本文介绍了一种在气液界面培养系统中构建包含诱导性多能干细胞（iPSC）来源的肺上皮细胞、间充质细胞、内皮细胞和巨噬细胞的复杂多细胞气道屏障模型的方法。
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摘要
摘要
人体肺组织由从鼻咽部上呼吸道到最小肺泡囊的上皮、间充质、内皮以及免疫细胞相互连接而成的网络构成。这些细胞之间的相互作用在肺的发育与疾病过程中至关重要，可作为抵御有害化学物质和病原体的屏障。目前 体外 共培养模型通常使用具有不同生物学背景的永生化细胞系，可能无法准确代表肺部的细胞微环境或细胞间相互作用。我们将人诱导多能干细胞（iPSCs）分化为包含上皮和间充质成分的三维肺类器官、内皮细胞以及巨噬细胞，并在气液界面（ALI）条件下进行共培养，构建出顶端由巨噬细胞包绕的上皮/间充质屏障和基底侧内皮屏障结构（iAirway）。源自iPSC的iAirway模型在受到呼吸道病毒或香烟毒素感染时，表现出屏障完整性的下降。该多谱系肺共培养系统为研究肺发育、稳态维持及疾病进展过程中的细胞互作、信号通路和分子机制提供了平台。iAirway能够高度模拟人体生理状态和细胞相互作用，可由患者来源的iPSCs生成，并可根据需要定制包含气道中不同类型的细胞。总体而言，源自iPSC的iAirway模型为研究屏障完整性提供了灵活而强大的工具，有助于深入理解疾病相关遗传驱动因素、病原体反应、免疫调控以及药物发现或老药新用 体外，有望推动我们对气道疾病的理解与治疗。
引言
大气道中的气血屏障包括气管、支气管和细支气管。它在维持呼吸系统健康方面发挥着关键作用，由气道上皮、基底膜、血管和内皮细胞以及免疫细胞组成。气道中的主要上皮细胞包括基底细胞、club细胞、纤毛细胞和杯状细胞。基底细胞作为气道上皮的干细胞，是具有高度增殖和自我更新能力的多能前体细胞，可分化为成熟的气道上皮细胞1。club细胞为非纤毛的分泌性细胞，通过分泌保护性蛋白和表面活性物质，参与维持气道内衬的稳定2。杯状细胞位于管腔及黏膜下腺体中，可分泌黏蛋白以捕获异物，保护气道3。纤毛细胞是黏液纤毛清除系统的重要组成部分，可防止有害微生物的积聚4。基底膜由细胞外基质构成，为组织提供结构支持5。气管及其余气道周围分布着丰富的血管网络，其内壁由内皮细胞构成，这些细胞通过提供营养和氧气、清除代谢废物、调节炎症反应以及参与组织修复和血管生成，在维持气管功能中发挥重要作用6。最后，气道巨噬细胞是组织特异性的免疫细胞，对于防御感染、清除吸入颗粒物以及维持免疫反应的平衡至关重要7。
上皮细胞、间充质细胞、内皮细胞和巨噬细胞的协同作用对于呼吸道抵御病原体的有效免疫反应至关重要8。上皮细胞通过形成物理屏障构成抗病毒感染的第一道防线，其紧密连接可限制有害物质的通过。纤毛细胞与杯状细胞的协同作用有助于捕获并清除吸入的颗粒物、病原体及碎片4。此外，呼吸道上皮细胞还能分泌细胞因子和趋化因子，以招募免疫细胞9。内皮细胞维持血管完整性，防止病毒颗粒通过血液扩散，同时上调黏附分子（VCAM-1）以促进免疫细胞黏附，并产生促炎性细胞因子，将免疫细胞从血液募集至感染部位10。呼吸道巨噬细胞可吞噬并降解病毒颗粒、受感染的细胞及碎片，将病毒抗原呈递给T细胞，并分泌细胞因子以激活和招募其他免疫细胞，同时产生I型干扰素以抑制病毒复制11。上皮细胞、间充质细胞、内皮细胞和巨噬细胞的协同作用构建了一个强大而动态的防御系统，可保护呼吸道免受病毒感染，并维持呼吸系统健康。
了解人类肺部中各种细胞类型之间的动态相互作用，对于理解肺部对病毒感染、炎症性疾病和药物递送的反应至关重要。体外共培养系统可用于研究上皮细胞、内皮细胞和先天免疫细胞之间的细胞间信号传导12。我们开发了首个来源于患者特异性hiPSCs的真实多细胞类型肺模型13，该模型包含上皮和间充质细胞群体，并以三维结构形成。随后，肺前体细胞可进一步分化为"气道类器官"14，接种于无菌细胞培养小室上，并暴露于气液界面（ALI）条件下，以模拟人体气道的生理环境15,16,17。来源于iPSC的内皮细胞培养在膜的基底侧，模拟其在人体气道中的定位，即位于基底膜中上皮/间充质层下方。最后，将来源于iPSC的巨噬细胞添加至膜的顶端侧，使其与上皮细胞相互作用并等待激活信号（图1A）。该模型能够准确再现气道的生物学特性与功能。我们认为，来源于hiPSC的、患者特异性的、真实多细胞类型的iAirway培养体系最适合用于阐明气道屏障对病原体（包括病毒感染）所产生固有急性反应的机制。例如，该模型可用于：（1）研究病毒的进入与复制过程；（2）探究上皮细胞和组织特异性免疫细胞引发的初始免疫反应；（3）评估屏障的完整性与功能；（4）测试治疗药物的有效性；以及（5）在患者特异性模型中研究发病过程中的细胞与分子机制。
