优化冷冻电子显微镜样品制备

摘要

本方案以Methanocaldococcus jannaschii（MjsHSP16.5）为例，通过优化样品制备流程解决颗粒分布不均的问题，为研究人员高效解析大分子结构提供利用低温电子显微镜（cryo-EM）的技术参考。

摘要

冷冻电子显微镜（cryo-EM）通过在玻璃态冰中悬浮生物大分子，使其在接近天然状态下进行结构研究，从而彻底改变了结构生物学。该技术无需结晶即可实现对蛋白质及其他生物大分子的高分辨率可视化，为理解其功能与作用机制提供了重要见解。近年来，随着单颗粒分析技术的进步以及计算数据处理能力的提升，冷冻电镜已成为现代结构生物学不可或缺的工具。尽管该技术的应用日益广泛，但仍面临一些持续存在的挑战，可能限制其有效性，尤其是颗粒分布不均的问题。这一问题常导致重构蛋白结构的分辨率降低和准确性下降。本文介绍一种简单且实用的方法来应对这一挑战，所用模型为小热休克蛋白 Methanocaldococcus jannaschii 以MjsHSP16.5为例。该方法优化了样品制备流程，以最大限度减少优先吸附现象，确保更均匀的颗粒分布，从而获得更高品质的蛋白质冷冻电镜结构。该技术为致力于克服结构研究中类似难题的研究人员提供了有价值的指导。

引言

随着仪器硬件^1,2和图像处理软件^3,4,5的最新进展，冷冻电子显微镜（cryo-EM）已成为现代结构生物学中一种广受欢迎且功能强大的工具。尽管取得了这些突破，但在利用 cryo-EM 获得高分辨率大分子结构方面仍存在瓶颈。其中一个重大挑战是颗粒分布不均，包括取向偏好现象，这种现象主要出现在气液界面^6,7,8,9。

在样品玻璃化过程中，某些分子倾向于在载网上沿特定轴向排列，这会导致最终数据集中粒子视角分布不均。某些取向可能被过度代表，而其他取向则可能被低估甚至完全缺失，从而造成对完整蛋白质结构采样的不充分。那些优先朝向电子束的蛋白质区域在密度图中会显得更为明显，而背离电子束的区域则可能分辨率较差或完全缺失^10,11。因此，粒子分布不均会向最终重建的三维（3D）结构引入潜在的偏差和伪影。值得注意的是，α螺旋和β折叠等关键结构元件可能出现扭曲，氨基酸或核苷酸链可能呈现断裂状，特定蛋白质或核酸片段的密度可能出现畸变¹²。最终，这些错误表征对准确解析生物大分子的结构与功能构成了重大挑战。

目前有多种实验方法可用于应对这些挑战，包括样品制备优化^13,14,15、载网处理^{16,17,18,19,20,21,22}以及数据采集策略²³。值得注意的是，建议在可行的情况下优先在样品制备阶段解决这些问题⁷。样品制备中的常见优化措施包括调整缓冲液组成、引入小分子或大分子结合伴侣、生成分子内交联以及更换去垢剂。对于膜蛋白同样适用这些方法^24,25，但去垢剂必须专门用于纯化和稳定目的。在这些方法中，蛋白质缓冲液优化因其可定制性强、成本效益高且在大多数实验室中易于实施，成为首选策略。该方法允许针对每种蛋白质样品的具体需求，精确且即时地调节各种参数。通过迭代优化，研究人员可以系统地测试不同的缓冲条件，并调整多种参数，以尽量减少优势取向并提高冷冻电镜数据的整体质量。仅通过改变蛋白质缓冲液组分及其浓度，已被证明可通过调节蛋白表面电荷来影响蛋白质稳定性，从而进一步影响蛋白质在玻璃态冰中的行为²⁵。因此，优化蛋白质缓冲液组成被认为是解决冷冻电镜中常见问题最便捷且最直接的方法之一。

本文提出了一种解决冷冻电镜（cryo-EM）中常见难题——颗粒分布不均问题的实验方案。该方案以嗜热甲烷球菌的小热休克蛋白（Methanocaldococcus jannaschii sHSP16.5，简称MjsHSP16.5）为案例研究（图1），详细阐述了蛋白质制备与缓冲液筛选的关键步骤，并结合载网制备流程进行说明²⁶。该小热休克蛋白具有天然稳定性，单体分子量为16.5 kDa，可组装成由24个亚基构成的八面体笼状结构^26,27，是利用冷冻电镜进行结构分析的理想候选分子。然而，在冷冻电镜数据采集过程中出现的颗粒分布不均现象并未被预先预料，成为实验中的一大挑战。本文还讨论了可能有助于研究人员应对类似问题的潜在策略，从而推动利用冷冻电镜高效解析大分子结构的研究进程。

