生物样本库、个性化医疗和研究应用的乳腺活检和乳房切除术样本采集程序的优化

摘要

本文介绍了收集乳腺癌样本的详细方案，旨在优化其在生物样本库、个性化医疗和其他研究应用中的效用。详细描述了样本采集的工作流程，包括乳房活检和乳房切除术，重点是最大限度地减少组织损伤和最大限度地提高样本质量。

摘要

乳腺癌是影响女性的最普遍的癌症，尤其是在亚洲，菲律宾的发病率最高。尽管不断努力，但对乳腺癌生物学的了解仍然不足，而且缺乏有效的筛查计划和及时的治疗使情况更加复杂。为了解决这些问题，生物样本库和其他生物标本储存库在全球范围内获得了发展势头。菲律宾大学菲律宾总医院 （UP-PGH） 建立了癌症生物库，证明了政府支持的菲律宾癌症研究计划的可行性。该研究利用 UP-PGH、菲律宾基因组中心 （PGC） 和菲律宾大学迪利曼生物学研究所 （UPD-IB） 的专业知识，对 100 名处于不同疾病阶段的菲律宾乳腺癌患者进行前瞻性观察。它集成了生物样本的收集、处理和存储以及全面的患者数据。程序包括 RNA 提取、文库制备和测序。此外，一部分患者参加体 外 三维 （3D） 细胞培养实验，用于化疗预筛选。汇总数据旨在揭示可以在标准临床方法不足的情况下实现个性化治疗的治疗策略。关键技术包括超声引导下空心针活检、细致的正常乳腺组织采集和精确的肿瘤百分比测定，以确保高质量的 RNA 提取、测序和 3D 细胞培养。该研究还解决了先前生物样本库工作中遇到的挑战。最终，这项研究旨在为乳腺癌研究做出重大贡献，将自己定位为菲律宾等发展中国家合作研究、生物样本库建立和精准医疗进步的典范。

引言

乳腺癌是菲律宾女性中最常见的癌症。在亚洲，菲律宾是乳腺癌死亡率最高、死亡率发病率最低的国家之一¹。由于缺乏乳腺癌筛查计划和及时有效的治疗，发病率可能受到很大影响。在该国，乳腺癌通常在晚期被诊断出来，因为大多数癌症患者只在癌症晚期才寻求咨询。在乳腺癌发病率较高的菲律宾，53% 的乳腺癌病例被诊断为 III 期和 IV 期，只有 2-3% 被诊断为 I 期 ^1,2,3。除了促进乳腺癌筛查和患者教育外，还应进一步探索与乳腺癌相关的研究和开发，以降低该国的乳腺癌发病率。

全球生物样本库的建立加速了医学进步。生物样本库用于储存和保存具有科学价值的生物标本，以供未来的研究和开发使用⁴。从那时起，生物样本库一直被用于转化研究⁵ 和改进个性化医疗方法⁶。在亚洲，生物样本库主要集中在东亚，尤其是中国、日本和韩国⁴。在菲律宾等亚洲中低收入国家，生物样本库的概念仍在兴起。菲律宾的生物样本库主要归私人医疗机构所有，菲律宾更广泛的人口统计数据的健康和暴露状况可能没有得到很好的代表。

菲律宾大学马尼拉分校 （UPM） 菲律宾总医院 （PGH） 建立癌症生物样本库证明了建立政府支持的癌症生物样本库的可行性，该生物样本库可以推进菲律宾的癌症相关研究⁷.在此基础上，通过连接医学专业知识、研究创新和医疗保健政策的协作努力，我们努力为菲律宾的乳腺癌护理和研究格局带来积极的转变。因此，迫切需要一个癌症表型组生物样本库工作流程和一种扩展的方法，以简化在全国范围内收集广泛和分层的患者特定数据。本研究描述了乳腺活检和乳房切除术样本采集程序的方案，重点是将它们集成到生物样本库框架中。预计不仅可以增进我们对菲律宾人口背景下乳腺癌发病机制的理解，还可以促进与受影响个体独特的遗传、环境和临床属性相一致的精准治疗的开发。

