需要JoVE订阅才能观看此内容。 请登录或开始免费试用

方法文章

人源嵌合抗原受体调节性T细胞的制备

2.7K 次观看

⸱

DOI：

10.3791/67200

⸱

2025年1月3日

 ,  , 
1Department of Microbiology and Immunology, Medical University of South Carolina, 2Department of Regenerative Medicine and Cell Biology, Medical University of South Carolina, 3Hollings Cancer Center, Medical University of South Carolina

本文内容

摘要

本方案提供了一种简化的流程，用于生成和检测人源嵌合抗原受体调节性T细胞（CAR Tregs）。

摘要

嵌合抗原受体（CAR）T细胞疗法彻底改变了癌症治疗的格局，使先前无法治愈的血液系统恶性肿瘤实现了创纪录的缓解率。这些成功推动了将CAR技术平台拓展至一小部分关键的CD4+ 主要负责调节和抑制免疫反应的T细胞，即调节性T细胞（Tregs）。将Tregs的免疫抑制活性重定向至任意细胞外靶点的能力，对于开发治疗自身免疫性疾病、器官移植排斥反应以及移植物抗宿主病的细胞疗法具有重大意义。本文详细描述了以下方法 真正有效的 从人外周血中分离Treg细胞，利用慢病毒或借助腺相关病毒介导的同源定向修复（HDR）模板递送实现CRISPR/Cas9辅助的基因敲入技术对人Treg细胞进行遗传修饰，以及 离体 稳定人源CAR Treg的扩增。最后，我们描述了人源CAR Treg表型稳定性的评估方法 体外 抑制功能，这为了解人源CAR Treg在临床前和临床应用中的行为提供了见解。

引言

嵌合抗原受体（CAR）T细胞疗法彻底改变了血液系统恶性肿瘤的治疗，使以往无法治疗的癌症达到极高的缓解率1,2。早期在胶质母细胞瘤治疗中应用CAR T细胞所取得的令人鼓舞的结果3,4,5，凸显了CAR技术的多功能性及其未来靶向多种恶性肿瘤的潜力。随着该领域不断探索CAR的更多应用，调节性T细胞（Tregs）已成为一种极具前景的细胞类型。Tregs在维持免疫稳态方面发挥着关键作用，并通过多种机制调控免疫反应，包括隔离IL-2、分泌免疫抑制性细胞因子以及调节抗原呈递细胞6,7。

利用CAR技术，Treg细胞可被用于治疗器官移植排斥、自身免疫性疾病以及过敏和哮喘等炎症性疾病6,8,9。CAR Treg细胞有望通过减少对免疫抑制药物的依赖，显著改善患者的预后和生活质量，因为这些药物会整体抑制免疫系统，并伴随严重的不良反应10,11。在临床前模型中，将CAR技术应用于Treg细胞已显示出令人鼓舞的结果，在1型糖尿病、多发性硬化症、移植物抗宿主病和炎症性肠病等疾病中均取得了成功应用9,12,13,14,15。目前，临床研究正在探索CAR Treg细胞在预防实体器官移植排斥中的应用16。

本文介绍了一种生成人源嵌合抗原受体调节性T细胞（CAR Treg）的详细方法。该方案包括从人外周血中分离调节性T细胞（Treg），并利用慢病毒转导、CRISPR/Cas9基因编辑结合腺相关病毒（AAV）载体介导的精确基因敲入等技术对其进行遗传修饰。我们还描述了对这些工程化Treg细胞表型稳定性及抑制功能的评估方法，这些是验证其治疗潜力的关键步骤17,18,19。该方法简化了CAR Treg疗法的设计与早期测试流程，有望将CAR T细胞疗法的变革性影响拓展至免疫系统的调控领域。通过分享本方法，我们希望推动CAR Treg疗法这一新兴领域的进一步研究与创新9,20。

