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方法文章

微流控技术在血小板功能评估中的应用

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DOI：

10.3791/67214

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2024年11月8日

 ,  ,  ,  ,  , 
1Trauma and Transfusion Medicine Research Center, Department of Surgery, University of Pittsburgh

本文内容

摘要

利用微流控装置可评估血小板在流动条件下的功能，并模拟止血复苏过程，该技术在创伤和输血医学中具有应用价值。

摘要

微流控技术结合了生理相关的基质和流动条件，可模拟血管系统，因此是研究血栓形成和止血过程的有力工具。在模拟动脉血流的高剪切环境中，微流控检测能够促进血小板功能的研究，因为富含血小板的血栓会在流动通道的局部狭窄区域形成。使用可处理小样本体积的装置，还能进一步帮助评估来自样本量有限的患者或动物模型在流动条件下的血小板功能。研究创伤患者样本或血小板输注后的样本，可能有助于为血小板功能至关重要的患者群体制定治疗策略。该模型还可用于研究药物介导的血小板抑制效应。本实验方案的目标是建立一个整合生理流动、生物表面以及相关止血机制的微流控平台，以评估血小板功能，进而应用于创伤诱导凝血功能障碍和输血医学的研究。

引言

创伤是全球范围内导致死亡和残疾的主要原因。严重损伤常伴随一种独特的内源性止血和血栓功能紊乱，称为创伤诱导性凝血病（TIC）1。血小板在TIC中发挥关键作用，其功能既可表现为适应性，也可表现为失适应性2。损伤后血小板功能障碍的机制尚不明确，迫切需要更深入地理解细胞层面的应答，以指导更有效的复苏策略和治疗方案的开发。关于损伤后血小板功能的另一个棘手问题是，目前用于评估创伤患者血小板功能的检测指标的可靠性仍存在不确定性。

多项研究表明，即使是没有已知临床出血表型的轻度损伤患者，在使用常规血小板功能检测方法（如聚集测定法）时也表现出异常的血小板功能3,4。然而，聚集测定法在评估损伤状态下血小板功能时存在若干局限性，包括缺乏生理相关的损伤表面、激动剂刺激的简化模式、全血阻抗聚集测定中的样本稀释、光学透光率聚集测定中的血浆分离，以及静态样本检测。此外，这种血小板功能的敏感性变化究竟反映的是真实的细胞功能障碍，还是损伤环境下的一种检测假象（例如基础电阻力升高），目前尚不明确2。因此，在创伤背景下研究相关的血小板功能对于理解创伤性凝血病（TIC）至关重要，该领域仍有巨大的创新与改进空间。

传统上用于研究血小板功能的平台未包含流体动力学和流动因素，而这些因素在理解与创伤及创伤性凝血病相关的血小板功能障碍方面可能至关重要5。依赖于流动的止血机制包括：在高于临界剪切速率的高剪切条件下冯·威尔勒布兰德因子（von Willebrand factor, VWF）的伸展，以及通过糖蛋白1b介导的血小板捕获6,7,8，而静态的血小板功能检测方法无法捕捉这些过程。此外，血小板根据流动状态优先结合VWF或纤维蛋白原，并在动脉性与静脉性血栓形成中发挥不同的作用9,10。动脉血栓主要由血小板构成，而静脉血栓则主要由红细胞构成，部分原因在于不同的流动状态11。包含流动状态的检测方法有助于阐明与TIC表型谱相关的功能障碍，从低凝状态和出血表型到高凝状态和血栓表型。最后，创伤患者群体中的血液采样量受限，可能使传统的血小板功能检测面临挑战。尽管在此类情况下可以且应当使用流式细胞术等检测方法，但其结果通常仅反映样本的物理特征，而非止血功能的评估。

尽管创伤中血小板功能障碍的机制尚未完全明确，但对血小板功能障碍进行建模 体外，例如使用P2Y12拮抗剂，也有助于指导治疗性干预措施的研究。在创伤患者中，止血性复苏至关重要，此时采用平衡输注策略，通过输注全血或血液成分（红细胞、血浆和血小板浓缩物），以1:1:1的单位比例来纠正休克、凝血功能障碍和内皮损伤12,13,14在创伤患者中，早期使用血液制品与生存率提高相关15,16为延长保存期限，越来越多的研究关注冷藏血小板制品。对冷藏血小板的检测显示，其止血活性增强，在创伤后输注时也具有安全性。17,18.

