BV421	BioLegend	353208	1
抗人 CXCR5-BV750	BD	747111	1
Brilliant Stain缓冲液Plus（RUO）	BD	566385	10
	13 μL 每孔混合
其他表面抗体混合物			μL/well
抗人4-1BB-PE-CY7	BioLegend	309818	2.5
抗人 CD14-Spark Blue 550	BioLegend	367148	2.5
抗人CD19-Spark NIR 685	BioLegend	302270	2.5
抗人 CD200-PerCP-eFluor 710	ThermoFisher	46-9200-42	2.5
抗人 CD25-PE-Cy5	BioLegend	302608	5
抗人 CD3-BV510	BioLegend	344828	2.5
抗人 CD38-APC-Fire810	BioLegend	303550	1
抗人CD4-太平洋蓝	BioLegend	317423	1
抗人CD40L-PE	BD	557299	15
抗人 CD45RA-BUV395	BD	740315	0.6
抗人 CD56-BUV737	BD	612766	3.5
抗人 CD69-BUV650	BioLegend	310934	2.5
抗人CD8-BUV805	BD	612889	1.2
抗人 HLA-DR APC-Fire 750	BioLegend	307658	2
抗人 ICOS-BUV563	BD	741421	1.2
抗人OX40-APC	BioLegend	350008	5
抗人PD1-BV785	BioLegend	329929	1.2
抗人 CD45-PerCP	赛默飞世尔科技	MHCD4531	1.2
Brilliant Stain缓冲液Plus（RUO）	BD	566385	10
FACS 缓冲液			54.1
			117  μL 每孔加入其他表面抗体混合液； 直接加入单核细胞阻断液中  缓冲液（50 μL）和趋化因子受体混合液（13 μL, 50+13+117 = 180 μL 每孔总量）
转录因子抗体用于转录因子检测 panel	μL/well
抗人 T-bet-BV605	BioLegend	644817	4
抗人 Bcl6-PE-CF594	BD	562401	4
抗人 FoxP3-Alexa Fluor 488	BD	560887	1.6
抗人 GATA3-BB700	BD	566642	2
抗人 Ki67-Alexa Fluor 700	BD	561277	0.4
抗人 RORγt-Alexa Fluor 647	BD	563620	2
Brilliant Stain缓冲液Plus（RUO）	BD	566385	10
1 × 破膜缓冲液	eBioscience	00-5523-00	16
			40 μL 每孔混合
用于无监督分析的软件与工具包
	软件/工具包	版本	来源
1	data.table	1.16.2	综合 R 存档网络
2	FlowJO	10.9.0	Becton, Dickinson and Company
3	pheatmap	1.0.12	综合 R 存档网络
4	R	4.3.2	综合R档案网络
5	readxl	1.4.3	综合 R 存档网络
6	Rstudio	2023.12.1+402	Posit PBC
7	Seurat	5.1.0	综合 R 存档网络
8	SeuratData	0.2.2.9001	综合 R 存档网络
9	SpectroFlo	3.0	Cytek
10	tidyverse	2.0.0	综合 R 存档网络
11	viridis	0.6.5	综合 R 存档网络