本研究强调了采用Jeffrey和Humphrey所开发的方法从微藻中提取和定量脂溶性色素的优势。该方法是评估生长因素对这些生物体中叶绿素产生及细胞含量影响的重要工具。
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摘要
摘要
微藻包含两类主要色素：叶绿素和类胡萝卜素。叶绿素是一种绿色色素，能够吸收光能并将其转化为化学能，从而促进有机化合物的合成。由于具有较强的抗氧化性和着色能力，该色素在食品、制药和化妆品工业中可作为重要的生物技术原料。本研究旨在通过采用Taguchi L4正交实验设计，评估生长因子（CO2浓度、光色和光强）对Chlorella sorokiniana细胞生长以及叶绿素a和b细胞内含量的影响，并进一步利用雨生红球藻（Haematococcus pluvialis）微藻作为额外的研究模型对方法进行验证。细胞生长通过在550 nm波长下测定光密度的分光光度法进行定量。对于叶绿素的定量，首先使用90%纯度的丙酮溶液提取细胞内容物，随后根据Jeffrey和Humphrey所述方法，在647 nm和664 nm波长下采用分光光度法测定叶绿素a和b的浓度。实验结果表明，控制低浓度CO2添加、紫光照射及低光强条件，可同时促进细胞生长并提高细胞内叶绿素a和b的含量。该叶绿素定量方法的实施可实现快速、简便且精确的叶绿素含量测定，所用波长恰好位于两类叶绿素的吸收峰处，因此该技术易于在任何研究中的微藻样本上重复应用。
引言
近年来，人类活动引发的环境问题日益加剧，对生态系统的健康与平衡造成了不利影响，这促使人们寻求更高效且环境友好的生产系统。这一需求加速了工业领域的相关进程，并推动了生物修复技术的应用以及用于减轻这些有害影响的生物化合物的开发1。
这一背景推动了微藻研究的显著发展，其驱动力在于需要寻找应对当前环境与经济挑战的创新解决方案。微藻在水生环境中生长旺盛，分别利用阳光和二氧化碳作为能量和碳源。这一特性使其成为生产多种高价值产品的可持续且极具前景的替代途径。该领域的研究主要集中在深入了解这些细胞的生理学与代谢机制，以及开发高效的培养与加工技术2。
迫切需要开发易于使用且可靠的工具来研究微藻，以加快研究进程并加深对其生理学、代谢过程及潜在应用的理解。这些工具应能够快速分析环境因素和生产条件对关键参数的影响，例如叶绿素浓度，这是反映这些生物体健康状况和发育程度的基本指标。叶绿素含量的降低可能表明存在环境胁迫、营养缺乏或疾病。
这些绿色色素在光合作用中发挥着关键作用，能够捕获太阳光能，将二氧化碳和水转化为葡萄糖和氧气，占微藻生物量的0.5%至5%3。除了在维持生命过程中具有重要作用外，叶绿素还在多个行业中得到应用。叶绿素提取物被用于食品和饮料加工中作为天然着色剂，为产品赋予鲜艳的绿色，同时提供抗氧化特性。此外，基于叶绿素的膳食补充剂因其宣称的解毒和抗炎功效，在健康与保健领域日益受到青睐。通过利用叶绿素的多种特性，各行业可开发出既提升视觉吸引力又促进消费者健康的创新产品1。
在这一领域中，一种具有重要生物技术价值的微藻是C. sorokiniana。该微生物因其快速的生长速率而备受关注，在生物量生产方面具有很高的效率。此外，C. sorokiniana含有多种高营养价值的化合物，包括蛋白质、脂质和维生素，使其在食品、饲料和生物燃料生产等多个应用领域中具有重要价值2。而且，已发现这种微藻能够产生具有多种功能的胞外酶，为废水处理、生物修复以及制药等生物技术应用提供了新的可能性4。除了生长迅速和应用广泛之外，C. sorokiniana在叶绿素生产方面也表现出显著潜力。作为一种光合微生物，C. sorokiniana具备合成叶绿素所必需的代谢机制，叶绿素可占微藻生物量的0.5%至5%3。这一特性使C. sorokiniana成为实现规模化叶绿素生产的理想候选者，并有望为当前紧迫的环境与营养挑战提供可持续的解决方案5。
另一方面，另一种备受关注的微藻物种是 H. pluvialis。这种微藻以其产生虾青素的能力而闻名，虾青素是一种具有多种工业应用的强效抗氧化色素。虾青素可作为 H. pluvialis 光合系统的保护机制，使其免受环境因素引起的氧化应激损伤。由于其抗氧化特性及潜在的健康益处，该色素在化妆品、营养补充剂和水产养殖行业中备受青睐。凭借其高效的虾青素生产能力，H. pluvialis 为开发满足多种工业和消费者需求的创新产品提供了广阔前景6。
