本研究提出了一种标准化框架，用于优化大蜡螟（G. mellonella）感染模型，以应用于临床前抗菌药物评估。在临床前抗菌药物研发流程中应用大蜡螟（G. mellonella）模型，可减少进入临床试验的无效化合物数量。
本文内容
摘要
摘要
为应对日益严重的全球抗生素耐药性问题，加快新型抗生素的研发至关重要。目前的抗菌药物临床前研发产生了大量候选化合物，其中许多在临床试验前或临床试验过程中被证明并不适用。为了提高临床前研发的效率，必须建立相关、标准化、可及且具有成本效益的模型。 大蜡螟 （大蜡螟）幼虫被广泛用作感染模型，以评估微生物毒力、进行药物毒性测试，并作为评价候选治疗剂体内活性的初步手段 体内 新型抗菌化合物的疗效。这些感染模型相较于通量相当的体外筛选具有更高的生物学相关性，在用作抗菌测试的预筛手段时，可减少对哺乳动物模型的依赖。本方案描述了一种标准化的方法学，用于优化 G. mellonella 感染模型，可应用于所选的细菌种类和抗菌治疗手段。利用世界卫生组织（WHO）重点病原体 铜绿假单胞菌 作为一个范例，我们概述了建立可重复的感染模型及药物疗效测试的步骤。这些步骤包括实验设计、样本制备以及感染与治疗方案的建议。将该模型整合到临床前抗菌药物研发流程中，可减少对哺乳动物模型的依赖，降低进入临床试验的无效化合物数量，并最终提高临床前抗菌药物研发的效率。
引言
Galleria mellonella （大蜡螟）幼虫在生物科学领域被广泛用作微生物物种的感染模型，以及新型药物化合物的毒性测试。1,2。它们在临床前抗菌测试流程中具有重要的应用潜力，因为其通量高，并能复制整体功能 体内 人类感染特征，并减少对哺乳动物模型的依赖，符合科研中伦理使用哺乳动物所遵循的减量、优化和替代原则。
开发新型抗生素需要进行广泛的临床前测试 体外 和 体内 临床验证前的模型3只有少数具有前景的临床前数据包的新药能够成功进入临床阶段，而造成这一高淘汰率的原因之一是临床前筛选未能充分反映感染环境的复杂性。4这些问题不仅导致抗菌药物向临床转化的比率较低，还使得在临床前后期筛选过程中对实验性脊椎动物的使用增加。为了改进新型抗菌药物的临床前评估，并减少对昂贵、耗时、复杂且存在伦理问题的小鼠模型的使用 体内 需要开发更优的早期药物筛选工具，以减少进入脊椎动物系统测试的无前景化合物数量。
G. mellonella 生命周期短，为8周，包含四个阶段：卵、幼虫、蛹和成虫，本方案中使用的是幼虫阶段。1. G. mellonella 在整个实验过程中易于维持，无需专业设备或专用动物实验设施。使用该生物无需申请伦理审批，研究人员可在实验室内自行繁育以提高实验质量2,5,6,7。该 G. mellonella 免疫系统与哺乳动物的先天免疫系统非常相似，能够对“自身”和“非自身”刺激产生反应8血细胞负责病原体相关分子模式的识别及随后的吞噬作用，其功能类似于人类的中性粒细胞9. G. mellonella 编码三种Toll样受体，这些受体通过序列同源性在人类中已被鉴定，并产生类似补体的蛋白质，可识别非自身物质，并在酚氧化酶活化并聚合为黑色素后形成局部黑色素化复合物10这可以作为感染实验中幼虫健康状况的可视化指标，因为表皮会因黑色素化而变暗。然而需要注意的是，昆虫中的黑色素化通路涉及酚氧化酶，与哺乳动物中的酪氨酸酶-黑色素通路存在显著差异。11,12此外， G. mellonella 产生18种可诱导的抗菌肽，包括溶菌酶和防御素同源物13这种相似性，以及该模型简单的幼虫培养流程和高通量特性，使其成为 G. mellonella 一种广泛用于评估新药的模式生物。在临床前抗生素研发中， G. mellonella 相较于……具有更高的实用性 体外 模型，因为它们能在具有活性免疫的复杂环境中更准确地模拟宿主-病原体-药物相互作用。