方案

这是一项前瞻性观察性研究，收集了来自 100 名不同阶段的菲律宾乳腺癌患者的去识别化生物样本（肿瘤和正常乳腺组织）以及临床病理学、治疗和结果数据。这是菲律宾总医院（PGH）、菲律宾基因组中心（PGC）和菲律宾大学迪利曼分校生物研究所（IB）之间的合作工作，每个研究所都有指定的任务。该协议已在研究资助管理办公室 （RGAO-2020-0933） 注册，并由菲律宾大学马尼拉研究伦理委员会 （UPMREB） 审查和批准，根据伦理许可编号 UPMREB 2020-822-01 实施。使用的所有实验室都遵守每个机构的生物安全指南。从 PGH 招募患者确保了临床病理因素、种族和环境暴露方面的方差和代表性。在以前的项目中制定和验证的标准作程序 （SOP） 被用作与样品相关的采集、收集、运输和其他后勤安排的框架。

注意：有关协议工作流程的摘要以及参与研究的每个机构的角色，请参阅 图 1 - 协议的图表工作流程 。

1. 乳房前样本采集程序

1. 在临床咨询或术前会议期间确定并筛选符合研究条件的患者。
   1. 癌症患者的纳入标准
      1. 包括被诊断患有 1、2 和 3 期乳腺癌的 19-75 岁菲律宾女性，以及被诊断患有 3B 期和 4 期乳腺癌的 19-70 岁菲律宾女性。
      2. 包括临床怀疑或病理诊断的任何阶段的浸润性乳腺癌病例。
      3. 包括将接受手术治疗（改良根治性乳房切除术或根治性乳房切除术）的患者，无论是前期（临床 I 期或 II 期）还是新辅助化疗后（IIIB 期、IIIC 期）。IIIA 期患者可以根据医生的建议接受前期手术或新辅助治疗。对于 IV 期患者，那些愿意接受乳腺肿瘤和邻近正常组织空心针活检的患者。IV 期乳腺癌患者不会接受手术治疗。
      4. 纳入招募前接受过新辅助治疗的III期乳腺癌患者，并有完整的内科和临床治疗反应记录。
      5. 包括能够理解并签署知情同意书的患者。
   2. 癌症患者的排除标准
      1. 排除既往或并发恶性肿瘤的患者，包括既往诊断为乳腺癌的患者。
      2. 排除双侧乳腺癌患者。
      3. 排除既往接受过新辅助放疗或激素治疗的患者。
      4. 排除先前接受过核心活检或切检的患者，且未同意对将接受新辅助化疗的患者重复活检程序（因为无法获得化疗前新鲜肿瘤标本）
      5. 排除既往接受过切除活检且无残留肿瘤的患者。
      6. 排除患有无法进行手术治疗或新辅助化疗的合并症的患者。
   3. 退出标准
      1. 告知参与者，出于安全或其他考虑，他们可以随时退出，而不会影响他们的医疗护理。这项非干预性研究不会影响参与者的治疗选择。
2. 获得患者的同意并填写数据收集表。
   注意：指定的负责人 （FIC） 或顾问与大学研究助理 （URA） 一起获得同意。
3. 在确认患者参与研究后，获取并验证患者的核心针活检程序的时间表。
4. 按照机构伦理委员会和生物安全委员会制定和批准的指导方针执行程序。

