利用基因组编辑技术设计培育功能性水稻

摘要

本方案介绍了一种利用基因组编辑技术，以精确、高效且技术简便的方式设计培育抗性淀粉水稻品种的方法。

摘要

传统的作物育种方法主要依赖于传统杂交和诱变育种等耗时且劳动密集型的技术，在高效引入目标性状和创制多样化植物群体方面面临挑战。相比之下，基因组编辑技术的出现带来了一场范式变革，使得能够精确且快速地操控植物基因组，从而有目的地引入期望的性状。其中应用最广泛的编辑工具之一是CRISPR/Cas系统，研究人员已利用该系统研究诸多重要的生物学问题。然而，基因组编辑在作物育种中的精确且高效的操作流程尚未得到充分明确。本研究展示了培育富含高抗性淀粉（resistant starch, RS）水稻品种的完整过程，抗性淀粉是一种在预防糖尿病和肥胖等疾病中发挥关键作用的功能性状。该操作流程包括多个关键步骤：功能SBEIIb基因的筛选、单导向RNA（sgRNA）的设计、合适的基因组编辑载体的选择、载体递送方法的确定、植物组织培养、突变基因分型以及表型分析。此外，本研究还清晰地展示了每个阶段所需的时间周期。该技术方案不仅简化了育种流程，而且提高了性状引入的准确性和效率，从而加速了功能性水稻品种的开发。

引言

传统育种依赖于将性状导入作物或产生具有足够变异的植物群体，这需要长期的田间观察^1,2。由于传统育种存在局限性，基因编辑技术得以发展，该技术可对作物基因组进行精确修饰，从而获得目标植物群体的理想性状³。目前在植物中应用最广泛的基因编辑系统是CRISPR/Cas（成簇规律间隔短回文重复序列/CRISPR相关Cas核酸酶），该系统依赖于一种可编程的RNA引导核酸酶，在DNA中产生特异性的双链断裂（DSBs）^4,5。这些双链断裂随后由细胞自身的DNA修复机制进行修复^6,7，通常导致目标遗传变异的引入。尽管该技术已在小麦⁸、玉米⁹、大豆¹⁰和水稻¹¹等多种作物中得到应用，但其主要仍用于揭示生物学问题。与基因编辑技术在解析植物基因功能方面的广泛应用相比，将其应用于作物育种的研究仍相对较少¹²。

作物基因编辑的过程通常遵循一个明确定义的工作流程，该流程包括多个关键步骤¹³第一步是确定需要修饰以获得目标性状的特定基因或基因组区域。第二步是设计基因编辑策略，包括选择合适的基因编辑系统（例如 CRISPR-Cas9 或 CRISPR-Cas12）以及设计特异的向导 RNA，以引导内切核酸酶靶向目标位点。第三步是将基因编辑系统整合到递送载体中，用于将编辑工具导入植物细胞。这些载体可以是 DNA、RNA 或核糖核蛋白（RNP）复合物。随后，通过多种方法将基因编辑载体递送至植物细胞，包括 农杆菌介导的转化、基因枪轰击或电穿孔。转化后的植物细胞需立即在适当条件下进行培养，以获得基因编辑的愈伤组织或胚性组织。随后，通过组织培养技术将这些组织再生为完整植株。再生植株需经过严格的分子鉴定，以确认目标遗传修饰的存在。

Tsakirpaloglou 等人先前发表的一篇文章¹⁴对基因编辑过程提供了全面概述，涵盖了从载体设计到获得编辑幼苗的各个环节，但并未深入探讨与靶向基因相关的特定性状的详细分析，也未对编辑作物的农艺表现或功能验证进行后续评估。我们的研究已超越了仅仅证明在水稻中实现基因编辑可行性的层面。本工作系统地评估了该基因编辑对水稻品系在生化、分子及农艺性状方面的影响，包括对淀粉组成成分的分析——这是影响稻米品质和营养价值的关键因素，而在以往的基因编辑研究中对此尚未进行充分探索。

大米淀粉通常由约20%的直链淀粉和约80%的支链淀粉组成¹⁵。SBEIIb 是支链淀粉合成所必需的一种酶，其在胚乳中表达¹⁶。通过发夹RNA（RNAi）和微小RNA表达对OsSBEIIb进行基因沉默，可提高抗性淀粉含量^17,18。抗性淀粉是一种不能在小肠中被消化和吸收的底物淀粉，但可在肠道中被某些消化细菌分解为短链脂肪酸和气体。由于其不能被快速分解，与其他淀粉相比具有较低的血糖生成指数，在摄入后短时间内不会引起血糖迅速升高，因此在膳食中可在一定程度上缓解糖尿病¹⁹。此外，抗性淀粉还具有多种生理功能，例如降低胰岛素反应、调节肠道功能、防止脂肪积累、有助于体重控制以及促进矿物质离子的吸收。因此，抗性淀粉正被广泛开发为一种新型膳食纤维²⁰。

