利用基因组编辑技术设计培育功能性水稻

摘要

本方案介绍了一种利用基因组编辑技术，以精确、高效且技术简便的方式设计培育抗性淀粉水稻品种的方法。

摘要

传统的作物育种方法主要依赖于传统杂交和诱变育种等耗时且劳动密集型的技术，在高效引入目标性状和创制多样化植物群体方面面临挑战。相比之下，基因组编辑技术的出现带来了一场范式变革，使得能够精确且快速地操控植物基因组，从而有目的地引入期望的性状。其中应用最广泛的编辑工具之一是CRISPR/Cas系统，研究人员已利用该系统研究诸多重要的生物学问题。然而，基因组编辑在作物育种中的精确且高效的操作流程尚未得到充分明确。本研究展示了培育富含高抗性淀粉（resistant starch, RS）水稻品种的完整过程，抗性淀粉是一种在预防糖尿病和肥胖等疾病中发挥关键作用的功能性状。该操作流程包括多个关键步骤：功能SBEIIb基因的筛选、单导向RNA（sgRNA）的设计、合适的基因组编辑载体的选择、载体递送方法的确定、植物组织培养、突变基因分型以及表型分析。此外，本研究还清晰地展示了每个阶段所需的时间周期。该技术方案不仅简化了育种流程，而且提高了性状引入的准确性和效率，从而加速了功能性水稻品种的开发。

引言

传统育种依赖于将性状导入作物或产生具有足够变异的植物群体，这需要长期的田间观察^1,2。由于传统育种存在局限性，基因编辑技术得以发展，该技术可对作物基因组进行精确修饰，从而获得目标植物群体的理想性状³。目前在植物中应用最广泛的基因编辑系统是CRISPR/Cas（成簇规律间隔短回文重复序列/CRISPR相关Cas核酸酶），该系统依赖于一种可编程的RNA引导核酸酶，在DNA中产生特异性的双链断裂（DSBs）^4,5。这些双链断裂随后由细胞自身的DNA修复机制进行修复^6,7，通常导致目标遗传变异的引入。尽管该技术已在小麦⁸、玉米⁹、大豆¹⁰和水稻¹¹等多种作物中得到应用，但其主要仍用于揭示生物学问题。与基因编辑技术在解析植物基因功能方面的广泛应用相比，将其应用于作物育种的研究仍相对较少¹²。

方案

本研究在中国贝尔基因生物技术有限公司进行，遵循人类研究伦理委员会的指导原则。在参与研究之前，已向受试者详细说明研究方案，并获得其知情同意。

1. 设计sgRNA并构建载体（耗时5-7天）

注意：使用了双元载体来表达CRISPR/Cas-SF01系统²¹。sgRNA与潜在脱靶位点之间的错配核苷酸（nt）不得少于3个。sgRNA接头需要与编辑载体经Bsa I酶切后产生的黏性末端互补。软件的选择依据是该软件在水稻中报道的高效性和特异性¹⁴，以及其易用性和对研究团队的可及性。

1. 访问 NCBI 网站（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/）以检索 Japonica 中的 OsSBEIIb（LOC4329532）基因。在 SnapGene 软件中下载并访问参考基因组。
2. 分析 X134 品种 OsSBEIIb 基因外显子序列中的插入/缺失（InDel）和单核苷酸多态性（SNP），并与参考基因组进行比较。利用 NCBI Primer Blast²² 设计位于外显子区域两侧的引物（补充表 1）。
....

结果

在本研究中，通过基因组编辑技术展示了培育功能性水稻的完整流程，以获得稳定的抗性淀粉水稻品种。我们整合了靶向 SBEIIb 进入 CRISPR/Cas-SF01（补充图1），使用渗透法处理水稻 农杆菌 转化后，经过筛选和生根阶段获得T0代植株。筛选出基因功能缺失的植株，在收获种子后测定其抗性淀粉含量（图1在E0植株中通过Sanger测序检测到纯合突变（20.8%），并且 sbeIIb-1（-2bp，CC）， sbeIIb-2 （-4bp，AGCC），以及 sbeIIb -3（-4bp，GTGC）在目标序列中导致编码区发生移码突变，从而产生无功能的蛋白质（图2, 补充图2和补充图3).

经过细致的筛选过程，以鉴定出携带 E1 植株 sbeIIb-1, sbeIIb-2 和 sbeIIb-.......