冷藏血小板复苏的发展凸显了进一步检测的必要性，以明确当前可用于创伤救治的最有效血小板制品。然而，传统的血小板功能检测方法往往在检测功能障碍方面存在过度或不足的敏感性，这种功能障碍既可能出现在接受治疗性血小板输注的创伤患者中，也可能存在于血小板储存损伤所致的输注产品本身。鉴于现有血小板功能检测方法的局限性，包括大多数检测的静态特性，确定功能障碍的来源可能具有挑战性。因此，在研究止血复苏时 体外因此，受体和供体血小板群体的检测平台与检测方法对于确定最佳治疗干预措施至关重要。

微流控检测通过提供流动轮廓和生物保真表面，构建出具有生理相关性的检测体系，用于研究血小板功能。微流控装置可进行定制化设计，以研究特定的病理生理过程或损伤类型，例如血管穿刺19或内皮损伤20。这类装置通常由聚二甲基硅氧烷（PDMS）与经表面修饰的玻璃载玻片键合而成，表面修饰物（如胶原蛋白）可模拟内皮下层和组织损伤。利用此类基于流动的装置，有助于指导与创伤相关的血小板功能障碍研究，并推动优化输血医学策略以改善血小板功能障碍。这些方法可能有助于澄清当前关于静态血小板检测（如聚集测定法）在创伤患者中应用价值的争议。

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方案

所有研究均按照机构指南进行。已获得匹兹堡大学人类研究保护办公室的批准，并取得了健康人类志愿者的知情同意。

1. 微流控装置制备

  1. 为了制备装置的PDMS部分，使用黄铜通过计算机数控（CNC）微加工技术制备母模。
    注意：根据通道尺寸，也可采用光刻技术制备母模。本方案中使用的装置包含八个平行的微加工通道，其宽度约为480 µm，在装置入口和出口处高度约为140 µm，在狭窄区域高度为40 µm，狭窄区前后斜坡长度约为0.3 mm。通道长度约为6 mm。
  2. 获得母模后，将硅弹性体基质（来自弹性体试剂盒）倒入称量皿中。按10:1（基质与固化剂比例）加入硅固化剂（来自弹性体试剂盒），该固化剂可促进硅聚合物链的交联，使液态PDMS转变为耐用且柔韧的固体，并充分搅拌混合物。
  3. 将模具放入培养皿中，并将未固化的PDMS浇注到模具上。将培养皿置于真空干燥器中30分钟，以去除气泡。
  4. 将带有PDMS的母模放入设定为70 °C的烘箱中，继续固化90分钟。
  5. PDMS完全固化后，使用剃刀片或手术刀切割出微流控芯片。在通道边缘打孔（两侧直径均为1.5 mm）。
  6. 使用实验室胶带清洁载玻片表面以及微流控芯片的刻蚀面。根据需要使用压缩空气去除残留碎屑。
  7. 将载玻片和刻蚀面向上的微流控芯片放入等离子清洗机中。启动真空泵，密封腔室，并将等离子清洗机调至高功率档位。将载玻片和PDMS在等离子清洗机中处理30秒，然后关闭等离子清洗机并解除真空。
  8. 通过轻轻按压在等离子清洗机中朝上的表面，将经等离子处理的芯片与载玻片键合在一起。随后将微流控装置置于70 °C的烘箱或加热板上10分钟。
    注意：键合芯片与载玻片时切勿施加过大压力，以免导致通道形貌受损。
  9. 用10–30 µL的70%乙醇冲洗每个腔室以进行灭菌，并将微流控装置置于70 °C加热板上干燥。
    注意：装置应至少提前24小时制备，也可提前数周至数月制备。装置应储存在密闭容器或加盖的培养皿中，于室温保存。
  10. 在使用微流控装置进行实验的前一天，再次用10–30 µL的70%乙醇冲洗每个腔室以灭菌，并将装置置于70 °C加热板上干燥。
  11. 通过指定出口向指定入口注入经0.9% NaCl按1:5体积比稀释的1型马纤维胶原试剂（1 mg/mL）对腔室进行包被。确保实验内包被方向保持一致。将装置存放在温暖、湿润且密闭的容器中，以防止通道内包被的胶原蒸发。
  12. 1小时后，用磷酸盐缓冲液（PBS）冲洗以清除胶原溶液。冲洗方向应与包被方向相反。不使用时，再次将装置存放在温暖、湿润且密闭的容器中。

