微流控技术在血小板功能评估中的应用

摘要

利用微流控装置可评估血小板在流动条件下的功能，并模拟止血复苏过程，该技术在创伤和输血医学中具有应用价值。

摘要

微流控技术结合了生理相关的基质和流动条件，可模拟血管系统，因此是研究血栓形成和止血过程的有力工具。在模拟动脉血流的高剪切环境中，微流控检测能够促进血小板功能的研究，因为富含血小板的血栓会在流动通道的局部狭窄区域形成。使用可处理小样本体积的装置，还能进一步帮助评估来自样本量有限的患者或动物模型在流动条件下的血小板功能。研究创伤患者样本或血小板输注后的样本，可能有助于为血小板功能至关重要的患者群体制定治疗策略。该模型还可用于研究药物介导的血小板抑制效应。本实验方案的目标是建立一个整合生理流动、生物表面以及相关止血机制的微流控平台，以评估血小板功能，进而应用于创伤诱导凝血功能障碍和输血医学的研究。

引言

创伤是全球范围内导致死亡和残疾的主要原因。严重损伤常伴随一种独特的内源性止血和血栓功能紊乱，称为创伤诱导性凝血病（TIC）¹。血小板在TIC中发挥关键作用，其功能既可表现为适应性，也可表现为失适应性²。损伤后血小板功能障碍的机制尚不明确，迫切需要更深入地理解细胞层面的应答，以指导更有效的复苏策略和治疗方案的开发。关于损伤后血小板功能的另一个棘手问题是，目前用于评估创伤患者血小板功能的检测指标的可靠性仍存在不确定性。

多项研究表明，即使是没有已知临床出血表型的轻度损伤患者，在使用常规血小板功能检测方法（如聚集测定法）时也表现出异常的血小板功能^3,4。然而，聚集测定法在评估损伤状态下血小板功能时存在若干局限性，包括缺乏生理相关的损伤表面、激动剂刺激的简化模式、全血阻抗聚集测定中的样本稀释、光学透光率聚集测定中的血浆分离，以及静态样本检测。此外，这种血小板功能的敏感性变化究竟反映的是真实的细胞功能障碍，还是损伤环境下的一种检测假象（例如基础电阻力升高），目前尚不明确²。因此，在创伤背景下研究相关的血小板功能对于理解创伤性凝血病（TIC）至关重要，该领域仍有巨大的创新与改进空间。

方案

所有研究均按照机构指南进行。已获得匹兹堡大学人类研究保护办公室的批准，并取得了健康人类志愿者的知情同意。

1. 微流控装置制备

1. 为了制备装置的PDMS部分，使用黄铜通过计算机数控（CNC）微加工技术制备母模。
   注意：根据通道尺寸，也可采用光刻技术制备母模。本方案中使用的装置包含八个平行的微加工通道，其宽度约为480 µm，在装置入口和出口处高度约为140 µm，在狭窄区域高度为40 µm，狭窄区前后斜坡长度约为0.3 mm。通道长度约为6 mm。
2. 获得母模后，将硅弹性体基质（来自弹性体试剂盒）倒入称量皿中。按10:1（基质与固化剂比例）加入硅固化剂（来自弹性体试剂盒），该固化剂可促进硅聚合物链的交联，使液态PDMS转变为耐用且柔韧的固体，并充分搅拌混合物。
3. 将模具放入培养皿中，并将未固化的PDMS浇注到模具上。将培养皿置于真空干燥器中30分钟，以去除气泡。
4. 将带有PDMS的母模放入设定为70 °C的烘箱中，继续固化90分钟。
5. PDMS完全固化后，使用剃刀片或手术刀切割出微流控芯片。在通道边缘打孔（两侧直径均为1.5 mm）。
6. 使用实验室胶带清洁载玻片表面以及微流控芯片的刻蚀面。根据需要使用压缩空气去除残留碎屑。
7. 将载玻片和刻蚀面向上的微流控芯片放入等离子清洗机中。启动真空泵，密封腔室，并将等....

结果

采用该方法后，微流控实验应显示在流动通道狭窄区域形成富含血小板的血栓（图1）。图1A展示了代表性结果，其中功能正常的血小板在通道狭窄区域形成血栓，从而阻断通道内的血流。实验期间采集的动力学图像的平均荧光强度（MFI）曲线显示出血小板在血栓生长过程中经历延迟期、生长期和平台期（图2A、C）。随着P2Y12拮抗剂替格瑞洛浓度的增加，血小板MFI值以及MFI曲线下的计算面积（AUC）均下降（图2B、D）。与5分钟孵育相比，需要更长的孵育时间（30分钟）才能观察到明显的血小板功能障碍，这与在30分钟替格瑞洛孵育后使用全血阻抗聚集测定法所显示的更显著的剂量-反应关系一致（补充图S1）。在不同载体条件下，微流控模型中也观察到P2Y12抑制作用具有类似的时间依赖性效应（补充图S2）.......