本文介绍了一种制备多细胞肺共培养体系的详细方案，用于研究细胞对病毒感染的响应。
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方案
本研究方案已获得加州大学圣地亚哥分校人类研究保护项目机构审查委员会的批准（编号：181180）。本方案使用小分子和生长因子诱导多能干细胞分化为气道细胞、内皮细胞和巨噬细胞。随后将这些细胞共培养于细胞培养小室中，并在气液界面条件下进行极化培养。材料表中列出了所用试剂、耗材和设备的详细信息。补充文件1提供了培养基和缓冲液的组成成分。
1. 诱导多能干细胞来源的气道类器官的生成（第1 - 30天）
注意：本方案概述了生成iPSC来源的气道类器官的步骤（图1B），遵循Leibel等13所述的方法。该过程包括定型内胚层诱导（第1-3天）、前部前肠内胚层生成（第4-6天）以及向肺前体细胞分化（第7-16天）。详细方法见先前发表的研究13。以下步骤详述了从肺前体细胞生成气道类器官的过程。
- 从细胞外基质聚合物中提取并解离肺前体细胞球体（第17天）
- 在冰上解冻细胞外基质（ECM）聚合物（8-9 mg/mL）。
- 使用真空吸液器吸除嵌于细胞外基质中的肺类器官的废弃培养基。
注意：后续的吸出步骤中，除非另有说明，均应使用真空吸液器。 - 加入1 mL浓度为2 U/mL的dispase 加入10 µM ROCK1抑制剂（ROCKi）至细胞中，并使用P1000移液器手动重悬肺前体细胞于细胞外基质（ECM）中。于37 °C孵育30分钟，每15分钟重悬混合物一次，以通过机械处理增强dispase的解离效果。
- 使用前15分钟，将45 mL室温PBS置于-20 °C冰箱中预冷。确保PBS温度低于4 °C，以保证后续步骤中细胞外基质（ECM）的有效去聚合。
- 消化酶孵育30分钟后，将类器官及消化酶溶液转移至15 mL锥形管中。
- 加入预冷的 PBS（每 1 mL 蛋白酶加入 2 mL），用于洗涤并收集培养板中残留的类器官和细胞外基质（ECM）材料。使用 P1000 移液器重悬类器官，并在 400 x g 条件下离心 g 5 分钟。
注意：除非本方案中另有说明，所有离心步骤均在室温下进行。 - 离心后，应可见含有类器官的浑浊ECM沉淀。小心吸除上清液 通过 移液时避免触碰ECM沉淀。
- 用预冷的 PBS 进行第二次洗涤，使用 P1000 移液器重悬细胞，然后在 400 x g 条件下离心 g 5 分钟后，吸除上清液 通过 移液，留下约100 µL残余溶液。
- 向15 mL锥形管中的类器官加入2 mL胰蛋白酶样蛋白酶，使用P1000移液器重悬。于37 °C孵育10–12分钟，孵育过程中半程翻转或轻弹管子以重新混悬混合物。
注意：使用胰蛋白酶样蛋白酶消化 10–12 分钟，以类器官聚集体形式进行传代。 - 12分钟后，通过加入2 mL含2% FBS的基础培养基（终止液，参见 补充文件 1）。用 P1000 移液器重悬溶液，然后在 400 x g 5 分钟。
- 吸弃上清液，将类器官重悬于添加了10 µM ROCKi的终止培养基中。取10 µL样品，用血细胞计数板和台盼蓝进行细胞计数。计数期间将类器官置于冰上。
- 计算获得每孔100,000个细胞所需的体积。将细胞聚集体分装至1.5 mL微量离心管中，在400 x g条件下离心5分钟 g. 去除上清液，残留约 10 µL 培养基。
- 将细胞沉淀重悬于200 µL冷的ECM聚合物中（避免产生气泡，并迅速操作以防止过早聚合）。取200 µL ECM与细胞的混合物，加入12孔板每个孔的底部。在生物安全柜中室温下静置5分钟，使ECM部分聚合。
- 将培养板转移至37 °C培养箱中孵育30–60分钟，以完成ECM聚合。随后，加入1.5 mL气道类器官诱导培养基（补充文件 1).