最近的研究还强调了H. pluvialis1在叶绿素生产方面的潜力，进一步提升了其工业价值。例如，一项研究考察了在不同生长条件下H. pluvialis的叶绿素含量，发现当培养参数处于最佳状态时，H. pluvialis表现出显著的叶绿素生成速率，超过其他微藻物种7。该发现凸显了H. pluvialis作为可持续叶绿素来源的潜力，为其在多个工业领域的应用提供了新的机遇。
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方案
1. 培养基制备与接种物制备
- 制备1 L的3N-BBM+ V(CCAP)培养基（大量营养素：NaNO3 [0.75 g L-1]，CaCl2 [0.019 g L-1]，MgSO4 [0.019 g L-1]，K2HPO4 [0.057 g L-1]，NaCl [0.025 g L-1]，KH2PO4 [0.175 g L-1]；微量营养素：Na2 EDTA [0.0186 g L-1]，FeCl3 [0.0024 g L-1]，MnCl2 [0.001 g L-1]，ZnCl2 [1.25 × 10-4 g L-1]，CoCl2 [5 × 10-5 g L-1]，Na2MoO4 [9.98 × 10-5 g L-1])8，并在121 °C、1.5 psi条件下灭菌15分钟。
- 将约1 L培养基接种至锥形瓶中，微藻C. sorokiniana的接种浓度约为3 × 106 个细胞 mL-1；或向培养基中加入5%至10%（v/v）的接种物。
注意：为保持无菌条件，建议使用超净工作台、手套、实验服和口罩。 - 将接种后的锥形瓶置于红光光源下培养，光照强度约为3,600至4,200 lux，温度控制在22–26 °C之间，C. sorokiniana采用12小时光照/12小时黑暗的光周期，H. pluvialis采用16小时光照/8小时黑暗的光周期，每天手动振荡一次，两种菌株均培养约7天。
注意：C. sorokiniana需在生长条件下维持至少7–10天（直至呈现深绿色），H. pluvialis则需10–12天。为获得用于动力学实验的微藻浓缩接种物，需去除藻体产生的上清培养基。 - 在无菌环境下，将约10 mL接种培养基加入无菌的15 mL锥形离心管中，在25–30 °C条件下以3,000 × g离心20分钟。
- 在无菌条件下，使用移液器或倾倒法去除上清液，并将生物质浓缩至无菌的50 mL锥形离心管中。
- 根据需要重复此过程，直至获得动力学实验所需的接种物体积。
- 测定接种物在550 nm处的光密度（OD550 nm），以确定微藻的细胞浓度，并将其储存于3–4 °C，待用。
注意：最初通过直接细胞计数建立细胞浓度与吸光度之间的相关性。计数完成后，接种物可在冷藏条件下保存不超过4天。
2. 生长动力学研究
- 制备适用于每项实验所需体积的3N-BBM+ V(CCAP)（光生物反应器级别测试需8 L） C. sorokiniana 以及用于烧瓶级别测试的0.5 L H. pluvialis按照标准实验室操作规程进行，确保充分灭菌。
- 对于光生物反应器和烧瓶，将光源设置为所需的颜色光谱（蓝色为460 nm，紫色为460 nm与630 nm的混合光） C. sorokiniana 630 nm 处为红色 H. pluvialis）；覆盖两个系统以避免外界光线干扰。
注意：由于每个发光二极管发射的波长存在差异，需使用光谱辐射计对光源进行光谱辐射测量，以确定每个二极管的波长和辐射功率9通过组合红色和蓝色LED获得紫光，波长为460 nm，发射功率为1.65 W/nm-1 对于蓝光LED和发射功率为0.6 W/nm的630 nm光-1 用于红光LED。这些测量数据被用于仅在蓝光和红光条件下进行的实验。 - 将定时器设置为在12小时光照和12小时黑暗周期之间交替 C. sorokiniana 16小时光照和8小时黑暗循环 H. pluvialis.
- 连接CO₂培养箱2 将通气系统连接至光生物反应器培养容器，以每12小时间隔提供二氧化碳供应 C. sorokiniana.