讨论

上述方案包含若干关键步骤，以确保实验的可靠性和可重复性。首先，应谨慎选择荧光抗体。用于检测样本中血小板的抗体不应阻断糖蛋白Ib（GPIb）血小板受体的功能。在不同实验之间尽可能使用同一批号的抗体，对于确保荧光信号的可重复性也至关重要。本方案中的另一个关键步骤是尽可能使用无菌耗材和溶液，并对样本进行过滤处理。在实验前立即过滤血液样本，可防止大于微流控通道尺寸的碎片或血小板聚集体堵塞流路，而流路通畅是保证各次实验间条件一致的另一关键参数。此外，除研究血液制品储存损伤的情况外，血液样本应在采集后4小时内完成检测，此要求依据AABB、美国红十字会、美国血液中心以及武装部队血液计划联合编制的《人血及血液成分使用信息通告》中的规定。

本方案中可考虑进行一些修改，例如将PDMS键合到盖玻片上以用于共聚焦显微镜观察，如图3C所示。如有必要，在成像前可通过通道灌注固定液，并用PBS洗涤，以便在成像前保存样品。此外，尽管可重复的通道尺寸对于确保不同条件下剪切速率的一致性至关重要，但狭窄区域的高度可以调整，不过这将直接影响血栓形成的时间进程，即.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
仪器
Axio Observer	Zeiss	491917-0001-000
Bel-Art Space Saver 真空干燥器	Fisher Scientific	08-594-15A
Fisherbrand Isotemp 数字加热磁力搅拌器	Fisher Scientific	FB30786161
往复式混合器	Fischer Scientific	88-861-043
OHAUS Scout 电子天平	Uline	H-5852
烘箱	Fisher Scientific	15-103-0520
等离子清洗仪	Harrick	PDC-32G (115V)
注射泵（PHD ULTRA CP，I/W 可编程）	Harvard Apparatus	883015
Zen 3.4	Zeiss	Blue edition	软件
材料
1/16 英寸内径 - 带凸缘弯头接头	Qosina	11691
10 mL 注射器	Fischer Scientific	14-955-459
2-羟丙基-β-环糊精	Cayman Chemicals	16169	溶于磷酸盐缓冲液，浓度为 30%
40 微米滤膜	Fischer Scientific	NC1469671
CD41 抗体	Novus Biologicals	NB100-2614	全血中稀释比例为 1:600
Chrono-Par 胶原试剂	Chrono Log Corporation	385	0.9% 生理盐水中稀释比例为 1:5
Electron Microscopy Sciences Miltex 带推杆活检打孔器，3.0 mm	Fisher Scientific	NC0856599
Eppendorf Snap-Cap 微量离心管（SafeLock），1.5 mL	Fisher Scientific	05-402-25
Essendant 121 盎司 Clorox 杀菌漂白剂	Fischer Scientific	50371500
乙醇	Fisher Scientific	07-678-005	70%
Falcon Safety Dust Off DPSXLRCP 压缩气体	Supra	1381978
Human TruStain	Biolegend	422302	全血中稀释比例为 1:600
LevGo smartSpatula 一次性聚丙烯刮刀	Fisher Scientific	18-001-017
显微镜载玻片	Fisher Scientific	12-550-A3
磷酸盐缓冲液	Gibco	10010-023
安全手术刀	Fisher Scientific	22-079-718
生理盐水	Millipore	567442	0.90%
Sartorius 聚苯乙烯称量舟	Fisher Scientific	13-735-744
Superslip 盖玻片 - Superslip No. 1.5	Fisher Scientific	12-541-055
SYLGARD 184 硅橡胶弹性体试剂盒	Fisher Scientific	NC9285739	聚二甲基硅氧烷（PDMS）
替格瑞洛	Cayman Chemicals	15425
Tygon PVC 透明管，1/16" 内径，1/8" 外径，50 英尺长	McMaster-Carr	6516T11
可超精密加工 360 黄铜棒	McMaster-Carr	8954K721	用于母模制作
真空采血管	BD	363083
World Precision Instrument 可重复使用活检打孔器，1.5 mm	Fisher Scientific	NC1215626