目前，欧洲尚无标准化的科研级 G. mellonella 供应商。研究人员只能从鱼饵商店购买 G. mellonella 幼虫，或自行维持种群培养。尽管已有文献描述了在实验室内部维持 G. mellonella 种群的方法，并且该方法可提高实验的一致性5,6,7，但这一选择可能仅对频繁使用幼虫的研究者具有吸引力。因此，本实验方案重点介绍从活体鱼饵供应商处购得幼虫后的实验准备流程。尽管该方法更易获取材料，但也会增加实验的复杂性，并因供应商提供的幼虫在接收时健康状况不一，从而在检测中引入额外的变异性。为了使学术界、工业界和监管机构能够接受并采用 G. mellonella 检测作为临床前抗菌药物研发流程的一部分，建立标准化的抗菌效果优化与评估体系十分必要。
本研究优化了用于抗生素开发的G. mellonella感染模型的实验设计。尽管已有文献描述过G. mellonella感染模型14,15，但本方法学记录了额外的步骤，以减轻因供应不一致所带来的额外复杂性，并为新型抗菌药物的评估提供了框架。作为验证案例，采用世界卫生组织列为优先级一的病原菌Pseudomonas aeruginosa感染G. mellonella，并优化了氨基糖苷类药物（妥布霉素）的治疗方案。该框架如图1所示，为未来使用新型药物开展临床前抗菌筛选研究奠定了基础。
方案
在本研究中， Galleria mellonella （大蜡螟）幼虫被选为抗生素敏感性测试和急性毒性试验的模型。实验使用这些幼虫无需获得伦理审批。 Galleria mellonella所用试剂与设备的详细信息列于下文 材料表.
1. 实验设计
- 确定合适的 Galleria mellonella 基于研究旨在捕捉的幼虫存活率的相对变化来确定幼虫群体规模。 表1 详细说明了使用特定方法检测生存率特定百分比变化所需的研究组规模 铜绿假单胞菌 PAO1 菌株感染模型
注意：使用新型病原体时，应首先确定感染但未经处理的幼虫在不同实验间的存活率变异程度，因为这将影响样本量的确定。- 包括两组PBS对照：一组在其他感染操作之前注射，以确保注射器锋利且可正常使用；另一组在细菌感染期间或之后注射，以确保不同感染组之间的适当灭菌。若使用新病原体进行优化实验，应增设热处理对照组，以确认死亡并非由对异源颗粒的免疫反应所致。
注意：可使用胰岛素注射器进行注射，以降低针头变钝和污染的风险。然而，实验可能常规需要数百次 G. mellonella，导致使用胰岛素注射器成本高昂且浪费。 - 在优化抗菌治疗的研究中，应增设两个额外对照组：一组为感染细菌后接受溶剂“假”处理的组，另一组为接受两次溶剂注射的组，其中一次在其他组感染时进行，另一次在治疗时进行。
注意：前者为未经处理的对照组，后者用于控制注射所造成的创伤。当使用钝针时，更易造成此类创伤。
- 包括两组PBS对照：一组在其他感染操作之前注射，以确保注射器锋利且可正常使用；另一组在细菌感染期间或之后注射，以确保不同感染组之间的适当灭菌。若使用新病原体进行优化实验，应增设热处理对照组，以确认死亡并非由对异源颗粒的免疫反应所致。
- 订购 G. mellonella 从活体诱饵供应商处获取，或维持一个种群 G. mellonella 如先前所述5,6,7。对于列表中所列的供应商 材料表，订购计划所需幼虫数量的1.8倍，因为约有33%的幼虫会因体型不符而被剔除，另有约10%可能在表皮消毒后死亡。
- 确定 G. mellonella 实验前应控制体重变异，确保体重范围不超过平均值的一个标准差。
注意：对于未在列表中的供应商 材料表，安排供应商提供新货品。
- 确定 G. mellonella 实验前应控制体重变异，确保体重范围不超过平均值的一个标准差。
- 收到后储存 G. mellonella 在室温下孵育，以降低在37 °C孵育后发生缠绕现象的可能性。
注意：并非来自商业供应商的所有幼虫都会结茧，而结茧此前曾被用作幼虫健康状况的指标16. - 收到幼虫后应在1周内使用，此期间无需喂食。
注意：尽管幼虫的生长期在不同批次间可能存在差异，但大多数幼虫在化蛹前的末龄幼虫阶段送达。在此阶段，与早期阶段相比，幼虫的摄食活动自然减少。17.
