本研究强调了采用Jeffrey和Humphrey所开发的方法从微藻中提取和定量脂溶性色素的优势。该方法是评估生长因素对这些生物体中叶绿素产生及细胞含量影响的重要工具。
本文内容
摘要
摘要
微藻包含两类主要色素：叶绿素和类胡萝卜素。叶绿素是一种绿色色素，能够吸收光能并将其转化为化学能，从而促进有机化合物的合成。由于具有较强的抗氧化性和着色能力，该色素在食品、制药和化妆品工业中可作为重要的生物技术原料。本研究旨在通过采用Taguchi L4正交实验设计，评估生长因子（CO2浓度、光色和光强）对Chlorella sorokiniana细胞生长以及叶绿素a和b细胞内含量的影响，并进一步利用雨生红球藻（Haematococcus pluvialis）微藻作为额外的研究模型对方法进行验证。细胞生长通过在550 nm波长下测定光密度的分光光度法进行定量。对于叶绿素的定量，首先使用90%纯度的丙酮溶液提取细胞内容物，随后根据Jeffrey和Humphrey所述方法，在647 nm和664 nm波长下采用分光光度法测定叶绿素a和b的浓度。实验结果表明，控制低浓度CO2添加、紫光照射及低光强条件，可同时促进细胞生长并提高细胞内叶绿素a和b的含量。该叶绿素定量方法的实施可实现快速、简便且精确的叶绿素含量测定，所用波长恰好位于两类叶绿素的吸收峰处，因此该技术易于在任何研究中的微藻样本上重复应用。
引言
近年来，人类活动引发的环境问题日益加剧，对生态系统的健康与平衡造成了不利影响，这促使人们寻求更高效且环境友好的生产系统。这一需求加速了工业领域的相关进程，并推动了生物修复技术的应用以及用于减轻这些有害影响的生物化合物的开发1。
这一背景推动了微藻研究的显著发展，其驱动力在于需要寻找应对当前环境与经济挑战的创新解决方案。微藻在水生环境中生长旺盛，分别利用阳光和二氧化碳作为能量和碳源。这一特性使其成为生产多种高价值产品的可持续且极具前景的替代途径。该领域的研究主要集中在深入了解这些细胞的生理学与代谢机制，以及开发高效的培养与加工技术2。
迫切需要开发易于使用且可靠的工具来研究微藻，以加快研究进程并加深对其生理学、代谢过程及潜在应用的理解。这些工具应能够快速分析环境因素和生产条件对关键参数的影响，例如叶绿素浓度，这是反映这些生物体健康状况和发育程度的基本指标。叶绿素含量的降低可能表明存在环境胁迫、营养缺乏或疾病。
这些绿色色素在光合作用中发挥着关键作用，能够捕获太阳光能，将二氧化碳和水转化为葡萄糖和氧气，占微藻生物量的0.5%至5%3。除了在维持生命过程中具有重要作用外，叶绿素还在多个行业中得到应用。叶绿素提取物被用于食品和饮料加工中作为天然着色剂，为产品赋予鲜艳的绿色，同时提供抗氧化特性。此外，基于叶绿素的膳食补充剂因其宣称的解毒和抗炎功效，在健康与保健领域日益受到青睐。通过利用叶绿素的多种特性，各行业可开发出既提升视觉吸引力又促进消费者健康的创新产品1。
在这一领域中，一种具有重要生物技术价值的微藻是C. sorokiniana。该微生物因其快速的生长速率而备受关注，在生物量生产方面具有很高的效率。此外，C. sorokiniana含有多种高营养价值的化合物，包括蛋白质、脂质和维生素，使其在食品、饲料和生物燃料生产等多个应用领域中具有重要价值2。而且，已发现这种微藻能够产生具有多种功能的胞外酶，为废水处理、生物修复以及制药等生物技术应用提供了新的可能性4。除了生长迅速和应用广泛之外，C. sorokiniana在叶绿素生产方面也表现出显著潜力。作为一种光合微生物，C. sorokiniana具备合成叶绿素所必需的代谢机制，叶绿素可占微藻生物量的0.5%至5%3。这一特性使C. sorokiniana成为实现规模化叶绿素生产的理想候选者，并有望为当前紧迫的环境与营养挑战提供可持续的解决方案5。
另一方面，另一种备受关注的微藻物种是 H. pluvialis。这种微藻以其产生虾青素的能力而闻名，虾青素是一种具有多种工业应用的强效抗氧化色素。虾青素可作为 H. pluvialis 光合系统的保护机制，使其免受环境因素引起的氧化应激损伤。由于其抗氧化特性及潜在的健康益处，该色素在化妆品、营养补充剂和水产养殖行业中备受青睐。凭借其高效的虾青素生产能力，H. pluvialis 为开发满足多种工业和消费者需求的创新产品提供了广阔前景6。