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

方案

1. 人调节性T细胞的分离

  1. 白细胞富集包处理
    1. 将白细胞富集包中的内容物转移至一个50 mL圆锥形离心管中。加入等体积的含2%胎牛血清（FBS）的杜尔贝科氏磷酸盐缓冲液（DPBS），用移液器轻轻混匀。
    2. 在室温（RT）下以300 × g离心10分钟。小心吸除上清液。将细胞沉淀重悬于2 mL DPBS + 2% FBS中。按4:1的比例，用移液器向细胞悬液中加入8 mL氯化铵溶液，轻轻颠倒混匀，并在冰上孵育15分钟以裂解残留的红细胞。
    3. 在室温下以300 × g离心10分钟。小心吸除上清液。加入30 mL DPBS + 2% FBS洗涤细胞。关闭离心机制动，于室温下以150 × g离心洗涤后的细胞10分钟。小心吸除上清液。将细胞沉淀重悬于30 mL DPBS + 2% FBS中。
    4. 用台盼蓝按1:1比例计数已分离的外周血单个核细胞（PBMCs）。
      1. 由于细胞浓度较高，先用DPBS将10 µL细胞按1:100稀释；然后取10 µL该1:100稀释液与10 µL台盼蓝溶液混合，得到最终1:1的稀释液。使用自动细胞计数仪时，需将报告的细胞浓度乘以100以校正200倍稀释（因多数计数仪默认按2倍稀释计算）。预计从1/10份白细胞富集包中可获得1–2.5 × 109个PBMC。
  2. CD4+ T细胞分离（阴性选择法）
    1. 在室温下以500 × g离心108–109个PBMC 5分钟，弃上清，将细胞重悬于细胞分离缓冲液（DPBS + 1 mM EDTA + 2% FBS）中，浓度为5 × 107个细胞/mL。
      注：为获得足够数量的人调节性T细胞（Treg）用于基因修饰，建议起始使用1 × 109个PBMC。
    2. 根据CD4+ T细胞富集试剂盒的说明书进行磁性分离。
    3. 通过台盼蓝染色计数（10 µL细胞 + 10 µL台盼蓝）确定所分离的CD4+ T细胞数量。
  3. CD8+ T细胞分离（阴性选择法）
    1. 在室温下以500 × g离心5 × 107个PBMC 5分钟。弃上清，将细胞重悬于细胞分离缓冲液（DPBS + 1 mM EDTA + 2% FBS）中，浓度为5 × 107个细胞/mL。
      注：建议起始使用5 × 107个PBMC，以获得2–5 × 106个CD8+ T细胞。
    2. 根据CD8+ T细胞富集试剂盒的说明书进行磁性分离。
    3. 通过台盼蓝染色计数（10 µL细胞 + 10 µL台盼蓝）确定所分离的CD8+ T细胞数量。
  4. 调节性T细胞的荧光激活细胞分选（FACS）
    1. 按步骤1.2所述方法分离CD4+ T细胞，并将其在含2% FBS的DPBS中于4 °C避光保存过夜（细胞数量和活力损失最小），次日进行FACS分选。通过台盼蓝染色计数（10 µL细胞 + 10 µL台盼蓝）确定步骤1.2中获得的CD4+ T细胞数量。
    2. 在500 × g下离心CD4+细胞5分钟。将细胞重悬于200 µL DPBS中。
    3. 每1 × 106个细胞，加入1 µL抗人CD4-FITC、1 µL抗人CD25-APC和1 µL抗人CD127-PE抗体。轻轻涡旋混匀，置于4 °C避光冰箱中孵育30分钟。
    4. 用含2% FBS的10 mL DPBS洗涤细胞。在500 × g下离心5分钟。将染色后的细胞轻轻重悬于含2% FBS的DPBS中，浓度为1.5 × 107个细胞/mL。此为推荐用于荧光激活细胞分选（FACS）的细胞浓度。
    5. 将染色后的细胞悬液经40 µm滤帽过滤至FACS管中，随后将管子置于冰上。
    6. 准备含3 mL RPMI10培养基的15 mL收集管，并置于冰上。
      注：该培养基由RPMI1640基础培养基、10% FBS、1×青霉素-链霉素、1× L-丙氨酰-L-谷氨酰胺、1×非必需氨基酸、1×丙酮酸钠和1× HEPES组成。
    7. 使用FACS分选CD4+CD25highCD127-调节性T细胞（Tregs）和CD4+CD25lowCD127+常规T细胞（Tconv），如图1A所示。
    8. 测定细胞得率和活力，随后进行下游分析或T细胞活化。

2. T细胞活化

  1. 用台盼蓝计数分离的T细胞（10 µL细胞 + 10 µL台盼蓝）。
  2. 每获得1 × 106个T细胞，需洗涤25 µL抗CD3/CD28磁珠（106个磁珠），保持磁珠与T细胞数量比为1:1。通过加入DPBS洗涤抗CD3/CD28磁珠，置于磁力架上孵育3分钟，然后移除已被稀释的抗CD3/CD28磁珠缓冲液，因其对细胞具有毒性。
  3. 将试管从磁力架上取下，用RPMI10培养基重悬洗涤后的磁珠，使磁珠浓度为1 × 106个/1 mL RPMI10。
  4. 用RPMI10培养基重悬T细胞，并加入抗CD3/CD28磁珠，使T细胞浓度为1 × 106个/mL。然后，向Treg细胞中加入1,000 IU/mL的IL-2，向CD4+ Tconv细胞中加入100 IU/mL的IL-2，向CD8+ T细胞中加入300 IU/mL的IL-2。
  5. 将T细胞以每孔1 × 106个细胞的密度接种于24孔板中，根据实验需要加入不同量的抗CD3/CD28磁珠和IL-2。将24孔板置于37 °C、5% CO2的细胞培养箱中培养。
  6. 在IL-2存在条件下活化T细胞并扩增9–12天，直至用于后续实验或再次使用抗CD3/CD28磁珠进行再激活以进一步扩增。每2–3天更换一次培养基，并在每次更换新鲜培养基时补充IL-2。扩增过程中通过细胞计数或显微镜观察，在传代前将Treg细胞密度维持在每毫升5 × 105至1 × 106个细胞之间。

3. 人调节性T细胞慢病毒转导

  1. 激活后48小时重悬并计数Treg细胞。室温下以500 ×g离心5分钟。将Treg细胞重悬于RPMI10培养基中，浓度为1.25 × 106 个细胞/mL，并添加1,000 IU/mL的IL-2。
  2. 将离心机预热至32 °C。
  3. 在冰上解冻含有CAR构建体的慢病毒。
    注意：我们将单次使用量的慢病毒分装保存于-80 °C，每份含有足够以MOI为1转导2.5 × 105个细胞的病毒量。
  4. 将每份慢病毒分装物加入含2.5 × 105个Treg细胞的200 µL微离心管中，每管代表一个反应体系。在32 °C下以1,000 × g离心1小时（spinoculation）。
  5. 将每个200 µL反应体系转移至24孔板中。确保培养基覆盖整个孔底。将转导后的Treg细胞置于组织培养孵箱中过夜孵育（16–18小时）。用RPMI10培养基补加每孔至2 mL，最终IL-2浓度为1,000 IU/mL。
  6. 在激活后第9至12天继续扩增转导后的Treg细胞，根据需要（每2–3天）按比例分瓶，并补充新鲜预热的RPMI10培养基和IL-2。理想的细胞浓度为5 × 105–1 × 106 个细胞/mL。
  7. 通过流式细胞术评估基因修饰效率，如图2所示。
    注意：我们的慢病毒CAR构建体在CAR基因的N端包含一个Myc标签，并通过2A肽连接一个GFP报告基因，从而可在无需抗体染色的情况下定量转导效率（通过GFP）并验证CAR在细胞表面的表达（通过Myc标签）。我们通常在转导后第5天评估基因修饰效率。转导效率因供体及所用CAR构建体的不同，通常在30%至70%之间。如有需要，可对CAR+细胞进行分选。
  8. 确保经修饰的Treg细胞完成其激活周期（9–12天），并在用于任何实验前在无IL-2条件下静置培养24小时。

