来自头部固定小鼠脑干的急性单单位多电极记录

摘要

该协议描述了一种从头部固定小鼠的脑干获得 体内高密度单神经元记录的方法。这种方法用于测量全身麻醉前和全身麻醉期间腹外侧导水管周围灰质（在快速眼动 （REM） 睡眠期间不活跃的脑干区域）中神经元的动作电位放电。

摘要

基于硅多电极的记录在研究许多大脑区域动作电位的时间分辨率下的神经元活动方面越来越受欢迎。然而，使用多通道探针记录来自脑干等深尾结构的神经元活动仍然具有挑战性。一个重要的问题是找到避开大血管的探针插入轨迹，例如上矢状静脉窦和横静脉窦。损伤这些大静脉会导致大出血、底层脑组织损伤，甚至可能死亡。这种方法描述了通过将前坐标与倾斜方法耦合来靶向脑干结构，使记录探针能够穿透高风险血管结构下方的大脑。与严格的垂直方法相比，倾斜方法最大限度地提高了可以靶向的大脑区域的数量。使用这种策略，可以可重复且可靠地访问腹外侧导水管周围灰质 （vlPAG），一个与 REM 睡眠相关的脑干区域，以在七氟烷麻醉之前和期间在头部固定小鼠中获得单单元、多电极记录。以高时间分辨率记录 vlPAG 和周围细胞核中神经元活动的能力是推进对 REM 睡眠和麻醉之间关系的理解向前迈出的一步。

引言

基于硅多电极的记录越来越受欢迎，用于测量许多大脑区域的神经元活动，具有单动作电位分辨率 1,2,3,4。在过去十年中，高密度录制技术取得了长足的发展。目前的硅基记录电极可以容纳高通道数、光纤和皮层电图 （ECoG） 记录设备 ^5,6。此外，这些电极的慢性植入允许长期记录 ^7,8。

尽管最近的技术取得了进步，但用多通道探针靶向脑干等深部尾部结构仍然具有挑战性。当靶向脑干结构，如腹外侧导水管周围灰质 （vlPAG） 时，一个重大障碍是确定避开主要血管的探针轨迹，例如，矢状上静脉窦和横静脉窦。这些大静脉的损伤会导致大面积出血、底层脑组织损伤，甚至死亡 ^9,10。我们建议从前坐标以一定角度靶向脑干结构，使记录探针能够穿透此类高风险血管结构下方的大脑（见图 1）。与垂直方法相比，这种倾斜的方法最大限度地提高了可用于记录的大脑区域的数量。此外，在需要 ECoG 记录的实验环境中，倾斜的前入路为 ECoG 头戴式设备植入提供了更多的颅骨表面，因为用于探针插入的开颅手术窗口位于更靠前的位置^10,11。

确定负责麻醉诱导的 REM 睡眠变化的特定细胞群和回路仍然是麻醉研究的主要目标。因此，这里的目标是可重复且可靠地访问 vlPAG（与 REM 睡眠相关的脑干区域），以便在七氟烷麻醉之前和期间在头部固定小鼠中获得单单元、多电极记录^12,13。以前的研究使用清醒小鼠 vlPAG 的电生理局部场电位 （LFP） 测量来识别与麻醉相关的神经状态变化^14,15。然而，LFP 测量主要对记录区域内的突触活动敏感，而不是动作电位¹⁶。因此，对麻醉剂如何直接影响 vlPAG 神经元产生的神经活动模式的理解仍然有限。在这里，描述了一种从头部固定小鼠的脑干获得高密度单神经元记录的方法。这种方法也可以适用于记录来自其他各种深脑干和后脑干结构的单神经元活动。

方案

所有研究均已获得弗吉尼亚大学（弗吉尼亚州夏洛茨维尔）机构动物护理和使用委员会的批准。使用 5 只雄性 C57BL/6J 小鼠，年龄 3-7 个月，体重 25-30 g。此处使用的试剂和设备的详细信息列在 材料表中。