2. 血液样本制备

  1. 通过静脉穿刺获取枸橼酸盐抗凝的全血样本。将枸橼酸盐抗凝全血与Fc受体阻断溶液（1:600）孵育。
    注意：血液样本在实验前及实验过程中均于室温保存。
  2. 将枸橼酸盐抗凝全血与荧光标记（选用所需的荧光染料）的CD41抗体（1:600）孵育，在旋转摇床上染色30分钟。
  3. 作为血小板抑制的阳性对照，加入用含30% w/v 2-羟丙基-β-环糊精（HP-β-CD）的PBS溶液配制的P2Y12受体拮抗剂替卡格雷。
    注意：替卡格雷储备液浓度最高可达6.4 mM，可在实验前用HP-β-CD溶液（30% HP-β-CD溶于PBS）进一步稀释（建议配制1,000倍浓度的储备液）。
  4. 将枸橼酸盐抗凝样本与替卡格雷（终浓度最高达6.4 µM）孵育30分钟，以观察血小板抑制效果。
  5. 若需将血液制品与枸橼酸盐抗凝样本混合，则先用Fc受体阻断溶液（1:600）及荧光标记（使用与枸橼酸盐样本不同的特异性荧光染料）的CD41抗体（1:600）对血液制品进行染色。
    1. 将输注用血液制品按体积等比例与枸橼酸盐抗凝样本混合。例如，为模拟向出血患者输注2个单位的血小板制品（每个制品约250 mL，总血容量为5,000 mL），可将100 µL血液制品加入1,000 µL枸橼酸盐抗凝全血样本中。
  6. 实验前立即将血液样本通过40 µm滤膜过滤至无菌的1.5 mL微量离心管中。

3. 流动条件下的血小板功能检测（方法1）

  1. 打开显微镜及相关软件。
  2. 将微量注射泵的吸液水平与显微镜载物台对齐，并调节注射泵的设置。
    1. 利用公式（1）和（2）21，计算在微流控通道狭窄区域实现目标平均管壁剪切速率（γ）为 3,500 s-1 所需的体积流速（Q）。
      流体动力学方程 Q=γ8A²/Pλ，用于说明流体力学原理。     (1)
      用于物理研究分析中光学测量的波长公式 λ 计算方程。     (2)
      其中 A 为通道的横截面积，P 为润湿周长，λ 为形状因子，b 为矩形的短边（高度），a 为矩形的长边（宽度）。
      注意：选择 3,500 s-1 的剪切速率是基于 VWF 的临界剪切阈值，且该值处于动脉血流范围7,22,23。
  3. 将微流控装置放置在显微镜载物台上，并用胶带固定装置边缘以防止移动。确保出口朝向显微镜后方。
  4. 将一段内径为 1/16”的管路（长约 30 cm）一端连接至弯头接头，另一端连接至带有内径为 1/16” 接头的 10 mL 注射器。
  5. 用无菌 PBS 填充注射器，并将其连接至注射泵。
  6. 将弯头接头插入装置的出口端。
  7. 准备长约 10 cm 的进样管路，一端装有弯头接头，另一端为斜切口。
  8. 将进样端的弯头接头插入装置的进样口。
  9. 将进样管路置于倾斜支架上的废液微量离心管中。
  10. 使用 10 倍物镜（适用于宽度约为 500 µm 的通道），聚焦于微流控装置通道的边缘。
  11. 手动推动注射泵，用 PBS 预润湿管路，并清除通道中可能存在的 PDMS 碎屑或其他杂质。务必检查通道入口和出口附近区域。
  12. 打开已保存的图像采集设置，或创建一个图像采集程序，用于以明场通道和与血液样本中使用的荧光 CD41 抗体相对应的荧光通道，每 1–2 秒采集一次时间序列图像。
  13. 获取过滤后的枸橼酸抗凝血液样本，并在实验开始前通过移液器反复吹打混匀。将样本置于倾斜的微量离心管支架上。
  14. 将进样管路插入样本中。
  15. 开始记录图像采集。
  16. 缓慢回抽注射器，以填充管路中的死体积。一旦血液到达通道，立即点击注射泵上的 播放 按钮，恢复至目标剪切速率下的流动。
  17. 根据需要调整焦距。
  18. 持续运行实验，直至血小板完全阻塞微流控装置的狭窄区域，或达到预设的实验终点（例如 10 分钟）。
  19. 在整个实验过程中，确保进样管路始终浸没在血液样本中。
  20. 实验结束后，停止图像采集并关闭注射泵，保存所采集的图像数据。
  21. 移除进样端的弯头接头，并将管路内容物排入废液锥形管中。同时将注射器及出口管路中的残留液体也排入废液锥形管。
  22. 根据需要为后续样本更换进样和出样接头及管路。