方案

本研究中所用试剂和设备的详细信息见材料表。

1. 蛋白质纯化

1. 在 E. coli BL21(DE3) 中诱导表达重组 MjsHSP16.5 蛋白，并按照先前所述方法使用镍螯合层析柱纯化该蛋白²⁶。经尺寸排阻层析（SEC）柱进一步纯化后²⁶，取洗脱峰组分 5 µL 上样至 12.5% SDS-PAGE 凝胶，通过标准考马斯亮蓝染色法检测蛋白纯度²⁸（图 2）。
2. 使用截留分子量为 50 kDa 的离心过滤器，根据制造商说明书（见材料表），在 4 °C 下将含有 MjsHSP16.5 的合并组分浓缩至约 65 mg/mL。
   注意：离心过程中每 5 分钟轻柔吹打一次 蛋白溶液，以防止蛋白聚集。
3. 浓缩完成后，在 4 °C 下以 16,000 x g 离心 10 分钟，去除聚集物；将上清液分装至 0.2 mL 薄壁 PCR 管中，每管 50 μL，用液氮速冻后于 -80 °C 保存，待后续使用。

2. 用于透射电子显微镜（TEM）成像的蛋白质制备

1. 将两管冷冻蛋白置于冰上解冻。解冻后，轻轻弹击管壁数次以充分混匀溶液，并在 4 °C 条件下以 16,000 × g 离心 10 分钟，以去除聚集物。
2. 将上清液上样至 SEC 柱，并收集每管 0.5 mL 的洗脱组分。
3. 收集在 280 nm 处具有最高紫外吸光度的峰对应的洗脱组分，并使用 Bradford 法测定这些组分中的蛋白浓度²⁹。
   注意：为确保下游应用中单个峰组分含有足够的蛋白浓度，需在不超过 SEC 柱推荐载样量的前提下，上样较大量的蛋白样品。

3. 缓冲液置换

1. 配制所需的缓冲液（9 mM MOPS-Tris（pH 7.2）、50 mM NaCl 和 0.1 mM EDTA），将缓冲液分装至 50 mL 烧杯中，并将缓冲液烧杯置于 4 °C 保存。
   注意：根据目标蛋白生化特性的已有知识，配制多种不同组成的缓冲液（如缓冲类型、pH 和离子强度），例如 20 mM HEPES（pH 7.5）、100 mM NaCl 和 0–5 mM DTT，以确定能够促进蛋白在后续载网制备中具有最佳溶解性、均一性和稳定性的条件。
2. 按照制造商说明书准备透析膜（参见材料表）。
3. 使用剪刀将透析膜剪成 30 mm × 30 mm 的小片。通过将这些膜在去离子水或缓冲液中孵育进行平衡（图 3A）。
4. 向 50 μL 微型透析装置的腔室中加入 55 μL 蛋白溶液（浓度约为 2.5 mg/mL）（图 3B）。
5. 用镊子垂直夹住透析膜，轻轻将膜的一边接触滤纸以去除多余液体（图 3C）。小心地将透析膜覆盖在微型透析装置上，确保微型透析腔内无气泡产生（图 3D）。将 O 形圈置于透析膜上方，轻轻将其滚入装置边缘的凹槽中。
6. 替代方法：将 O 形圈套在高尔夫球座的轴线上，并将高尔夫球座倒置放在膜上（图 3E）。轻轻将 O 形圈沿高尔夫球座滑下，使其脱离并套在装置边缘（图 3F）。小心引导 O 形圈进入装置边缘的凹槽中（图 3G）。
7. 将每个透析装置浸入盛有终末缓冲液的独立烧杯中，确保膜面朝上（图 3H）。
8. 透析过程中将烧杯保持在 4 °C。2 小时后更换透析缓冲液，并继续透析过夜。
9. 使用带有细针的注射器（如 Hamilton 注射器或胰岛素注射器）小心刺穿膜，从微型透析腔中回收蛋白溶液（图 3I）。将蛋白样品收集至微量离心管中，置于冰上保存以备后续使用。采用 Bradford 法测定蛋白浓度²⁹。

