建立小鼠呼吸道极低温空气吸入模型

摘要

寒冷环境刺激与多种慢性疾病的发生发展相关。因此，建立用于临床前研究的动物模型至关重要。该系统通过提供一种可构建刺激模型的装置，满足了针对致病机制基础研究的需求。

摘要

目前，构建用于寒冷环境刺激的小鼠模型主要采用冷热板和可穿戴式降温装置。这些方法能够在一定程度上满足研究小鼠皮肤或神经回路对冷刺激反应及其调控作用的需求。大量临床研究已证实，暴露于低温环境与多种疾病的发生发展存在相关性。近年来，人们对器官与组织之间持续进行信息交换的关注日益增加，这为解决人体内长期存在的复杂问题提供了新的视角。然而，现有的实验装置尚无法建立小鼠吸入冷空气的动物模型。

尽管将小鼠置于低温环境中看似可行，但这种方法存在显著局限性。当小鼠吸入冷空气时，其皮肤也受到寒冷环境的刺激，因此难以确定所观察到的病理变化是源于肺部通过远端器官相互作用所受到的刺激，还是源于皮肤感受器及神经信号传导。这给相关研究带来了较大困惑。本方案提出一种构建小鼠极端冷空气吸入刺激模型的新方法。该装置可使小鼠吸入极低温度的气体，同时保持其身体处于正常温度状态。该方法最大程度地模拟了极端环境温度对小鼠的刺激效应，满足了研究极端环境温度与相关疾病之间关系的科研需求。

引言

本方法主要利用一种非侵入性、标准化、稳定且可批量操作的半导体制冷温度反馈装置，在小鼠中建立极低温空气刺激模型。与低温相关的临床实验已证实，低温与多种疾病的发病率及预后存在密切关系。一项涵盖中国272个主要城市的时序研究共收集了1,826,186例非意外死亡病例。温度与死亡率之间的关系始终呈现为反J型曲线，其中因寒冷导致高死亡率的阶段显著长于其他温度条件。这表明低温对中风及心血管疾病的影响不仅局限于寒冷阶段，在寒冷阶段消退后的一段时间内仍持续存在影响。

在非意外死亡中，有14.33%可归因于环境温度因素，其中中度寒冷（-1.4至22.8 °C）和极端寒冷（-6.4至-1.4 °C）分别占10.49%和1.14%。死亡原因包括心脑血管疾病（17.48%）、冠心病（18.76%）、缺血性脑卒中（14.09%）、出血性脑卒中（18.10%）、呼吸系统疾病（10.57%）以及慢性阻塞性肺疾病（12.57%）¹。在中国，脑卒中的流行病学研究表明其发病率呈现出明显的由北向南递减的梯度趋势²。在中国东北寒冷地区，脑卒中的患病率是南方地区的2.36倍³。大量研究已证实低温环境对死亡率和脑卒中发病率具有直接的影响^4,5,6。因此，显著的气候温差是不可忽视的环境因素。

目前仍缺乏有效的科学推理来解释低温环境与中风及心脏问题发病率升高之间的关联，这一问题仍是研究的课题。尽管传统观点认为，低温可能通过皮肤刺激和交感神经兴奋导致血压升高⁷，但个体通常会采取措施进行保温，以维持体温平衡来应对寒冷环境。当暴露于低温时，现代人类主要依赖呼吸系统而非皮肤作为主要防御机制。虽然厚重衣物可以保护皮肤免受外界寒冷影响，却无法阻止冷空气被吸入呼吸道，从而使气管和肺泡暴露于强烈的寒冷刺激之下。目前构建低温刺激动物模型的方法主要分为两个方面。首先，大量研究聚焦于探索小鼠皮肤对低温刺激的反应及其调控机制。其中一种方法是将小鼠置于可控制温度变化（4–25°C）的金属板上，以研究机体在寒冷刺激下体温调节和回避行为的具体调控机制^8,9。另一些研究则在小鼠背部放置冷却装置，以探究神经回路在体温调节中的作用¹⁰。

相反，已有若干研究将小鼠置于温度可变（4–30 °C）的小型密闭舱内。Lal 及其同事以及 Qian 等人采用该方法构建了冷刺激小鼠模型，以探索调控寒冷诱导摄食行为的神经内分泌神经回路^11,12。然而，上述两种方法均存在局限性。首先，最低温度为 4 °C，不足以模拟极端低温空气刺激；该方法无法排除皮肤及神经回路对寒冷环境的调控作用。作为主要的气体交换场所，肺部也是冷敏感神经元富集的器官^13,14。多位研究人员已证实冷敏感神经元在多种疾病中的调控作用^15,16,17。因此，亟需建立一种稳定、大规模且标准化的呼吸道低温动物模型构建方法。明确在极端低温空气刺激下肺部及冷敏感神经元在多种慢性疾病中的调控作用，对于在寒冷地区预防和治疗脑卒中、冠心病及呼吸系统疾病具有重要的理论意义。过去两年中，本团队通过构建一种低温装置，有效填补了这一关键空白。该装置具有可重复性高、实用性强、结构简单和成本低廉等特点，适用于此类研究。