- 每两天更换一次培养基，持续14天，直至第30天。如果培养基在24小时内变黄，将培养基体积增加至2 mL。
2. 诱导多能干细胞来源的内皮细胞的生成（第1-14天）
注意：以下步骤详细说明了从诱导多能干细胞（iPSCs）生成内皮细胞的过程（图1C），改编自Patsch等人的研究18。该方法包括培养板的准备、iPSCs的分化、内皮细胞诱导、分选及扩增。表1列出了本研究中使用的抗体。
- 第0天：iPSCs的内皮分化铺板
- 当 hiPSCs 达到 70%–80% 汇合度时，开始内皮细胞分化。在解离前 1 小时，向每孔加入 10 µM 的 ROCK 抑制剂 Y-27632。
- 吸去培养基， 用 1 mL PBS 清洗孔板，然后每孔加入 1 mL 细胞解离溶液以解离 iPSCs。在 37 °C 下孵育 20 分钟。
- 通过向孔中加入 2 mL 终止培养基来中和细胞解离液。用移液器吹打以获得单细胞悬液。将细胞转移至 15 mL 圆底离心管中，在 300 x g 条件下离心 5 分钟 g.
- 吸弃上清液，将iPSCs重悬于添加了10 µM ROCKi的iPSC培养基中，并进行细胞计数。将100,000个hiPSCs接种至经ECM包被的12孔板中，每孔加入含10 µM ROCKi的1 mL iPSC培养基。于37 °C孵育过夜。
注意：iPSC 内皮分化过程中的接种密度可能需要根据不同的细胞系进行优化。在第 6 天通过流式细胞术检测 CD31 以评估分化效率。
- 侧中胚层诱导（第1-3天）
- 吸弃已接种的iPSC培养基，加入3 N2B27基础培养基，每孔添加6 µM CHIR和25 ng/mL BMP4补充文件 1）。在加入细胞前将培养基预热。3 天内不要更换培养基。
- 内皮细胞诱导（第4-5天）
- 第4天，吸除N2B27培养基，每孔加入2 mL内皮分化培养基（EDM），并补充200 ng/mL VEGF165和2 µM forskolin。第5天更换培养基。
- 内皮细胞分选与重铺（第6天）
- 第5或第6天，将1 mg纤连蛋白溶于无菌水中，配制成浓度为100 µg/mL的纤连蛋白溶液，用于包被T75培养瓶，以进行荧光激活细胞分选（FACS）富集。向T75培养瓶中加入6 mL纤连蛋白溶液，室温孵育1小时。吸除纤连蛋白溶液，用无菌水洗涤一次。将T75培养瓶置于室温下干燥。多余的培养瓶可于4 °C保存。
- 制备内皮细胞维持培养基（EMM）18.
- 第6天，富集iPSC来源的内皮细胞 通过 使用CD31抗体进行FACS18.
- 在37°C下解离前一小时，向每孔加入10 µM的ROCKi Y-27632。吸去培养基，并用PBS洗涤。每孔加入1 mL预热的细胞解离溶液（12孔板），于37°C孵育8–10分钟。
- 轻柔吹打以确保单细胞完全解离。将细胞转移至15 mL锥形管中，并加入等体积的终止培养基。在300 × g条件下离心5分钟。 g.