2. 灭菌与筛选 G. mellonella 幼虫
- 称量Galleria mellonella幼虫，剔除体重不在224 mg ± 49.2 mg范围内的个体（该范围为幼虫平均体重加减一个标准差），此举将导致约33%的幼虫被排除。
注：不同供应商提供的幼虫体重变异可能不同。对于本方案未列出的供应商，需自行计算合适的体重范围。 - 以下所有步骤均需在无菌条件下进行。
- 向培养皿中喷洒70%乙醇，确保液体足以覆盖皿底。
- 以每批10–20只幼虫为单位，对G. mellonella表面进行灭菌。
- 将每批幼虫单独放入培养皿中，并用70%乙醇喷洒两次。
- 使用镊子滚动幼虫，确保其表面完全被覆盖。
- 将幼虫从乙醇中取出，置于无菌培养皿中，敞口放置以使幼虫干燥。
注意：若将G. mellonella幼虫在乙醇中停留超过15秒，将导致高死亡率。
- 在灭菌后约2小时，当约90%的幼虫恢复活动时，根据表1中详述的统计效能计算结果，将恢复的幼虫分组，每组数量应足以有效检测存活率的变化。
- 在完成表面灭菌后的6小时内使用G. mellonella幼虫。
3. 优化细菌接种密度
- 在感染前制备已知浓度（CFU/mL）的细菌感染液。不同微生物的制备方法可能有所不同。此处，Pseudomonas aeruginosa 在营养肉汤中培养至对数中期，分装后以 6 × 107 CFU/mL 的密度冷冻保存。
- 将感染液在室温下以 10,000 × g 离心 5 分钟，收集菌体沉淀，并用 PBS 重悬。将细菌悬液进行连续十倍梯度稀释，以获得每只幼虫接种剂量为 101–107 CFU 的系列浓度，注意每只幼虫注射体积为 10 µL。
注意：具体的接种剂量范围取决于细菌的毒力，但此处建议的范围适用于大多数致病菌种。体外 生长速率测定有助于确定合适的剂量范围，因为菌株在液体培养中的生长速率与幼虫死亡率相关。 - 开始感染前，采用 Miles 和 Misra 连续稀释法对实际接种物进行菌落计数，以准确测定接种密度18。
- 准备三个 1 mL 微量离心管，分别装入无菌 dH2O、70% 乙醇或无菌 PBS。这些溶液将用于持续灭菌注射用的注射器。
- 检查一支无菌的 100 µL Hamilton 注射器，确保针尖锋利且未形成钩状，否则会对感染部位造成显著损伤。
警告：Hamilton 注射器针尖在约 300 次注射后开始变形。若发现针尖变形，必须更换。 - 在感染前，依次用 dH2O、乙醇和 PBS 冲洗注射器，每次吸取并弃去注射器最大容量的液体。
- 将重悬的感染接种液充分涡旋混匀，然后吸入最多 100 µL 至 Hamilton 注射器中，足以完成每只幼虫 10 µL 的注射。
- 向每只幼虫的右后侧腹足注射 10 µL 接种液。确保针头刺入体内约 2 mm。
注意：可采用多种感染方法，包括将幼虫置于移液枪头上方以暴露腹足、固定注射器并 手动定位 G. mellonella，或直接徒手注射。 - 每次完成一组感染后，按照步骤 2.5 所述方法对注射器进行灭菌，以防止残留皮肤共生菌污染。
- 将感染后的幼虫置于适合微生物生长的温度下孵育，推荐温度范围为 20 °C 至 42 °C，该范围也适合 G. mellonella 存活5。
- 从通常首次观察到死亡的时间点起，定期监测 G. mellonella 的存活情况，以准确记录死亡时间。该参数需通过初步筛选确定。及时移除死亡幼虫并记录其死亡时间。
- 根据治疗试验研究的需求，选择最佳感染剂量：即在 18 小时内导致 50% 死亡率、72 小时内超过 80% 死亡率的剂量。此剂量可支持快速的单日筛选，同时保证足够的毒力和适当的治疗窗口。
4. 未感染幼虫中新型抗菌剂的毒性测试
- 评估新型抗菌剂及选定载体的毒性 Galleria mellonella 在使用实验感染的幼虫之前，准备一系列超过抗菌药物预期治疗范围的剂量，根据 体外 （例如，细胞系）毒性数据（如有）。
- 考虑到将向幼虫注射10 µL的治疗剂。制备仅含载体的对照组，其浓度应与治疗剂给药时的浓度一致。
- 注射健康的无菌 G. mellonella 以适当的分组规模，使用不同的抗菌剂和PBS溶剂浓度，具体步骤详见3.2-3.10。在本研究中，所用抗菌剂为tobramycin。