2. 乳腺活检样本采集程序

注意：有关III期和IV期患者的核心针乳房活检程序的详细工作流程，请参阅 图2 ，显示了每个程序的样本分布。

1. 标本采集前将试管预标记为 GB，表示基因组学 - 乳房（标本所从事的研究），xxx 是参与者编号，范围可以从 001 到 100，或更多，以及字母 A、C 和 D。以下是用于标记管子的字母代码：
   A - 表示空心针活检，肿瘤组织，用于发送到 PGC
   C - 表示用于生物样本库的空心针活检，肿瘤组织
   D - 表示空心针活检，正常组织
   1. 为提交测序的样本分配实验室标签：“BC”和两个两位数样本号（例如，BC01、BC21）。每个样品都有一个相应的“GB”代码，该代码与标本采集期间分配的代码相关。
2. 在门诊、手术室或其他无菌环境中，在超声引导下使用 14 G 核心针活检枪获得多达 9 个组织核心。
   1. 对于每个核心，在肿瘤中心获得长约 2 厘米、距离肿瘤 1 厘米的相邻正常组织的乳房样本。从每个参与者那里收集两种类型的标本：肿瘤组织和正常组织。
   2. 将每个样品交给 URA，以放入装有磷酸盐缓冲盐水 （PBS） 溶液的培养皿中。
      注意：在这项研究中，仅对 III 期和 IV 期乳腺癌患者进行空心针活检。对于 III 期患者，空心针活检提供了未接受过化疗的肿瘤样本。对于 IV 期患者，空心针活检作为原发肿瘤样本，因为没有进行乳房切除术。对于 I 期和 II 期乳腺癌患者，未进行空心针活检。相反，肿瘤和邻近的正常组织是从乳房切除标本中获得的。
3. 将活检标本切成两半，以均匀分布在研究和组织病理学分析之间。
   1. 对于肿瘤组织，使用 14-G 针头为每位研究患者获得最多 9 个核心。
   2. 在培养皿中将获得的肿瘤核心分为2组：用于RNA分析的样品（6个核心）和用于生物样本库的样品（3个核心）。
   3. 将每个芯纵向切成 2 个，但在难以做到的情况下，将芯横向切成 2 个。使用无菌刀片切割核心。将一半的组织核心送去进行 RNA 分析或储存用于生物样本库。将另一半组织核心送到病理学进行常规组织病理学分析。
   4. 对于正常组织，使用 14 G 针头为每位研究患者最多获得 3 个核心。使用与用于获取肿瘤组织的针头不同的针头，以避免污染。在无法做到这一点的情况下，请先获得正常的乳房组织，然后再获得肿瘤组织。
   5. 将获得的每个正常组织放入培养皿中，类似于对肿瘤组织所做的工作，并将核心切成两半。将样本分发给研究样本并分发给病理科进行组织病理学分析。
4. 样品采集后，按照优先顺序将样品分布在试管中。
   1. 将一半的核心放入预装有 1.25 mL RNA 稳定溶液的指定 2 mL 冷冻管中（用于 RNA 分析的所有核心一起放置在 1 个小瓶中，所有用于生物样本库的核心放置在单独的小瓶中，始终将样品保持在低温）并将这些核心的相应一半放入普通样品瓶/管中，并用 10% 中性缓冲福尔马林 （10% NBF） 固定， 用于组织病理学分析。确保两个相应的半组，一个前往指定中心（例如，送去RNA分析的样品）和相应的病理标本具有相同的标本代码。
5. 填写手术病理表。连同表格，将用福尔马林固定的病理标本提交给病理学进行常规组织病理学。
6. 用封口膜密封浸泡在含有RNA稳定溶液的管中的空心针活检样品（理想情况下，溶液与组织的比例为5：1，因此如果是0.25 cm组织，则为1.25 mL RNA稳定溶液）。
7. 将样品在4°C下储存24小时，然后最终将其转移到温度为-80°C的超低温冰箱中。
   注意：第 4 节（标本的储存、包装和运输）将讨论储存指南。