方案

哈尔滨医科大学附属第一医院实验动物伦理委员会已批准所有涉及动物受试对象的实验程序。

1. 装置组装

注意：设备组件见图1。

1. 使用金属连接件将两组黄铜外壳固定到两组半导体冷却芯片上。在黄铜外壳与半导体冷却芯片之间涂抹导热硅脂。
2. 在黄铜外壳与半导体冷却芯片之间涂抹导热硅脂。
3. 在每一块半导体制冷片下方连接两组风扇。确保黄铜外壳、风扇、半导体冷却芯片和导热硅脂牢固连接，构成一个完整的组件。
4. 将整个装置放入集气瓶中，并安装槽口的两块盖板。
5. 在集气瓶的上方和下方安装盖板。
6. 将进水管和出水管分别连接到黄铜外壳的进水口和出水口。
7. 用管道将四组黄铜外壳连接到集气瓶的顶部和底部。
8. 将水泵连接到进水管。
9. 将出水管置于水箱中。
10. 将四组半导体冷却器和水泵连接至两组电源（12 V 和 40 A）。

2. 实验动物的准备

注意：本实验使用一只4周龄的C57Bl/6雄性小鼠。建议在制备模型前，让小鼠适应固定装置3至5天。实验环境应保持室温，并维持安静，避免整个实验过程中产生噪音。

1. 将小鼠固定在固定器中：把小鼠放入固定器，使其鼻部前端位于固定器开口处。使用匹配的海绵塞填充并固定固定器后端，确保海绵塞上有通风孔。随后，将小鼠固定器放入气体收集罐的圆柱形插槽中（图1D）。

3. 实验操作流程

1. 准备冰水混合物，并将其放入水槽中。
   注意：此步骤中，应确保冰水混合物的液面高于水泵，以保证在整个实验过程中能及时补充混合物。不建议使用室温水。
2. 将水泵置于冰水混合物中，并确保出水软管已浸没于液体中。
3. 将温度传感器探头插入气体收集瓶的测温孔内。
4. 将水泵连接至电源并开启。
5. 将电源连接至温度控制器，将制冷装置的电源适配器插入温度控制器的电源插座，并在控制器上设定所需的温度范围。
6. 设定温度控制器的温度范围。
7. 实验结束后，取出小鼠并将其放回饲养环境。
8. 关闭温度控制器的电源。
9. 关闭水泵。

4. 热成像

注意：为了证明并验证小鼠在此装置中能够吸入极低温空气的同时维持正常体温，使用热成像相机测量了气体收集瓶内的温度（图2）。

1. 使用手持式热成像仪从最佳距离测定集气瓶的通气孔和测温孔的温度。
2. 将指示测量位置的红色激光点精确对准指定测温区域的中心。
3. 采用相同方法，重新测量小鼠的体温。

结果

我们可以观察到该装置的整体结构，包括半导体制冷芯片、导热硅脂、气体收集罐、温度控制器、风扇、水冷循环系统、小鼠固定器以及电源适配器。单个装置可同时满足最多16只小鼠的造模需求（图1A，B）。气体收集罐、水冷循环系统、半导体制冷芯片、风扇和小鼠固定器共同构成装置的主体部分（图1C）。在装置主体内部，小鼠固定器的前端可插入气体收集罐中，确保小鼠鼻部直接吸入低温气体（图1D）。在装置主体内侧顶部可见四组风扇，风扇背面通过导热硅脂与半导体制冷芯片相连（图1E）。与该装置配合使用的小鼠固定器呈圆柱形，前端可伸入气体收集罐内，固定器中部设有通风孔，后端配有塞子用于固定，可满足不同体型小鼠的固定需求（图1F）。

实验过程中，通常使用温度传感器探头实时连续监测集气罐内的温度，具体操作详见方案步骤3.3。为演示并验证小鼠在此装置中可吸入极低温气体的同时维持正常体温，采用红外热成像相机对集气罐内的温度进行了测量（图2）。集气罐内的温度观测值约为-20 °C。结果显示，固定装置内的小鼠体温未受影响。结果证实，该装置能够在维持小鼠体温处于正常状态的同时，使其吸入极低温气体。目前，已有若干研究人员聚焦于极端低温条件下慢性疾病的影响及其病理机制研究。本装置可满足此类研究的需求。通过应用该装置，可建立稳定的批量动物模型，为后续研究奠定坚实基础。

