优化低温电子显微镜的样品制备

Summary

该方案提出了一种以 Methanocaldococcus jannaschii （MjsHSP16.5） 为例，通过样品制备优化解决颗粒分布不均匀的问题，为研究人员使用低温电子显微镜 （cryo-EM） 有效阐明大分子结构提供参考。

Abstract

低温电子显微镜 （cryo-EM） 通过在近天然条件下研究悬浮在玻璃体冰中的大分子结构，彻底改变了结构生物学。该技术允许在不需要结晶的情况下对蛋白质和其他生物分子进行高分辨率可视化，从而为了解它们的功能和机制提供重要见解。单颗粒分析的最新进展，加上改进的计算数据处理，使冷冻电镜成为现代结构生物学中不可或缺的工具。尽管冷冻电镜的采用率越来越高，但它仍面临着可能限制其有效性的持续挑战，尤其是颗粒分布不均匀。此问题通常会导致分辨率差和重建蛋白质结构的准确性降低。本文以 Methanocaldococcus jannaschii （MjsHSP16.5） 的小热休克蛋白为例，概述了一种简单实用的方法来应对这一挑战。该方法优化了样品制备，以最大限度地减少优先吸附，确保更均匀的颗粒分布和更高质量的蛋白质冷冻电镜结构。这项技术为旨在克服结构研究中类似挑战的研究人员提供了有价值的指导。

Introduction

随着仪器硬件 ^1,2 和图像处理软件 ^3,4,5 的最新进展，低温电子显微镜（冷冻电镜）已成为现代结构生物学中一种流行且强大的工具。尽管取得了这些突破，但在使用冷冻电镜实现高分辨率大分子结构方面仍然存在瓶颈。其中一个重大挑战是不均匀的粒子分布，包括取向偏好现象，这主要在气-水界面处观察到 6,7,8,9。

在样品玻璃化过程中，一些分子表现出沿网格上的特定轴排列的趋势。这会导致最终数据集中粒子视图的分布不均匀。某些取向可能代表性过高，而其他取向代表性不足或完全不存在，导致总蛋白质结构的采样不完整。优先朝向电子束的蛋白质区域在密度图中显得更加突出，而远离电子束的区域可能分辨率差或完全缺失^10,11

Protocol

本研究中使用的试剂和设备的详细信息列在 材料表中。

1. 蛋白质纯化

1. 在 大肠 杆菌 BL21 （DE3） 中诱导重组 MjsHSP16.5 的表达，并使用镍螯合色谱柱纯化蛋白质，如前所述²⁶。在体积排阻色谱 （SEC） 色谱柱²⁶ 上纯化后，通过将 5 μL 峰级分加载到 12.5% SDS-PAGE 凝胶上并通过标准考马斯蓝染色²⁸ 进行可视化来检查蛋白质纯度（图 2）。
2. 根据制造商的说明，使用截留分子量为 50 kDa 的离心过滤器，在 4 °C 下将含有 MjsHSP16.5 的池级分浓缩至约 65 mg/mL（参见 材料表）。
   注:离心过程中每 5 分钟轻轻移液一次蛋白质溶液，以防止蛋白质聚集。
3. 浓缩后，将样品在 4 °C 下以 16,000 x g 离心 10 分钟以去除聚集体，将上清液分装成 50 μL 体积的 0.2 mL 薄壁 PCR 管中，在液氮中快速冷冻试管，并将样品储存在 -80 ....

Results

为了确定 MjsHSP16.5 的最佳网格条件，进行了初步冷冻电镜筛选，主要侧重于检查各种蛋白质缓冲液条件:（1） 最终纯化缓冲液，确保 MjsHSP16.5 的稳定性和均一性，对其结晶很重要³⁰;（2） 适应于高衍射质量 MjsHSP16.5 晶体生长所需条件的缓冲液³⁰;（3） 以前用于 MjsHSP16.5 电子显微镜 （EM） 研究的缓冲液^31,32。

在缓冲液优化（使用微透析按钮更换缓冲液，如步骤 3 中所述）的同时，检查不同的辉光放电参数以修改网格的表面电荷，如步骤 4 中所述。网格要么不放电（疏水），要么辉光放电，以产生带负电荷或正电荷的亲水表面。无论缓冲液或网格电荷如何，所有网格都显示阵列中的颗粒积累，表明颗粒分布不均匀（图 4A-D

Discussion

所有蛋白质结构研究都从蛋白质纯化开始，这是一个迭代过程，旨在实现在分离高纯度和均一性蛋白质靶标的同时保留其天然功能之间的平衡。尽管在纯化过程中精心挑选了用于纯化和保存蛋白质样品的缓冲液成分，但这些缓冲液在随后的冷冻电镜样品制备和成像过程中经常会带来挑战⁶。这个问题是由于缓冲液组分与最佳冷冻电镜分析的先决条件不匹配而引起的，因此需要采取关键步骤:优化蛋白质储存缓冲液，使其与有效的冷冻电镜分析兼容。然而，没有一种放之四海而皆准的方法，因为每种蛋白质都具有独特的结构和功能特征²⁴。因此，最佳样品制备可能因所研究的特定蛋白质而异。

蛋白质在特定 pH 范围内基本表现出稳定性³⁴，这突出了将缓冲溶液的 pH 值维持在蛋白质稳定的 pH 范围内的重要性。对于经过充分研究的蛋白质，这些信息通常很容易在文献中获得。对于其他人来说，它可以来自特定的生化实验。此外，蛋白质的稳定状态增加了蛋白质.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
14 mL 圆底管	SPL 生命科学	40114
250 和微量;L 气密注射器型号 1725 LTN	Hamilton	81100	胶合针头，22 秒规格，2 英寸，尖式 2
50 µL 透析按钮	Hampton Research	HR3-326
50 毫升玻璃烧杯	DIAMOND	HA.1010D.50
ÄKTA pure 25 L	Cytiva	29018224	FPLC
Amicon Ultra-15 离心过滤装置	Millipore	UFC905024	50-KDa NMWL
Bradford 试剂	Supelco	B6916
Dumoxel Style N5	Dumont	0103-N5-PO
Glacios 2 Cryo-TEM	ThermoFisher Scientific	GLACIOSTEM
HiLoad 16/600 Superdex 200 pg	Cytiva	28989335
微量离心管 1.5 mL	HD 微量	H23015
PCR 管 0.2 mL，平盖	Axygen	PCR-02-C
PELCO easiGlow 辉光放电装置	Ted Pella	91000
PELCO TEM 网格支架模块	Ted Pella	16820-25
Quantifoil R 1.2/1.3 200 目，铜	电子显微镜Sciences	Q2100CR1.3
Spectra/Por 3 RC 透析膜管	Fisher Scientific	086705B	3500 Dalton MWCO
Superose 6 Increase 10/300 GL	Cytiva	29091596
乙酸铀酰	Merck	8473
Vitrobot Mark IV	ThermoFisher Scientific	VITROBOT
VitroEase 缓冲液筛选试剂盒和洗涤剂	ThermoFisher Scientific	A49856