- 吸弃上清液，将内皮细胞重悬于1 mL添加了10 µM ROCKi的终止培养基中。 将细胞通过70 μm滤网过滤，先加入1 mL停止培养基润湿滤网，然后用移液器将细胞悬液通过滤网。取10 μL样品，用血细胞计数板和台盼蓝进行细胞计数。计数过程中保持细胞置于冰上。
- 进行细胞计数。取200,000个细胞作为未染色阴性对照。将剩余细胞转移至1.5 mL离心管中，每100万细胞加入10 µL CD31-APC，溶于100 µL FACS缓冲液中。在4 °C条件下于旋转仪上孵育30分钟。
- 孵育完成后，将含有细胞的离心管在300 x g条件下离心5分钟 g加入1 mL PBS洗涤细胞，重复洗涤和离心步骤两次，每次洗涤之间手动移除上清液。
- 将细胞沉淀重悬于1 mL FACS缓冲液中，并加入5 μg/mL DAPI溶液进行活率染色，分选前孵育5分钟。按照机构指南进行分选。
- 在含有2 mL EMM的15 mL圆锥形离心管中收集FACS分选的细胞。将含有细胞的15 mL圆锥形离心管在300 x g下离心5分钟。 g吸弃上清液，将内皮细胞重悬于10 mL EMM培养基中，培养基中添加10 µM ROCK抑制剂Y-27632和1%青霉素-链霉素。
- 将重悬的经FACS富集的iPSC来源的内皮细胞转移至纤维连接蛋白包被的培养瓶中。均匀分布细胞后，置于37 °C培养箱中过夜培养。
注意：每T75培养瓶使用细胞数量至少为500,000个，最多不超过2,000,000个。
- 分选内皮细胞的扩增与冷冻保存（第7天及以上）
- FACS 富集后每 2-3 天更换一次 EMM 培养基。当 T75 培养瓶中的细胞达到汇合状态时（约在 FACS 分选后 7 天，具体时间取决于接种密度），可将 iPSC 来源的内皮细胞用于共培养，或冻存以备后续应用。
- 在细胞解离前配制2倍内皮细胞冻存液（80% Endo-CM2，20% DMSO，20 µM ROCKi）。
- 使用耐乙醇记号笔在冻存管上标注相应信息：细胞系编号、传代次数、培养基种类、“复苏至6孔板”、冻存日期。
- 当分选后的iPSC来源的内皮细胞达到汇合状态时，开始进行解离。
- 用 5 ml 的 PBS -/- 清洗 T75 培养瓶。
- 用5 mL类胰蛋白酶消化液消化T75培养瓶中的iPSC来源内皮细胞。37 °C孵育10分钟，期间定期观察T75培养瓶，确认细胞已脱落。
- 加入5 mL终止培养基以中和反应。将10 mL细胞悬液转移至15 mL离心管中。在300 x g 5 分钟。
- 吸弃上清液，用E-CBM培养基重悬内皮细胞，并取出10 µL样品进行计数 通过 血细胞计数板
- 细胞计数后，将100万个细胞分装至每0.5 mL EGM2培养基中。
注意：以下步骤具有时间敏感性。请立即准备好将要使用的冻存管和冷冻容器。 - 向内皮细胞中加入等体积的2倍冻存液。终浓度为90% Endo-CM2、10% DMO和10 µM ROCKi（每100万个细胞加入1 mL）。
- 将盖好的小瓶立即放入冷冻室，置于-80 °C过夜，次日转移至液氮（-180 °C）中长期保存。
3. 诱导多能干细胞来源的巨噬细胞的生成（第1 - 26天）
注意：本方案概述了从诱导多能干细胞（iPSCs）生成巨噬细胞的步骤（图1D），参考自van Wilgenburg等19和Pouyanfard等20的研究。内容包括iPSCs的单细胞适应、类胚体分化、巨噬细胞前体形成以及巨噬细胞成熟。
- 诱导多能干细胞（iPSC）的单细胞适应
- 当iPSC达到约70%-90%融合度且无明显分化迹象时，使用类胰蛋白酶蛋白酶开始单细胞传代。
- 吸除废弃培养基，并用PBS洗涤。去除PBS后加入类胰蛋白酶蛋白酶（6孔板每孔1 mL，12孔板每孔500 µL）。在37 °C孵育2-5分钟，直至iPSC集落从培养皿上解离。
