本文介绍了一种用于采集乳腺癌样本的详细方案，旨在优化样本在生物样本库、个体化医学及其他科研应用中的使用价值。文中详细描述了样本采集的工作流程，包括乳腺活检和乳房切除术的操作步骤，重点在于最大限度减少组织损伤并提高样本质量。
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方法文章
优化乳腺活检与乳房切除样本采集流程以用于生物样本库、个体化医学及科研应用
* These authors contributed equally
本文内容
摘要
摘要
乳腺癌是影响女性的最常见癌症，尤其在亚洲，其中菲律宾的发病率最高。尽管已有持续努力，但对乳腺癌生物学的理解仍显不足，加之缺乏有效的筛查项目和及时治疗，问题更加复杂。为应对这些挑战，生物样本库及其他生物标本储存机构在全球范围内迅速发展。菲律宾大学—菲律宾总医院（UP-PGH）已建立癌症生物样本库，展示了在菲律宾由政府支持开展癌症研究项目的可行性。该研究前瞻性地观察了100名处于不同疾病阶段的菲律宾乳腺癌患者，依托菲律宾大学—菲律宾总医院（UP-PGH）、菲律宾基因组中心（PGC）以及菲律宾大学迪里曼分校—生物学研究所（UPD-IB）的专业能力，整合了生物标本的采集、处理与储存，并同步收集全面的患者数据。实验流程包括RNA提取、文库构建和测序。此外，部分患者还参与了一项 体外 用于化疗预筛选的三维（3D）细胞培养实验。整合的数据旨在揭示潜在的治疗策略，以在标准临床方法不足的情况下实现个体化治疗。关键技术包括超声引导下粗针穿刺活检、精细的正常乳腺组织采集以及精确的肿瘤比例测定，以确保高质量的RNA提取、测序和3D细胞培养。本研究还针对既往生物样本库建设中遇到的挑战提出解决方案。最终，该研究有望显著推动乳腺癌研究的发展，并为协作研究、生物样本库建立以及在菲律宾等发展中国家推进精准医学提供示范模式。
引言
乳腺癌是中国台湾女性中最常见的癌症类型。在亚洲，菲律宾的乳腺癌死亡率最高之一，且死亡率与发病率之比较低1。这些数据可能在很大程度上受到缺乏乳腺癌筛查项目以及及时有效治疗手段的影响。在该国，乳腺癌通常在晚期才被诊断，因为大多数癌症患者仅在疾病进展到晚期阶段时才寻求医疗咨询。在乳腺癌发病率较高的菲律宾，53%的乳腺癌病例在III期和IV期才被确诊，仅有2-3%的病例在I期被发现1,2,3。除了推广乳腺癌筛查和加强患者教育外，还应进一步开展与乳腺癌相关的研究与开发工作，以降低该国乳腺癌的发病率。
全球生物样本库的建立推动了医学进步的步伐。生物样本库用于储存和保存具有科学价值的生物标本，以供未来的研究与开发使用4。此后，生物样本库被广泛应用于转化医学研究5以及改进个体化医疗策略6。在亚洲，生物样本库主要集中于东亚地区，尤其是中国、日本和韩国4。而在菲律宾等亚洲中低收入国家，生物样本库的概念仍处于发展阶段。菲律宾的生物样本库大多由私营医疗机构拥有，因此可能无法充分代....
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方案
这是一项前瞻性观察性研究，收集了100名不同分期的菲律宾乳腺癌患者的去标识化生物样本（肿瘤组织和正常乳腺组织）以及临床病理、治疗和预后数据。本研究由菲律宾总医院（PGH）、菲律宾基因组中心（PGC）和菲律宾大学迪里曼分校生物研究所（IB）合作开展，各单位承担指定任务。该方案已通过伦理审查。 在菲律宾大学马尼拉分校研究资助管理办公室注册（RGAO-2020-0933），并经该校研究伦理委员会（UPMREB）审查批准，伦理批号为UPMREB 2020-822-01。所有实验室均遵守各机构的生物安全指南。从PGH招募患者，确保了在临床病理因素、种族和环境暴露方面的变异性和代表性。样本的获取、收集、运输及其他相关物流安排，均以先前项目中制定并验证的标准操作程序（SOP）为框架执行。
注意：有关实验方案流程的概述以及参与本研究的各机构所承担角色，请参见图1 — 实验方案的示意图流程。
1. 采集乳腺样本前的操作步骤
- 在门诊咨询或术前会议期间，识别并筛选符合研究纳入条件的患者。
- 癌症患者的纳入标准
- 纳入年龄为19至75岁、经诊断为I期、II期和III期乳腺癌的菲律宾女性，以及年龄为19至70岁、经诊断为IIIb期和IV期乳....
