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方法文章

马肠神经胶质细胞培养及其在马腹痛神经炎症机制研究中的应用

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DOI：

10.3791/67244

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2024年10月4日

 ,  ,  ,  , 
1Department of Clinical Sciences, College of Veterinary Medicine, NC State University

本文内容

摘要

肠胶质细胞在肠道稳态及疾病过程（包括术后并发症）中的作用正日益受到重视。接受急诊探查性剖腹手术后恢复的马匹患者面临较高的炎症性术后并发症风险，这凸显了建立可重复的马源性肠胶质原代细胞培养体系以供研究的重要性。

摘要

马科动物绞痛（急性腹症）的术后炎症状态不仅会增加客户的治疗费用、导致患者不适并延长住院时间，而且在许多情况下可能危及生命。一类独特的肠道细胞——肠胶质细胞，其在感知胃肠道环境并与周围细胞类型进行通讯方面的作用正日益受到重视。肠胶质细胞与肠上皮细胞之间的相互作用，可能在揭示马肠胶质细胞如何在健康状态及绞痛状态下通过改变黏膜屏障来调节炎症反应方面具有关键意义。

为了研究这种相互作用，我们提出一种方法，即从马的空肠组织建立原代马肠胶质细胞培养物，并将这些培养物暴露于已知存在于绞痛中的炎症条件下。原代肠胶质细胞培养物来源于因与绞痛无关原因被实施安乐死的成年马。通过显微解剖分离肠绒毛和黏膜下层，以暴露黏膜下层组织。分离出的黏膜下层组织使用胶原酶、蛋白酶和牛血清白蛋白进行酶消化处理，持续2-3小时。随后，通过离心、移液和细胞筛（40-100 µm）进行机械消化，获得细胞沉淀，并将其以约400,000个细胞/300 µL培养基的浓度接种于经0.05 mg/mL多聚-L-赖氨酸包被的培养孔中。

在达到汇合状态并进行首次传代后，肠胶质细胞被暴露于马重组IL-1β（0、10、25 ng）中处理24小时。为模拟腹痛发生时的上皮-胶质细胞相互作用，将经对照或处理后的肠胶质细胞条件化培养基直接加入汇合的马空肠单层细胞中，同时使用双电极EndOhm室测量跨上皮电阻（TEER）。这些数据仅展示了马肠胶质细胞培养众多潜在重要应用中的一个实例。

引言

马科动物腹痛是急诊会诊中最常见的内科就诊病症1。高达17%的患马需要外科手术干预，因此提高术后疗效应成为马科医学研究的首要任务2。目前，术后腹痛患马面临多种危及生命的疾病风险，包括败血症/内毒素性休克（占患者总数的12.3%）和术后肠梗阻（占患者总数的13.7%）3。尽管在术后并发症治疗方面已取得进展，但仍亟需开发更先进的预防和治疗方法以应对这些状况。

近期研究强调了绞痛患者局部和全身的炎症状态4。例如，与正常肠组织相比，绞痛患者的肠黏膜中肿瘤坏死因子（TNF）α、白细胞介素1β（IL-1β）、白细胞介素6（IL-6）以及单核细胞趋化蛋白-1等促炎蛋白的表达水平均显著升高4。从全身角度来看，已有研究表明，肠组织中TNF α水平升高与术后鼻胃反流液量超过2 L的风险增加相关，而后者是术后运动功能障碍的普遍评估指标4。此外，已知给予白细胞介素IL-1β和TNF α可诱发脓毒性休克的临床症状5。

结肠绞痛相关肠道组织炎症状态及其与术后并发症关联的一个可能解释是肠道上皮屏障。在健康状态下，连接肠道单层柱状上皮细胞的紧密连接复合物构成了一道功能性屏障，可限制肠腔内容物及其细菌成分进入黏膜下层和血液循环。然而，由结肠绞痛相关的肠梗阻以及手术过程中肠道操作所引起的肠道扩张和损伤，可能会破坏这种肠道屏障功能。