4. 载网制备

1. 选择合适的载网类型。
   注意：通常使用铜支持膜上的无定形有孔碳膜。应根据所需的冰层厚度选择碳膜厚度、孔径大小和网格数目。本实验中 MjsHSP16.5 样品制备采用了有孔碳膜载网。
2. 使用镊子轻轻夹住载网边缘，避免损坏载网上的孔洞。将载网放置于载网架上，使碳膜面朝上。将载网架放入电晕放电系统的腔室中。
3. 在 15 mA 条件下进行 60 秒的电晕放电处理，使载网具有亲水性。建议在此过程中施加负电荷。
   注意：推荐的参数是本研究所用电晕放电系统的起始条件。根据不同的电晕放电仪器类型以及特定载网材料所需达到的亲水程度，可能需要进行优化。对于等离子清洗，可考虑测试其他气体或气体混合物，如氢气或氩-氧混合气体。
4. 可选步骤：将额外的化学溶液（如装在敞口玻璃瓶中的 99% 戊胺）引入载网架旁边的腔室中，以在载网上产生净正电荷。
5. 放电处理后的载网应在 0.5–1 小时内使用，以确保最佳性能。

5. 负染电镜载网制备

1. 将5 µL样品（50-300 nM 或 20-120 ng/mL）加到辉光放电处理的载网上。让样品在载网表面静置1分钟，以促进蛋白质沉降。
2. 在石蜡膜片上制备三滴各50 µL的水。通过轻轻将载网表面与第一滴水接触并轻擦，对载网上的样品进行清洗。用剩余的两滴水重复此清洗步骤。
   注意：清洗时间可根据每个实验的具体需求进行优化。
3. 向载网上加入5 µL过滤后的1%（w/v）醋酸铀酰溶液，并立即用移液器吸除醋酸铀酰溶液。
4. 再次向载网上加入5 µL的1%（w/v）醋酸铀酰溶液。让载网在醋酸铀酰溶液中孵育90秒以进行染色。
   注意：染色时间可根据具体样品进行调整和优化。
5. 用滤纸轻轻接触载网的镊子一侧，以去除多余的染色液。让载网在室温下完全自然干燥。将干燥后的载网置于载网盒中，在室温下保存直至观察。

6. 样品玻璃化

1. 将蛋白样品稀释至所需浓度。
   注意：蛋白浓度应足够高，以最大化每个孔中的颗粒数量，但又需足够低，以确保单颗粒的分布。冷冻电镜蛋白浓度通常在 0.5 至 2 mg/mL 范围内。然而，某些蛋白根据其分子量和特定的样品制备条件，可能需要超出此范围的浓度。
2. 在 4 °C 条件下，以 16,000 × g 离心 10 分钟，以去除任何聚集体。
3. 开启冷冻固定仪器。将蒸馏水注入加湿器储水槽中。在吸水纸垫上安装带环的滤纸。设置玻璃化参数（温度：4 °C，湿度：100%，吸水时间：6 秒，吸水力度：5 单位，等待时间：10 秒）。
   注意：吸水时间和力度是优化玻璃化装置的重要参数，因为从载网中去除水分以及颗粒暴露于气液界面可能导致解离或取向偏好。
4. 将冷冻剂容器组件（包括黄铜杯、载网盒支架、蜘蛛单元和防污染环）组装到底板托盘中。通过向托盘中注入液氮来冷却容器组件。向黄铜杯中加入冷冻剂（液态乙烷）。当冷冻剂达到熔点温度时，移除蜘蛛单元。
5. 将镊子和载网组件安装到仪器上，将样品（通常为 4 µL）加载到载网的碳膜面，然后启动浸入冷冻过程。
6. 小心地将镊子从仪器上取下，将载网放入储存用载网盒中，并用盖子密封盒子。将含有玻璃化样品的载网盒存放在液氮中。

7. 将载网加载到透射电子显微镜

1. 组装自动网格装配站，并用液氮冷却。
2. 将含有玻璃化网格的网格盒放置到位，小心拧开盖子以接触网格。在附近放置一个空的自动网格储存盒，以便于转移已组装的网格。
3. 将自动网格环放置在装配站上为环设计的切口位置。小心地将玻璃化网格从网格盒中移出，并将其嵌入自动网格环内。确保网格与环对齐。
4. 调整圆盘，使圆形开口对准自动网格环和网格组件的上方。为将网格固定在自动网格环中，将C型夹插入工具置于网格上方，轻轻下压，使C型夹卡入到位。
5. 将圆盘旋转回位，并将组装好的网格移入自动网格储存盒中。
6. 组装样品盒装载站，并用液氮冷却装载站。
7. 将自动网格储存盒放入装载站中。将网格组件从自动网格储存盒转移至样品盒中，并轻轻敲击网格以确保其正确就位。
8. 使用手柄将样品盒装入自动进样胶囊中。检查自动进样器中的销钉，确认其可自由移动，并确保其未被冻结。
9. 将自动进样胶囊对接至透射电子显微镜（TEM），以进行网格观察。