4. 人类调节性T细胞中CRISPR/Cas9介导的基因敲入

  1. 激活48小时后，重悬Treg细胞并转移至15 mL圆锥形离心管中。将细胞悬液置于磁力架上孵育3分钟。
  2. 在磁铁中时，用移液器将细胞连同培养基转移至新离心管中。抗CD3/CD28磁珠将仍附着在管壁上。去除磁珠后，让去珠的Treg细胞在RPMI10培养基中静置2小时，以恢复因去珠操作造成的即时应激，从而提高后续转导效率及电穿孔后的细胞恢复能力。
  3. 用台盼蓝对去磁珠的Treg细胞进行计数。
  4. 预温不含FBS的低血清培养基至 37 °C.
  5. 在6孔板中加入2.5 mL RPMI10培养基 无 抗生素（青霉素-链霉素）以及每孔 1,000 IU/mL IL-2。将培养板预热至 37 °C 在组织培养孵箱中。
  6. 将含有腺相关病毒（AAV）的CAR同源定向修复（HDR）模板置于冰上解冻。
    注意：我们将单次使用分装的 AAV 按可感染 4 × 10⁶ 个细胞的量进行保存6 细胞以 20,000 的 MOI 在 -80 °C.
  7. 500 × g 离心 Treg 细胞 g 5分钟。倒出上清液后，将细胞重悬于预热的低血清培养基中，浓度为4 × 107 cells/mL
  8. 分装细胞于 100 µL 在低蛋白结合性1.5 mL离心管中。向每份样品加入MOI为20,000的CAR AAV，并重悬。将反应管置于组织培养孵箱中孵育1小时。
  9. 在1小时孵育期间，通过缓慢加入制备并组装CRISPR/Cas9核糖核蛋白（RNP）复合物 8.3 µL Cas9蛋白（1 mg/mL 原液）至 2.5 µL 靶向TRAC基因位点的sgRNA100 µM 储存液）以获得Cas9与sgRNA的摩尔比为1:1，且总RNP体积为 10.8 µL 每个样品。轻轻吹吸混匀。将RNP混合物在室温下孵育15分钟 37°C 在组织培养孵育箱中。
    注意：RNP复合物在此之后可于室温保存，直至准备使用。
  10. 用3 mL高渗电穿孔缓冲液填充一支新的电穿孔管（E管）。将装有缓冲液的E管插入电穿孔系统的移液站，直至听到咔嗒声。设置电穿孔条件为 2,200 V，20 ms，1次脉冲 在电穿孔系统中。
  11. 当与 AAV 共孵育 1 小时结束后，以 300 × g 室温下孵育5分钟。小心吸除上清液，并将细胞沉淀重悬于 100 µL 每份样品加入电穿孔系统提供的细胞重悬缓冲液。
    注意：操作需迅速，避免细胞在缓冲液中停留超过15分钟。避免产生气泡。
  12. 添加 10.8 µL 每样品的RNP复合物。用移液器充分混匀，避免产生气泡。
  13. 插入一个 100 µL 通过将移液器推至第二档以打开夹钳，将移液器顶部插入电穿孔吸头中，直至夹钳牢固地卡在活塞的安装杆上。在保持对移液器向下压力的同时，逐渐松开按钮，确保吸头紧密贴合，无任何间隙。
  14. 将移液器按至第一档，将电穿孔尖端浸入细胞-RNP 混合物中。轻柔吸取样品至移液器内，避免产生气泡。
    注意：电穿孔过程中移液器吸头内不得有气泡。
  15. 将装有电穿孔尖端并含有样品的移液器垂直插入E管中，直至听到咔嗒声。避免产生气泡。
  16. 确认已输入人Treg细胞的最佳设置参数（2,200 V，20 ms，1 次脉冲）并按压 开始 在触摸屏上选择以对细胞进行电穿孔。
  17. 等待触摸屏显示 完成 电穿孔完成后，轻柔移开移液枪头，立即将样品转移至已准备好的6孔板中，每孔含有2.5 mL预热的无抗生素RPMI10培养基，并添加1,000 IU/mL的IL-2。对剩余样品重复上述操作。轻轻以直线方式摇动培养板（从左至右、从上至下），确保细胞在各孔中均匀分布，随后将培养板放入组织培养孵箱中。
    注意：如果使用相同的细胞和RNP复合物，电穿孔尖端最多可重复使用3次。在计数细胞或进行任何操作（如加入HDR增强剂）之前，需让细胞恢复30分钟。
  18. 次日，即16–18小时后，更换为含抗生素的培养基，用台盼蓝对电穿孔的Treg细胞进行计数，并以10⁶个细胞/mL的密度继续培养6 细胞/mL，并添加1,000 IU/mL IL-2。按照步骤2.6所述方法，通过传代细胞并补充新鲜RPMI10和IL-2，继续扩增电穿孔后的Treg细胞。
  19. 将样品置于冰上，用于流式细胞术分析。
    1. 设置单色补偿对照，并将其应用于实验文件。
    2. 先观察未染色样本，调整FSC和SSC增益，使淋巴细胞群位于“所有事件”散点图的中央位置。
    3. 建立淋巴细胞的设门策略：从非碎片/单细胞到活细胞再到CD4+ 细胞，如所示 图3C.
  20. 使用流式细胞术评估基因修饰效率。
    注意：我们的 AAV CAR 载体除包含 TRAC 位点同源臂外，还包含一个截短的表皮生长因子受体（EGFRt）报告基因，该基因通过 2A 肽与 CAR 基因相连，如图所示 图3基因敲入效率通过CD3表面染色来确定，CD3的丢失表明TCR表面表达的缺失，从而反映CRISPR/Cas9对TRAC位点的成功靶向；同时检测EGFRt的表达，其表达表明CAR转基因的成功整合。CAR敲入的Treg细胞为CD3阴性-EGFRt+ 细胞。我们在电穿孔后第5天评估基因编辑效率。
  21. 确保经修饰的Treg细胞完成其活化周期（9-12天），并在无IL-2条件下静置24小时后，再用于任何实验。