3. 乳房切除术样本采集程序

1. 遵循第 1 节中的乳房前样本采集程序。
   注意：参加研究的 I、II 和 III 期患者将在手术室 （OR） 接受乳房切除术。对于 I 期和 II 期患者，将预先进行乳房切除术，而对于 III 期患者，只有在完成 8 个周期的新辅助治疗后才会进行乳房切除术。对于第 4 阶段，不收集乳房切除术样本。有关详细的乳房乳房切除术样本采集方案，请参阅 图 3 ，该方案显示了每个程序的样本分布。
2. 与合作者和病理科协调时间表。至少在手术的目标日期前 2 天执行此作。如果设定的时间表发生变化，请立即通知相关人员，以避免时间表发生冲突。
3. 在标本采集前将试管预先标记为 GB，即 Genomics Breast（标本所从事的研究），xxx 是参与者编号，范围可以从 001 到 100 或更多，以及字母 E 和 F。以下是用于标记管子的字母代码：
   E - 表示乳房切除术、肿瘤组织，用于发送到 PGC、IB 和生物样本库
   F - 表示乳房切除术，正常组织
   1. 为提交测序的样品分配实验室标签：“BC”和两位数样本编号（例如，BC01、BC21）。每个样品都有一个相应的“GB”代码，该代码与标本采集期间分配的代码相关。
4. 在等待标本的同时，在手术过程中填写手术病理表。向负责病理学家发送最新信息，以便他们为标本采集做任何必要的准备。
5. 取出并记录乳房标本后，立即将标本放入干净的塑料/标本袋中。确保立即将乳房切除标本带到病理科进行粗查，以尽量减少冷缺血时间。提交时不要将标本放入福尔马林中。
   注意：乳房切除术期间的样本动作照片如 图4 所示（乳房切除术期间样本采集的代表性图像）。
6. 在进行肉检时从每个标本中获取两种类型的样本：肿瘤组织和正常组织。
   1. 肿瘤组织
      1. 每个标本至少获得一个块（最好是更多），测量 1 厘米× 1 厘米× 1 厘米的肿瘤组织。
      2. 将获得的组织块进一步切成两部分，每半块尺寸为1厘米×0.5厘米×0.5厘米。将一半的组织块交给 URA 进行生物样本库和分析，然后将另一半固定在福尔马林中进行常规组织病理学。
      3. 将半块新鲜组织均匀地三等份。这将用于 RNA 测序、生物样本库和类器官培养。
      4. 对于 RNA 测序：立即放入预冷、预标记的 5 mL 冷冻管中，预装有 2.5 mL RNA 稳定溶液（不超过 30 分钟，必须始终保持低温）。
      5. 对于生物样本库：立即放入预冷、预标记和预填充的 5 mL 冷冻管中，并加入 2.5 mL RNA 稳定溶液（不超过 30 分钟，必须始终保持低温）。
      6. 对于类器官培养：立即放入预冷、预标记和预装的 15 mL 锥形小瓶中，装有 5 mL 组织储存溶液和 0.01 mL Primocin（不超过 30 分钟，必须始终保持低温）。将从标本的不同部分获得的所有肿瘤块的三分之一汇集在一个锥形管中。
   2. 正常组织
      1. 每个标本至少获得一个测量 1 厘米× 1 厘米× 1 厘米正常乳腺组织的块（最好更多）。
      2. 将获得的组织块进一步切成两部分，每半块尺寸为1厘米×1厘米×0.5厘米。将一半的组织块交给 URA 进行生物样本库和分析，然后将另一半固定在福尔马林中进行常规组织病理学。
      3. 将组织块平均切成两半以进行研究。这些将用于 RNA 测序和生物样本库。
      4. 对于RNA测序：立即放入预冷、预标记的5mL冷冻管中，预装有2.5mL冷冻管和RNA稳定溶液（不超过30分钟，始终保持在低温下）。
      5. 对于生物样本库，立即放入预冷、预标记和预填充的 2.5 mL 冷冻管中，其中装有 RNA 稳定溶液（不超过 30 分钟，始终保持在低温下）。
         注意：标记为“E”的肿瘤样本通常从标本的三个或更多不同部分获得。为避免混淆，用于RNA分析和生物样本库的肿瘤样本应放入标记为E1，E2，E3等的单独管中，而用于细胞培养的混合肿瘤样本应放入简单标记为E的管中。对于标记为 E1、E2 和 E3 的样本，应记录每个组织样本相对于肿瘤的相对位置/位置（例如，中心，10 点钟位置）。
7. 用封口膜密封装有从乳房切除术中获得的样品的冷冻管。
8. 将冷冻管在4°C中储存24小时，然后最终将其转移到超低温冰箱中，温度为-80°C进行长期储存。
9. 包装装有汇集的肿瘤块的锥形管并准备运输。这些肿瘤块将用于细胞培养成类器官。