4. 使用小体积样本（低于1 mL）在流动条件下进行血小板功能检测（方法2）

  1. 重复上述步骤 1.1 至 1.4。
  2. 在通道边缘打孔，出口直径为 1.5 mm，进口直径为 3 mm。
  3. 重复上述步骤 1.6 至 3.6。
  4. 使用 10 倍物镜观察宽度约为 500 µm 的通道，并聚焦于微流控装置通道的边缘。
  5. 通过手动推进注射泵并用实验室擦拭纸吸除多余液体，清除通道内的任何 PDMS 或碎片；使用实验室胶带清除微流控装置顶部的任何残留物。
  6. 手动推进泵，使 PBS 填充 3 mm 的进口储液池。
  7. 打开已保存的图像采集设置，或创建一个图像采集程序，用于每 1–2 秒采集一次明场通道和与血液样本中使用的荧光 CD41 抗体相对应的荧光通道的时间序列图像。
  8. 启动注射泵的回抽（手动或设定速度），当 PBS 开始进入通道且储液池中的液面开始下降时，暂停泵的回抽操作。
  9. 用移液器去除储液池中多余的 PBS。
  10. 开始图像采集。
  11. 将血液样本移入储液池（约 40 μL），并立即启动回抽注射器，确保流动开始。
    注意：如果在步骤 4.8 中未对回抽注射泵电机进行预填充，则流动不会立即开始，应重复实验。
  12. 在整个实验过程中持续补充血液储液池，确保无气泡进入通道。
  13. 运行实验直至血小板完全阻塞微流控装置的狭窄区域，或达到预设的实验终点（例如 10 分钟）。
  14. 实验完成后，停止图像采集并关闭注射泵，保存图像数据。
  15. 用移液器去除储液池中多余的血液，并将回抽管路中的内容物排入废液离心管中。
  16. 根据需要更换连接器和管路，以用于后续样本。

5. 去污染

  1. 通过将液体冲洗至10%的漂白溶液中，清除入口和出口管路中的血液。
  2. 如果微流控装置上的所有通道均已使用，则将该装置丢弃至锐器生物危害废物容器中。
    注意：所有生物废弃物均应按规定妥善处置于生物危害废物容器中。

6. 图像分析

  1. 使用软件通过点击导出动力学实验的图像 文件 | 导出/导入 | 导出.
  2. 选择以下参数：文件类型：标签图像文件格式 (TIFF)；压缩方式：LZW；勾选 原始数据 和 移动像素；取消勾选 应用显示曲线和通道颜色；检查 定义子集 （区域，矩形区域，并在各实验条件下选择具有相同宽度和高度测量值的通道区域）。导出至目标文件夹并检查 创建文件夹.
  3. 注意软件中显示的以下实验数值： 起始帧 当 血液进入通道; 帧率 (信息, 时间序列).
  4. 使用所提供的 Matlab 代码，测量实验中每帧的归一化平均荧光强度 补充文件 1，为每次实验更改以下输入： 起始帧/结束帧 根据实验时长（确保不同条件之间的实验时长保持一致）； 实验名称/文件夹名称; 裁剪 X、Y、H 和 W参数运行代码，分别针对受体血小板荧光通道和产物血小板荧光通道各运行一次。报告 标准化 MFI（第 2 列） 和 标准化AUC值 （归一化至起始帧）将实验时长值从归一化的AUC值中减去。

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结果

采用该方法后，微流控实验应显示在流动通道狭窄区域形成富含血小板的血栓（图1）。图1A展示了代表性结果，其中功能正常的血小板在通道狭窄区域形成血栓，从而阻断通道内的血流。实验期间采集的动力学图像的平均荧光强度（MFI）曲线显示出血小板在血栓生长过程中经历延迟期、生长期和平台期（图2A、C）。随着P2Y12拮抗剂替格瑞洛浓度的增加，血小板MFI值以及MFI曲线下的计算面积（AUC）均下降（图2B、D）。与5分钟孵育相比，需要更长的孵育时间（30分钟）才能观察到明显的血小板功能障碍，这与在30分钟替格瑞洛孵育后使用全血阻抗聚集测定法所显示的更显著的剂量-反应关系一致（补充图S1）。在不同载体条件下，微流控模型中也观察到P2Y12抑制作用具有类似的时间依赖性效应（补充图S2）...