1. 头板和耳机植入

1. 通过将全氟烷氧基 （PFA） 涂层不锈钢线焊接到 3 针连接器接头上来制作 ECoG 耳机（图 2A）。
2. 基于鼠标立体定位图谱¹⁷ 确定插入坐标。使用勾股定理计算探针插入的角度和深度 - 特别是当文献中的信息很少时 - 是一个合理的起点（图 1）¹⁸。
   注意:最终，坐标将通过反复试验进行调整。为了靶向 vlPAG，在成年小鼠中使用以下坐标:前后 （AP） -3.6 mm，中外侧 （ML） +0.5 mm，背腹 （DV） -4 mm。探头以 20° 角 （AP） 插入。
3. 通过将小鼠置于诱导室（氧气中 1.5%-3% 异氟醚）来诱导全身麻醉。麻醉后，将鼠标放置在立体定位框架中，将动物的鼻子放在鼻锥中，并用头杆稳定头部。
4. 将眼药膏涂抹在眼睛上，以防止角膜损伤。使用温度控制系统将体温保持在 37 °C。
5. 在头皮上涂抹脱毛霜或剃毛，然后用聚维酮碘和 70% 酒精消毒。使用"仅尖端"无菌技术来保持无菌手术区域。
6. 进行脚趾捏合试验以检查麻醉深度。
7. 给予镇痛:卡洛芬 2.5 mg/kg，背部皮下注射。
8. 做一个 5 毫米的头皮切口，去除顶骨和枕骨上方的圆形皮肤斑块。用手术刀刀片刮擦脑膜，轻轻去除脑膜。
9. 使用手术刀刀片切割肌肉附件并露出顶骨和枕骨¹⁹.根据需要涂抹过氧化氢以控制出血并干燥颅骨表面。在干燥的颅骨上涂抹牙科粘接剂和树脂以实现牢固的粘合至关重要。
10. 首先，识别头骨²⁰ 上的前囟和 lambda 标志。然后，调整鼻锥位置以调平颅骨的前后位置，确保两个标志之间的高度差不超过 100 μm。
11. 为了平整颅骨的内侧位置，在前囟和 lambda 之间选择两个相对的点，每个点距离矢状缝合线 1 毫米，并检查它们的水平。如果它们之间的高度差超过 100 μm，则通过操纵头杆来调整颅骨的内侧-外侧位置。
12. 测量前囟和 lambda 之间的距离，并将其与 Franklin-Paxinos 立体定位图谱中报告的距离（通常为 4.2 毫米）进行比较¹⁷。使用测量距离和报告距离之间的差值按比例缩放 AP 坐标。用消毒过的铅笔在颅骨上标记开颅手术坐标。
    注意:如果测得的 bregma-lambda 距离相差 4.2 mm，则需要按比例缩放坐标。立体定向图谱中报告的所有 AP 坐标都对应于标准化的 bregma-lambda 距离。由于老鼠头骨的大小是可变的，因此相应地调整坐标非常重要。
13. 使用立体定向显微操作器，将头板直接放在 lambda 缝合线的顶部，并通过在头板上及其周围涂抹牙科粘接剂将其固定到颅骨上（图 3A、B）。至少等待 10 分钟让水泥干燥。
14. 为两个皮质电极（额叶和顶叶皮层）和一个将用作参考电极（小脑）钻钻孔（直径 0.5 毫米）。将涂层银丝电极的剥离端 （0.5 mm） 放入毛刺孔中，并使用紫外线光激活树脂固定。
15. 用牙科水泥完全覆盖涂有涂层的不锈钢丝，以免金属丝暴露在外。用牙科水泥覆盖头戴式设备的底部和侧面，使其牢固就位。确保头戴式设备固定到位后，前囟和 lambda 缝合线仍然可见（图 2B）。
16. 让小鼠恢复至少 7 天，每天检查动物和手术部位是否有任何异常情况。根据需要服用镇痛药（卡洛芬 2.5 mg/kg，SC）。