- 用等体积的终止培养基（Stop Media）中和类胰蛋白酶蛋白酶（6孔板每孔1 mL，12孔板每孔500 µL）。以200 × g离心5分钟。
- 吸除上清液，轻柔地将细胞重悬于含10 µM ROCK抑制剂（ROCKi）的iPSC培养基中，接种至新的细胞外基质（ECM）包被的培养板。在冷冻保存或使用单细胞适应的iPSC前，重复传代2-3次。
注：根据细胞状态和适应情况，调整传代比例为1:2至1:10。此外，经过至少三次单细胞传代且处于低代次的iPSC可获得最佳的巨噬细胞分化效果。
- 拟胚体形成（第0-6天）
- 当单细胞适应的iPSC达到约75%融合度时，按照步骤3.1-3.4使用类胰蛋白酶蛋白酶进行传代。
- 用终止培养基重悬细胞，并通过70 µm细胞筛网转移至新的50 mL锥形管中以去除细胞团块。重悬细胞后取10 µL样本，使用血细胞计数板进行细胞计数 via hemacytometer。
- 为生成拟胚体（EB），每96孔超低吸附（ULA）板每孔接种8,000-50,000个细胞。计算接种60孔所需的总细胞数。
注：不同iPSC细胞系可能需要优化接种密度。 - 将iPSC在15 mL锥形管中以200 × g离心5分钟。吸除上清液。
- 对于480,000个iPSC（60孔中每孔8,000个细胞），用6 mL（60孔中每孔100 µL）EB诱导培养基重悬。
- 向圆底96孔ULA板的36个外周孔中各加入150 µL PBS。
- 将EB培养基中的iPSC重悬后转移至加样槽中。使用多通道移液器将100 µL/孔的细胞悬液加入96孔ULA板中央的60个孔中。间歇性重悬iPSC以确保细胞分布均匀。
- 将96孔板在4 °C以300 × g离心5分钟（如条件允许）。随后将培养板转移至37 °C培养箱中。
- 48-72小时后更换50 µL培养基（半量换液）。第6天检查是否有囊状结构形成。
注：某些iPSC细胞系形成EB的时间更早或更容易。需密切监测EB形成情况，并确保在适当时间点转移EB（应处于囊状发育阶段）。
- 明胶包被及EB转移以形成巨噬细胞前体（第6-19天）
- 准备两块0.1%明胶包被的6孔板。每孔加入1 mL 0.1%明胶溶液，室温孵育20分钟。吸除明胶溶液后，在生物安全柜中干燥30-60分钟。
- 使用2 mL移液管将EB从96孔板转移至明胶包被的6孔板中。每孔明胶包被的6孔板中分配约8-10个EB。
- 小心去除转移过程中残留的EB培养基。每孔加入2 mL巨噬细胞培养基1（Mac-CM1）。在37 °C、5% CO2条件下静置培养5-7天。
注：理想情况下，一块96孔板的拟胚体可分至两块6孔板。若EB发育不良，可调整每块6孔板中转移的EB数量，以优化iPSC向拟胚体的分化步骤。
- 巨噬细胞前体生成
- 每周两次更换2/3体积的培养基；若培养基颜色变化，可将体积增加至3 mL。
- 在第8-19天之间检查培养物，判断是否已准备好收获巨噬细胞前体。若EB脱落，将其转移至新包被的培养板中，加入Mac-CM1并静置培养7天。
注：维持巨噬细胞前体形成复合体对巨噬细胞前体的发育和持续生成至关重要。优化后的巨噬细胞前体形成复合体可持续生成髓系前体细胞达2-6个月以上。
- 收获髓系前体细胞（第19-26天及以上）
- 当悬浮液中出现巨噬细胞前体细胞时，收集含细胞的培养基并转移至50 mL锥形管中。以200 × g离心5分钟，小心吸除上清液。
- 用Mac-CM2重悬巨噬细胞前体，并转移至未经处理的无菌培养皿/瓶中。在37 °C、5% CO2条件下培养3-4天。