- 接种足够体积的预培养液至培养容器中，以达到初始细胞密度为 3 x 105 细胞/mL-1 或其在光密度（OD）上的等效值550 nm) = 0.180
注意：接种过程中须确保无菌操作，以防止污染。 - 每隔12小时定期取样培养物 C. sorokiniana 8小时 H. pluvialis 监测细胞生长和生理参数。采用无菌技术采集样品，以保持培养物的完整性。
3. 叶绿素的定量分析
注意：细胞定量的数据见补充文件1。
- 将40 mL样品放入塑料锥形离心管中。
- 在15 °C条件下以3,000 × g离心20分钟，通过倾倒或使用巴斯德吸管弃去上清液。
- 将细胞沉淀转移至用铝箔包裹并带有螺旋盖的玻璃管中，以防止氧化。
- 使用涡旋振荡器将细胞沉淀用3 mL 90%纯丙酮溶液重新悬浮。
- 将悬浮样品置于冰浴中超声处理两个循环，每个循环5分钟，并在4 °C下静置16小时10。
- 16小时后，按照前一步骤（步骤3.5）所述相同条件再次进行超声处理，并按照先前描述的条件（步骤3.2）再次离心。
- 使用巴斯德吸管分离色素提取液，并转移至另一支避光的洁净试管中。
- 将色素提取液放入石英比色皿中，在分光光度计中分别于630 nm、647 nm和664 nm波长下测定吸光度。
注意：使用90%丙酮预先校准分光光度计。 - 计算叶绿素浓度时，使用以下公式11：
叶绿素 a = 11.93 A664 - 1.93 A647
叶绿素 b = 20.36 A647 - 5.50 A664
注意：结果以µg mL-1提取液表示，乘以提取液体积后除以样品体积（mL），即可得到以µg mL-1培养液表示的叶绿素浓度。 - 若需获得以µg chl cell-1为单位的数值，请使用以下公式：
μg chl cell-1 = 1 mL培养液中的μg chl / [cells mL-1] 培养液中的细胞浓度。
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结果
为了观察该技术检测C. sorokiniana细胞叶绿素浓度变化的效率，并评估生长因子对其生长的影响，采用Taguchi L4实验设计，考察了CO2通入量、光颜色和光强度三个因素。每个因素均在低水平和高水平下进行评估，具体条件如表1所示，实验设计条件见表2。
实验过程结束后，结果表明，低剂量添加 CO 与特定催化剂结合使用可显著提高反应效率。2，紫光，以及高强度光照（C1，P，I2）对应于处理组2，微生物生长增加至7.83 x 105 细胞/mL-1另一方面，在条件C下，处理4的叶绿素含量较高2P，I2，达到 5.92 x 10 的浓度-7 µg 细胞-1 在132 h（图1与紫光和高光强在两次实验中...
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讨论
H. pluvialis 与 C. sorokiniana 之间的比较研究揭示了叶绿素生成动态的显著差异。H. pluvialis 在整个实验过程中表现出叶绿素浓度的下降，而 C. sorokiniana 则显示出持续增加的趋势。此外，两种物种在初期叶绿素 a 的比例均较低，但在特定生长条件下该比例发生逆转，这可能提示通过特定波长的选择性或暴露诱导了这些叶绿素的生成。这些发现表明，每种物种对实验条件具有独特的响应，突显了所用分析技术在检测生物模型内部及之间变化时的敏感性。能够分辨叶绿素 a 与 b 比例中的细微变化，为微藻色素合成调控机制提供了新的见解，可能在生物技术和环境研究等领域具有重要意义。
检测叶绿素产量增加的时期至关重要，因为叶绿素是光合作用过程中的主要色素。叶绿素a对于捕获光能并将其转化为化学能至关重要，该化学能随后用于驱动细胞生长和代谢。因此，叶绿素a产量的增加表明生物体光合能力的提升，提示微生物生长处于最佳...
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
作者们衷心感谢墨西哥国立技术学院（TecNM）在联邦理工学院“科学、技术发展与创新研究项目”（16898.23-P）资助计划下提供的部分经费支持。同时，他们也感谢米却肯州奥坎波科学、技术和创新研究所（FCCHTI23_ME-4.1.-0001）给予的支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| C3H6O | 迈耶 | 67-64-1 | 90%丙酮 |
| 15 mL 离心管 | Biologix | 10-9502 | 试管 |
| 2510-DTH | Branson | D-73595 | 超声波破碎仪 |
| 5 mL 螺口试管 | Kimax | 45066-13100 | 试管 |
| 50 mL 离心管 | Biologix | 10-9151 | 试管 |
| 铝箔 | Reynolds | 611 标准，12" x 1000 英尺 | 试管盖 |
| CaCl2 | 迈耶 | 0925-250 | 氯化钙 |
| 离心机 | Dynamica | 14 R | 制冷离心机 |
| CoCl2 | 默克 | 1057-100 | 二氯化钴 |
| FeCl3 | 默克 | 157740 | 三氯化铁 |
| K2HPO4 | 迈耶 | 2051-250 | 磷酸氢二钾 |
| KH2PO4 | 迈耶 | 2055-250 | 磷酸二氢钾 |
| MgSO4 | 迈耶 | 1605-250 | 硫酸镁 |
| 微量移液器 | LabNet | 型号 Beta-Pette | 微量移液器 |
| MnCl2 | 默克 | 429449 | 氯化锰(II) |
| Na2 EDTA | 默克 | 200-449-4 | 乙二胺四乙酸二钠盐二水合物 |
| Na2MoO4 | 默克 | 243655 | 钼酸钠 |
| NaCl | 迈耶 | 2365-500 | 氯化钠 |
| NaNO3 | 迈耶 | 2465-250 | 硝酸钠 |
| RGB LED 灯带 | Steren | GAD-LED2 | 光源 |
| 分光光度计 | PerkinElmer | 型号 Lambda35 | 分光光度计 |
| 光谱辐射计 | Gigahertz-Optik | 型号 BTS256 | |
| 涡旋振荡器 | Scientific Industries | Vortex-Genie® 2 | 涡旋振荡器 |
| ZnCl2 | 默克 | 208086 | 氯化锌 |
参考文献
- Ramírez, M. E., Rendón, L., Veléz, Y. Microalgas para la industria alimenticia. , 1ra edición, Universidad Pontífica Bolivariana. http://hdl.handle.net/20.500.11912/2306 (2013).
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