5. 人源 CAR Treg 的激活

  1. 共培养体系建立（第0天）
    1. 将表达CAR抗原的靶细胞系收集至锥形管中。
      注：我们使用K562细胞，这是一种不表达HLA、CD80和CD86的人慢性髓系白血病细胞系，作为CAR Treg激活的靶细胞。亲本K562细胞用作阴性对照，表达CAR抗原的K562细胞用于激活CAR Treg17,21。
    2. 使用铯-137或X射线辐照仪对靶细胞系进行4,000 rad辐照。若无法获得辐照仪，可采用丝裂霉素C处理以抑制细胞增殖，同时维持靶细胞表面抗原的表达22。
    3. 若尚未去磁珠，将结合了抗CD3/CD28磁珠的Treg细胞重悬，并转移至15 mL锥形管中。将细胞悬液置于磁铁中孵育3–5分钟。在仍处于磁铁吸附状态下，用移液器将上清中的细胞转移至新管中；抗CD3/CD28磁珠将保留在管壁上。
    4. 使用台盼蓝染色法测定辐照后的靶细胞及去磁珠后的CAR Treg细胞浓度。
    5. 将辐照后的靶细胞和CAR Treg细胞在500 × g下离心5分钟。分别用预热的RPMI10培养基重悬至106 个细胞/mL。向CAR Treg细胞中加入IL-2，使其终浓度为2,000 IU/mL。
      注：当CAR Treg细胞与靶细胞混合后，IL-2将被稀释一倍，最终浓度为1,000 IU/mL。
    6. 在96孔圆底培养板中，将1 × 105个CAR Treg细胞（100 µL）与以下成分共培养：1 × 105个（100 µL）不表达CAR抗原的辐照靶细胞（激活阴性对照）、1 × 105个（100 µL）表达CAR抗原的辐照靶细胞（实验组），或2.5 µL抗CD3/CD28磁珠（激活阳性对照）加97.5 µL RPMI10培养基。将培养板置于37 °C、5% CO2的细胞培养箱中孵育48小时。
      注：每孔终体积为200 µL。确保每种条件设置三个重复孔。
  2. 流式细胞术检测
    1. 若不使用酶标仪，将96孔圆底板中各孔内容物重悬并转移至FACS管中。在500 × g下离心5分钟。弃去上清，轻轻涡旋重悬细胞沉淀。
    2. 配制流式抗体混合液：每样本100 µL，包含DPBS、抗人CD4 PE/Cy7抗体（1:200）、抗人CD71 PE抗体（1:100）和Ghost活率染料BV510（1:2000）。
      注：若CAR报告基因是GFP，该抗体组合效果良好。若报告基因编码需抗体染色的表面蛋白（如EGFRt），可使用FITC标记的相应抗体。
    3. 向每个样本中加入100 µL抗体混合液，轻轻混匀，在4 °C冰箱中孵育30分钟。
    4. 加入500 µL DPBS洗涤，在500 × g下离心5分钟。将细胞沉淀重悬于200 µL DPBS中。
    5. 将样本置于冰上，准备进行流式细胞术分析。
      1. 设置单色补偿对照，并应用于实验流式数据文件。
      2. 检测未染色样本，调节SSC和FSC增益，使淋巴细胞群位于“所有事件”散点图中央。
      3. 建立淋巴细胞门控策略：从非碎片/单细胞→活细胞→CD4+细胞，如图3C所示（使用不同荧光染料）。
      4. 以约1,500个事件/秒的速率采集数据，评估Treg细胞的激活情况。
        注：预期结果为在CAR抗原存在时，CAR Treg细胞表面CD71表达上调，如图4所示。若在CAR抗原存在下未观察到上调，则可能存在持续性信号激活（tonic signaling）。

