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方法文章

在嵌合抗原受体T细胞中进行体外全基因组CRISPR敲除筛选

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DOI：

10.3791/67338

⸱

2025年1月31日

 ,  , 
1T Cell Engineering, Mayo Clinic, 2Mayo Clinic Graduate School of Biomedical Sciences, Mayo Clinic, 3Department of Molecular Pharmacology and Experimental Therapeutics, Mayo Clinic, 4Center for Regenerative Biotherapeutics, Mayo Clinic, 5Division of Hematology, Mayo Clinic, 6Department of Immunology, Mayo Clinic

本文内容

摘要

本文描述了一种应用于 体外 健康供体嵌合抗原受体T细胞中用于耗竭模型的全基因组CRISPR敲除筛选

摘要

嵌合抗原受体T（CART）细胞疗法是一种创新的靶向免疫治疗形式，已彻底改变了癌症的治疗方式。然而，持久的治疗反应仍然有限。最近的研究表明，输注前CART细胞产品的表观遗传景观可能影响对治疗的反应，因此有人提出基因编辑可作为解决方案。但要确定最佳的基因编辑策略，仍需开展更多工作。全基因组CRISPR筛选已成为研究耐药机制和优化基因编辑策略的常用工具。然而，将其应用于原代细胞仍面临诸多挑战。本文介绍了一种利用健康供体来源的CART细胞进行全基因组CRISPR基因敲除筛选的方法。作为概念验证模型，我们设计该方法用于研究靶向CD19抗原的CART细胞耗竭的形成过程。但我们认为，该方法也可用于探究不同CAR结构和肿瘤模型中多种治疗耐药机制。

引言

嵌合抗原受体T（CART）细胞疗法在治疗B细胞恶性肿瘤方面已显示出显著疗效；然而，持久应答率仅限于30-40%1,2,3,4,5。尽管研究人员已开发并测试了多种策略以应对CART细胞疗法的耐药机制，包括优化CAR结构设计、基因编辑以及联合治疗方案，但耐药性的发生机制仍 largely 未知。近期越来越多的证据表明，输注前CART细胞产品的基线基因表达谱是决定CART疗法毒性和疗效的重要因素6,7,8,9。因此，在CART细胞制备过程中进行基因编辑已成为提高CART细胞治疗成功率的常用策略。

例如，我们实验室先前的研究表明，利用成簇规律间隔短回文重复序列（CRISPR）Cas9 技术敲除粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）基因，可增强 CART 细胞活性，并减轻 CART 相关毒性的症状10,11,12。此外，基于 CRISPR 技术改造的细胞疗法已在临床试验中得到验证，展现出良好的有效性和安全性13。综上表明，CRISPR 基因编辑技术不仅有助于深入理解 CART 细胞的生物学特性，还可推动具有临床转化潜力的 CART 细胞产品的开发。

全基因组范围的CRISPR敲除筛选已成为癌症生物学研究中日益流行的工具，用于解析治疗耐药性的机制。在该技术中，将数以万计的向导RNA（gRNA）递送至细胞池中，使每个细胞通常仅携带一种gRNA14。随后，细胞经历施加选择压力的条件，其中携带靶向必需基因gRNA的细胞死亡，而携带靶向抑制性基因gRNA的细胞则存活并增殖。通过使用高通量测序技术，我们可以确定在整个CRISPR筛选过程中gRNA丰度的变化情况14。

然而，在原代细胞（如 CART 细胞）中实现全基因组范围的基因扰动，其所需规模和筛选时间可能难以完成。因此，研究团队已采用靶向 CRISPR 筛选策略，以进一步解析治疗耐药的机制15,16靶向筛选在原代细胞中通常更容易完成，因为其文库较小，达到足够文库代表性的细胞数量需求较少。尽管这些研究加深了我们对CAR-T细胞治疗耐药机制的理解，但靶向筛选由于基因靶点的人工选择而引入了偏差。本文旨在描述一种完成全基因组筛选的方法 体外 健康供体来源的CAR-T细胞全基因组CRISPR敲除筛选。该高通量方法可高效、无偏倚地鉴定出可编辑的关键通路和基因，从而改善治疗应答17,18,19.