为了克服这些挑战并成功利用基因编辑技术培育功能性水稻品种，我们对水稻中的操作流程进行了改进和优化。我们的工作重点在于细致分析目标基因位点的设计，谨慎选择最合适的基因编辑工具，并在整个育种过程中进行严格的表型分析。为证明这些技术的强大功能与高效性，我们展示了一个案例研究，介绍了一种富含高抗性淀粉的功能性水稻品种的快速培育过程。该实例凸显了基因编辑技术在加速功能性水稻育种方面的潜力，有助于弥补当前该领域研究的不足。

方案

本研究在中国贝尔基因生物技术有限公司进行，遵循人类研究伦理委员会的指导原则。在参与研究之前，已向受试者详细说明研究方案，并获得其知情同意。

1. 设计sgRNA并构建载体（耗时5-7天）

注意：使用了双元载体来表达CRISPR/Cas-SF01系统²¹。sgRNA与潜在脱靶位点之间的错配核苷酸（nt）不得少于3个。sgRNA接头需要与编辑载体经Bsa I酶切后产生的黏性末端互补。软件的选择依据是该软件在水稻中报道的高效性和特异性¹⁴，以及其易用性和对研究团队的可及性。

1. 访问 NCBI 网站（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/）以检索 Japonica 中的 OsSBEIIb（LOC4329532）基因。在 SnapGene 软件中下载并访问参考基因组。
2. 分析 X134 品种 OsSBEIIb 基因外显子序列中的插入/缺失（InDel）和单核苷酸多态性（SNP），并与参考基因组进行比较。利用 NCBI Primer Blast²² 设计位于外显子区域两侧的引物（补充表 1）。
3. 为通过 Sanger 测序验证 X134 中 OsSBEIIb 基因的外显子序列，按如下方式配制反应体系：10 µL 聚合酶混合缓冲液，加入 1 µL 正向引物、1 µL 反向引物、1 µL X134 组织的基因组 DNA 以及 7 µL 蒸馏水。PCR 程序设置如下：95 °C 预变性 3 min；然后进行 35 个循环：(95 °C 变性 20 s - 56 °C 退火 30 s - 72 °C 延伸 60 s)，最后 72 °C 延伸 5 min。
4. 根据 Tsakirpaloglou 等人¹⁴的方案，在 X134 的 OsSBEIIb 外显子序列上设计 sgRNA，并确保 PAM 序列为 TTN。
5. 对 sgRNA 序列进行修饰：在正向引物的 5' 端添加 -ACAC- 寡核苷酸，在反向引物的 5' 端添加 -GGCC- 寡核苷酸。将修饰后的正向/反向引物（用于 sgRNA）进行商业合成。
6. 将正向和反向引物溶解至浓度为 10 µmol/L，各取 1 µL 加入 8 µL 退火缓冲液（Tris-EDTA 缓冲液 + 50 mM NaCl）中，用移液器混匀。放入 PCR 仪中，运行退火程序：从 95 °C 缓慢降温至 16 °C，降温速率为 0.1 °C/s。
7. 将 sgRNA 片段连接至基因组编辑载体中。按如下方式配制连接反应体系：20 µL 混合缓冲液中加入 0.5 µL T4 DNA 连接酶、1 µL Bsa I 限制性内切酶、2 µL 10x 限制性酶切缓冲液、2 µL 10x T4 DNA 连接酶缓冲液、2 µL 退火后的引物、2.5 µL 载体（其体积可根据比例调整）以及 10 µL 蒸馏水。所有情况下均采用 2:1 的插入片段与载体摩尔比，以提高连接效率。PCR 组装程序设置为：(37 °C 2 min；16 °C 3 min)，共 30 个循环，最后 55 °C 保温 30 min。
8. 按照文献所述方法²³，将构建好的载体转化至 E. coli 感受态细胞中。
9. 设计跨越质粒中 gRNA 插入位点的引物，对单个菌落进行 PCR 扩增，以筛选成功插入的克隆。对 PCR 产物进行 Sanger 测序，确认克隆正确后提取质粒²⁴。