2. 硅探针的放置和记录

1. 让鼠标习惯于记录装置和头部固定（至少两天 1.5 小时）（图 2D）。
2. 记录当天，将小鼠置于麻醉室中（异氟醚 1.5%-3% 的氧气溶液）。
3. 将鼠标放置在立体定位框架中，按照 1.3 中的说明调整鼻锥和头杆。在整个立体定位手术中保持麻醉（异氟醚 1.5%-3% 的氧气）。进行脚趾捏合试验以检查麻醉深度。
4. 将眼药膏涂抹在眼睛上并保持足够的体温。
5. 识别前囟和 lambda，确保两个解剖标志之间的高度差不超过 100 μm。
6. 用无菌铅笔在颅骨上找到并标记计算出的坐标，然后在坐标周围创建 2 毫米 x 2 毫米开颅窗口的轮廓。
7. 进行脚趾捏试验以检查麻醉深度。
8. 使用高速钻头创建一个 2 毫米 x 2 毫米的开颅手术窗。涂抹 0.5-1 mL 生理盐水以防止脑表面干燥。使用注射器针头和细镊子去除硬脑膜。
   注意:注意主要血管（矢状窦上部、横窦）以避免出血过多（图 3）。
9. 使用高速钻头为硅探针的参比电极创建一个单独的毛刺孔，通常距离颅窗 ~1-2 毫米。
10. 使用附带的涂抹器在颅骨上涂抹 0.2 mL 低毒硅胶以完全密封开颅手术。
11. 让鼠标恢复约 1 小时。
12. 使用头板和螺钉将鼠标头固定在电生理记录装置上（图 2D）。
13. 用荧光染料 DiI（1:4 DiI:乙醇）涂覆硅探针柄，以便在实验后可以重建探针轨迹。
14. 将探针安装在操纵器上并设置所需的角度。为了靶向 vlPAG，应用 15-20° 的 AP 角。
15. 将记录探针降低到颅窗中心内的大脑表面。首先，手动将探针插入 ~300 μm 的深度。插入到此深度后，慢慢地将探针自动降低（例如，200 μm/min）至目标深度，以尽量减少组织损伤²¹ （图 2C）。
    注意:最初建议手动插入探头。手动探头插入可确保在探头初次插入时弯曲时能够停止和缩回探头。一旦探针完全穿透组织，通常可以安全地以自动模式继续下降探针。
16. 将矿物油涂抹在开颅窗口内的大脑表面，以防止干燥。
17. 插入后让记录探针静置 10 分钟。
18. 使用 Intan 记录控制器以 30kHz 记录来自硅探头和 ECoG 的数据。
19. 记录后 1-2 小时，使用经心灌注技术将大脑固定在 4% 多聚甲醛²² 中。
    注意:由于粘接物的存在，可能很难去除颅骨的喙部。这就是为什么最好通过切除颅骨的背侧部分来切除大脑。
20. 将鼠标斩首，沿着背侧的中线从脖子到下颌切开皮肤。去除附着在颅骨上的肌肉和组织，切掉下颌，以便更容易进入大脑。
21. 如果灌注正确完成，大脑应该会收缩一点，留下足够的空间在枕骨大孔的背侧插入细剪刀。在枕骨上做一个内侧切口，一个外侧和一个对侧切口，大小约为 1 毫米。
22. 使用眼科镊子小心地切除颅骨的背面。从枕骨开始，去除所有颅骨碎片，直到露出整个大脑的背侧。
23. 将微型刮刀滑到大脑下方，从嗅球开始，将大脑舀出。
24. 灌注并取出后，大脑可以在 4 °C 下在 4% 多聚甲醛中储存 24-48 小时。