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讨论

上述方案包含若干关键步骤，以确保实验的可靠性和可重复性。首先，应谨慎选择荧光抗体。用于检测样本中血小板的抗体不应阻断糖蛋白Ib（GPIb）血小板受体的功能。在不同实验之间尽可能使用同一批号的抗体，对于确保荧光信号的可重复性也至关重要。本方案中的另一个关键步骤是尽可能使用无菌耗材和溶液，并对样本进行过滤处理。在实验前立即过滤血液样本，可防止大于微流控通道尺寸的碎片或血小板聚集体堵塞流路，而流路通畅是保证各次实验间条件一致的另一关键参数。此外，除研究血液制品储存损伤的情况外，血液样本应在采集后4小时内完成检测，此要求依据AABB、美国红十字会、美国血液中心以及武装部队血液计划联合编制的《人血及血液成分使用信息通告》中的规定。

本方案中可考虑进行一些修改，例如将PDMS键合到盖玻片上以用于共聚焦显微镜观察，如图3C所示。如有必要，在成像前可通过通道灌注固定液，并用PBS洗涤，以便在成像前保存样品。此外，尽管可重复的通道尺寸对于确保不同条件下剪切速率的一致性至关重要，但狭窄区域的高度可以调整，不过这将直接影响血栓形成的时间进程，即...

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披露

作者声明无利益冲突。

致谢

作者谨此致谢所有参与研究的献血者，以及创伤与输血医学研究实验室的采血人员和匹兹堡大学医学中心蒙特菲奥雷临床与转化研究中心在样本采集过程中提供的协助。SMS 获 K25HL161401 项目资助。MDN 获 1R01HL166944-01A1 项目资助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
仪器
Axio ObserverZeiss491917-0001-000
Bel-Art Space Saver 真空干燥器Fisher Scientific08-594-15A
Fisherbrand Isotemp 数字加热磁力搅拌器Fisher ScientificFB30786161
往复式混合器Fischer Scientific88-861-043
OHAUS Scout 电子天平UlineH-5852
烘箱Fisher Scientific15-103-0520
等离子清洗仪HarrickPDC-32G (115V)
注射泵（PHD ULTRA CP，I/W 可编程）Harvard Apparatus883015
Zen 3.4ZeissBlue edition软件
材料
1/16 英寸内径 - 带凸缘弯头接头Qosina11691
10 mL 注射器Fischer Scientific14-955-459
2-羟丙基-β-环糊精Cayman Chemicals16169溶于磷酸盐缓冲液，浓度为 30%
40 微米滤膜Fischer ScientificNC1469671
CD41 抗体Novus Biologicals NB100-2614全血中稀释比例为 1:600
Chrono-Par 胶原试剂Chrono Log Corporation3850.9% 生理盐水中稀释比例为 1:5
Electron Microscopy Sciences Miltex 带推杆活检打孔器，3.0 mmFisher ScientificNC0856599
Eppendorf Snap-Cap 微量离心管（SafeLock），1.5 mLFisher Scientific05-402-25
Essendant 121 盎司 Clorox 杀菌漂白剂Fischer Scientific50371500
乙醇Fisher Scientific07-678-00570%
Falcon Safety Dust Off DPSXLRCP 压缩气体Supra1381978
Human TruStainBiolegend422302全血中稀释比例为 1:600
LevGo smartSpatula 一次性聚丙烯刮刀Fisher Scientific18-001-017
显微镜载玻片Fisher Scientific12-550-A3
磷酸盐缓冲液Gibco10010-023
安全手术刀Fisher Scientific22-079-718
生理盐水Millipore5674420.90%
Sartorius 聚苯乙烯称量舟Fisher Scientific13-735-744
Superslip 盖玻片 - Superslip No. 1.5Fisher Scientific12-541-055
SYLGARD 184 硅橡胶弹性体试剂盒Fisher ScientificNC9285739聚二甲基硅氧烷（PDMS）
替格瑞洛Cayman Chemicals15425
Tygon PVC 透明管，1/16" 内径，1/8" 外径，50 英尺长McMaster-Carr6516T11
可超精密加工 360 黄铜棒McMaster-Carr8954K721用于母模制作
真空采血管BD363083
World Precision Instrument 可重复使用活检打孔器，1.5 mmFisher ScientificNC1215626

参考文献

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