特别是，本文所述方案旨在通过完成全基因组范围的CRISPR敲除筛选，以增进领域内对CART细胞耗竭机制的理解 体外 耗竭模型。耗竭是一种功能失调的CART细胞命运，已被证实与CART细胞治疗无应答相关20,21,22这种细胞命运已知受表观遗传调控，其特征表现为CART细胞增殖能力下降、效应细胞因子产生减少以及抑制性受体表达增加。23在以往的研究中，通过上调或下调关键基因，基因编辑已能够阻止耗竭状态的发展。24,25,26鉴于CART细胞在耗竭过程中增殖能力下降，且已有证据表明基因编辑可预防其发生，我们据此建立了模型 体外 全基因组CRISPR敲除筛选该细胞命运。然而，未来可对该方案进行修改，以探索对CART细胞治疗耐药的其他机制。

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方案

重要的是，以下所述方案遵循并已获得梅奥诊所机构审查委员会（IRB 18-005745）和机构生物安全委员会（IBC HIP00000252.43）的批准。所有细胞培养操作，包括慢病毒的制备，均应在细胞培养生物安全柜中进行，并佩戴适当的个人防护装备。特别是慢病毒操作应遵循生物安全二级（BSL-2）防护措施，包括在处理废弃物前使用10%漂白剂对物品进行消毒。

1. CRISPR 文库的扩增

  1. 根据制造商的建议扩增CRISPR文库。简言之，通过完成以下步骤，将CRISPR文库电转化至四份电转感受态细胞中：
    1. 添加 2 µL 50 ng/µL CRISPR文库质粒至 25 µL 在1.0 mm比色皿中制备电转感受态细胞。
    2. 使用以下参数对样品进行电穿孔： 10 µF600 欧姆，1,800 伏特 和 一个时间常数 介于 3.5 ms 和 4.5 ms.
    3. 恢复于 975 µL 恢复培养基并转移至含有1 mL恢复培养基的离心管中。
    4. 以 250 RPM 转速旋转所有等分试样，于 1 小时内 37 °C.
  2. 涂布转化产物：
    1. 将所有电穿孔细胞的等分试样汇集并充分混匀。
    2. 将所有电穿孔后的细胞接种到培养板中并铺匀 400 µL 将转化混合物涂布于预热的含10 cm LB（Luria broth）培养基的平板上 100 µg/mL 羧苄青霉素。将平板置于培养箱中，在 32 °C 14 小时。
  3. 收集菌落：
    1. 移液1 mL LB培养基 + 100 µg/mL 将羧苄青霉素加入每个平板。刮下每个平板上的菌落，并收集至50 mL锥形管中。
    2. 加入另 1 mL LB 培养基 + 100 µg/mL 向每块平板中加入羧苄青霉素，以清洗并确保完全回收。
    3. 按照大提质粒试剂盒的说明书进行大提质粒操作。
    4. 将获得的质粒DNA混合。

2. 采用下一代测序验证 CRISPR 文库中gRNA的基线代表性

注意：该 CRISPR 文库的 NGS 引物已在先前发表的研究中设计完成27。对每个样本使用不同的下游引物可为各样本添加条形码，从而在测序过程中实现样本的混合 pooling。

  1. 使用以下反应体系（总体积 = 50 µL）制备PCR样品：高保真PCR预混液（2×）：25 µL；混合模板DNA（0.5 µg）：1 µL；NGS文库正向引物（10 µM）：1.25 µL；NGS文库反向引物（10 µM）：1.25 µL；无DNase水：21.5 µL。
  2. 按以下扩增程序进行PCR：第1个循环：98 °C 变性3分钟；第2–23个循环：98 °C 变性10秒，63 °C 退火10秒，72 °C 延伸25秒；第24个循环：72 °C 延伸2分钟。
  3. 将每个样本的PCR反应产物混合后，按照试剂盒制造商说明书，使用PCR纯化试剂盒对PCR产物进行纯化。
  4. 取每个样本3 µg PCR产物，在2%（w/v）琼脂糖凝胶上电泳。
  5. 使用凝胶回收试剂盒，按照制造商说明书从凝胶中切取并回收PCR产物（约260–270 bp）片段，目标回收DNA量至少为500 ng。
  6. 将提取的样品保存于-20 °C。
  7. 对样品进行高通量测序（NGS），目标每个gRNA获得100条读长27。
  8. 使用MAGeCK-VISPR分析流程对测序结果进行分析，确保文库中超过99.5%的gRNA均被检出28。