注意：对于需要二甲基亚砜（DMSO）作为溶剂的试剂，应使用26号针头而非标准的22号针头进行注射，因为使用较大针头会造成更大的组织损伤，从而在使用DMSO时增加死亡率。 - 将安全剂量定义为与仅注射PBS的幼虫相比，其死亡率无显著差异的剂量。
5. 使用抗菌剂优化 G. mellonella 细菌感染的治疗
- 准备一系列抗菌剂剂量，需考虑感染幼虫将以10 µL剂量进行处理。根据步骤4的评估结果，选用毒性最小的剂量范围。
- 按照本方案的步骤1和步骤2进行准备和感染 大蜡螟 在先前优化的感染剂量下分组处理。
- 感染后2小时，用制备好的抗菌剂或对照溶剂处理幼虫。按照步骤3.2–3.8操作，注射至之前未注射的对侧腹足。 感染期间注射。每组之间对针头进行灭菌。
注意：选择在2 h进行处理以获得较强的剂量-反应数据，并据此进一步优化处理时间19. - 监测 G. mellonella 在通常首次观察到死亡率的时间点开始，每隔30分钟或更频繁地记录存活情况。移除任何死亡的幼虫，并记录其死亡时间。
- 计算各处理组之间生存比例的变化。采用Kaplan-Meier生存分析方法，判断处理是否显著改变幼虫死亡率。在多组比较分析中，应包含适当的多重比较事后校正。
6. 优化感染 G. mellonella的治疗时机
- 按照步骤1和步骤2，将大蜡螟（Galleria mellonella）分组，并以先前优化的感染剂量进行准备。
- 按照步骤4中先前优化的剂量配制抗菌剂。
- 在感染后2小时、4小时、6小时、9小时或12小时，按照步骤3.2–3.8对感染的幼虫进行处理，以比较不同给药时间对死亡率的影响。
- 从通常首次观察到死亡的时间点开始，以30分钟间隔或更频繁地监测大蜡螟（G. mellonella）的存活情况。及时移除死亡幼虫并记录其死亡时间。最佳给药时间应为能够维持先前治疗剂量优化实验中所观察到的存活率的时间点。
注意：在大蜡螟（G. mellonella）模型中测试抗菌效果时，应分别优化治疗剂量和给药时间，并以前者的优化结果指导后者的剂量选择。
结果
评估 G. mellonella 幼虫体重的批次间差异
感染实验中潜在的非预期变异来源之一是不同实验单位（即幼虫）个体之间以及不同批次之间的体型差异。这种变异的影响可通过根据体重调整处理或感染剂量来减轻，也可通过仅选择处于特定体重范围内的幼虫用于实验来控制。后一种方法更为实用，且可避免在配制剂量过程中可能出现的人为误差。额外称量幼虫的一个优势在于，它能够将施用于幼虫的处理剂量换算为相应的人体等效剂量（mg/kg）。为了量化批次内和批次间的体重变异情况，本研究对在不同时间订购的三批幼虫（每批50只）进行了称重。各组的平均体重分别为225.5 mg、230.54 mg 和 215.86 mg，标准差分别为49.1 mg、53.7 mg 和 44.3 mg（图2A）。批次之间的体重差异无统计学意义。综合所有批次，幼虫体重范围为107.5 mg 至341.0 mg，平均体重为224.0 mg ± 49.2 mg。
为了获得可重复的实验结果，在实验前对幼虫进行称重，并选择体重为224 mg ± 49.2 mg的个体，使体重范围从233.5 mg至98.4 mg缩小，同时剔除33%的幼虫。这与先前的研究结果一致，即当幼虫体重差异超过100 mg时，感染耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）后的存活率存在显著差异14,20。我们还比较了大蜡螟（G. mellonella）在收到时与送达后一周的体重，因为若体重发生显著变化，则在幼虫未立即使用的情况下可能影响实验结果。大蜡螟（G. mellonella）的平均体重为230.54 mg ± 53.7 mg。送达后一周的平均体重为221.8 mg ± 45.7 mg（标准差）（图2B）。到达时与一周后的体重之间无显著差异，因此我们得出结论：在送达后的第一周内，幼虫可在任意时间点用于实验。需要强调的是，这些结果仅代表从单一供应商购买的大蜡螟（G. mellonella），不同供应商之间或不同批次订购的幼虫体重可能存在显著差异。
优化接种密度 P. aeruginosa PAO1