从肠道壁整体功能组分的角度来看，肠神经系统中的黏膜下层肠胶质细胞网络已被证实对与炎症通路相关的术后并发症的病理生理发展具有关键作用，并可能成为特定的治疗靶点6,7,8,9。肠胶质细胞不仅遍布整个胃肠道，还作为肠道环境的感受器，影响与肠道壁多种细胞类型的信号交流，并直接调控肠道屏障功能6。因此，可以合理推测，这些强大的肠道感受器在受到损伤和炎症刺激时会被激活，并可能引发诸如肠道屏障通透性改变等急性反应。

本研究首次描述了马肠道胶质细胞的培养，以及更具体地探讨了炎症性马肠道胶质细胞对肠屏障功能的作用。本文介绍了马肠黏膜下层肠道胶质细胞原代培养的方法，观察其对炎症因子IL-1β刺激的反应，评估IL-1β刺激后肠道胶质细胞产物对马肠上皮细胞单层通透性的影响，并探讨通过添加马血清实现可能的阻断作用。

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方案

马肠神经胶质原代培养物来自三匹因与本研究无关原因而被人道实施巴比妥类药物过量安乐死的马。用于培养研究的马匹均为成年马，且无当前胃肠道疾病病史。

1. 马肠黏膜下层肠胶质细胞原代培养

  1. 从三匹成年马的空肠隐窝中培养马源上皮单层细胞。
    1. 将24孔板用包被液在37 °C孵育2小时，或在室温过夜包被，随后用无菌水洗涤2次，并在室温下保存，直至细胞准备接种。
    2. 在人道安乐死后60分钟内，取出一段空肠组织并置于冰上预冷的林格氏液中。
    3. 从空肠中取出一段约10 cm长的组织，在对系膜缘切开，使非淋巴组织区域位于组织中央。将组织修剪成约7 cm × 7 cm大小的片状。在解剖前，用新鲜的林格氏液充分冲洗组织。
    4. 将组织固定在涂有硅橡胶的培养皿中，黏膜面朝上，置于冷的林格氏液或PBS中，并尽可能拉伸组织（图1A）。
    5. 使用弯头镊子去除肠绒毛（图1B），随后从约5 cm × 5 cm的非淋巴区域去除固有层（图1C）。
      注：这些层可轻易与黏膜下层分离（图1B）。
    6. 用显微解剖剪在组织一角松解黏膜下层，将其整片剥离，并在剥离过程中观察其与空肠内环肌层之间的自然分离现象（图1D）。
    7. 将收集的黏膜下层组织剪碎为2–5 mm大小的片段，放入含有5 mL "Organo-FBS"（表1）、0.825 mg胶原酶、5 mg蛋白酶和20 mg牛血清白蛋白的50 mL锥形管中。在37 °C孵育2–3小时以进行酶消化。
    8. 孵育结束后，加入10 mL室温的"Organo + FBS"以终止酶反应。使用10 mL移液管将组织混合物上下吹打约15次，使细胞从组织中解离，随后在室温下以3,000 × g离心3分钟。
    9. 弃去上清液，用10 mL室温PBS重悬沉淀，再次使用10 mL移液管上下吹打约15次，使细胞充分解离。
    10. 将锥形管在室温下以3,000 × g离心3分钟。弃去上清液，加入10 mL室温的"Organo + FBS"，使用10 mL移液管上下吹打约15次，使细胞从组织中解离。
    11. 将细胞依次通过孔径为100 µm、70 µm和40 µm的细胞筛进行过滤。
    12. 将过滤后的细胞和培养基在室温下以3,000 × g离心3分钟。弃去上清液，用1 mL "Organo + FBS"重悬沉淀。
    13. 使用台盼蓝染色以鉴别活细胞，并用血细胞计数板进行细胞计数。
    14. 在24孔板的每孔中加入约400,000个细胞，悬浮于300 µL "Organo + FBS"中，并向每孔添加生长因子：N2 5 µL/孔，G5 5 µL/孔，B27 10 µL/孔。将24孔板置于37 °C、5% CO2的培养箱中，使细胞贴壁。24小时后，更换为含上述生长因子的"胶质细胞培养基"（表1），每48小时更换一次培养基（图2）。