3. CRISPR 文库和 CAR 表达慢病毒的制备

  1. 按照先前所述方法制备慢病毒10,29。
    1. 第1天：取处于D10培养基中、融合度为80-90%的293T细胞T175培养瓶，D10培养基组成为10%胎牛血清（FBS）（v/v）、1%青霉素-链霉素-谷氨酰胺（PSG）（v/v）和DMEM高糖培养基。开始前，将转染试剂和DNA恢复至室温，并对DNA进行定量。
    2. 为每个293T培养瓶标记两个50 mL锥形管，分别标记为A和B。向管A和管B中各加入4.5 mL低血清培养基。
    3. 在无菌的1.5 mL微量离心管中，混合以下DNA，并静置1分钟：18 µg pCMVR8.74（含gag、pol、tat和rev）、7 µg pMD2.G（VSV-G）以及15 µg慢病毒表达载体（CRISPR文库A或CAR19-28ζ载体）。
    4. 向管A中加入129 µL转染试剂。用手指轻轻涡旋充分混匀管A。
    5. 将DNA混合物加入管B中。用手指轻轻涡旋充分混匀管B。
    6. 向管B中加入111 µL中性共脂试剂。用手指轻轻涡旋充分混匀管B。
    7. 将管A中的内容物加入管B中，用手指轻轻涡旋充分混匀。将管B在室温下孵育30分钟。
    8. 在30分钟孵育即将结束时，吸除293T细胞原有培养基。向每个293T培养瓶中加入16 mL R10培养基，R10培养基组成为10% FBS（v/v）、1% PSG（v/v）和RPMI 1640培养基。
    9. 30分钟孵育结束后，将管B中的内容物（约9 mL）逐滴加入293T细胞培养瓶中。将培养瓶平放并轻轻旋转混匀，随后置于37 ˚C、5% CO2条件下孵育。
    10. 在第2天（转染后约24小时），按以下步骤收集慢病毒：
      注：预先冷却所有设备和材料，并在冰上操作，以保持病毒上清液处于低温状态。
      1. 将转染后的293T培养瓶中的上清液转移至预冷的50 mL锥形管中。
      2. 向293T培养瓶中加入30 mL预热的R10培养基。
      3. 使用封闭转子在4 ˚C条件下以900 × g离心10分钟，沉淀细胞碎片。
      4. 离心后，用0.45 µm滤器过滤上清液。将滤液在超速离心机中于4 ˚C、112,700 × g条件下离心2小时。
      5. 2小时离心结束后，吸除上清液，保留约5 mL。通过轻柔吹打10次重悬病毒颗粒。将病毒悬液于4 ˚C过夜保存。
    11. 在第3天，按以下步骤收集并保存慢病毒：
      1. 将转染后的293T培养瓶中的上清液转移至预冷的50 mL锥形管中。
      2. 向293T培养瓶中加入30 mL 10%次氯酸钠溶液（漂白剂）。
      3. 使用封闭转子在4 ˚C条件下以900 × g离心10分钟，沉淀上清液中的细胞碎片。
      4. 离心后，用0.45 µm滤器过滤上清液。将滤液在超速离心机中于4 ˚C、112,700 × g条件下离心2小时。
      5. 2小时离心结束后，吸除上清液，保留约2 mL，通过轻柔吹打10次重悬病毒颗粒。将病毒上清液分装为300–500 µL每管，于-80 ˚C保存。