- 癌症患者的纳入标准
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结果
在进行粗针穿刺活检采集样本时，超声引导下操作对患者的便利性、工作流程的效率以及样本RNA的完整性均有显著影响。若不采用超声引导，可能无法获得预期结果，患者将需要返回门诊重复操作，从而延长样本采集与处理的时间。
此外，由负责的病理学家确定每个样本的肿瘤比例，也是确保样本提取质量并尽量减少数据分析延迟的重要步骤。肿瘤比例是对乳腺组织样本中肿瘤成分的估计值。据此，可更方便地选择用于RNA提取和测序的组织块，仅将肿瘤比例较高的肿瘤组织块以及不含肿瘤组织的正常组织块送检提取。在缺乏不含肿瘤组织的代表性正常组织块的情况下，则送检肿瘤比例最低的样本。
病理学家根据估计的肿瘤百分比筛选样本后，将样本送检进行RNA提取和测序。质量欠佳的样本详细列表及其相应的RNA完整性数值（RIN）和浓度见表 1。从该表可以看出，有2个样本因RIN值和浓度不同，在测序过程中的文库构建步骤失败，因此未纳入最终分析。影响文库质量的因素包括RIN值、样本浓度，以及样本采集与RNA提取和测序.......
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讨论
该方案的成功实施不仅依赖于技术上的精确性，还依赖于 临床与研究团队之间的协调，以确保样本质量和数据完整性。本方案包含多个关键步骤，旨在提高诊断准确性，并获得适用于后续分子分析的高质量生物样本。关键步骤包括超声引导下粗针穿刺活检以获取正常及肿瘤乳腺组织、治疗反应数据的收集，以及肿瘤比例的定量分析。
对于可疑为癌症的可触及乳腺肿块，建议采用粗针穿刺活检（CNB）进行诊断。根据菲律宾外科医师学院（PCS）发布的早期乳腺癌临床实践指南9，粗针穿刺活检在乳腺肿块诊断中被广泛应用，其优势包括但不限于：提高诊断准确性；能够区分非浸润性癌与浸润性癌；并可通过免疫组织化学染色提供组织学诊断以及激素受体状态和其他预后标志物的信息。在本方案中，对患者实施超声引导下的CNB，以提高检出率，并确保对目标区域（肿瘤或正常组织）进行充分取样。多项研究支持在乳腺肿块诊断中使用超声引导下CNB。2020年在中东地区开展的一项研究结果显示，在109例经超声引导CNB检测出恶性病变的患者中，其对恶性肿瘤的敏感性为96.33%，特异性为75.10%
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披露
作者声明不存在任何需要披露的经济、个人或机构层面的利益冲突。
致谢
本研究由菲律宾科学技术部健康研究与发展理事会（DOST-PCHRD）资助，并与菲律宾基因组中心（PGC）及菲律宾大学迪里曼分校生物学研究所（UPD-IB）合作开展。作者还要感谢Lech Havel Tizon先生、Conrad Chong先生和Susan Valibia女士在优化本实验方案过程中提供的协助， 以及参与本方案拍摄工作的病理科住院医师 Clarisse Veronica Mirhan博士和Patricia Franco博士。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 37% 甲醛溶液 | PHILUSA Corporation | N/A | 用于组织样本的固定，以便进行组织病理学分析 |
| 70% 异丙醇 | Green Cross Inc. | N/A | 用作消毒剂 |
| 条形码打印机 | Zebra | GC420t | 用于打印条形码标签，以标记含有样本的试管 |
| 漂白剂 | Green Cross Inc. | N/A | 用作消毒剂；用于手术器械的去污染处理 |
| 蓝色冰袋 | Rubbermaid | 1002 | 用于在运输过程中保持样本的低温状态 |
| 14-G 核心针活检针 | Bard | MN1410 | 一种侵入式管状外科器械，设计用于连接活检枪手柄，自动从解剖结构中取出少量组织样本（活检），同时尽量减少周围组织损伤，用于组织病理学检查/检测。 |