注：根据收获的细胞数量，可将其转移至10 cm培养皿（相当于6孔板的3-4孔）、T25培养瓶（1-2孔）或T75培养瓶（整块6孔板），并加入相应体积的培养基。T25培养瓶使用5-6 mL培养基，培养皿使用10-12 mL，T75培养瓶使用12-15 mL。后续收获时，若来自同一细胞系或髓系形成复合体，可将前次收获的髓系前体细胞和巨噬细胞合并。只需确保培养瓶足够容纳并维持细胞数量。巨噬细胞不增殖，而是由巨噬细胞前体生成。巨噬细胞可合并后维持培养2-6周而不丧失标志物表达。
- 收获巨噬细胞
注：在Mac-CM2培养基中完成14天巨噬细胞分化后，巨噬细胞培养物即可用于共培养或流式细胞术分析。- 收集废弃培养基并转移至50 mL锥形管中。用PBS冲洗培养瓶/板，以去除残留培养基和细胞。
- 向培养瓶中加入基础培养基（T25为3 mL，T75为5 mL），使用无菌细胞刮刀将细胞从瓶/板底部刮下。将细胞转移至锥形管中，必要时重复刮取。
- 室温下以200 × g离心5分钟。小心吸除上清液，将细胞重悬于适当的培养基或缓冲液中以供后续使用。
4. 气道细胞、内皮细胞与巨噬细胞的共培养
注意：本实验方案描述了使用细胞培养小室共培养气道细胞、内皮细胞和巨噬细胞的步骤（图1A），改编自 Costa 等人12。
- 共培养细胞培养小室的细胞外基质包被（共培养第0天）
- 用 4 mg/mL 的 ECM 溶液包被 3.0 µm 孔径的聚对苯二甲酸乙二醇酯（PET）细胞培养小室。将 4 mg/mL ECM 溶液短暂孵育于细胞培养小室的顶端表面。吸除多余的 ECM 溶液，将培养板置于 37 °C 培养箱中孵育 1 小时。
- 获取一个大号培养皿（100 mm × 20 mm 或 150 mm × 20 mm）。使用洁净的镊子将细胞培养小室从12孔板中无菌转移至大号培养皿中。将小室倒置，使基底侧朝上。
- 在细胞培养小室的基底外侧涂布4 mg/mL的ECM溶液。吸除多余的ECM溶液。将涂有ECM的细胞培养小室置于培养皿中，放入37 °C培养箱中过夜干燥。
- iPSC来源的内皮细胞的解离与接种（共培养第1天）
- 用 PBS 清洗 T75 培养瓶并吸除液体。向 T75 培养瓶中加入 5 mL 类胰蛋白酶蛋白酶，于 37 °C 孵育 8 分钟。观察内皮细胞是否已从培养瓶表面脱落。
注意：如果由iPSC衍生的内皮细胞尚未从培养瓶脱落，可延长胰蛋白酶样蛋白酶的消化时间。 - 轻敲培养瓶以确保内皮细胞脱落，并将细胞转移至15 mL锥形离心管中。加入5 mL终止培养基以终止消化。以300 x g离心细胞 g 5 分钟。
- 吸弃上清液，将细胞沉淀重悬于1 mL含10 µM ROCKi的内皮细胞培养基中。取10 µL重悬液进行细胞计数，计数期间将细胞置于冰上。
- 每12 mm细胞培养小室使用150,000个iPSC来源的内皮细胞，接种于100 µL内皮细胞培养基中。根据需要调整相应培养基体积，以达到每个小室所需的细胞数量。
- 从培养箱中取出含有ECM包被的3.0 µm细胞培养小室的培养皿（见步骤4.1–4.3）。
- 重悬iPSC-内皮细胞，用移液器将含150,000个细胞的100 µL细胞悬液加至倒置的细胞培养小室（基底侧朝上）。对每个制备好的细胞培养小室重复移液操作。
- 将细胞小心转移至培养箱中，并静置孵育3小时。
- 在12孔板中，每孔加入1 mL内皮细胞培养基（根据所准备的细胞培养小室数量对应加入）。
- 从培养箱中取出含有内皮细胞的培养皿。使用无菌镊子，将细胞培养小室小心转移至含有内皮细胞培养基的培养板中（翻转小室，使底部朝下浸入培养基中）。
- 在显微镜下观察，确认内皮细胞已贴壁。将培养板置于37 °C培养箱中过夜。
- 用 PBS 清洗 T75 培养瓶并吸除液体。向 T75 培养瓶中加入 5 mL 类胰蛋白酶蛋白酶，于 37 °C 孵育 8 分钟。观察内皮细胞是否已从培养瓶表面脱落。
- iPSC来源的气道类器官的解离与接种（共培养第2天）