3. 探针轨迹重建的组织学

1. 使用振动切片机将大脑切成 70 μm 冠状切片。
2. 使用对细胞核进行染色的 DAPI 封固剂将切片固定在载玻片上。盖上玻片并用透明指甲油密封载玻片。
3. 在荧光显微镜上对载玻片进行成像。调整对比度/亮度，使探头轨迹清晰可见。确保生成的 tiff 图像文件大小小于 10 MB，以便 MATLAB 代码顺利运行。使用 MATLAB 代码²³ 重建探针轨迹。

4. 电生理数据分析

1. 使用离线检测和自动分拣软件 （Kilosort） 分析来自硅探针的记录神经信号²⁴。
2. 使用 Phy 将检测到的集群手动分类为多单元或单单元²⁵.当簇具有生理尖峰波形形状、在交叉相关中显示不应期和振幅视图呈正态分布时，将簇分类为单个单元。
3. 将单个单位数据导入 MATLAB 并分析²³.

结果

五只雄性 C57BL/6J 植入了 ECoG 耳机和头板（图 4A）。恢复后，小鼠在不同日期的两次 1.5 小时的疗程中习惯于头部固定和电生理记录装置（图 4B）。接下来，创建一个 2 mm x 2 mm 开颅手术窗口（图 4C），并在鼠标清醒并头部固定的情况下插入硅探针（图 4D）。使用了两种类型的硅 UCLA 探针:（1） 64 M:单柄 64 电极探针;（2） 256 ANS:四柄 256 电极探针。使用固定在电生理装置上的鼻锥施用七氟烷和氧气。使用在线气体分析仪每 5 分钟监测一次氧和七氟烷的水平。经心灌注后，收获大脑（图 4E）并评估探针轨迹（图 4F）。然后将记录的动作电位整理成单个单位数据（图 4G）。

进行了 5 次记录，其中探针放置使用 MATLAB²³ 中开发的可用探针重建算法进行了验证。使用这些算法，硅探针的每个电极都定位到特定的大脑结构，从而获得探针在大脑中放置的三维视角（图 5）。这些重建算法与免疫组织化学标志物相结合，以进一步验证探针轨迹（图 6）。然后将数据与精选的单个单位匹配（图 7）。

共捕获 64 个单神经元，其中 13 个位于 vlPAG 中。其余 51 个神经元位于附近的细胞核: 中脑、中脑网状核、滑车旁核、楔状核、外背膜被盖核、臂旁核和小脑上蒂。每只小鼠中神经元的放电活动以热图表示（图 7）。小鼠 3 由于单单位记录质量差而被排除在分析之外。大多数记录的神经元在七氟烷麻醉期间减少了放电。

比较每只小鼠在 5 分钟基线 （即记录 10-15 分钟） 和七氟烷期间 5 分钟 （即记录 40-45 分钟） 的 vlPAG 神经元的平均放电。vlPAG 放电显着减少（图 8A），此外，这种增加在所有 vlPAG 神经元中是一致的（图 8B）。

图 1:计算探针插入的立体定位坐标。 左图:使用几何结构计算探针插入的倾斜方法。确定了直角三角形的以下组成部分:（a） 目标结构从大脑表面获得的 DV 深度（使用立体定向图谱获得），（b） 假设严格垂直下降的 AP 坐标与目标结构的 AP 坐标之间的距离。右图:使用 （a） 和 （b），可以使用勾股定理来计算探针插入的 AP 角度 （β） 和长度 （c）。以下坐标用于定位 vlPAG:（AP） -3.6 mm、（ML） +0.5 mm、（DV） -4 mm。使用了 20° 的 AP 角 （β）。 请单击此处查看此图的较大版本。

图 2:头板植入和单个单位记录。 （A） 植入过程中的 ECoG 耳机线放置。（B） ECoG 耳机和头板植入后小鼠头骨的俯视图。（C） 插入大脑的硅探针柄。（D） 硅探针记录期间的头部固定鼠标。 请单击此处查看此图的较大版本。

图 3:颅窗相对于主要血管的位置。 小鼠大脑表面脉管系统的示意图，带有上矢状窦和横窦标记。白色方块表示颅窗的位置，红点表示探针插入点。 请单击此处查看此图的较大版本。