6. 人源 CAR Treg 的稳定性

  1. 共培养体系的建立与扩增（第0-9天）
    1. 按照步骤5.1所述方法建立共培养体系以激活CAR Treg细胞。
    2. 48小时后，将每个96孔圆底培养板孔中的共培养物转移至含有2 mL预温的RPMI10培养基（含1,000 IU/mL IL-2）的24孔板孔中，以促进细胞扩增。
    3. 根据需要，加入新鲜预温的RPMI10培养基（含1,000 IU/mL IL-2），并将细胞分种至额外的24孔板中。
  2. 流式细胞术检测
    1. 将每份重复样品的内容物重悬并转移至15 mL或50 mL锥形管中，测定细胞浓度。
    2. 将每份重复样品中的5 × 105 至 1 × 106 个细胞转移至流式管中，于500 × g 离心5分钟。
    3. 使用转录因子染色缓冲液套装配制用于表面染色的流式抗体主混合液：每样本100 µL，包含DPBS、抗人CD4 PE/Cy7抗体（1:200）、抗人CD25 APC抗体（1:200）和Ghost活力染料BV510（1:2000）。如需要，可加入针对CAR报告蛋白的FITC标记抗体。
    4. 弃去步骤6.2.2中的上清液，轻轻涡旋沉淀细胞。向每根流式管中加入100 µL表面染色抗体主混合液，短暂涡旋后置于4 °C冰箱中避光孵育30分钟。
    5. 使用转录因子染色缓冲液套装，通过将3体积的固定/透化稀释液加入1体积的固定/透化浓缩液中配制固定/透化缓冲液。每份样本需使用100 µL固定/透化缓冲液。
    6. 用500 µL DPBS洗涤表面染色后的细胞，于500 × g 离心5分钟，弃去上清液。向每管中加入100 µL已配制的固定/透化缓冲液，短暂涡旋后于4 °C避光固定30-60分钟。
    7. 使用转录因子染色缓冲液套装，通过将9体积的去离子水加入1体积的10倍浓缩透化缓冲液中配制1×透化缓冲液。每份样本洗涤需1,000 µL透化缓冲液，胞内蛋白抗体染色需100 µL透化缓冲液。
    8. 加入500 µL 1×透化缓冲液洗涤固定/透化后的细胞，在室温下于500 × g 离心5分钟。
    9. 使用1×透化缓冲液配制胞内染色抗体主混合液，包含抗人FOXP3 eFluor 450抗体（1:50）、抗人HELIOS PE抗体（1:50）和抗人CTLA-4 PerCP-e710抗体（1:50）。每份样本需100 µL抗体主混合液。
      注：若CAR报告基因是GFP，或CAR报告蛋白（如EGFRt）使用FITC标记抗体进行染色，则该抗体组合适用。
    10. 弃去步骤6.2.8中的上清液，向每管中加入100 µL胞内染色抗体主混合液，短暂涡旋后于室温避光孵育30分钟。
    11. 加入500 µL 1×透化缓冲液洗涤染色后的固定/透化细胞，于500 × g 离心5分钟。弃去上清液，将细胞沉淀重悬于300 µL DPBS中，并置于冰上保存。
    12. 按照图5所示进行流式细胞术分析。预期结果为大多数CAR Treg细胞为FOXP3+HELIOS+细胞。使用CD4+ Tconv细胞作为FOXP3和HELIOS染色的阴性对照。

7. 人源 CAR Treg 抑制作用

  1. 应答T细胞（Tresp）细胞示踪染料染色及过夜激活
    1. 分别收集扩增后的CAR Treg细胞、新鲜分离的CD4+ Tconv细胞和新鲜分离的CD8+ T细胞至不同的15 mL圆锥形离心管中，若尚未去除抗CD3/CD28磁珠，则需进行去珠处理。
    2. 按照步骤5.1所述方法制备经照射的表达CAR抗原的靶细胞。
    3. 测定未激活T细胞和经照射靶细胞的浓度。
    4. 将5 × 106 CD4+ Tconv细胞与5 × 106 CD8+ T细胞（1:1比例）混合。这些即为在实验中由CAR Treg抑制的应答T细胞（Tresp）。在室温下以500 × g离心5分钟。小心吸除上清液，并将Tresp细胞重悬于1 mL DPBS中。
    5. 向含107 Tresp细胞的1 mL DPBS中加入1 mL用DMSO重悬的5 mM CellTrace Violet（CTV）染料，使终浓度为5 µM CTV。将细胞置于37 °C水浴中20分钟。在10分钟时轻轻涡旋混匀，以重新分布沉降的CTV染料。
    6. 用9 mL预温的RPMI10完全培养基洗涤细胞。以500 × g离心5分钟。将细胞重悬于5 mL预温的RPMI10完全培养基中。
    7. 测定CTV标记的Tresp细胞浓度。将200 µL RPMI10培养基中的5 × 104 CTV标记的未激活 Tresp细胞加入96孔圆底板的3–6个孔中，作为最小增殖对照。
    8. 在RPMI10培养基中，以1:10（磁珠:Tresp细胞）的比例，不添加IL-2，使用抗CD3/CD28磁珠激活CTV标记的Tresp细胞。每孔加入1 mL RPMI10培养基中的106 CTV标记Tresp细胞，置于组织培养箱中过夜。
    9. 同时，准备106 CAR+ Treg细胞。该数量足以覆盖四种CAR Treg:Tresp比例（1:1、1:2、1:4、1:8）的三复孔，每孔含5 × 104靶细胞，置于96孔圆底板中，计算如下：5 × 104 × 3 + 2.5 × 104 × 3 + 1.25 × 104 × 3 + 0.625 × 104 × 3 = 2.81 × 105 CAR Treg细胞，涵盖两种CAR Treg激活条件：经照射的CAR抗原阴性靶细胞（阴性对照，无激活）和经照射的CAR抗原阳性靶细胞（实验组，CAR激活）。
    10. 在两个独立的15 mL圆锥形离心管中，分别将3 × 105 CAR Treg细胞与3 × 105经照射的CAR抗原阴性细胞（1:1比例）混合，以及将3 × 105 CAR Treg细胞与3 × 105经照射的CAR抗原阳性靶细胞（1:1比例）混合，在室温下以500 × g离心5分钟。小心吸除上清液。
    11. 将步骤7.1.10中每管的沉淀物重悬于600 µL预温的RPMI10培养基中。每管可获得用于1:1 Treg:Tresp三复孔的200 µL细胞悬液。在96孔圆底板中进行连续稀释，步骤如下：
      1. 从已制备的600 µL Treg + 靶细胞悬液中，用移液器将200 µL细胞悬液分别加入三个1:1比例的孔中。
      2. 向空置的1:2、1:4和1:8比例的每个孔中加入100 µL预温的RPMI10完全培养基。
      3. 对每个三复孔，从1:1孔中吸取100 µL细胞悬液加入对应的1:2比例孔中。
      4. 对每个三复孔，从1:2孔中吸取100 µL细胞悬液加入对应的1:4比例孔中。
      5. 对每个三复孔，从1:4孔中吸取100 µL细胞悬液加入对应的1:8比例孔中。
      6. 将1:8比例孔中剩余的100 µL细胞悬液移入废液容器。
        注：每个孔应含有100 µL细胞悬液，其中分别含5 × 104（1:1）、2.5 × 104（1:2）、1.25 × 104（1:4）或0.625 × 104（1:8）个CAR Treg细胞，以及等量的经照射靶细胞。
  2. CAR Treg与Tresp细胞共孵育
    1. 激活后16–18小时，将24孔板中的激活Tresp细胞收集至离心管中，并通过磁铁去除抗CD3/CD28磁珠。
    2. 测定去珠后CTV标记的Tresp细胞数量。
    3. 洗涤细胞，并将2 × 106 Tresp细胞在500 × g下离心5分钟。小心吸除上清液，将细胞重悬于4 mL RPMI10完全培养基中。
    4. 向含CAR Treg的各孔中加入100 µL T细胞悬液（含5 × 104 T细胞），同时向3–6个仅含100 µL RPMI10培养基的孔中加入相同体积的细胞悬液，作为最大增殖对照。将板置于37 °C、5% CO2的组织培养箱中孵育72小时。
      注：此时96孔圆底板包含3–6个仅含未激活Tresp细胞的孔（最小增殖对照）、3–6个仅含激活Tresp细胞的孔（最大增殖对照），以及含递减数量CAR Treg的激活Tresp细胞孔。
  3. 流式细胞术检测
    1. 将每个96孔圆底板孔中的内容物重悬并转移至标记好的FACS管中。若使用具备板读模式的流式细胞仪，也可转移至96孔V底板中。以500 × g离心5分钟。
    2. 同时，准备抗体主混合液：DPBS中含抗人CD4 PE/Cy7（1:200）和抗人CD8 PerCP（1:200）。每份样品需100 µL抗体主混合液。
    3. 轻轻涡旋细胞沉淀。向每根FACS管中加入100 µL抗体主混合液。短暂涡旋后，在4 °C避光孵育30分钟。
    4. 用500 µL DPBS洗涤一次。若使用96孔V底板，则用100 µL DPBS洗涤两次。以500 × g离心5分钟。倾去上清液，将细胞沉淀重悬于200 µL DPBS中，置于冰上避光保存。
    5. 按图6所示进行流式细胞术分析。预期结果为：仅含未激活Tresp细胞的样本（最小增殖）显示单一高CTV荧光峰；仅含激活Tresp细胞的样本显示多个CTV强度峰，每个峰对应一次细胞分裂（最大增殖）；而在激活CAR Treg存在下，激活的CD4+和CD8+ T细胞的CTV峰数量和高度减少，即增殖受到抑制。
    6. 按以下公式计算Treg细胞介导的抑制率：
      细胞增殖分析中的抑制率计算公式；免疫学研究中使用的公式。
      注：若使用FlowJo软件，也可通过细胞增殖建模计算每份样品的分裂指数（DI），并用DI替代上述公式中的增殖细胞百分比来计算抑制率。