2. 转化 农杆菌 （耗时 4 天）

1. 解冻 EHA105 农杆菌 将感受态细胞置于冰上。向细胞悬液中加入1-2 µL质粒DNA（含约100-200 ng DNA），轻轻混匀。
2. 将试管置于冰上5分钟，液氮中5分钟，37 °C热激5分钟，再置于冰浴中5分钟，进行热激转化。
3. 向离心管中加入700 µL不含抗生素的酵母提取蛋白胨（YEP）培养基，轻轻混匀。将细胞置于28 °C、200–250 rpm的摇床培养箱中恢复培养2–3小时。
4. 将培养物在 2,800 x g 1分钟。弃去大部分上清液，保留约100 µL，重悬细胞。将细胞铺于含有1%抗生素（卡那霉素和利福平）的YEP琼脂平板上，用于质粒筛选。在28 °C培养24–48小时。
5. 用含有单菌落的移液枪头在YEP（含抗生素抗性）平板上划线 农杆菌 含有CRISPR/Cas的细胞转入5 mL添加适当抗生素的YEP液体培养基中，于28 °C培养3天。
6. 储存转化后的 农杆菌 将菌株以甘油菌种形式保存于 -80 °C，以备后续使用。

3. 农杆菌介导的水稻转化 Agrobacterium （耗时3个月）

注意：已有多种植物转化方法被报道用于将外源DNA序列递送并表达于植物细胞中²⁵。考虑到单拷贝整合以及基因组中双链断裂（DSB）的发生频率较低，农杆菌介导的转化是将表达DNA片段整合到水稻染色体中的首选方法。

1. 执行 农杆菌介导的水稻转化，遵循以下方案中的步骤²⁵生长旺盛的愈伤组织（淡黄色、相对较干、直径1-3 mm）是高效转化的关键。在用农杆菌侵染愈伤组织之前，应剔除已出现苗状结构或呈褐色的愈伤组织。 农杆菌.

4. 转基因植株的基因分型及种子收获（耗时8个月）

注意：需要种植两代水稻以获得纯合突变且无外源DNA的品系。

1. 取样幼苗组织：将转基因植株移栽至花盆中，在温室中培养1个月。为检测突变类型，从单株幼苗的每个分蘖采集2–3 mg新鲜叶片，并合并为一个样品。
2. 基因组DNA提取：按照已建立的植物基因组DNA提取方案进行²⁶。
3. 设计突变引物（补充表1）：设计PCR引物以扩增SBEIIb基因中sgRNA靶位点周围的区域¹⁴，扩增片段长度为493 bp。
4. 突变基因分型：直接对PCR产物进行测序，或将其克隆至T-克隆载体后采用Sanger法测序，以鉴定突变类型¹⁴。
5. 种子收获：选择呈现纯合移码突变的E0株系，将其种植于温室中以收获种子。
6. 设计用于鉴定T-DNA的引物：针对载体中的潮霉素抗性基因盒（Hygromycin cassette）、UBI基因盒和Cas基因盒设计三种特异性引物，用于从突变株系中鉴定无外源DNA的植株（补充表1）。
7. 确认无外源T-DNA株系：采集2周龄幼苗的叶片，按照步骤4.2所述方法提取植物基因组DNA。进行基因组PCR扩增，程序如下：95 °C预变性3 min；随后进行35个循环：95 °C变性20 s、56 °C退火30 s、72 °C延伸60 s，最后72 °C延伸5 min。该程序可用于检测植物基因组中是否存在潮霉素抗性基因盒、UBI基因盒和Cas基因盒。
8. 通过琼脂糖凝胶电泳分析PCR产物，选择无扩增条带的株系，表明其为无转基因成分的E1代植株。采集这些筛选出的株系的种子。