五种病原体的毒力 P. aeruginosa 在四种接种密度下评估了分离株的特性，包括三种常用的实验室菌株PAO1、PA14和PAK，以及两个来自慢性呼吸道感染的临床分离株LESB58和IST27-M。这些菌株是Mahenthiralingam等人开发的与囊性纤维化相关的菌株组合的一部分。.21 并且代表了该物种的全球系统发育关系。在营养肉汤中的初步生长数据显示，慢性感染分离株的生长速率较低（图3）。考虑到这一点， G. mellonella 以每组10个幼虫为单位，分别用10的剂量进行感染1, 102, 103，或 104 每10μl PBS中PAO1、PA14和PAK的CFU/幼虫，剂量为102, 103, 104，或105 每条幼虫CFU数为LESB58和IST27-M。另设两组各10条幼虫仅注射PBS，一组在感染前注射，另一组在感染后注射。感染前注射PBS用于控制PBS污染或针头因接触蜡螟体壁而沾染的微生物污染，感染后注射PBS用于控制针头在感染过程中沾染的细菌污染。PAO1、PA14和PAK的最佳剂量为每条幼虫10 CFU，更高密度会导致 > 18小时时50%死亡（图4）。10 CFU 是可稳定且可重复制备用于感染的最低剂量。为了达到预期的存活动力学，LESB58 和 IST27-M 需要更高的接种剂量，这反映了这些分离株在以下条件下生长较慢且承载能力较低 体外 条件图4）。两者的最佳剂量均为104 CFU/幼虫。LESB58 和 IST27-M 是从慢性感染患者中分离的临床菌株，且既往研究表明，在啮齿类动物模型中，LESB58 的毒力低于 PAO1。22.
妥布霉素和多粘菌素在Galleria mellonella中的毒性测试
在评估新型抗菌化合物的疗效之前，必须通过注射一系列临床相关剂量来评估其毒性，以便在临床前研究的早期阶段排除高毒性的化合物。本研究对妥布霉素和多粘菌素在未感染的G. mellonella幼虫中进行了评估，因为这两种药物常用于治疗囊性纤维化患者（pwCF）的P. aeruginosa感染23。妥布霉素的临床使用剂量范围从无囊性纤维化的重症患者每日3 mg/kg，到囊性纤维化患者每24小时11 mg/kg24,25。这些数值被用作Galleria mellonella给药的参考，选择1 mg/kg、2.5 mg/kg、5 mg/kg、10 mg/kg、25 mg/kg、50 mg/kg、100 mg/kg和250 mg/kg的妥布霉素进行毒性测试。在任何浓度下均未观察到死亡现象。鉴于妥布霉素在高浓度下仍无毒性，进一步评估了多粘菌素的毒性，因为此前报道其在29.8%的囊性纤维化患者中可引起肾毒性或神经毒性，其负荷剂量为2.9 (±1.5) mg/kg，总日剂量为4.1 (±1.1) mg/kg26。因此，多粘菌素成为毒性测试的有价值候选药物，尽管其在人体中的器官特异性毒性提示其毒性可能无法在G. mellonella中完全重现。事实上，当给予1 mg/kg、2.5 mg/kg、5 mg/kg、10 mg/kg、25 mg/kg、50 mg/kg、100 mg/kg和250 mg/kg的多粘菌素时，在72小时内未观察到幼虫死亡。因此，最终以多粘菌素在H2O中的最大溶解度剂量2000 mg/kg进行给药。所有幼虫在12小时内均死亡，证实药物毒性可在G. mellonella中进行评估，但在尝试外推至人体毒性时应保持谨慎。
优化妥布霉素治疗剂量以对抗 P. aeruginosa PAO1 感染
给予一系列具有临床相关性的妥布霉素剂量 P. aeruginosa-感染的幼虫以优化治疗剂量。对于新型抗菌药物，初始剂量可根据类似现有抗生素的临床使用情况或该新型药物的临床前数据（如肉汤稀释法最低抑菌浓度）进行选择。为评估妥布霉素对 P. aeruginosa PAO1 G. mellonella 幼虫感染了10 CFU的 P. aeruginosa PAO1，按先前优化的方法，在感染后2小时分别注射1 mg/kg、2.5 mg/kg或5 mg/kg的妥布霉素。这些剂量的选择依据先前研究 G. mellonella 与妥布霉素联合使用，且与非囊性纤维化患者的妥布霉素当前临床剂量一致24,27,28.