4. CAR表达慢病毒滴度的计算

注意：CAR 慢病毒的滴定方法如前所述10,12。

  1. 在 第1天，激活并接种T细胞。
    1. 使用阴性选择试剂盒从健康供体的外周血单个核细胞（PBMCs）中分离出 1 × 106 个T细胞。
    2. 计数T细胞。
    3. 洗涤足够数量的CD3+/CD28+ 磁珠，以3:1的磁珠:细胞比例刺激T细胞。例如，若要刺激 1 × 106 个T细胞，则需洗涤 3 × 106 个磁珠。洗涤步骤如下，重复3次：
      1. 使用磁力分离法将磁珠从悬浮液中分离出来。
      2. 移除上清液。
      3. 加入1000 µL T细胞培养基（TCM），该培养基由10%人血清（v/v）、1% PSG（v/v）和造血细胞培养基组成。
        注：TCM应在使用前通过0.45 µm无菌真空滤器过滤，再用0.22 µm无菌真空滤器过滤，以实现灭菌。
      4. 按3:1的磁珠:细胞比例将磁珠加入T细胞悬浮液中。
      5. 将T细胞重悬于TCM中，使细胞密度为 1 × 106 个细胞/mL。
      6. 将100 µL活化的T细胞加入96孔板的10个孔中。将培养板置于37 ˚C、5% CO2 条件下孵育。
  2. 在 第2天，通过制备稀释板，向各孔中加入CAR慢病毒的稀释液，步骤如下：
    1. 向96孔板的七个孔中各加入100 µL TCM。
    2. 向第一个孔中加入50 µL目标病毒，充分混匀。
    3. 通过将50 µL液体从第1孔转移至第2孔进行连续稀释，充分混匀。
    4. 将50 µL液体从第2孔转移至第3孔，并依此类推，直至第7孔。
    5. 充分混匀第7孔后，移除50 µL液体。确保所有孔的总体积均为100 µL。
    6. 将稀释板中每孔的50 µL液体加入第1天的T细胞板的前七个孔中，充分混匀。
    7. 向T细胞板的最后三个孔中各加入50 µL TCM，充分混匀。将培养板置于37 ˚C、5% CO2 的培养箱中孵育。
  3. 在 第3天，向T细胞板所有孔中加入100 µL TCM以补充培养基，充分混匀。
  4. 在 第4天，通过以下步骤进行流式细胞术检测，以抗κ链抗体作为CAR表达的替代标志物，检测表达CAR的细胞百分比：
    1. 将T细胞板在1,000 × g 条件下离心3分钟，弃上清。
    2. 用抗κ链抗体缓冲液（由4%牛血清白蛋白（w/v）溶于PBS中组成）洗涤培养板3次：每孔加入200 µL抗κ链抗体缓冲液，在1,000 × g 条件下离心3分钟，弃上清。
    3. 向每孔中加入生物素标记的抗κ链抗体。在4 ˚C条件下于摇床上孵育45分钟。
    4. 按照步骤4.4.2的方法，用抗κ链抗体缓冲液洗涤培养板3次。
    5. 使用荧光染料偶联的链霉亲和素抗体和活/死细胞染色抗体对细胞进行流式染色。将样本在室温避光条件下孵育15分钟。
    6. 用流式缓冲液（由2% FBS（v/v）和1%叠氮化钠（v/v）溶于PBS中组成）洗涤样本一次：每孔加入200 µL流式缓冲液，在1,000 × g 条件下离心3分钟，弃上清。
    7. 将细胞重悬于100 µL流式缓冲液中，并上机检测。
    8. 使用三个未转导的孔进行阴性设门。

5. CRISPR文库慢病毒病毒滴度的计算

注意：本方案描述了用于滴定CRISPR文库慢病毒的最低T细胞数量，但可根据需要扩大规模，以适应更多的T细胞，从而使用更高体积的病毒。

  1. 在第0天，通过向6 × 106个T细胞中加入18 × 106个CD3+/CD28+磁珠（磁珠:细胞比例为3:1），并用TCM补足至终体积6 mL，以激活T细胞。将T细胞悬液每0.5 mL分装至48孔板的12个孔中。置于37 ˚C、5% CO2的培养箱中孵育。
  2. 24小时后，在第1天，向每孔加入MOI（感染复数）为3的CAR病毒。通过反复吹打数次充分混匀。置于37 ˚C、5% CO2的培养箱中孵育。
  3. 48小时后，在第2天，向已激活的CART细胞中加入一系列不同体积的CRISPR文库病毒，即向每孔分别加入以下体积的CRISPR病毒（0 µL、0 µL、6.25 µL、6.25 µL、12.5 µL、12.5 µL、25 µL、25 µL、50 µL、50 µL、100 µL或100 µL）。通过反复吹打数次充分混匀。置于37 ˚C、5% CO2的培养箱中孵育。
  4. 在第3天，向半数孔中（包括分别接受以下体积CRISPR病毒的各一孔：0 µL、6.25 µL、12.5 µL、25 µL、50 µL和100 µL）的培养基中加入每毫升1 µg的嘌呤霉素。其余孔不加嘌呤霉素处理。
  5. 从第4天至第8天，每天计数T细胞，并将加有嘌呤霉素的孔中的细胞密度调整为1 × 106 个细胞/mL（使用含1 µg/mL嘌呤霉素的TCM），未处理孔则使用TCM调整至相同细胞密度。
  6. 在第8天，计数每孔的活细胞数量，并使用以下公式计算病毒上清液的转导单位/mL（TU/mL）：
    静态平衡公式，TU/mL = A/BV×D，物理学方程中的核心概念。
    其中A：病毒转导孔中的活细胞数；B：无抗生素筛选对照孔中的活细胞数；V：每孔感染所用病毒体积；D：稀释倍数。
  7. 根据显示约20%转导效率孔所计算出的TU/mL值，使用以下公式计算在MOI为0.3时转导1 × 106个细胞所需的病毒体积：
    静态平衡计算，显示用于流体动力学分析的微升换算公式。