4. 标本的储存、包装和运输

1. 立即用封口膜密封所有含有肿瘤和正常组织的冷冻管，并将它们储存在4°C下24小时。24小时后，将试管转移到-20°C约2-4小时，然后最终无限期地转移到-80°C，长期储存直至运输。
2. 在运输样本进行 RNA 分析之前更新样本追踪器和数据库，包括常规组织病理学结果和肿瘤百分比，以确保样本的身份。
3. 在运输之前，为每个样品完成运输清单。确保包装过程快速，并且装有样品的试管不会长时间放置在室温 （RT） 下。
   1. 用封口膜密封所有冷冻帽以防止泄漏。
   2. 将所有试管放入试管架中。
   3. 设置温度记录仪并将其放在管子旁边的架子上进行运输。
   4. 用吸水材料包裹管子，然后用气泡膜包裹，然后将物品放入可重新密封的袋子中。在将物品密封在袋子内之前，确保温度记录仪正在记录温度并且管子完好无损且直立放置。
   5. 将凝胶包放在聚苯乙烯运输箱的底部，然后将装有试管的可重新密封袋放在凝胶包的顶部。在袋子顶部再放一层凝胶包。确保试管夹在凝胶包之间，以确保标本在运输过程中保持低温。
   6. 关闭聚苯乙烯盒并将其放入纸板运输箱中。如果没有可用的大纸板箱，请使用更大的聚苯乙烯箱。将填妥的运输舱单放入自封袋中，然后放入箱内。盒子内物品的放置如 图 5 所示。
   7. 密封纸板箱并将适当的运输标签放在箱外。
4. 告知接收者标本采集时间表以及样本的目标发送时间。
   1. 对于类器官培养，仅发送和利用来自乳房切除术的肿瘤组织。确保这些样品在湿冰上新鲜交付，并在标本采集后 24 小时内交付。样品包装完毕并密封盒子后，请迅速预订快递公司进行运输。确保盒子不会长时间留在高温区域，因为严重的温度下降或升高会损害样品的活力。
   2. 在交给快递员之前，请注意运输的小瓶/试管的数量以及快递员离开生物样本库的时间。包裹到达后，确保收件人注意以下事项：到达指定中心和收到的时间、到达时的温度、收到的小瓶/试管数量以及任何受损的标本
   3. 对于 RNA 分析，在将样本送入 RNA 分析之前，请检查要递送的样本是否具有相应的组织病理学结果和外科病理学部门的肿瘤百分比。为每位患者确定并选择肿瘤含量最高的组织块，以提交进行 RNA 提取。仅运输具有肿瘤百分比的样本。
   4. 以不超过40个为一组发送样品，以方便批量处理。选择来自空心针活检或乳房切除术的肿瘤组织和来自乳房切除术的正常组织的任意组合。如果要运输来自空心针活检的正常组织，请检查以下条件：
      - 入组为第 3 阶段，但组织病理学结果显示第 4 阶段
      -入组为第 3 阶段，但组织病理学结果显示疾病的局部区域进展。
   5. 确保所有样品都在湿冰上运输。与发送样品进行 3D 细胞培养时遵循的协议类似，一旦标本包装完毕并密封盒子，请立即预订快递进行运输。避免将盒子长时间放置在高温区域，因为显着的温度波动会损害样品的活力。
   6. 在交给快递员之前，请注意运输的小瓶/试管的数量以及快递员离开生物样本库的时间。包裹到达时请注意以下事项：到达指定中心和收到的时间、到达时的温度、收到的小瓶/试管数量以及任何受损的标本（如果有）。
5. 在进一步处理样品之前，更新发送的样品数据库并输入所需的所有必要信息。每周监控和评估一次数据库。

结果

对于空心针活检期间的样本采集，在超声引导下进行手术对患者的便利性和工作流程的效率以及样本的RNA完整性产生了巨大影响。如果不这样做，可能无法获得预期的结果，患者必须返回诊所重复该程序，从而延长样本采集和处理时间。

除此之外，由负责病理学家完成的每个样本的肿瘤百分比识别也是确保提取样本质量和最大限度地减少数据分析延迟的重要步骤。肿瘤百分比是对乳腺组织样本肿瘤成分的估计。这样，选择用于RNA提取和测序的组织块将更容易，因为只有肿瘤百分比高的肿瘤块和没有肿瘤组织的正常组织块才会被送去提取。如果没有没有肿瘤组织的代表性正常组织块，则将发送肿瘤百分比最小的组织块。

在病理学家根据病理学家估计的肿瘤百分比选择样本后，将样本送出进行 RNA 提取和测序。质量不佳的样品的详细列表，以及它们相应的 RNA 完整性数 （RIN） 值和浓度，如 表 1 所示。从提供的表格中可以观察到，在测序过程中，具有不同 RIN...