初步成功的标准是与未处理对照组相比，G. mellonella 的存活率提高50%。使用1 mg/kg的妥布霉素处理PAO1菌株对G. mellonella的死亡率影响甚微，感染后28小时死亡率达90%（图5）。使用2.5 mg/kg妥布霉素可延缓死亡，但总体死亡率为80%；而使用5 mg/kg妥布霉素时，幼虫存活率达到最佳的90%。PA14菌株的有效剂量为5 mg/kg，而PAK菌株为2.5 mg/kg。IST27-M菌株所需有效剂量更高，为10 mg/kg；而对于LESB58感染，所有测试浓度的妥布霉素均未能挽救幼虫。该趋势与在阳离子调节的穆勒-欣顿肉汤（cation-adjusted Mueller Hinton broth）中测定的妥布霉素最低抑菌浓度（MIC）值一致：除LESB58菌株的MIC为8 µg/mL外，其余各菌株均仅需1 µg/mL即可抑制90%的菌体生长。因此，初步MIC检测可用于提示不同菌株间的相对耐药性，但不应将其作为确定G. mellonella模型中给药剂量范围的依据，该剂量需单独优化。
优化妥布霉素治疗时机以对抗 P. aeruginosa PAO1 感染
抗生素的临床应用通常不是在感染后数小时内，而是在数天或数周后才开始。然而，在 G. mellonella 模型中，这种延迟给药方式难以实现，因为使用 P. aeruginosa PAO1 感染后 24 小时内即观察到高死亡率。为了提高该感染模型的临床相关性，应尽可能在感染后期给予新型抗菌药物。为优化治疗时机，本研究在 PAO1 感染后的 2 小时、4 小时、6 小时、9 小时和 12 小时，向感染的 G. mellonella 幼虫给予 5 mg/kg 的妥布霉素。实验成功的标准定义为：与仅感染 PAO1 相比，抗生素治疗使存活率提高 >50%。在感染后 9 小时和 12 小时给药虽可延缓死亡，但未能清除感染（图 6）。而在感染后 2 小时、4 小时和 6 小时给药则实现了超过 50% 的存活率。
优化 G. mellonella 实验分组数量
实验分组数量根据 G. mellonella 幼虫感染 10 CFU/幼虫的 P. aeruginosa PAO1 后存活率的观察变异程度计算得出。在不同研究中，分组数量可能因预期未处理对照组与处理组之间的百分比变化不同而有所差异（表1）。计算方法依据 Charan 等人29 所述。所用公式如下所述。
其中：
= 1.96，对应 5% 的 I 类错误水平。
Zβ = 0.842 是提供 80% 统计功效的值。
p1 = 检验组中的事件比例，计算公式为 p2 加上预期的百分比变化
p2 = 对照组（未经处理的感染）中事件所占比例，根据 P. aeruginosa PAO1 在 
时的存活率变异性计算得出。
P = 合并患病率，定义为 (p1 + p2)/2。
图 1：G. mellonella 感染研究示意图。 常规实验流程包括在感染前准备 G. mellonella 幼虫，接种 10 µL 接种物，可在感染后若干小时进行可选治疗，并持续监测幼虫状态。请点击此处查看该图的放大版本。
图 2：Galleria mellonella 幼虫体重的批次和时间依赖性变化。（A）三个批次共50只 Galleria mellonella 幼虫在收到时立即称重的体重数据。每个批次在不同时间订购。通过单因素方差分析（one-way ANOVA）计算，各批次间体重差异无统计学意义（P > 0.05）。（B）50只幼虫在收到时称重，与同一批次在一周后再次称重的体重比较。通过Student's t-test 分析，体重差异无统计学意义（P > 0.05）。ns：无显著性差异。请点击此处查看该图的放大版本。
图3：生长曲线 P. aeruginosa 菌株 PAO1， PA14、PAK、LESB58 和 IST27-M。 每种菌株均在LB培养基中培养，起始OD600 0.08–0.13，以及OD600 随后在37 °C静置培养24 h期间，每隔15 min测定一次。 请点击此处以查看此图的放大版本。