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

结果

本文所述方案提供了一种简化且标准化的流程，用于评估人调节性T细胞（Tregs）中的新型嵌合抗原受体（CAR）结构，旨在开发用于自身免疫病、移植物抗宿主病、器官移植排斥反应及过敏等疾病的活体治疗手段。 图1 展示我们如何利用FACS从外周血中获得高纯度的人类Treg细胞图1A），通过检测其Treg谱系转录因子FOXP3和HELIOS的高水平表达来评估 离体 扩增（图1B).

我们介绍了两种在人调节性T细胞（Tregs）中进行基因修饰的方法：慢病毒转导（图2）和CRISPR/Cas9介导的基因敲入（图3），两种方法均具有较高的效率。我们委托第三方合成慢病毒骨架载体，并进行慢病毒的生产与滴定，随后将病毒运送至本实验室，并在-80 °C保存直至使用。然而，也可通过在HEK293...

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

讨论

本方案提供了一种简化的综合性方法，用于生成和评估人源嵌合抗原受体调节性T细胞（CAR Tregs）。CAR技术在治疗血液系统恶性肿瘤方面取得的成功，推动了其在具有免疫抑制功能的T细胞亚群——调节性T细胞（Tregs）中的应用。与传统的T细胞不同，Tregs能够抑制免疫反应，因此在治疗由异常免疫应答引起的疾病方面具有潜在价值，例如自身免疫病、器官移植排斥反应、移植物抗宿主病以及过敏反应。9利用CAR Treg可实现抗原特异性治疗，有望避免广谱免疫抑制剂相关的副作用11. 这里我们描述 体外 验证CAR工程化Treg细胞谱系稳定性和功能的方案。尽管本文未予讨论，免疫缺陷型NSG小鼠为测试人源CAR Treg细胞功能提供了可能 体内 在移植物抗宿主病和器官移植模型中13,14在向人类应用之前的一个重要步骤。

本方案中的关键步骤是使用连续的磁珠...