6. CRISPR 筛选的 CAR-T 细胞制备阶段（第 0 - 8 天）

注意：以下方案描述的是在一个生物学重复中完成CRISPR筛选的流程。然而，本方案此前已在三个生物学重复中得到验证，我们建议其他使用者至少采用三个生物学重复30。

  1. 第0天：按照先前所述方法，从健康供体血液中分离并刺激T细胞10。
    1. 从匿名健康供体血液中分离外周血单个核细胞（PBMCs）。
      1. 向密度梯度分离管中加入15 mL密度梯度介质。
      2. 将1:2稀释的血液加至密度梯度分离管顶部，在室温下以1,200 × g离心10分钟。
        注意：血液应使用分离缓冲液（含2% FBS (v/v) 的磷酸盐缓冲液 [PBS]）进行稀释。
      3. 将上层液体小心弃入新的50 mL锥形管中，并用分离缓冲液将体积加倍。在4 °C下以300 × g离心8分钟，吸除上清液。
      4. 用分离缓冲液重悬细胞沉淀，并计数PBMCs。
    2. 使用阴性选择试剂盒从PBMCs中分离T细胞。请遵循试剂盒制造商提供的说明。
      注意：假设T细胞从PBMCs中的回收率为10–20%。
    3. 使用CD3+/CD28+磁珠刺激T细胞。
      1. 计数T细胞。
      2. 分装足够量的CD3+/CD28+磁珠，以3:1的磁珠:细胞比例刺激T细胞。例如，若要刺激110 × 106个T细胞，则分装330 × 106个磁珠。通过磁力分离将磁珠从悬液中分离后，加入1,000 µL TCM，重复洗涤3次。
      3. 将磁珠加入T细胞悬液中，用TCM将T细胞重悬至浓度为1 × 106 个细胞/mL。
      4. 将T细胞分装至6孔板中以获得最佳转导效率，每孔加入5 × 106个T细胞。于37 °C、5% CO2条件下培养24小时。
  2. 第1天：在BSL-2+条件下，解冻足量的CAR慢病毒，以感染复数（MOI）为3.0的条件转导T细胞。在加入适量混合慢病毒前，轻柔打散T细胞聚集体，用于转导5 × 106个T细胞（MOI为3.0）。将细胞置于37 °C、5% CO2条件下培养。
    注意：在转导T细胞前，应将多次制备的慢病毒合并至同一管中，以确保所有T细胞接受一致处理。此外，慢病毒仅可解冻一次。
  3. 第2天：在BSL-2+条件下，解冻足量的CRISPR慢病毒，以MOI为0.3的条件转导T细胞。在加入适量混合慢病毒前，轻柔打散T细胞聚集体并重悬细胞，用于转导5 × 106个T细胞（MOI为0.3）。将细胞置于37 °C、5% CO2条件下培养。
    注意：在转导T细胞前，应将多次制备的慢病毒合并至同一管中，以确保所有T细胞接受一致处理。
  4. 第3–5天：重悬CAR-T细胞以打散聚集体，并进行细胞计数。用含1 µg/mL嘌呤霉素的TCM将细胞终浓度调整为1 × 106 个细胞/mL。于37 °C、5% CO2条件下培养细胞。
  5. 第6天：重悬CAR-T细胞以打散聚集体，通过磁力分离去除CD3+/CD28+磁珠，并对CAR-T细胞进行计数。加入含1 µg/mL嘌呤霉素的TCM，将细胞终浓度调整为1 × 106 个细胞/mL，于37 °C、5% CO2条件下继续培养。按照步骤4.4所述方法，通过流式细胞术检测CAR表达水平。