图4接种密度的优化 铜绿假单胞菌 用于感染的菌株 Galleria mellonella 幼虫 存活率 Galleria mellonella 幼虫在每只幼虫注射不同浓度的菌落形成单位（CFU）后的反应。所测试的接种浓度分别为10、10²、10³或10⁴ CFU/幼虫。4 每条幼虫的菌落形成单位（CFU）A) PAO1, (B) PA14，或（CPAK，以及10²、10³、104，或 105 每条幼虫的菌落形成单位（CFU）D) LESB58 和 (E) IST27-M。每组使用十只幼虫，每只幼虫在右后侧腹足注射10 µL接种物。感染后16小时开始，每30分钟监测一次存活情况，并记录死亡时间。通过Log-rank（Mantel-Cox）检验确定，所有菌株均表现出剂量依赖性毒力。 P < 除PAK 10外，所有菌株内剂量比较均为0.051 与PAK 102，PAK 103 与PAK 104，LESB58 104 与. LESB58 105，以及 IST27-M 103 与. IST27-M 104，差异不显著。该图代表三次生物学重复实验的结果。 请点击此处以查看此图的放大版本。
图5：存活率 大蜡螟 注射后的幼虫 P. aeruginosa 菌株分组及感染后2小时用硫酸妥布霉素处理 10 G. mellonella 每实验组幼虫感染10 CFU的（A) PAO1, (B) PA14，或（CPAK 或 103 菌落形成单位（CFU）的D) LESB58 或 (E每条幼虫注射 10 µL PBS 中含 IST27-M。感染部位为左后侧腹足。感染后 2 小时，PAO1、PA14 和 PAK 菌株分别注射 10 µL PBS 作为无处理对照组，或注射 1 mg/kg、2.5 mg/kg 或 5 mg/kg 妥布霉素；LESB58 和 IST27-M 菌株则根据图示分别接受 10 µL PBS、1 mg/kg、2.5 mg/kg、5 mg/kg、10 mg/kg、20 mg/kg 或 40 mg/kg 妥布霉素处理。妥布霉素用蒸馏水稀释，注射于右后侧腹足。持续监测存活情况，并记录死亡时间。显著性分析采用 log-rank（Mantel-Cox）检验 对比. 每种菌株的PBS对照。ns：无显著性差异，*P < 0.05, **P < 0.005, ***P < 0.0005 ****P < 0.0001。该图像代表三次生物学重复实验的结果。 请点击此处以查看此图的放大版本。
图6：存活率 Galleria mellonella 感染后幼虫 铜绿假单胞菌 PAO1 感染后，在不同时间点给予妥布霉素治疗。 10 G. mellonella 每个实验组的幼虫在后右腹足注射10 µL含10 CFU PAO1的PBS进行感染。感染后2 h、4 h、6 h、9 h或12 h，在后左腹足注射10 µL含5 mg/kg硫酸妥布霉素的蒸馏水。持续监测幼虫存活情况，并记录死亡时间。采用Log-rank（Mantel-Cox）检验进行显著性分析 与. 未经处理的对照组。***P < 0.0005, ****P < 0.0001。该结果来自三次生物学重复实验，具有代表性。 请点击此处以查看此图的放大版本。
| 预期生存率变化 (%) | 组大小 |
| 30 | 26 |
| 40 | 18 |
| 50 | 13 |
| 60 | 10 |
| 70 | 8 |
| 80 | 6 |
| 90 | 5 |
| 100 | 4 |
表1：在用10 CFU/幼虫的 P. aeruginosa PAO1 感染 G. mellonella 幼虫并随后给予某种处理剂的 G. mellonella 存活实验中，各实验组的样本数量。
讨论
抗菌耐药性（AMR）的负担持续增加。2019年，全球估计有495万人的死亡与AMR相关30。到2050年，由AMR导致的死亡人数预计将达到1000万31。为应对这一风险，必须高效且 经济地开发和测试新型抗菌药物，这就需要使用能够准确预测抗菌效果的临床前模型。在向临床试验转化过程中观察到的高失败率是一个主要限制因素。一项研究描述了13种在临床试验中失败的抗生素候选药物，其中11种未能进入II期临床试验32。