图 4:实验设计。5 只雄性 C57BL/6J 小鼠植入 ECoG 头戴式设备和头板 （A）。康复后，他们习惯了头部固定和记录装置 （B）。接下来，进行开颅手术 （C） 并在鼠标清醒并处于头部固定位置的情况下插入硅探针。使用鼻锥 （D） 给予挥发性麻醉剂和氧气。记录后，收获大脑 （E） 并使用免疫组织化学技术进行分析，以重建探针的轨迹 （F）。然后将记录的动作电位整理成单个单位数据 （G）。 请单击此处查看此图的较大版本。

图 5:带有重建探针轨迹的大脑 3D 模型。 每条彩色直线代表一个探测轨迹。每个点都标记了冠状脑切片上可见的 DiI 染料的位置。为硅探针的每个柄重建探针轨迹。 请单击此处查看此图的较大版本。

图 6:vlPAG 内探针放置的事后重建。 用 DAPI（蓝色）染色的每只记录的小鼠 （1-5） 的代表性冠状脑切片，显示探针轨迹（（DiI，红色，用绿色箭头标记）和大脑区域的轮廓。比例尺:500 μm。小鼠 1-3 是用单柄硅探针（即 64 个通道）记录的，而鼠标 4 和 5 是用四柄硅探针（即 256 个通道）记录的。 请单击此处查看此图的较大版本。

图 7:七氟烷麻醉前和期间的分箱放电活动。 热图表示 64 个单个神经元在一分钟间隔内触发的动作电位数量。根据探针轨迹重建为单个神经元分配起源结构。白色虚线表示七氟烷给药开始，n = 4 只小鼠。 请单击此处查看此图的较大版本。

图 8:七氟烷麻醉期间 vlPAG 神经元的放电被消除。 （A） 每只小鼠在麻醉前和麻醉期间发射的动作电位的平均数量。（B） 每个 vlPAG 神经元触发的动作电位数 （B）。配对 t 学生检验，**P = 0.0036，P = 0.0053。请单击此处查看此图的较大版本。

图 9:不均匀的头板放置如何影响探针轨迹的示例。 （A） 头板在小鼠头部上的放置不均匀。（B，C） 具有渲染探针轨迹的 3D 小鼠大脑重建，其中由于头板在小鼠头部上的放置不均匀而导致无意的中外侧角。 请单击此处查看此图的较大版本。

讨论

脑干核介导呼吸、意识和睡眠等基本功能 26,27,28。脑干的位置（深部和后部）对使用标准技术研究其体内神经元活动提出了挑战。这里提出了一种倾斜的前入路，以允许在头部固定的小鼠中进行可重复的单单元记录。

小心插入多电极硅探针对于确保一致地靶向与 REM 睡眠相关的脑干结构，同时避免对主要血管造成损伤至关重要。需要相当程度的技巧、专注和耐心才能解决进入¹³ 的最佳坐标和轨迹。

由于探头轨迹倾斜且瞄准深部结构所需的距离，即使坐标和头板定位的微小不一致也可能导致错过目标结构。在头板植入过程中，前囟和 Lambda 必须处于同一水平线上，并且要精确测量它们之间的距离。值得注意的是，由于手术是在立体定位框架上进行的，并且记录是在单独的电生理装置上进行的，因此将头板固定在水平的颅骨上至关重要。引入额外的角度（即倾斜的头部）会增加出错的风险，这对于小而深的大脑结构来说尤其高（图 9）。

由于硅探针很脆弱，因此从大脑表面去除硬脑膜并确保没有骨碎片阻塞颅窗非常重要。去除硬脑膜后可能会出现轻微出血，因此清除开颅手术表面的凝结血液至关重要，这可能会导致探头弯曲。如果将硅探针插入大脑被证明是困难的（例如，探针弯曲），重要的是要检查是否有任何残留的硬脑膜或大脑表面是否已经干燥，因为当几乎没有液体时会形成一层薄膜。在人类²⁷ 中，靠近血管的区域硬脑膜较厚，在小鼠中也发现了类似的问题，在不破裂血管的情况下去除硬脑膜可能具有挑战性。虽然小心地去除硬脑膜通常可以顺利插入探针，但较大的插入角度可能会带来额外的困难。