讨论

该协议的成功实施不仅依赖于技术精度，还依赖于临床和研究团队的协调，以确保一致的样本质量和数据完整性。该协议包含几个关键程序，旨在最大限度地提高诊断准确性并生成适合下游分子分析的高质量生物样本。关键步骤包括超声引导下空心针活检以获得正常和肿瘤乳腺组织、治疗反应数据收集以及肿瘤百分比量化。

空心针活检 （CNB） 推荐用于诊断疑似癌症的可触及乳房肿块。根据菲律宾外科医师学会 （PCS） 发布的早期乳腺癌临床实践指南⁹，空心针活检因其优点而常用于乳腺肿块的诊断，包括但不限于：提高诊断准确性;它可以区分非浸润性癌症和浸润性癌症;并可通过免疫组化染色提供组织学诊断和激素受体状态和其他预后标志物的数据。在该协议中，对患者进行超声引导CNB以提高产量并确保对感兴趣区域（肿瘤或正常组织）进行充分采样。多项研究支持使用超声引导下CNB诊断乳房肿块。2020 年在中东进行的一项研究结果包括，对 109 名超声引导下 CNB 检测到恶性病变的患者的恶性肿瘤的敏感性为 96.33%，特异性为...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
37%福尔马林溶液	菲卢萨公司	无	用作组织病理学分析的防腐剂
70%异丙醇	绿十字公司	无	用作消毒剂
条码打印机	斑马	GC420t	用于用于标注样品管的条码标签打印
漂白剂	绿十字公司	无	用作消毒剂;用于手术工具的去污
蓝色冰层	橡胶女郎	1002	用于在运输过程中保持样品低温
核心针活检14-G针	吟游诗人	MN1410	一种侵入式管状手术器械，设计用于连接活检枪手，用于自动从解剖结构中提取小组织样本（活检），同时对周围组织造成最小损伤，用于组织病理检查/检测。
核心针刺乳腺活检枪	吟游诗人	MG1522	用于核心针刺活检中采集组织样本的可重复使用核心活检仪器
一次性培养皿 90 mm x 15 mm	凤凰生物医药产品	洛特：20220206	用于PBS中浸没组织时的核心针活检样本采集
杜尔贝科磷酸盐缓冲盐水（PBS）	赛莫飞世尔科学	21600010	一种平衡盐溶液，用于多种细胞培养应用，如解离前清洗细胞、运输细胞或组织、稀释细胞计数以及制备试剂。
镊子	本地供应商	无
Kimtech 科学 KimWipes 精致任务雨刷	金伯利·克拉克职业	KC34120	4.3 x 8.4英寸。（11.0厘米 x 21.3厘米）;单层280发;对于清洁表面、零件、器械和医疗机构，这些湿巾轻松清洁液体、灰尘和细小颗粒。
MACS组织储存溶液	米尔滕尼生物技术	130-100-008	用于优化新鲜器官和组织样本储存的存储方案
微量移液器	上海地衣仪器科技有限公司	STEM-GC-3197-Y	用于小体积液体移液/转移
微量移液器头	塔森家族	521100	用于小体积液体移液/转移
副胶片	Parafilm M	5259-04LC PM996	用于对管道进行气密和防潮密封，防止泄漏
普莫辛 250毫克（5 x 1 毫升）	InvivoGen	蚁-PM-05	用于保护组织免受微生物污染
冰箱（4 & deg;C)	LG	型号：GR-Y331SLZB	用于组织样本和试剂的储存
RNAlater解决方案	赛莫飞世尔科学	AM7021	用于组织储存和生物样本库的RNA稳定溶液
无菌15毫升锥形管	热力科学	339650	用于制作用于组织储存的试剂/培养基的分量
无菌5毫升冷冻瓶	热力科学	5000-1020	用于制作用于组织储存的试剂/培养基的分量
无菌手术刀刃（#11）	外科技术	无	用于切除肿瘤和正常乳腺组织
外科剪刀（18.5厘米7和frac14;“str”	奥尔滕乐器	BO-0125	用于切除肿瘤和正常乳腺组织
温度计时器	Extech 仪器	42280	用于记录样品运输过程中的温度和湿度
纸巾墨水	埃普雷迪亚	3120123	用于为切除手术标本的边缘染色，用于组织病理学分析
超低温冷冻柜	海尔生物医药	DW-86L579	用于肿瘤和正常乳腺组织的无限期储存
尿液样本容器 60毫升	守护	0016UCS06PC	用于组织病理分析的组织储存
密封袋	雷诺兹消费品有限责任公司		用于包装样品以便运输