G. mellonella 的临床前抗菌药物筛选研究具有重要优化价值，本研究为此提供了一个框架，并建立了一种评估抗菌效果的方法。G. mellonella 幼虫在药物毒性评价、最小抑菌浓度（MIC）测定以及毒力测试方面具有广泛应用，同时有助于减少临床前研究中哺乳动物的使用。Galleria mellonella 幼虫通量相对较高，生物学相关性强，且能很好地转化为更复杂的哺乳动物模型。相比之下，每只野生型实验小鼠的成本在 £8 至 £30 之间，每只小鼠每周的维持费用约为 £7，而 50 条 G. mellonella 幼虫的成本约为 £2。因此，在 G. mellonella 模型中测试 10 种化合物的成本约为 £60，而在小鼠中进行相同研究的成本则超过 £4000。此外，已有研究对比了新型化合物的毒性和疗效，并发现 G. mellonella 与小鼠在急性毒性之间存在相关性8,19,33。因此，建议采用 G. mellonella 筛选模型优先选择需在小鼠模型中进一步测试的化合物。
尽管该模型具有明确的实用性，但在成功应用时仍需考虑若干因素。由于缺乏可用于研究的无菌幼虫，实验前的准备工作较为复杂，必须使用乙醇进行消毒，或者研究人员需自行维持G. mellonella种群，这可降低污染风险并提高整体实验质量5,6。消毒不当会导致较高的死亡率，而完全灭菌也存在困难，因为乙醇暴露时间过长会致死幼虫。替代的消毒方法包括在感染前用70%乙醇擦拭每只幼虫的腹足，这种方法可降低消毒过程中的死亡率，但操作更为耗时费力。也可使用其他抗菌剂进行消毒，但本研究未评估任何替代方案，因为在优化条件下，乙醇消毒的死亡率可控制在<10%。此外，供应商是否对其G. mellonella使用抗生素通常并不明确，因为供应商可能从其他供应商处采购幼虫，而非自行维持种群。
G. mellonella 生物学特性与哺乳动物存在显著差异，这限制了其应用价值。它们缺乏适应性免疫系统，尽管先天性免疫的关键可溶性成分和细胞成分仍然存在。血细胞是其先天性免疫防御的主要组成部分 G. mellonella 并表现出类似吞噬细胞的特性. 已描述了这些细胞的多种亚群，包括粒细胞和浆细胞等。34. G. mellonella 也无法重现相关感染部位，例如呼吸道或膀胱感染的感染位点。然而，在临床前研究流程中， G. mellonella 可作为小鼠模型的初步筛选，确保仅有最具前景的化合物进入更接近人类感染环境的复杂哺乳动物系统。最后，该模型还需对大蜡螟（G. mellonella）进行进一步的基因组学表征，以评估其在检测临床相关生物标志物变化方面的适用性。特别是，这需要加深我们对 G. mellonella 免疫
总体而言，Galleria mellonella 感染模型是一种在哺乳动物模型评估之前对新型抗菌化合物进行临床前评价的有力工具。尽管其应用受到供应标准化不足的限制，但该模型具有高通量、操作简便等优点，可广泛应用于抗菌药物研发的各个领域。未来，若能将该模型整合到标准化的临床前研究流程中，将有望加快新型抗菌化合物的开发进程，提高从临床前评估进入临床试验阶段的候选药物比例。
披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
TB、AK、JF 和 DN 获得了战略研究中心（SRC）的资助支持 "囊性纤维化中抗菌治疗药物开发的循证临床前研究框架" （PIPE-CF；项目编号：SRC 022）由英国囊性纤维化信托基金和美国囊性纤维化基金会资助。LD 和 JF 感谢肾脏研究西北部（项目编号：49/19）提供的经费支持。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 22号规格，小头RN针头，2英寸，2型针尖 | Hamilton | 7758-03 | 用于替换Hamilton注射器。 |
| 细菌感染菌种 | 已知浓度（CFU/mL）的细菌菌种，在对数生长期中期冷冻保存。 | ||
| 乙醇 | 费舍尔科技公司 | 10610813 | 可使用其他厂商的产品。 |
| G. mellonella 幼虫 | Livefoods | 5.06045E+12 | 对于该供应商，订单标注为 “实验室用新批次”。截至2024年4月，新批次于每周一送达供应商，建议在当日下单，以便周三收货。 |
| 微量注射器 | Hamilton | 80630 | 80630型注射器容量为100 µL。其他容量型号也存在，例如80430、80530或80730。 |
| 培养皿 | 费舍尔科技公司 | 12674785 | 可使用其他厂商的产品。 |
参考文献
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