注意：参照步骤 1.1.1–1.1.15 进行气道类器官从 ECM 聚合物中的分离。将类胰蛋白酶（步骤 1.1.10）消化时间调整为 15–20 分钟，以获得单细胞悬液。- 孵育15-20分钟后，加入3 mL终止培养基以终止胰蛋白酶样蛋白酶反应。使用P1000移液器重悬溶液，并在400 x g条件下离心 g 5分钟。
- 吸弃上清液，将气道类器官重悬于1 mL含10 µM ROCKi的气道扩增培养基中。取10 µL样品进行血细胞计数板细胞计数，计数期间将细胞置于冰上。
- 在每个12 mm细胞培养小室中，用500 µL气道扩增培养基接种300,000个iPSC-气道细胞。根据所需细胞数量，调整相应培养基体积，以达到每个制备好的小室中目标细胞数。
- 从37 °C培养箱中取出带有内皮细胞（接种于基底外侧）的细胞培养小室板。
- 重悬iPSC-气道细胞，每孔细胞培养插入式培养皿的顶端室中加入含300,000个细胞的500 µL悬液。将培养板置于37 °C培养箱中培养48 h，顶端细胞保持液-液界面条件。
- 气液界面共培养（共培养第4天）
- 移除细胞培养小室顶端侧的培养基。将基底外侧培养基更换为1:1的气道分化培养基与内皮细胞培养基。将培养板放回培养箱。
- iPSC来源巨噬细胞的分离与接种（共培养第5天）
- 使用细胞刮刀从培养瓶中分离iPSC来源的巨噬细胞（参见步骤3.22–3.24）。在300 x g条件下离心 g 5 分钟后吸除上清液。
- 将iPSC来源的巨噬细胞重悬于1 mL Mac-CM2培养基中。取10 µL样品进行细胞计数，计数期间将细胞置于冰上。巨噬细胞数量应与接种的气道细胞数量相等（巨噬细胞与气道细胞比例为1:1）。
- 细胞计数后，将300,000个巨噬细胞分装至1.5 mL微量离心管中，每管含35 µL培养基，随后接种于预先准备好的细胞培养小室的各孔中。在200 x g条件下离心 g 5 分钟。
- 离心后，用移液器吸出上清液。根据计算结果，用相应的Mac-CM2重悬巨噬细胞。
- 从培养箱中取出含有内皮细胞和气道细胞共培养物的培养插件。将300,000个巨噬细胞接种于35 µL Mac-CM2培养基中，加入至细胞培养插件的顶端侧。将培养板置于37 °C培养箱中培养48 h。
注意：为了确认iPSC来源的免疫细胞是否贴附于细胞培养小室，可用荧光探针标记细胞以验证其贴附情况。 通过 巨噬细胞铺板后48小时进行荧光信号显微镜检测。
- 三重共培养（共培养第7天）
- 确保共培养体系已准备好用于后续应用，如感染研究、跨上皮电阻（TEER）测量和屏障完整性检测。
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结果
在诱导多能干细胞来源的气道类器官、内皮细胞、免疫细胞及共培养体系的分化过程中，存在多个可评估其是否成功完成的阶段。该分化方案可在不同的诱导多能干细胞系中进行，且本方案已在至少五个不同的细胞系中经过验证。然而，该方案需针对每一个新的诱导多能干细胞系进行适当调整，特别是通过修改和优化接种密度来实现。
iPSC来源的气道类器官成功获得的产量可进行评估 通过 明场下观察，应具备四个特征：边界清晰、呈半透明/囊状形态、具有增殖/扩展能力，以及无坏死细胞。在培养2周过程中体积不增大、形态模糊或出现坏死的气道类器官，不应用于共培养实验。外周存在厚壁腔层的类器官 与透明/囊状类器官仍可用于后续实验。然而，透明/囊状气道类器官主要由基底细胞组成，而厚壁双层膜类器官则主要由克拉拉细胞（club cells）组成。由于基底细胞易于增殖和扩增，因此更适合气液交界面培养和极化。其他评估iPSC来源肺类器官成功产出的方法还包括在肺前体细胞阶段（分化第16天）通过流式细胞术分析表面标志物CPM表1），成功的分化产出率 >50% CPM+...
