本方案描述了一种在固定头部的小鼠脑干中获取体内高密度单神经元记录的方法。该方法用于在全身麻醉前和麻醉期间，测量腹外侧导水管周围灰质（即快速眼动（REM）睡眠期间不活跃的脑干区域）神经元的动作电位发放。
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摘要
摘要
基于硅多电极的记录技术正日益广泛应用于研究多个脑区神经元活动，其时间分辨率可达到动作电位水平。然而，使用多通道探针记录脑干等深部尾侧结构的神经活动仍具挑战性。其中一个主要问题是寻找合适的探针插入路径，以避开上矢状窦和横窦等大型血管。损伤这些大静脉可能导致严重出血、下方脑组织受损，甚至引发死亡。本方法通过结合前部坐标与倾斜入路的方式精确定位脑干结构，使记录探针能够穿透高风险血管结构下方的脑组织。与严格的垂直入路相比，倾斜入路可最大化可靶向的脑区数量。采用该策略，可重复且可靠地进入与快速眼动（REM）睡眠相关的脑干区域——腹外侧导水管周围灰质（vlPAG），在固定头部的小鼠中获取单细胞单位及多电极记录数据，实验可在七氟烷麻醉前及麻醉期间进行。以高时间分辨率记录vlPAG及其周围核团神经元活动的能力，是深入理解REM睡眠与麻醉之间关系的重要进展。
引言
基于硅的多电极记录技术正日益普及，可用于在单个动作电位分辨率下测量多个脑区的神经元活动1,2,3,4。在过去十年中，高密度记录技术取得了显著发展。目前基于硅的记录电极可集成大量通道、光纤以及皮层脑电图（ECoG）记录装置5,6。此外，这些电极的慢性植入可实现长期记录7,8。
尽管近年来技术不断进步，使用多通道探针靶向脑干等深部尾侧结构仍然具有挑战性。当靶向腹外侧导水管周围灰质（vlPAG）等脑干结构时，一个主要障碍是确定一条能够避开主要血管（例如上矢状窦和横窦）的探针路径。损伤这些大静脉可能导致大量出血、下方脑组织受损，甚至死亡9,10。我们建议从前方坐标以一定角度靶向脑干结构，使记录探针能够穿过这些高风险血管结构下方进入脑组织（见图....
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方案
所有研究均经弗吉尼亚大学（弗吉尼亚州夏洛茨维尔）机构动物护理和使用委员会批准。实验使用了5只雄性C57BL/6J 小鼠，年龄为3-7个月，体重25-30 g 。所用试剂和设备的详细信息列于材料表中。
1. 头部固定板和头戴装置的植入
- 通过将全氟烷氧基（PFA）包被的不锈钢丝焊接到3针连接器插头上，制作一个ECoG头戴装置（图2A）。
- 根据小鼠立体定位图谱确定插入坐标17。当文献中相关信息较少时，使用勾股定理计算探针插入的角度和深度是一个合理的起点（图1）18。
注意：最终坐标需通过反复试验进行调整。为靶向vlPAG，在成年小鼠中使用的坐标如下：前后向（AP）-3.6 mm，内外侧（ML）+0.5 mm，背腹向（DV）-4 mm。探针以20°角（AP方向）插入。 - 将小鼠置于诱导室中，使用1.5%-3%异氟烷与氧气混合气体诱导全身麻醉。麻醉后，将小鼠固定于立体定位仪框架中，鼻部置于鼻罩内，并用头夹固定头部。
- 在眼睛上涂抹眼用软膏以防止角膜损伤。使用温控系统将体温维持在37 °C。
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结果
五只雄性C57BL/6J小鼠植入了ECoG耳机和头固定板（图4A）。术后恢复后，小鼠在两天内分别进行两次、每次1.5小时的头部固定适应训练，并熟悉电生理记录装置（图4B）。随后，在小鼠清醒且头部固定的状态下，制作一个2 mm × 2 mm的颅骨开窗（图4C），并插入硅探针（图4D）。实验中使用了两种类型的UCLA硅探针：（1）64 M：单束、64通道电极探针；（2）256 ANS：四束、256通道电极探针。通过固定在电生理记录装置上的鼻罩给予七氟烷和氧气，每5分钟使用串联气体分析仪监测一次氧气和七氟烷浓度。经心脏灌注后取出脑组织（图4E），并评估探针轨迹（图4F）。随后将记录到的动作电位整理为单细胞单位数据（图4G）。
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讨论
脑干核团介导呼吸、意识和睡眠等基本功能26,27,28脑干的位置（深部且靠后）为其神经元活动的研究带来了挑战 体内 采用标准技术。本文介绍一种倾斜的前部入路，可在头部固定的的小鼠中实现可重复的单单位记录。
精确插入多电极硅探针对于稳定靶向与快速眼动睡眠相关的脑干结构至关重要，同时需避免损伤主要血管。确定最佳的植入坐标和路径需要相当高的技巧、专注力和耐心13。
由于探针轨迹呈一定角度，且需要较长距离才能到达深层结构，即使坐标和颅骨固定板位置存在微小偏差，也很可能导致无法命中目标结构。在植入颅骨固定板时，必须确保前囟（Bregma）和后囟（Lambda）处于同一水平面，并精确测量二者之间的距离。值得注意的是，由于手术是在立体定位仪上进行，而记录则在独立的电生理装置上完成，因此必须将.......