最近的研究还强调了H. pluvialis1在叶绿素生产方面的潜力，进一步提升了其工业价值。例如，一项研究考察了在不同生长条件下H. pluvialis的叶绿素含量，发现当培养参数处于最佳状态时，H. pluvialis表现出显著的叶绿素生成速率，超过其他微藻物种7。该发现凸显了H. pluvialis作为可持续叶绿素来源的潜力，为其在多个工业领域的应用提供了新的机遇。
方案
1. 培养基制备与接种物制备
- 制备1 L的3N-BBM+ V(CCAP)培养基（大量营养素：NaNO3 [0.75 g L-1]，CaCl2 [0.019 g L-1]，MgSO4 [0.019 g L-1]，K2HPO4 [0.057 g L-1]，NaCl [0.025 g L-1]，KH2PO4 [0.175 g L-1]；微量营养素：Na2 EDTA [0.0186 g L-1]，FeCl3 [0.0024 g L-1]，MnCl2 [0.001 g L-1]，ZnCl2 [1.25 × 10-4 g L-1]，CoCl2 [5 × 10-5 g L-1]，Na2MoO4 [9.98 × 10-5 g L-1])8，并在121 °C、1.5 psi条件下灭菌15分钟。
- 将约1 L培养基接种至锥形瓶中，微藻C. sorokiniana的接种浓度约为3 × 106 个细胞 mL-1；或向培养基中加入5%至10%（v/v）的接种物。
注意：为保持无菌条件，建议使用超净工作台、手套、实验服和口罩。 - 将接种后的锥形瓶置于红光光源下培养，光照强度约为3,600至4,200 lux，温度控制在22–26 °C之间，C. sorokiniana采用12小时光照/12小时黑暗的光周期，H. pluvialis采用16小时光照/8小时黑暗的光周期，每天手动振荡一次，两种菌株均培养约7天。
注意：C. sorokiniana需在生长条件下维持至少7–10天（直至呈现深绿色），H. pluvialis则需10–12天。为获得用于动力学实验的微藻浓缩接种物，需去除藻体产生的上清培养基。 - 在无菌环境下，将约10 mL接种培养基加入无菌的15 mL锥形离心管中，在25–30 °C条件下以3,000 × g离心20分钟。
- 在无菌条件下，使用移液器或倾倒法去除上清液，并将生物质浓缩至无菌的50 mL锥形离心管中。
- 根据需要重复此过程，直至获得动力学实验所需的接种物体积。
- 测定接种物在550 nm处的光密度（OD550 nm），以确定微藻的细胞浓度，并将其储存于3–4 °C，待用。
注意：最初通过直接细胞计数建立细胞浓度与吸光度之间的相关性。计数完成后，接种物可在冷藏条件下保存不超过4天。
2. 生长动力学研究
- 制备适用于每项实验所需体积的3N-BBM+ V(CCAP)（光生物反应器级别测试需8 L） C. sorokiniana 以及用于烧瓶级别测试的0.5 L H. pluvialis按照标准实验室操作规程进行，确保充分灭菌。
- 对于光生物反应器和烧瓶，将光源设置为所需的颜色光谱（蓝色为460 nm，紫色为460 nm与630 nm的混合光） C. sorokiniana 630 nm 处为红色 H. pluvialis）；覆盖两个系统以避免外界光线干扰。
注意：由于每个发光二极管发射的波长存在差异，需使用光谱辐射计对光源进行光谱辐射测量，以确定每个二极管的波长和辐射功率9通过组合红色和蓝色LED获得紫光，波长为460 nm，发射功率为1.65 W/nm-1 对于蓝光LED和发射功率为0.6 W/nm的630 nm光-1 用于红光LED。这些测量数据被用于仅在蓝光和红光条件下进行的实验。 - 将定时器设置为在12小时光照和12小时黑暗周期之间交替 C. sorokiniana 16小时光照和8小时黑暗循环 H. pluvialis.
- 连接CO₂培养箱2 将通气系统连接至光生物反应器培养容器，以每12小时间隔提供二氧化碳供应 C. sorokiniana.