5. 抗性淀粉含量测定（耗时4天）

1. 收获突变体和X134植株的种子，并在室温下自然干燥，保持水分含量约为13%-15%。采用下述胰腺α-淀粉酶/淀粉葡萄糖苷酶（AMG）法测定抗性淀粉含量。
2. 启动脱壳机，将10 g稻谷加入进料口，有效去除颖壳，得到加工后的稻米种子。
3. 将脱壳后的稻米种子转移至精米机中，运行60秒以去除糊粉层，获得精米。
4. 将精米放入组织研磨仪中，调节研磨频率至60 Hz，运行15秒，重复2次，制备成米粉。
5. 将研磨后的米粉放入培养皿中，并置于预热的烘箱内。设定温度为37 °C，干燥12小时。
6. 精确称取100 mg ± 5 mg样品，直接倒入2.0 mL微量离心管中。轻弹管壁，确保样品沉降至管底。
7. 向管中加入180 µL纯化水，在水浴中煮沸20分钟。
8. 让样品冷却至室温，然后向每根试管中加入含胰腺α-淀粉酶（10 mg/mL）的AMG酶液4 mL（3 U/mL）。
9. 盖紧管盖，用涡旋振荡器混匀，于37 °C条件下持续振荡孵育16小时。
10. 加入4 mL乙醇，使用涡旋振荡器混匀，然后在1,500 x g条件下离心10分钟。
11. 倾去上清液，加入2 mL 50%乙醇，随后加入6 mL 50%工业甲基化酒精（IMS），涡旋混匀后离心。
12. 小心倒掉上清液，将离心管倒置以排尽残留液体。将试管置于冰浴中，向每管加入2 mL 2 M KOH，搅拌20分钟，使絮状物重悬并溶解抗性淀粉。
13. 向每个试管中加入8 mL 1.2 M乙酸钠缓冲液（pH 3.8），使用磁力搅拌器混匀。
14. 立即向每管加入0.1 mL AMG酶液（3300 U/mL），充分混匀后，在50 °C水浴中孵育30分钟，期间间歇性使用涡旋振荡器混匀。随后在1,500 x g条件下离心10分钟。
15. 取0.1 mL上清液转移至玻璃试管中，加入3 mL葡萄糖氧化酶/过氧化物酶（GOPOD）试剂，在50 °C孵育20分钟。通过混合0.1 mL 100 mM乙酸钠缓冲液与3 mL GOPOD试剂制备试剂空白。通过混合0.1 mL D-葡萄糖与3 mL GOPOD试剂制备标准品。
16. 小心吸取每种空白溶液、待测溶液和标准溶液各200 µL，加入96孔板中。
17. 以空白溶液为对照，在510 nm处测定各样品的吸光度，并使用提供的公式计算抗性淀粉含量。
    抗性淀粉含量（g/100 g）= ΔA × F/W ×9.27
    其中，ΔA = 相对于试剂空白测得的吸光度；F = 吸光度转换为微克的换算系数（由GOPOD反应中100 µg D-葡萄糖所产生的吸光度确定）；W = 分析样品的干重。

6. 餐后血糖反应（持续时间5天）

1. 采用以下纳入标准招募参与者：年龄在18至60岁之间的健康中国汉族成年人，非吸烟者，体重指数（BMI）在18.5至25 kg/m²之间，血压正常（< 140/90 mmHg）。采用以下排除标准：患有代谢性疾病（如糖尿病、高血压等）、胃肠道疾病、内分泌系统异常或精神类疾病。共筛选并招募10名参与者。
2. 测试流程（持续两个连续日）
   1. 第0天（准备日）：要求参与者在测试前3天保持规律的睡眠模式和正常饮食。测试前一晚（20:00后）避免摄入高纤维和高糖食物。第1天上午不建议进行剧烈运动。
   2. 第1天（测试日）：将稻谷碾磨制成白米，然后将白米冲洗2次。在锅中加入1.5份水与1份白米。煮沸至水分完全吸收。关闭火源，盖上锅盖，静置10分钟。
   3. 将10名参与者随机分为两组，每组人数相等：一组为试验组，食用抗性淀粉白米；另一组为对照组，食用X134白米。要求参与者在测试开始前休息10分钟。
   4. 用75%医用酒精对指尖进行消毒。将采血针轻轻按压在指尖上，释放弹簧以刺破皮肤。轻柔挤压手指，产生一小滴血珠，并将该血滴接触血糖仪试纸的吸血端。血糖仪将自动吸入血液并启动检测过程。等待血糖读数显示。
   5. 进食与采血：向每位参与者提供50 g已制备好的米饭及200 mL水，要求其在5至10分钟内以舒适的速度食用完毕。餐后，于进餐开始后的以下时间点采集静脉血样：15分钟、30分钟、60分钟、90分钟和120分钟。按照步骤6.2.4进行血糖分析。

结果

在本研究中，通过基因组编辑技术展示了培育功能性水稻的完整流程，以获得稳定的抗性淀粉水稻品种。我们整合了靶向 SBEIIb 进入 CRISPR/Cas-SF01（补充图1），使用渗透法处理水稻 农杆菌 转化后，经过筛选和生根阶段获得T0代植株。筛选出基因功能缺失的植株，在收获种子后测定其抗性淀粉含量（图1在E0植株中通过Sanger测序检测到纯合突变（20.8%），并且 sbeIIb-1（-2bp，CC）， sbeIIb-2 （-4bp，AGCC），以及 sbeIIb -3（-4bp，GTGC）在目标序列中导致编码区发生移码突变，从而产生无功能的蛋白质（图2, 补充图2和补充图3).