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讨论
在大气道中建立和实施用于研究病毒感染及其他毒素的血液-空气屏障模型，需要细致入微的操作，以确保所涉及的各种细胞类型能够成功分化并发挥正常功能。本文将探讨实现成功分化的关键因素、可能面临的挑战、其他潜在应用以及在人类疾病研究中的意义。
为了确保成功分化，需注意细胞培养小室的类型和孔径大小。应使用较大的孔径，以确保通过细胞外基质（ECM）各层实现细胞间的相互通讯。确保诱导性多能干细胞（iPSC）系的最佳接种密度至关重要。适当的密度有助于实现均匀分化，并防止形成不希望的细胞团块，从而获得更均一且具有功能性的上皮层。为了维持健康且具有功能的上皮层，在添加任何化合物、毒素或病毒之前，清洗顶端表面非常重要。这有助于去除积聚的黏液、死亡细胞及其他碎片，从而促进稳定且可存活的培养环境，并使化合物能够有效接触上皮细胞。
对于内皮组分，必须确保细胞经过适当分选且具有均一性。可通过FACS等技术实现，以确保仅使用所需的目的内皮细胞，从而维持实验的一致性和细胞功能。
对于巨噬细胞组分，尽管巨噬细...
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
本研究由 CIRM（DISC2COVID19-12022）资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 12 孔板 | Corning | 3512 | |
| 12 孔插件，0.4 µm，透明 | VWR | 10769-208 | |
| 2-巯基乙醇 | Sigma-Aldrich | M3148 | |
| Accutase | Innovative Cell Tech | AT104 | |
| 激活素 A | R&D Systems | 338-AC | |
| 全反式维甲酸（RA） | Sigma-Aldrich | R2625 | |
| 抗坏血酸 | Sigma | A4544 | |
| 不含维甲酸的 B27 | ThermoFisher | 12587010 | |
| BMP4 | R&D Systems | 314-BP/CF | |
| 牛血清白蛋白（BSA）V 级，7.5% 溶液 | Gibco | 15260-037 | |
| Br-cAMP | Sigma-Aldrich | B5386 | |
| CD14（FITC） | BioLegend | 982502 | |
| CD31 PECAM-1（APC） | R&D System | FAB3567A | |
| CD45（PE） | BD Biosciences | 560975 | |
| CD68（PE） | BioLegend | 33808 | |
| CHIR99021 | Abcam | ab120890 | |
| CPM | Fujifilm | 014-27501 | |
| 地塞米松 | Sigma-Aldrich | D4902 | |
| Dispase | StemCellTech | 7913 | |
| DMEM/F12 | Gibco | 10565042 | |
| Dorsomorphin | R&D Systems | 3093 | |
| E-CAD/CD324（APC） | BioLegend | 324107 | |
| EGF | R&D Systems | 236-EG | |
| EGM2 培养基 | Lonza | CC-3162 | |
| EPCAM/CD326（APC） | BioLegend | 324212 | |
| FBS | Gibco | 10082139 | |
| FGF10 | R&D Systems | 345-FG/CF | |
| FGF7 | R&D Systems | 251-KG/CF | |
| 纤维连接蛋白 | Fisher | 356008 | |
| 佛波醇 | Abcam | ab120058 | |
| Glutamax | Life Technologies | 35050061 | |
| Ham’s F12 | Invitrogen | 11765-054 | |
| HEPES | Gibco | 15630-080 | |
| IBMX（3-异丁基-1-甲基黄嘌呤） | Sigma-Aldrich | I5879 | |
| IL-3 | Peprotech | 200-03 | |
| Iscove’s 改良杜尔贝科’s 培养基（IMDM）+ Glutamax | Invitrogen | 31980030 | |
| 无血清替代物（KSR） | Life Technologies | 10828028 | |
| Matrigel | Corning | 354230 | |
| M-CSF | Peprotech | 300-25 | |
| 单硫代甘油 | Sigma | M6145 | |
| mTeSR plus 试剂盒（每箱 10 个） | Stem Cell Tech | 5825 | |
| N2 | ThermoFisher | 17502048 | |
| NEAA | Life Technologies | 11140050 | |
| PBS | Gibco | 10010023 | |
| 青霉素/链霉素 | Lonza | 17-602F | |
| ReleSR | Stem Cell Tech | 5872 | |
| RPMI1640 + Glutamax | Life Technologies | 12633012 | |
| SB431542 | R&D Systems | 1614 | |
| SCF | PeproTech | 300-07 | |
| SMA | Invitrogen | 50-9760-80 | |
| STEMdiff APEL 2 培养基 | STEMCELL Technologies | 5275 | |
| TrypLE Express | Gibco | 12605-028 | |
| VEGF165 | Preprotech | 100-20 | |
| 波形蛋白 | Cell Signaling | 5741S | |
| Y-27632（ROCK 抑制剂） | R&D Systems | 1254/1 | |
| ZO-1 | Invitrogen | 339100 |
参考文献
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