结果

为了确定 MjsHSP16.5 的最佳载网条件，首先进行了冷冻电镜初步筛选，主要聚焦于考察多种蛋白质缓冲条件：（1）最终纯化缓冲液，该缓冲液可确保 MjsHSP16.5 的稳定性和均一性，对其结晶至关重要³⁰；（2）根据获得高分辨率衍射质量的 MjsHSP16.5 晶体所需条件优化的缓冲液³⁰；以及（3）先前在 MjsHSP16.5 的电子显微镜（EM）研究中使用的缓冲液^31,32。

在进行缓冲液优化的同时（通过微透析按钮进行缓冲液置换，如步骤3所述），考察了不同的辉光放电参数以改变载网表面电荷，如步骤4所述。载网可保持未放电状态（疏水性），或进行辉光放电处理以形成带负电或正电的亲水性表面。无论缓冲液或载网电荷如何，所有载网上均显示出颗粒聚集成阵列的现象，表明颗粒分布不均（图4A-

讨论

所有蛋白质结构研究都始于蛋白质纯化，这是一个迭代过程，旨在实现高纯度和均一性地分离目标蛋白质，同时保持其天然功能活性。尽管在纯化过程中会精心选择用于纯化和保存蛋白质样品的缓冲液组成，但这些缓冲液在后续的冷冻电镜（cryo-EM）样品制备和成像中常常带来挑战⁶。这一问题源于缓冲液成分与冷冻电镜分析所需条件之间的不匹配，因此必须进行一个关键步骤：将蛋白质储存缓冲液优化为适用于高效冷冻电镜分析的兼容缓冲液。然而，并不存在适用于所有蛋白质的通用方案，因为每种蛋白质都具有独特的结构和功能特性²⁴。因此，最佳的样品制备方案可能因具体研究的蛋白质而异。

蛋白质在特定pH范围内才具有基本的稳定性³⁴，因此必须将缓冲液的pH值维持在蛋白质的稳定pH范围之内。对于研究较为充分的蛋白质，此类信息通常可在文献中便捷获取；而对于其他蛋白质，则需通过特定的生化实验来确定。此外，蛋白质的稳定状态有助于提高蛋白质晶体成功生长的可能性^35...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
14 mL 圆底管	SPL Life Sciences	40114
250 µL 气密式进样器，型号 1725 LTN	Hamilton	81100	固定针头，22s 规格，2 英寸，2 号针尖类型
50 µL 透析按钮	Hampton Research	HR3-326
50 mL 玻璃烧杯	DIAMOND	HA.1010D.50
ÄKTA pure 25 L	Cytiva	29018224	FPLC
Amicon Ultra-15 离心过滤单元	Millipore	UFC905024	50 KDa 截留分子量
Bradford 试剂	Supelco	B6916
Dumoxel Style N5 镊子	Dumont	0103-N5-PO
Glacios 2 冷冻透射电子显微镜	ThermoFisher Scientific	GLACIOSTEM
HiLoad 16/600 Superdex 200 pg 层析柱	Cytiva	28989335
微量离心管，1.5 mL	HD Micro	H23015
PCR 管，0.2 mL，平盖	Axygen	PCR-02-C
PELCO easiGlow 等离子清洗仪	Ted Pella	91000
PELCO 透射电镜载网支架块	Ted Pella	16820-25
Quantifoil R 1.2/1.3 200 目，铜网	Electron Microscopy Sciences	Q2100CR1.3
Spectra/Por 3 RC 透析膜管	Fisher Scientific	086705B	3500 道尔顿截留分子量
Superose 6 Increase 10/300 GL 层析柱	Cytiva	29091596
醋酸铀酰	Merck	8473
Vitrobot Mark IV	ThermoFisher Scientific	VITROBOT
VitroEase 缓冲液筛选试剂盒及去垢剂	ThermoFisher Scientific	A49856