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

披露

LMRF 是发明人，已从工程化免疫细胞相关专利中获得专利使用费，并为 Guidepoint Global 和 McKesson 提供咨询服务。其余作者声明不存在利益冲突。

致谢

LMRF 由人类胰岛研究网络（HIRN）1型糖尿病新兴领袖资助项目 U24DK104162-07、美国癌症协会（ACS）机构研究资助项目 IRG-19-137-20、南卡罗来纳临床与转化研究（SCTR）试点项目探索资助 1TL1TR001451-01、糖尿病研究连接（DRC）资助项目 IPF 22-1224 以及 Swim Across America 资助项目 23-1579 提供资金支持。RWC 得到细胞、生物化学与分子科学培训资助项目 T32GM132055 以及霍林斯癌症中心 Lowvelo 研究生奖学金的支持。本研究部分由南卡罗来纳医科大学霍林斯癌症中心流式细胞术与细胞分选共享资源（P30 CA138313）提供支持。特别感谢加州大学旧金山分校（UCSF）的 Qizhi Tang 博士慷慨赠送 CAR 突变体质粒。

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
腺相关病毒 (AAV)Charles River Laboratories
表达CAR靶标的K562细胞例如，CD19-K562
铯-137辐照仪
抗人CD8 PerCP（克隆SK1）Biolegend344708
抗人CD4 PE/Cy7（克隆SK3）Biolegend344612
DynaMag-15磁力架ThermoFisher12301D
Ghost BV510活率染料 TONBO13-0870-T100
K562细胞美国模式培养物集存库CCL-243
0.5 M EDTA，pH 8.0Gibco 15575020
1 M HEPESGibco15630080
氯化铵溶液STEMCELL Technologies7850
抗人CD127 PE（克隆hIL-7R-M21）BD Biosciences557938
抗人CD25 APC（克隆BC96）Biolegend 302610
抗人CD4 FITC（克隆SK3）Biolegend 344604
抗人CD71 PE（克隆SK1）Biolegend334106
抗人CD8 PerCP（克隆SK1）Biolegend 344707
抗人CTLA-4 PerCP-e710ThermoFisher46-1529-42
抗人EGFR APC（克隆AY13）Biolegend352905
抗人FOXP3 eFluor 450ThermoFisher48-4776-42
抗人HELIOS PEBiolegend137216
无Ca2+和Mg2+的杜氏磷酸盐缓冲液（DPBS）’ Gibco14190144
细胞计数仪（TC20全自动细胞计数仪）Bio-Rad1450102
细胞计数载玻片Bio-Rad1450016
CellTrace Violet细胞增殖检测试剂盒ThermoFisherC34571
DNA LoBind离心管Eppendorf22431021
Easy 50 EasySep磁力架 STEMCELL Technologies18002
EasySep人CD4+ T细胞富集试剂盒STEMCELL Technologies19052
EasySep人CD8+ T细胞富集试剂盒STEMCELL Technologies19053
EasySep磁力架 STEMCELL Technologies18000
eBioscience Foxp3转录因子染色缓冲液套装ThermoFisher00-5523-00
带滤网螺帽的Falcon圆底聚苯乙烯试管，5 mLFisher Scientific08-771-2340μm
胎牛血清（FBS）Gibco26140079
流式细胞仪Beckman CoulterCytoFLEX LX U3-V5-B3-Y5-R3-I2
荧光激活细胞分选仪BD BiosciencesFACS Aria III细胞分选仪
GlutaMAXGibco35050061
人CD3/28 T细胞扩增与激活DynabeadsGibco11131D
Invitrogen Neon转染系统ThermoFisher10431915
Invitrogen Neon转染系统100 μL试剂盒ThermoFisher10114334
慢病毒VectorBuilder
MEM非必需氨基酸溶液 Gibco11140050
Myc标签抗体A647（克隆9B11）Cell Signaling Technologies2233S
Opti-MEM I减血清培养基ThermoFisher31985062
青霉素-链霉素溶液Gibco15140122
重组人白细胞介素-2（rhIL-2）Peprotech200-02
RPMI 1640培养基，不含谷氨酰胺 Gibco11875093
丙酮酸钠Gibco11360070
光谱流式细胞仪CytekNorthern Lights
TRAC gRNASynthego序列（CAGGGTTCTGGATATCTGT）
TrueCut Cas9蛋白v2ThermoFisherA36496
台盼蓝溶液 Sigma T8154-100ML
1/10 LeukopakSTEMCELL Technologies200-009210-20亿PBMC