2. 免疫荧光细胞学

  1. 将肠神经胶质细胞从原代培养（P0）（步骤 2.1.14）培养至 70-80% 汇合度，并传代一次（P1）。
  2. 在加入 0.1% PBS 叠氮化物之前，使用 4% 多聚甲醛将原代培养（P0）细胞在孔板中固定 5 分钟。
  3. 配制含 PBS 叠氮化物、4% 驴血清和 0.5% Triton-X 的封闭液，每孔加入 300 µL 封闭液，在室温下孵育 2 小时以通透细胞。
  4. 在封闭液中按 1:1,000 稀释比加入胶质细胞标志物胶质纤维酸性蛋白（GFAP）的一抗，以及成纤维细胞标志物α-平滑肌肌动蛋白的一抗，4 oC 过夜孵育。
  5. 加入二抗前用 PBS 洗涤 3 次，二抗为驴抗兔 IgG Alexa Fluor 594 和羊抗小鼠 IgG Alexa Fluor 488，按 1:500 稀释比溶于封闭液中，孵育 2-3 小时。
  6. 用 DAPI（4',6-二脒基-2-苯基吲哚）按 1:1,000 稀释比溶于 PBS 中染色细胞核，孵育 5 分钟。
  7. 用 PBS 洗涤 3 次后，将细胞保存在 0.1% PBS 叠氮化物中。

3. 黏膜下层马肠道胶质细胞原代培养物暴露于IL-1β

  1. 当第一代（P1）细胞达到70-80%融合度时，进行IL-1β处理实验。将各孔分别暴露于0 ng、10 ng和25 ng的IL-1β中，持续24小时。处理24小时后，收集并储存每孔的培养基于-80 °C。

4. 用于生成肠上皮细胞单层的马源类器官培养

注意：根据 Stewart 等人于 2018 年发表的实验方案，将已冷冻保存的马肠道隐窝和芽状结构进行扩增，用于二维肠类器官研究10。

  1. 每个transwell小室使用约700-1,000个芽/隐窝片段（解离为单细胞时约为40,000-50,000个细胞）。在加入肠上皮细胞前，用42 µL的0.05% Matrigel包被transwell小室。于37 oC孵育1小时，使Matrigel固定。吸除多余液体，并将transwell小室在未加盖的情况下干燥30分钟。每个transwell小室中加入200 µL DMEM-F12培养基，将培养板置于37 °C保存备用。
  2. 用PBS洗涤含有类器官的Matrigel凝胶块，然后在冰上加入500 µL细胞回收溶液进行处理。反复吹打，确保将所有细胞完全收集至15 mL离心管中。
  3. 在4 °C条件下以300 × g离心5分钟，弃上清液，并将细胞沉淀重悬于目标体积的肠上皮干细胞（IESC）培养基中。目标体积可通过将所需单层培养数量乘以200 µL培养基计算得出。（表1）。
  4. 先用IESC培养基预润1 mL注射器，然后通过16 G针头吸取细胞悬液。将16 G针头更换为28 G针头，再将细胞悬液经28 G针头推出，以促进类器官的进一步分散。
  5. 将200 µL上述细胞悬液加入包被后的transwell小室的顶侧，同时在基底侧加入500 µL IESC培养基及前述生长因子10。每24-48小时更换一次培养基和生长因子，直至达到汇合状态。汇合状态定义为细胞密度对应跨上皮电阻（TEER）达到1,000 ohms×cm2,11。测量方法见步骤5.1。

暴露于炎性细胞因子及马肠道胶质细胞产物后马肠上皮细胞单层的通透性

  1. 使用双电极TEER测量室定量测定单层细胞的TEER值，并在每个Transwell可渗透膜上建立基础读数。测量前确保IESC培养基和Transwell放置15分钟以升至室温。向培养杯中加入1.5 mL IESC培养基，并确保Transwell插入物内恰好含有200 µL培养基，使测量时液面高度一致。
  2. 将Transwell插入物的基底外侧暴露于以下物质：每孔含25 ng IL-1β、10 ng和25 ng白细胞介素6（IL-6）的炎症性细胞因子，或暴露于含10 ng或25 ng IL-1β的胶质细胞培养物所产生的胶质产物。对照组Transwell插入物的基底外侧则暴露于胶质细胞培养基，以及未暴露于IL-1β的胶质细胞培养物所获得的培养基。
  3. 将每个Transwell放入培养杯中，每隔10–15分钟测量一次TEER，持续测量45分钟。