图1：装置的整体结构及各部件分解图。（A）装置在实验状态下的整体展示。（B）装置整体的仰视图，显示气体收集瓶底部有两组半导体制冷片和黄铜外壳。（C）气体收集瓶的局部放大图。（D）移除罐体顶部装置的局部放大图后，可观察到小鼠固定装置的头部可伸入瓶内，在实验过程中确保仅有小鼠的鼻部暴露于低温环境中。（E）风扇的放大图。（F）小鼠固定装置的图像，显示装置的头部、通气孔以及尾部的胶塞。请点击此处查看该图的放大版本。

图 2：设备运行过程中冷却效果的监测示意图。(A) 在远红外测温仪的监测下，可观察到整个设备处于低温状态。附着在设备外表面的保温材料显示温度为 13 °C。(B) 使用远红外测温仪测量实验过程中小鼠固定装置所在通风口的温度，可观察到气体收集罐内部温度为 -21.1 °C。该设备已满足我们的设计要求。(C) 实验中将小鼠从设备中取出后，使用远红外测温仪测量小鼠鼻部与身体的温度，结果显示小鼠鼻部温度显著降低，而身体温度保持正常。(D) 实验装置顶部设计有测温孔，通过该孔使用远红外测温仪测量气体收集罐内部温度，结果显示其内部温度为 -21 °C，证明该装置可用于低温相关研究。请点击此处查看该图的放大版本。

讨论

在构建低温刺激模型时，必须遵循若干关键步骤并采取必要的预防措施，以确保实验的准确性和动物福利。应使用冰水混合物而非室温水，以在整个实验过程中维持冷却水的低温状态，从而模拟极低温环境。确保循环冷却水系统畅通无阻，以保障制冷系统的高效运行。在制备冰水混合物时，需注意以下几点：（1）冰水混合物是指下方为固态冰、上方为液态水的状态；（2）实验过程中需仔细观察固态冰的融化情况，因为融化可能导致冰块上浮。这些上浮的冰块可能堵塞水泵表面，从而影响有效散热。实验结束时，应先关闭制冷单元的电源，再关闭水泵电源。这样可确保循环水系统在停机后仍能继续对制冷半导体进行散热，防止温度骤升而影响实验结果。在温度监测方面，本装置采用智能温度控制器。装置电源连接至智能温度控制器，由控制器设定温度范围。实验过程中，将温度探头置于集气瓶内，持续监测温度变化。一旦温度超出设定范围，控制器将自动切断装置电源，以维持温度在设定范围内。

如果在实验过程中制冷效率显著降低或制冷装置发生故障，请考虑以下可能性：（1）确保泵位于冰水混合物中；（2）检查水温是否过高；（3）检查半导体制冷片是否损坏；（4）确认半导体制冷片的电源连接线是否断裂。

该设备存在一定的局限性。实验过程中需要大量冰水混合物来冷却半导体制冷片，且设备的制冷效率受半导体冷却芯片制冷性能的影响。未来的改进方向可能包括将水循环制冷装置设计为闭环系统，并采用制冷液或防冻液作为冷却介质。同时，优化设备外观，解决管道和电源连接线裸露的问题，将有助于提升设备的便携性和推广性。此外，为了确保小鼠稳定、持续地吸入低温气体，实验中使用了小鼠固定装置和橡胶塞对小鼠进行固定。由于吸入极冷气体可能带来刺激，为保障小鼠的福利并防止冻伤及心理问题，刺激过程的时间受到严格限制。未来的研究将致力于优化固定装置，以尽量减少在刺激阶段对小鼠造成的额外伤害。

该技术不仅对研究低温环境对生物体影响的基础科学研究具有重要意义，而且在研究寒冷地区人群慢性疾病的发病机制方面也具有潜在应用价值。极寒空气的定义因不同地区和环境而异。然而，通过配置温度控制系统，该设备可调节至满足从室温到-20 °C范围内任意温度的研究需求。这种灵活性确保了设备能够适应研究人员多样化的温度要求。此外，该技术有助于探索低温条件下肺脏在器官间通讯中的作用，为预防和治疗寒冷地区人群的中风、冠心病及呼吸系统疾病提供了坚实的基础。通过遵循这些操作步骤和注意事项，研究人员可构建稳定且标准化的动物模型，用于研究极端低温环境对生物体的影响，从而为相关疾病的预防与治疗提供科学依据。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
黄铜外壳	深圳海达高科技电子设备公司
储水罐	深圳功德城塑料工业
风扇	超晶音电子有限公司	4010	12 V
气体收集瓶	深圳功德城塑料工业
进/出气管	上海申晨橡胶塑料制品厂
小鼠固定器	兰杰科技术
电源	深圳海达高科技电子设备公司		12 V 40 A
半导体冷却芯片	深圳海达高科技电子设备公司	TEC2-19006	双层制冷
海绵塞	深圳功德城塑料工业
不锈钢紧固件	深圳海达高科技电子设备公司
导热硅脂	深圳海达高科技电子设备公司	DRG102
水泵	深圳巨泰泵业有限公司	DC005	12 V
水泵电源适配器	超科电源适配器厂	1210	100-240 V 50-60 HZ 12 V