- 接种足够体积的预培养液至培养容器中，以达到初始细胞密度为 3 x 105 细胞/mL-1 或其在光密度（OD）上的等效值550 nm) = 0.180
注意：接种过程中须确保无菌操作，以防止污染。 - 每隔12小时定期取样培养物 C. sorokiniana 8小时 H. pluvialis 监测细胞生长和生理参数。采用无菌技术采集样品，以保持培养物的完整性。
3. 叶绿素的定量分析
注意：细胞定量的数据见补充文件1。
- 将40 mL样品放入塑料锥形离心管中。
- 在15 °C条件下以3,000 × g离心20分钟，通过倾倒或使用巴斯德吸管弃去上清液。
- 将细胞沉淀转移至用铝箔包裹并带有螺旋盖的玻璃管中，以防止氧化。
- 使用涡旋振荡器将细胞沉淀用3 mL 90%纯丙酮溶液重新悬浮。
- 将悬浮样品置于冰浴中超声处理两个循环，每个循环5分钟，并在4 °C下静置16小时10。
- 16小时后，按照前一步骤（步骤3.5）所述相同条件再次进行超声处理，并按照先前描述的条件（步骤3.2）再次离心。
- 使用巴斯德吸管分离色素提取液，并转移至另一支避光的洁净试管中。
- 将色素提取液放入石英比色皿中，在分光光度计中分别于630 nm、647 nm和664 nm波长下测定吸光度。
注意：使用90%丙酮预先校准分光光度计。 - 计算叶绿素浓度时，使用以下公式11：
叶绿素 a = 11.93 A664 - 1.93 A647
叶绿素 b = 20.36 A647 - 5.50 A664
注意：结果以µg mL-1提取液表示，乘以提取液体积后除以样品体积（mL），即可得到以µg mL-1培养液表示的叶绿素浓度。 - 若需获得以µg chl cell-1为单位的数值，请使用以下公式：
μg chl cell-1 = 1 mL培养液中的μg chl / [cells mL-1] 培养液中的细胞浓度。
结果
为了观察该技术检测C. sorokiniana细胞叶绿素浓度变化的效率，并评估生长因子对其生长的影响，采用Taguchi L4实验设计，考察了CO2通入量、光颜色和光强度三个因素。每个因素均在低水平和高水平下进行评估，具体条件如表1所示，实验设计条件见表2。
实验过程结束后，结果表明，低剂量添加 CO 与特定催化剂结合使用可显著提高反应效率。2，紫光，以及高强度光照（C1，P，I2）对应于处理组2，微生物生长增加至7.83 x 105 细胞/mL-1另一方面，在条件C下，处理4的叶绿素含量较高2P，I2，达到 5.92 x 10 的浓度-7 µg 细胞-1 在132 h（图1与紫光和高光强在两次实验中均为各因素的最佳水平相一致。
同时，在四种评估的细胞系中均观察到类似的行为。然而，在紫光条件下进行的实验中表现出明显的优势。这一模式表明，紫光可能对实验结果产生积极影响，或可促进细胞生长或活性的最佳条件。这些发现凸显了在生物学实验中仔细考虑光照条件的重要性。
通过统计分析，得到了主效应图。在图2中，可以观察到所评估因素的各个水平对C. sorokiniana叶绿素生产的影响。叶绿素生产的最佳条件为高浓度CO2添加、紫光和高光强（C2、P、I2），其中光照颜色和二氧化碳浓度具有非常接近的显著性值，而光强对所评估的响应变量影响相对较小。
此外，生成了一张对比图（图3），展示了细胞叶绿素浓度在不同CO2添加体积和光照颜色条件下的变化行为。
观察到紫光（蓝光与红光的混合）以及高光强显著促进微生物生长和叶绿素的产生。同时，高浓度添加CO2 对这两个参数分别产生正负影响，因为紫光在实验过程中虽能提高叶绿素的细胞浓度至最大值，但会抑制微生物的生长。然而可以明显观察到，在紫光条件下，CO2 20秒脉冲式加入CO体积2 每12小时一次，流速为8.5 ft³/h-1 使这两个参数均获得理想的响应。
为了验证从该方法中获得的结果和数据 C. sorokiniana 在烧瓶水平上进行了一项确证性测试 H. pluvialis 在红光下，由于该生物在胁迫条件下具有降解叶绿素以合成虾青素的天然特性，而胁迫条件是在168小时通过提高培养基盐度诱导产生的。绘制了浓度变化图（图4) 叶绿素浓度在0 h达到最高值，为1.41 x 10-7 µg 细胞-1在此情况下，由于微藻的自然行为，观察到叶绿素浓度下降，表明所研究的生物模型可能发生潜在的生理变化。这一点在下文中进一步得到说明。 图5，显示了一张显微照片 C. sorokiniana (图5A）以及两张显微照片 H. pluvialis：一个处于绿色阶段（图5B）以及一个处于转变期和虾青素生成期的阶段（图5C有趣的是，尽管存在类胡萝卜素化合物——这些化合物本身是存在于微藻中的脂溶性色素——但并未对检测造成干扰；这充分证明了该技术在具有不同能力和行为特性的微藻中具备高度的选择性和可重复性。