| 核心针乳腺活检枪 | Bard | MG1522 | 可重复使用的核心活检器械，用于核心针活检过程中采集组织样本 |
| 一次性培养皿 90 mm × 15 mm | Phoenix Biomedical Products | LOT: 20220206 | 在将组织浸入 PBS 时，用于核心针活检标本的收集 |
| 杜氏磷酸盐缓冲液（PBS） | Thermo Fisher Scientific | 21600010 | 一种平衡盐溶液，广泛用于多种细胞培养应用，例如在细胞解离前洗涤细胞、细胞或组织的转运、细胞稀释计数以及试剂的配制。 |
| 镊子 | 本地供应商 | N/A | |
| Kimtech Science KimWipes 精细任务擦拭纸 | Kimberly Clark Professional | KC34120 | 尺寸 4.3 × 8.4 英寸（11.0 cm × 21.3 cm）；单层，280 张；用于清洁表面、部件、仪器和医疗办公室，可轻松清除液体、灰尘和微小颗粒。 |
| MACS 组织保存液 | Miltenyi Biotec | 130-100-008 | 用于优化新鲜器官和组织样本的保存 |
| 微量移液器 | 上海利辰仪器科技有限公司 | STEM-GC-3197-Y | 用于小体积液体的移液/转移 |
| 微量移液器吸头 | Tarsons | 521100 | 用于小体积液体的移液/转移 |
| Parafilm 封口膜 | Parafilm M | 5259-04LC PM996 | 用于试管的气密性和防潮密封，防止泄漏 |
| Primocin 250 mg（5 × 1 mL） | InvivoGen | ant-pm-05 | 用于防止组织受到微生物污染 |
| 冰箱（4 °C） | LG | 型号：GR-Y331SLZB | 用于组织样本和试剂的储存 |
| RNAlater 溶液 | Thermo Fisher Scientific | AM7021 | RNA 稳定溶液，用于组织的储存和生物样本库建设 |
| 无菌 15 mL 锥形管 | Thermo Scientific | 339650 | 用于组织保存中所用试剂/培养基的分装 |
| 无菌 5 mL 冻存管 | Thermo Scientific | 5000-1020 | 用于组织保存中所用试剂/培养基的分装 |
| 无菌手术刀片（#11） | Surgitech | N/A | 用于切割肿瘤和正常乳腺组织 |
| 手术剪刀（18.5 cm 7 ¼" 直刃） | Olten Instruments | BO-0125 | 用于切割肿瘤和正常乳腺组织 |
| 温湿度记录仪 | Extech Instruments | 42280 | 用于记录样本运输过程中的温度和湿度 |
| 组织标记染料 | Epredia | 3120123 | 用于染色切除手术标本的边缘，以便进行组织病理学分析 |
| 超低温冰箱 | 海尔生物医疗 | DW-86L579 | 用于肿瘤和正常乳腺组织的长期保存 |
| 60 mL 尿液样本容器 | Sure Guard | 0016UCS06PC | 用于组织样本的储存，以便进行组织病理学分析 |
| 自封袋 | Reynolds Consumer Products LLC | 用于样本运输时的包装 |
参考文献
- Wu, T., Lee, J. Promoting breast cancer awareness and screening practices for early detection in low-resource settings. Eur J Breast Health. 15 (1), 18-25 (2018).
- De Leon Matsuda, M. L., et al. BRCA1 and BRCA2 mutations amon....
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