6. 统计学

  1. 计算每个transwell在0、10、20、30和45分钟时间点的TEER变化倍数。
  2. 使用选定的软件（参见材料表），通过非配对单尾t检验，比较TEER降低与基底外侧暴露于IL-1β（25 ng）、IL-6（10 ng、25 ng和100 ng）以及胶质细胞培养基（分别暴露于0 ng IL-1β、10 ng IL-1β和25 ng IL-1β）相对于对照培养基的相关性。

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结果

对马空肠进行显微解剖，分离至黏膜下层（图1），再结合酶消化与机械消化，可成功获得具有活性的马肠胶质细胞培养物。这些细胞表现出多形性，其中以梭形细胞为主，形态特征与其他物种的肠胶质细胞一致（图2A）。免疫染色显示，培养细胞表达特异性胶质细胞标志物胶质纤维酸性蛋白（GFAP），且成纤维细胞污染较少（α-SMA，图2B）。但在某些情况下，黏膜下层的显微解剖操作控制不够精确，导致培养物中成纤维细胞比例较高，通过成纤维细胞标志物平滑肌肌动蛋白的免疫荧光染色可观察到这一污染现象（图3）。

接下来，以马肠胶质细胞培养的应用价值为例，评估了经IL-1β处理的肠胶质细胞对肠道上皮屏障功能的影响。将肠上皮细胞基底侧暴露于马肠黏膜下层肠胶质细胞培养液（该培养液经10 ng和25 ng IL-1β处理24小时）后，上皮通透性显著增加（p值分别为0.05和0.04；对照组...

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讨论

本研究旨在建立一种可重复的马源性肠黏膜下层肠胶质细胞原代培养方法，并展示其在腹痛发生时模拟上皮-胶质细胞相互作用的应用。肠胶质细胞的分离与培养在马属动物中尚属首次，此前在猪、啮齿类动物模型及人类研究中已证实该技术有助于理解肠道疾病的发生机制6,7,13,14。研究此类细胞群体具有潜在重要意义，因其不仅作为肠道环境的上皮下感受器，还具备与肠壁内周围细胞相互作用和通讯的能力。鉴于其敏锐的感知功能，不难设想胶质细胞在马腹痛中可能发挥关键作用——在此过程中，肠组织受到扩张、缺血以及可能的外科操作等因素的应激6。

Lisowski 等人的前期研究已证实，马在绞痛手术时其肠道组织处于高度炎症状态。啮齿类动物肠胶质细胞培养实验进一步凸显了缓解此类炎症环境的重要性，这些实验表明肠胶质细胞能够合成破...