记录的产量因动物而异，并且取决于许多变量。一个重要因素是目标结构中神经元的密度;神经元密度低的区域（例如，皮层）往往具有较低的记录的单个神经元产量。此外，组织损伤，例如脑表面下的血管破裂，可导致神经元死亡或损伤，进一步降低产量^21,29。记录的质量也很重要，因为更高质量的记录更容易区分单个神经元。脱靶探针轨迹也会导致产量降低。虽然是为 vlPAG 中的记录而开发的，但该协议可用于从脑干中的附近结构进行记录。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
1024 通道 RHD 记录控制器	Intan Technologies，美国加利福尼亚州洛杉矶	C3008	硅探针记录;记录硬件和软件
24 mm x 50 mm No. 1.5 VWR 盖玻片	VWR，美国宾夕法尼亚州拉德诺	48393-081	组织学
4% PFA PBS	ThermoFisher Scientific，美国马萨诸塞	J61899。AK	组织学;灌注液
C&B metabond	Patterson Dental，美国弗吉尼亚州里士满粉末	：5533559，快速基：5533492，催化剂：55335007	头板和耳机植入
C57/6J 小鼠 4-6 周，雄性	美国缅因州巴港 The Jackson Laboratory	000664
Capnomac Ultima	Datex	ULT-SVi-27-07	气体分析仪;已停产;替代气体分析仪可从 Bionet America 购买
CM-DiI	ThermoFisher Scientific，美国马萨诸塞州沃尔瑟姆	V22888	用于硅探针涂层的红色荧光染料
连接器接头	DigiKey，美国明尼苏达州锡夫里弗福尔斯	1212-1788-ND	ECoG 耳机
DAPI Fluoromount-G	SouthernBiotech，美国阿拉巴马州伯明翰	0100-20	组织学
iBOND 通用	帕特森牙科，弗吉尼亚州里士满，USA	044-1113	头板 &耳机植入;为了 将不锈钢丝固定到颅骨上
低毒硅胶粘剂	世界精密仪器公司，美国佛罗里达州萨拉索塔	KWIK-SIL	头板
微机械手系统	New Scale Technologies，美国纽约州维克多	多探针机械手：XYZ 载物台组件：06464-0000，MPM 系统套件：06267-3-0001，MPM-Platform-360，MPM 手动臂 MPM 环，MPM_Ring-72 度：06262-3-0000	硅探针记录;将探针插入大脑
Microprobes 加州	洛杉矶分校，美国加利福尼亚州洛杉矶	256 ANS，64M	已停产;替代硅探针可从 Neuropixels
购买 矿物油	Sigma Aldrich，圣路易斯，密苏里州，美国	M8410-100ML	硅探针记录;防止记录过程中组织干燥
生理盐水	ThermoFisher Scientific，美国马萨诸塞州沃尔瑟姆	Z1376	头板 &耳机植入;防止手术过程中大脑干燥
PFA 涂层不锈钢丝 - 直径 0.008 英寸 涂有条纹端	A-M 系统，美国华盛顿州 Sequim	791400	ECoG 耳机和 ECoG 参比电极
铂丝 24AWG	World Precision Instruments，美国佛罗里达州萨拉索塔	PTP201	用于硅探针记录的参比电极
Shandon Colorfrost Plus 显微镜载玻片	ThermoFisher Scientific，美国马萨诸塞州沃尔瑟姆	99-910-01	组织学
不锈钢 头板	Star Rapid，中国	定制零件	头板和耳机植入;可根据要求提供设计
立体定位仪	KOPF，Tujunga，美国加利福尼亚州	940 型小动物立体定位仪，带数字显示控制台	头板和耳机植入术