该图显示在整个实验过程中总叶绿素浓度呈下降趋势。值得注意的是，在50小时时，叶绿素a相较于叶绿素b有所增加，此时叶绿素b的浓度显著降低。叶绿素浓度最显著的下降出现在指数生长期末期。这种下降归因于雨生血球藻（H. pluvialis）中类胡萝卜素的产生。
类似地，对 C. sorokiniana 产量最高处理组（C1、P、I2）的叶绿素 a 和 b 组成进行了分析，结果如图6所示。与 H. pluvialis 不同，叶绿素的产量在整个实验期间呈现持续上升趋势，且该分析仅在指数生长期进行。可以看出，与 H. pluvialis 相似，在实验初期，叶绿素 a 的比例低于叶绿素 b；然而，在50小时时比例发生显著变化，此后叶绿素 a 的生成速率高于叶绿素 b。
本研究中采用的分析技术在检测生物模型内部及不同生物模型之间的变化方面已证明具有高效性。这些结果凸显了该分析方法的灵敏度与精确性，使得对生物系统内外叶绿素动态的细微差异有了更深入的理解。此类见解对于揭示色素合成与代谢所涉及的复杂机制具有重要价值，并为进一步推动生物技术和环境研究的发展奠定了基础。
图 1：不同实验设计处理下的细胞内叶绿素含量。在不同实验处理条件下测定的Chlorella sorokiniana细胞内叶绿素含量。数据以n = 3的标准差表示。请点击此处查看该图的放大版本。
图2：细胞叶绿素含量的主效应图。 主效应图展示了不同处理对Chlorella sorokiniana细胞叶绿素含量的影响。数据以n = 3的标准差表示。请点击此处查看该图的放大版本。
图 3：细胞叶绿素浓度的等高线图。该等高线图显示了细胞叶绿素浓度、CO2浓度与光色之间的关系。光色以轴1表示蓝色，轴2表示紫色，中间水平表示添加红光。数据以n = 3的标准差表示。请点击此处查看此图的放大版本。
图4：H. pluvialis 生长动力学过程中的叶绿素浓度。 在 Haematococcus pluvialis 的生长动力学过程中测得的叶绿素浓度。数据以 n = 3 的标准差表示。请点击此处查看该图的放大版本。
图 5：C. sorokiniana 和 H. pluvialis 的显微图像。Chlorella sorokiniana（A）以及 Haematococcus pluvialis 的显微图像，分别展示处于绿色阶段的个体（B）和处于早期红色阶段的个体（C）。请点击此处查看此图的放大版本。
图6：C. sorokiniana 生长动力学过程中的叶绿素浓度。在 Chlorella sorokiniana 的生长动力学过程中测得的叶绿素浓度。数据以 n = 3 的标准差表示。请点击此处查看该图的放大版本。
| 因素 | 低水平 | 高水平 |
| CO2 添加量 (L) | C1 | C2 |
| 光颜色 | 蓝色 (B) | 紫色 (P) |
| 光照强度 (Lux) | I1 | I2 |
表1：动力学因素及其水平。 动力学因素及其相应水平的概述：C1 = 0.078 L；C2 = 0.15 L；B = 蓝光；P = 紫光；I1 = 550 lux；I2 = 1200 lux。
| 处理 | CO2 添加量 | 光颜色 | 光照强度 (Lux) |
| (L) | |||
| 1 | C1 | B | I1 |
| 2 | C1 | P | I2 |
| 3 | C2 | B | I1 |
| 4 | C2 | P | I2 |
表2：实验设计与处理。 实验设计及所用处理的汇总：C1 = 0.078 L；C2 = 0.15 L；B = 蓝光；P = 紫光；I1 = 550 lux；I2 = 1200 lux。
补充文件 1：细胞定量数据。 请点击此处下载该文件。
讨论
H. pluvialis 与 C. sorokiniana 之间的比较研究揭示了叶绿素生成动态的显著差异。H. pluvialis 在整个实验过程中表现出叶绿素浓度的下降，而 C. sorokiniana 则显示出持续增加的趋势。此外，两种物种在初期叶绿素 a 的比例均较低，但在特定生长条件下该比例发生逆转，这可能提示通过特定波长的选择性或暴露诱导了这些叶绿素的生成。这些发现表明，每种物种对实验条件具有独特的响应，突显了所用分析技术在检测生物模型内部及之间变化时的敏感性。能够分辨叶绿素 a 与 b 比例中的细微变化，为微藻色素合成调控机制提供了新的见解，可能在生物技术和环境研究等领域具有重要意义。