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披露

作者声明无利益冲突。

致谢

作者感谢莫里斯动物基金会对本项目的资助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
1 M HEPES缓冲液Gibco15630-080
10 mM HEPESLife Technologies15630-106
2 mM GlutaMAXLife Technologies25050-061
4’6-二氨基联苯并咪唑-2-苯基吲哚InvitrogenD3571
高级DMEM/F12Life Technologies12634-010
α-平滑肌肌动蛋白抗体Abcam7817
两性霉素BSigmaAA95294.4 g/mL 储存液分装，终浓度为 1.1 µg/mL
抗抗真菌素 1xGibco15240-096
B27Gibco12587010
牛血清白蛋白SigmaAA3311
BSA 50 mg/mL 储存液SigmaA3311
CaCl₂ACROS Organiics206791000马用林格液成分 ‘s 储液 1：与其他成分混合后，取 100 mL 该储液加入量筒中，用去离子水定容至 1 L，用 5% CO2 调节 pH 至 7.4。
与马林格液混合’s Stock 2 以制备完全培养基 “林格氏液’溶液”.
胶原酶Sigma9891
DMEM-F12 培养基赛默飞世尔科技11320033
驴抗兔IgG Alexa Fluor 594Invitrogen21207
EVOM EndOhm 双电极 TEER 测量室世界精密仪器公司EVM-EL-03-01
TEER 测量用 EVOM 操作手册世界精密仪器公司EVM-MT-03-01
G5Gibco17503012
庆大霉素溶液SigmaG1272终浓度 20 µg/mL
GFAP 抗体Abcam4674
山羊抗小鼠IgG Alexa Fluor 488Invitrogen28175
IL-1β ELISA赛默飞世尔科技ESIL1B
KClThermo FisherP330-500马用林格液成分’s 储液 1：与其他成分混合后，取 100 mL 该储液加入量筒中，用去离子水定容至 1 L。用 5% CO2 调节 pH 至 7.4。
与马林格液混合’s Stock 2 以配制完全培养基 “林格氏液’s 溶液”.
L-谷氨酰胺溶液康宁25-00-Cl
MatrigelBD Bioscience354277
MgCl2赛默飞世尔科技M33-500马用林格液成分’s 储液 1：与其他成分混合后，取 100 mL 该储液加入量筒中，用去离子水定容至 1 L。用 5% CO2 调节 pH 至 7.4。
与马林格液混合’s Stock 2 以制备完全培养基 “林格氏液’s 溶液”.
N2Gibco17502048
Na2HPO4Thermo FisherBP332-1马用林格液成分’s Stock 2：与其他成分混合后，取100 mL该储备液加入量筒中，用去离子水定容至1 L。用5% CO2调节pH至7.4。
与马林格液混合’s Stock 1 以配制完全培养基 “林格氏液’s 溶液”.
NaCl赛默飞世尔科技S271-10马用林格氏液成分’s Stock 1：与其他成分混合，取100 mL该储备液加入量筒中，用去离子水定容至1 L。用5% CO2调节pH至7.4。<急性腹痛（绞痛）的炎症性术后状况不仅增加了客户成本、患者不适和住院时间，而且在许多情况下可能危及生命。一类独特的肠道细胞——肠胶质细胞，因其在感知胃肠道环境及与周围细胞类型交流中的作用而日益受到关注。肠胶质细胞与肠上皮细胞之间的相互作用，可能在阐明马肠胶质细胞如何在健康状态和绞痛状态下改变黏膜屏障以调节炎症方面发挥关键作用。为研究这种相互作用，本文介绍一种从马空肠建立原代肠胶质细胞培养的方法，并将这些培养细胞暴露于已知存在于绞痛中的炎症条件下。原代肠胶质细胞培养物来源于因与绞痛无关原因被实施安乐死的成年马。通过显微解剖分离肠绒毛和固有层以暴露黏膜下层。分离的黏膜下层使用胶原酶、蛋白酶和牛血清白蛋白进行酶消化处理2–3小时。随后通过机械消化，包括离心、移液和使用细胞筛（40–100 µm），获得细胞沉淀，并以约400,000个细胞/300 µL培养基的浓度接种于经0.05 mg/mL多聚-L-赖氨酸包被的培养孔中。待细胞融合并完成首次传代后，将肠胶质细胞暴露于马重组IL-1β（0、10、25 ng）中24小时。为模拟绞痛发生时的上皮-胶质细胞相互作用，将经对照组或处理组肠胶质细胞条件化培养的培养基直接加入已融合的马空肠单层细胞中，同时使用双电极EndOhm chamber测量跨上皮电阻（TEER）。这些数据展示了马肠胶质细胞培养众多潜在重要应用中的一个实例。> 与马林格氏液混合’s Stock 2 以制备完全培养基 “林格氏液’s 溶液”.
NaH2PO4Thermo FisherBP329-500马用林格液成分’s 储液 2：与其他成分混合后，取 100 mL 该储液加入量筒中，用去离子水定容至 1 L。用 5% CO2 调节 pH 至 7.4。
与马林格液混合’s Stock 1 以制备完全培养基 “林格氏液’s 溶液”.
NaHCO₃Thermo FisherS637-212马用林格液成分’s Stock 2：与其他成分混合后，取100 mL该储备液加入量筒中，用去离子水定容至1 L。用5% CO2调节pH至7.4。
与马林格氏液混合’s Stock 1 以配制完全培养基 “林格氏液’s 溶液”.
青霉素/链霉素溶液双子座400-109
Poly-L-lysineSigmaP26360.5 mg/mL，溶于1×硼酸盐缓冲液
Prism 软件GraphPad
蛋白酶SigmaP4630
碳酸氢钠溶液SigmaS87617.5% 储备液

参考文献

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