经过细致的筛选过程，以鉴定出携带 E1 植株 sbeIIb-1, sbeIIb-2 和 sbeIIb-...

讨论

在构建基于CRISPR/Cas-SF01的敲低载体过程中，必须精细筛选单导向RNA（sgRNA），这是至关重要的步骤。需要选择那些具有高编辑效率且脱靶效应最小的序列。此外，在合成靶向引物时，需加入与载体剪接位点匹配的短接头寡核苷酸，以确保无缝整合。值得注意的是，与以往需要依次进行酶切消化、凝胶纯化和连接的实验方法不同，本研究通过将酶切与连接步骤整合到一个一体化系统中，简化了操作流程。这一改进显著提高了操作效率，并缩短了实验周期。

与经典的Cas9核酸酶相比，Cas-SF01展现出明显的优势，凸显了其在分子植物育种中的应用潜力。这些优势共同确立了Cas-SF01作为农业生物技术中一种极具前景的工具的地位。首先，Cas-SF01较小的蛋白质尺寸可能提高其在植物体内的细胞递送效率。其次，其较短的crRNA序列有利于设计多重靶向策略，从而实现更复杂的遗传修饰²⁸。第三，Cas-SF01通常诱导产生较大规模的突变，而Cas9通常仅引起1 bp的插入或缺失（indel），表明Cas-SF01在实现更显著的遗传改变方面具有更大潜力

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
2 x Taq Plus Master Mix II	诺唯赞生物科技有限公司	P213	检测基因的单核苷酸多态性（SNP）
2,4-二氯苯氧乙酸（2,4-D）溶液	植物技术	D309
AAM 培养基	山东拓普生物工程有限公司	M9051C
BsaI-HF	新英格兰生物实验室	R3535	编辑载体的 Bsa I 酶切消化
羧苄青霉素类抗生素	Applygen	APC8250-5	选择  培养基，再生培养基
水解酪蛋白䏡	BBI生命科学公司	A603060-0500	愈伤组织诱导培养基，共培养培养基，筛选培养基，再生培养基
DH5α 化学感受态细胞	Weidi Biotechnology Co., Ltd.	DL1001	E. coli 感受态细胞
D-山梨醇	BBI生命科学公司	A610491-0500
EDTA，二钠盐，二水合物	钻石	A100105-0500	CTAB缓冲液
EHA105 感受态细胞	Weidi Biotechnology Co., Ltd.	AC1010	农杆菌 感受态细胞
FastPure 质粒小提试剂盒	诺唯赞生物科技有限公司	REC01-100	质粒提取
潮霉素类抗生素	Yeasen	60224ES	共培养培养基、筛选培养基、再生培养基和生根培养基
卡那霉素类抗生素	Yeasen	60206ES10	农杆菌筛选
KOH	Macklin	P766798	CTAB缓冲液
L-谷氨酰胺	植物技术	G229	愈伤组织诱导培养基，共培养培养基，筛选培养基，再生培养基
L-脯氨酸	植物技术	P698	愈伤组织诱导培养基，共培养培养基，筛选培养基，再生培养基
秀水134水稻干种子	-	-	用于培育抗性淀粉水稻的粳稻品种
碾米机	MARUMASU	MHR1500A	生产白米
穆拉希格-斯科格	植物技术	M519	生根培养基，再生培养基
肌醇	植物技术	I703	再生培养基
NaCl	Macklin	S805275	对于  YEP 培养基
NB基础培养基	植物技术	N492	愈伤组织诱导培养基，共培养培养基，筛选培养基，再生培养基
蛋白胨	Solarbio	LA8800	对于  YEP 培养基
Phytogel	上海源叶生物科技有限公司	S24793
盆	Midea group Co.	MB-5E86	煮饭方法
冰箱	Haier	BCD-170	储存培养基
抗性淀粉检测试剂盒	Megazyme	K-RSTAR	抗性淀粉的测定与分析
利福平类抗生素	Sigma	R3501-250MG	农杆菌筛选
次氯酸钠溶液	Macklin	S817439	用于种子灭菌
蔗糖	上海源叶生物科技有限公司	B21647	愈伤组织诱导培养基，共培养培养基，筛选培养基，再生培养基
T4 DNA连接酶	新英格兰生物实验室	M0202	将sgRNA连接至CEISPRY/Cas-SF01载体
血糖监测仪	医疗设备 &安普供应有限公司	Xuetang 582	检测血糖
Tris-HCl	Macklin	T766494	CTAB缓冲液
酵母琼脂	Solarbio	LA1370	对于  YEP 培养基
YEP 培养基	-	-	农杆菌的培养