检测叶绿素产量增加的时期至关重要，因为叶绿素是光合作用过程中的主要色素。叶绿素a对于捕获光能并将其转化为化学能至关重要，该化学能随后用于驱动细胞生长和代谢。因此，叶绿素a产量的增加表明生物体光合能力的提升，提示微生物生长处于最佳条件12；这一现象支持了在C. sorokiniana中观察到的结果，即叶绿素浓度较高的实验组也获得了更高的细胞生长量，从而为光合微生物在何种环境条件下最有利于其发育和增殖提供了重要依据。
特别是，了解H. pluvialis中叶绿素的比例具有重要意义，因为这些比例可提供关于微藻胁迫状态的重要信号。当环境条件不利时，例如在强光或营养缺乏的情况下，微藻可能会减少叶绿素的合成，转而合成虾青素等类胡萝卜素色素11。这种从以高叶绿素含量为特征的绿色生长期向富含虾青素的胁迫诱导期的转变，有利于最大化虾青素的产量。这凸显了在H. pluvialis培养过程中监测叶绿素水平的重要性，可将其作为评估胁迫响应及色素生成动态的间接指标。
此外，尽管该技术因其高选择性而局限性较少，但仍需采取一些预防措施，例如将提取物避光保存以防止氧化，以及小心处理离心后的样品以消除生物量残留引起的浑浊。另外，该方法的一个缺点是需要相对较大的样品体积，特别是在稀释培养基或摇瓶水平的长期动力学研究中，这可能带来操作上的挑战。这些因素凸显了在微藻研究中精心设计实验和妥善处理样品的重要性，以最大限度地提高叶绿素分析技术的有效性。
披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
作者们衷心感谢墨西哥国立技术学院（TecNM）在联邦理工学院“科学、技术发展与创新研究项目”（16898.23-P）资助计划下提供的部分经费支持。同时，他们也感谢米却肯州奥坎波科学、技术和创新研究所（FCCHTI23_ME-4.1.-0001）给予的支持。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| C3H6O | 迈耶 | 67-64-1 | 90%丙酮 |
| 15 mL 离心管 | Biologix | 10-9502 | 试管 |
| 2510-DTH | Branson | D-73595 | 超声波破碎仪 |
| 5 mL 螺口试管 | Kimax | 45066-13100 | 试管 |
| 50 mL 离心管 | Biologix | 10-9151 | 试管 |
| 铝箔 | Reynolds | 611 标准，12" x 1000 英尺 | 试管盖 |
| CaCl2 | 迈耶 | 0925-250 | 氯化钙 |
| 离心机 | Dynamica | 14 R | 制冷离心机 |
| CoCl2 | 默克 | 1057-100 | 二氯化钴 |
| FeCl3 | 默克 | 157740 | 三氯化铁 |
| K2HPO4 | 迈耶 | 2051-250 | 磷酸氢二钾 |
| KH2PO4 | 迈耶 | 2055-250 | 磷酸二氢钾 |
| MgSO4 | 迈耶 | 1605-250 | 硫酸镁 |
| 微量移液器 | LabNet | 型号 Beta-Pette | 微量移液器 |
| MnCl2 | 默克 | 429449 | 氯化锰(II) |
| Na2 EDTA | 默克 | 200-449-4 | 乙二胺四乙酸二钠盐二水合物 |
| Na2MoO4 | 默克 | 243655 | 钼酸钠 |
| NaCl | 迈耶 | 2365-500 | 氯化钠 |
| NaNO3 | 迈耶 | 2465-250 | 硝酸钠 |
| RGB LED 灯带 | Steren | GAD-LED2 | 光源 |
| 分光光度计 | PerkinElmer | 型号 Lambda35 | 分光光度计 |
| 光谱辐射计 | Gigahertz-Optik | 型号 BTS256 | |
| 涡旋振荡器 | Scientific Industries | Vortex-Genie® 2 | 涡旋振荡器 |
| ZnCl2 | 默克 | 208086 | 氯化锌 |
参考文献
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