参考文献

  1. Zhang, X., Zhu, L., Zhang, H., Chen, S., Xiao, Y. CAR-T cell therapy in hematological malignancies: current opportunities and challenges. Front Immunol. 13, 927153(2022).
  2. Cappell, K. M., Kochenderfer, J. N. Long-term outcomes following CAR T cell therapy: what we know so far. Nat Rev Clin Oncol. 20 (6), 359-371 (2023).
  3. Choi, B. D., et al. Intraventricular CARv3-TEAM-E T cells in recurrent glioblastoma. N Engl J Med. 390 (14), 1290-1298 (2024).
  4. Brown, C. E., et al. Locoregional delivery of IL-13Ralpha2-targeting CAR-T cells in recurrent high-grade glioma: a phase 1 trial. Nat Med. 30 (4), 1001-1012 (2024).
  5. Bagley, S. J., et al. Intrathecal bivalent CAR T cells targeting EGFR and IL13Ralpha2 in recurrent glioblastoma: phase 1 trial interim results. Nat Med. 30 (5), 1320-1329 (2024).
  6. Ghobadinezhad, F., et al. The emerging role of regulatory cell-based therapy in autoimmune disease. Front Immunol. 13, 1075813(2022).
  7. Sakaguchi, S., Yamaguchi, T., Nomura, T., Ono, M. Regulatory T cells and immune tolerance. Cell. 133 (5), 775-787 (2008).
  8. Sakaguchi, S., et al. Regulatory T cells and human disease. Annu Rev Immunol. 38, 541-566 (2020).
  9. Ferreira, L. M. R., Muller, Y. D., Bluestone, J. A., Tang, Q. Next-generation regulatory T cell therapy. Nat Rev Drug Discov. 18 (10), 749-769 (2019).
  10. Rosenblum, M. D., Gratz, I. K., Paw, J. S., Abbas, A. K. Treating human autoimmunity: current practice and future prospects. Sci Transl Med. 4 (125), 125sr121(2012).
  11. Sawitzki, B., et al. Regulatory cell therapy in kidney transplantation (The ONE Study): a harmonised design and analysis of seven non-randomised, single-arm, phase 1/2A trials. Lancet. 395 (10237), 1627-1639 (2020).
  12. Spanier, J. A., et al. Tregs with an MHC class II peptide-specific chimeric antigen receptor prevent autoimmune diabetes in mice. J Clin Invest. 133 (18), e168601(2023).
  13. Muller, Y. D., et al. Precision engineering of an anti-HLA-A2 chimeric antigen receptor in regulatory T cells for transplant immune tolerance. Front Immunol. 12, 686439(2021).
  14. MacDonald, K. G., et al. Alloantigen-specific regulatory T cells generated with a chimeric antigen receptor. J Clin Invest. 126 (4), 1413-1424 (2016).
  15. Boardman, D. A., et al. Flagellin-specific human CAR Tregs for immune regulation in IBD. J Autoimmun. 134, 102961(2023).
  16. Schreeb, K., et al. Study design: human leukocyte antigen Cclass I molecule A(*)02-chimeric antigen receptor regulatory T cells in renal transplantation. Kidney Int Rep. 7 (6), 1258-1267 (2022).
  17. Zimmerman, C. M., Robino, R. A., Cochrane, R. W., Dominguez, M. D., Ferreira, L. M. R. Redirecting human conventional and regulatory T cells using chimeric antigen receptors. Methods Mol Biol. 2748, 201-241 (2024).
  18. Tang, Q., et al. Selective decrease of donor-reactive T(regs) after liver transplantation limits T(reg) therapy for promoting allograft tolerance in humans. Sci Transl Med. 14 (669), eabo2628(2022).
  19. Bender, C., et al. A phase 2 randomized trial with autologous polyclonal expanded regulatory T cells in children with new-onset type 1 diabetes. Sci Transl Med. 16 (746), eadn2404(2024).
  20. Ferreira, L. M. Conference report: Advanced Therapies Week 2023. Regen Med. 18 (4), 297-299 (2023).
  21. Cochrane, R. W., et al. How to test human CAR T cells in solid tumors, the next frontier of CAR T cell therapy. Methods Mol Biol. 2748, 243-265 (2024).
  22. Roy, A., Krzykwa, E., Lemieux, R., Neron, S. Increased efficiency of gamma-irradiated versus mitomycin C-treated feeder cells for the expansion of normal human cells in long-term cultures. J Hematother Stem Cell Res. 10 (6), 873-880 (2001).
  23. Eyquem, J., et al. Targeting a CAR to the TRAC locus with CRISPR/Cas9 enhances tumour rejection. Nature. 543 (7643), 113-117 (2017).
  24. Negrini, M., Wang, G., Heuer, A., Bjorklund, T., Davidsson, M. AAV Production everywhere: a simple, fast, and reliable protocol for in-house AAV vector production based on chloroform extraction. Curr Protoc Neurosci. 93 (1), e103(2020).
  25. Velasco Cardenas, R. M., et al. Harnessing CD3 diversity to optimize CAR T cells. Nat Immunol. 24 (12), 2135-2149 (2023).
  26. Boomer, J. S., Green, J. M. An enigmatic tail of CD28 signaling. Cold Spring Harb Perspect Biol. 2 (8), a002436(2010).
  27. Suhoski, M. M., et al. Engineering artificial antigen-presenting cells to express a diverse array of co-stimulatory molecules. Mol Ther. 15 (5), 981-988 (2007).
  28. Fung, V. C. W., Rosado-Sanchez, I., Levings, M. K. Transduction of human T cell subsets with lentivirus. Methods Mol Biol. 2285, 227-254 (2021).
  29. Bailey-Bucktrout, S. L., et al. Self-antigen-driven activation induces instability of regulatory T cells during an inflammatory autoimmune response. Immunity. 39 (5), 949-962 (2013).
  30. Nakagawa, H., et al. Instability of Helios-deficient Tregs is associated with conversion to a T-effector phenotype and enhanced antitumor immunity. Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (22), 6248-6253 (2016).
  31. Dawson, N. A. J., et al. Functional effects of chimeric antigen receptor co-receptor signaling domains in human regulatory T cells. Sci Transl Med. 12 (557), eaaz3866(2020).
  32. Rana, J., et al. CAR- and TRuC-redirected regulatory T cells differ in capacity to control adaptive immunity to FVIII. Mol Ther. 29 (9), 2660-2676 (2021).
  33. Battaglia, M., Stabilini, A., Tresoldi, E. Expanding human T regulatory cells with the mTOR-inhibitor rapamycin. Methods Mol Biol. 821, 279-293 (2012).
  34. Brady, B. L., Steinel, N. C., Bassing, C. H. Antigen receptor allelic exclusion: an update and reappraisal. J Immunol. 185 (7), 3801-3808 (2010).
  35. Samarasinghe, S., et al. Functional characterization of alloreactive T cells identifies CD25 and CD71 as optimal targets for a clinically applicable allodepletion strategy. Blood. 115 (2), 396-407 (2010).
  36. Voss, K., et al. FOXP3 protects conventional human T cells from premature restimulation-induced cell death. Cell Mol Immunol. 18 (1), 194-205 (2021).
  37. Collison, L. W., Vignali, D. A. In vitro Treg suppression assays. Methods Mol Biol. 707, 21-37 (2011).

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

重印与许可

标签

CAR Treg细胞Treg细胞分离慢病毒转导CRISPR Cas9基因编辑腺相关病毒体外扩增流式细胞术免疫抑制
人源嵌合抗原受体调节性T细胞的制备
联系我们
向图书馆推荐

隐私政策

使用条款

政策

版权所有 © 2026 MyJoVE Corporation。保留所有权利。