讨论

在构建基于CRISPR/Cas-SF01的敲低载体过程中，必须精细筛选单导向RNA（sgRNA），这是至关重要的步骤。需要选择那些具有高编辑效率且脱靶效应最小的序列。此外，在合成靶向引物时，需加入与载体剪接位点匹配的短接头寡核苷酸，以确保无缝整合。值得注意的是，与以往需要依次进行酶切消化、凝胶纯化和连接的实验方法不同，本研究通过将酶切与连接步骤整合到一个一体化系统中，简化了操作流程。这一改进显著提高了操作效率，并缩短了实验周期。

与经典的Cas9核酸酶相比，Cas-SF01展现出明显的优势，凸显了其在分子植物育种中的应用潜力。这些优势共同确立了Cas-SF01作为农业生物技术中一种极具前景的工具的地位。首先，Cas-SF01较小的蛋白质尺寸可能提高其在植物体内的细胞递送效率。其次，其较短的crRNA序列有利于设计多重靶向策略，从而实现更复杂的遗传修饰²⁸。第三，Cas-SF01通常诱导产生较大规模的突变，而Cas9通常仅引起1 bp的插入或缺失（indel），表明Cas-SF01在实现更显著的遗传改变方面具有更大潜力

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
2 x Taq Plus Master Mix II	诺唯赞生物科技有限公司	P213	检测基因的单核苷酸多态性（SNP）
2,4-二氯苯氧乙酸（2,4-D）溶液	植物技术	D309
AAM 培养基	山东拓普生物工程有限公司	M9051C
BsaI-HF	新英格兰生物实验室	R3535	编辑载体的 Bsa I 酶切消化
羧苄青霉素类抗生素	Applygen	APC8250-5	选择  培养基，再生培养基
水解酪蛋白䏡	BBI生命科学公司	A603060-0500	愈伤组织诱导培养基，共培养培养基，筛选培养基，再生培养基
DH5α 化学感受态细胞	Weidi Biotechnology Co., Ltd.	DL1001	E. coli 感受态细胞
D-山梨醇	BBI生命科学公司	A610491-0500
EDTA，二钠盐，二水合物	钻石	A100105-0500	CTAB缓冲液
EHA105 感受态细胞	Weidi Biotechnology Co., Ltd.	AC1010	农杆菌 感受态细胞
FastPure 质粒小提试剂盒	诺唯赞生物科技有限公司	REC01-100	质粒提取
潮霉素类抗生素	Yeasen	60224ES	共培养培养基、筛选培养基、再生培养基和生根培养基
卡那霉素类抗生素	Yeasen	60206ES10	农杆菌筛选
KOH	Macklin	P766798	CTAB缓冲液
L-谷氨酰胺	植物技术	G229	愈伤组织诱导培养基，共培养培养基，筛选培养基，再生培养基
L-脯氨酸	植物技术	P698	愈伤组织诱导培养基，共培养培养基，筛选培养基，再生培养基
秀水134水稻干种子	-	-	用于培育抗性淀粉水稻的粳稻品种
碾米机	MARUMASU	MHR1500A	生产白米
穆拉希格-斯科格	植物技术	M519	生根培养基，再生培养基
肌醇	植物技术	I703	再生培养基
NaCl	Macklin	S805275	对于  YEP 培养基
NB基础培养基	植物技术	N492	愈伤组织诱导培养基，共培养培养基，筛选培养基，再生培养基
蛋白胨	Solarbio	LA8800	对于  YEP 培养基
Phytogel	上海源叶生物科技有限公司	S24793
盆	Midea group Co.	MB-5E86	煮饭方法
冰箱	Haier	BCD-170	储存培养基
抗性淀粉检测试剂盒	Megazyme	K-RSTAR	抗性淀粉的测定与分析
利福平类抗生素	Sigma	R3501-250MG	农杆菌筛选
次氯酸钠溶液	Macklin	S817439	用于种子灭菌
蔗糖	上海源叶生物科技有限公司	B21647	愈伤组织诱导培养基，共培养培养基，筛选培养基，再生培养基
T4 DNA连接酶	新英格兰生物实验室	M0202	将sgRNA连接至CEISPRY/Cas-SF01载体
血糖监测仪	医疗设备 &安普供应有限公司	Xuetang 582	检测血糖
Tris-HCl	Macklin	T766494	CTAB缓冲液
酵母琼脂	Solarbio	LA1370	对于  YEP 培养基
YEP 培养基	-	-	农杆菌的培养