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披露
作者声明，本研究不存在任何竞争性财务利益或其他利益冲突。
致谢
图1、图3、图4、图8 和 图9 使用 BioRender.com 制作。我们感谢 Scott Kilianski 在 MATLAB 代码方面的帮助以及分享他的脚本。感谢 Anna Grace Carns 在探针轨迹重建方面的协助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 1024通道RHD记录控制器 | 美国加利福尼亚州洛杉矶市 Intan Technologies 公司 | C3008 | 硅探针记录；记录硬件与软件 |
| 24 mm × 50 mm No. 1.5 VWR 盖玻片 | VWR，美国宾夕法尼亚州拉德诺 | 48393-081 | 组织学 |
| PBS 中的 4% PFA | 美国马萨诸塞州沃尔瑟姆，赛默飞世尔科技公司 | J61899.AK | 组织学；灌注液 |
| C&B metabond | 美国弗吉尼亚州里士满，Patterson Dental公司 | 粉末：5533559，快固基质：5533492，催化剂：55335007 | 头板 &耳蜗植入物植入术 |
| 4-6周龄雄性C57/6J小鼠 | 美国缅因州巴港杰克逊实验室 | 000664 | |
| Capnomac Ultima | Datex，芬兰赫尔辛基 | ULT-SVi-27-07 | 气体分析仪；已停产；可从 Bionet America 购买替代气体分析仪 |
| CM-DiI | 美国马萨诸塞州沃尔瑟姆赛默飞世尔科技公司 | V22888 | 用于硅探针包被的红色荧光染料 |
| 连接器接头 | DigiKey，美国明尼苏达州索尔特河福尔斯 | 1212-1788-ND | ECoG 头戴装置 |
| DAPI Fluoromount-G | SouthernBiotech，美国阿拉巴马州伯明翰 | 0100-20 | 组织学 |
| iBOND Universal | 美国弗吉尼亚州里士满，Patterson Dental公司 | 044-1113 | 头板 &耳蜗植入；耳机植入；用于 将不锈钢丝固定在颅骨上 |
| 低毒性硅胶粘合剂 | 美国佛罗里达州萨拉索塔，世界精密仪器公司 | KWIK-SIL | 头板 |
| 显微操作仪系统 | New Scale Technologies，维多利亚，纽约州，美国 | 多探针操作器：XYZ 载物台组件：06464-0000，MPM 系统套件：06267-3-0001，MPM-Platform-360，MPM 手动臂用 MPM 环形支架，MPM_Ring-72 DEG：06262-3-0000 | 硅探针记录；将探针插入大脑 |
| 微电极 | 美国加利福尼亚州洛杉矶市，加州大学洛杉矶分校 | 256 个自主神经系统，64 兆 | 已停产；可从 Neuropixels 购买替代的硅探针 |
| 矿物油 | Sigma Aldrich，美国密苏里州圣路易斯 | M8410-100ML | 硅探针记录；防止记录过程中组织干燥 |
| 生理盐水 | 美国马萨诸塞州沃尔瑟姆赛默飞世尔科技公司 | Z1376 | 头板 &&耳机植入；防止手术过程中脑组织干燥 |
| PFA涂层不锈钢丝 - 直径0.008英寸，两端带条纹涂层 | A-M 系统公司，美国华盛顿州瑟quam | 791400 | ECoG 头戴装置 &用于ECoG的放大器和参比电极 |
| 铂丝 24AWG | 美国佛罗里达州萨拉索塔，世界精密仪器公司 | PTP201 | 用于硅探针记录的参考电极 |
| Shandon Colorfrost Plus 显微镜载玻片 | 美国马萨诸塞州沃尔瑟姆赛默飞世尔科技公司 | 99-910-01 | 组织学 |
| 不锈钢头板 | 中国深圳速星科技有限公司 | 定制部件 | 头板 &耳蜗植入体与耳机植入；设计可应要求提供 |
| 立体定位仪 | KOPF，美国加利福尼亚州图洪加 | Model 940 小动物立体定位仪，配备数字显示控制台 | 头板 &耳蜗植入与耳机植入 |
参考文献
- Wu, F., et al. Monolithically integrated µLEDs on silicon neural probes for high-resolution optogenetic studies in behaving animals. Neuron. 88 (6), 1136-1148 (2015).
- Hong, G., Lieber, C. M. Novel electrode technologies for neural recordin....
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