CRISPR 筛选的 gRNA 选择阶段（第 8 - 22 天）

  1. 第8天：保存样本用于下一代测序（NGS），并开始共培养。
    1. 用 TCM 将 CART 细胞洗涤 3 次，通过在 300 × g 离心样品 g 在 4 ˚C 下离心 5 分钟，吸除上清液，并将样品重悬于 20 mL TCM 中。
    2. 计数CART细胞。
    3. 通过完成以下步骤保存样本以用于下一代测序（NGS）：
      1. 在50 mL锥形管中分装足够数量的CART细胞，以维持每条gRNA对应500个细胞的gRNA代表性（例如，分装约33 × 10⁶个细胞）6 CART 细胞（若使用含 65,383 个 gRNA 的 CRISPR 文库）。将样品在 300 × g 4 °C下离心5分钟。
      2. 将细胞沉淀重悬于1 mL PBS中，并转移至2 mL微量离心管中。用1 mL PBS洗涤50 mL锥形管，并将洗涤液转移至2 mL微量离心管中。
      3. 将样品在 500 × g 4 °C下离心5分钟。弃去上清液。将细胞沉淀在-20 °C保存。
      4. 通过将CART细胞加入CD19开始共培养+ JeKo-1 细胞按 1:1 比例。例如，加入 80 × 106 CART 细胞至 80 × 106 JeKo-1 细胞。用 TCM 补至共培养体系总体积为 160 mL。将样品置于 37 ˚C、5% CO₂ 的培养箱中孵育。2.
        注意：我们建议至少从 80 × 10 开始6 CART细胞以维持文库的代表性，并确保有足够的细胞用于保存第15天和第22天的样本。
  2. 第10天：为了重新刺激CART细胞，将共培养物收集到50 mL圆锥形试管中，以300 × g 4 °C 下孵育 5 分钟。将每个样本重悬于 80 mL TCM 中，并加入 80 × 106 JeKo-1 细胞置于 80 mL TCM 中。将样品置于 37 ˚C、5% CO₂ 的培养箱中保存。2.
  3. 第12天 和 14：按照步骤 7.2 重新刺激 CART 细胞。
  4. 第15天：将样本保存用于下一代测序（NGS），并重新刺激CAR-T细胞。
    1. 通过首先计数细胞，然后结合使用CD4阳性选择试剂盒，从共培养物中分离CART细胞+ 使用CD8阳性选择试剂盒的T细胞+ 使用T细胞从CART-JeKo-1共培养物中分离T细胞。对T细胞进行计数。
    2. 通过分装 33 × 10 份样本用于 NGS 保存6 50 mL 圆锥形管中的 CART 细胞，以 300 × g 4 °C下离心5分钟。将样品重悬于1 mL PBS中，并转移至2 mL微量离心管中。用1 mL PBS洗涤50 mL锥形管，并将洗涤液转移至该2 mL微量离心管中。在500 × g 4 °C下离心5分钟；弃去上清液；将细胞沉淀在-20 °C保存。
    3. 建立共培养体系以继续实验 体外 通过添加 80 × 10 建立耗竭模型6 CART 细胞至 80 × 106 JeKo-1 细胞。然后用 TCM 将共培养体系总体积补至 160 mL。将样品置于 37 ˚C、5% CO₂ 的培养箱中孵育。2.
  5. 第17天、第19天 和 21：按照步骤 7.2 的方法再次刺激 CART 细胞。
  6. 第22天：将样本保存用于下一代测序（NGS）。
    1. 通过首先计数细胞，从共培养物中分离CART细胞。然后，结合CD4阳性选择试剂盒+ 使用CD8阳性选择试剂盒的T细胞+ 使用T细胞从CART-JeKo-1共培养物中分离T细胞。计数T细胞。
    2. 为保存用于下一代测序（NGS）的样本，重复步骤 7.4.2。

8. 下一代测序用基因组DNA的制备

注意：为了保持足够的测序覆盖度，应从至少 33 × 106 个 CART 细胞中分离基因组 DNA（gDNA）。此外，应将来自 33 × 106 个 CART 细胞的全部 gDNA 用于测序文库制备。

  1. 使用基因组DNA（gDNA）提取试剂盒从冷冻的细胞沉淀中分离gDNA。
  2. 通过乙醇沉淀法纯化gDNA。
    1. 将100% EtOH预冷至-20 °C。
    2. 将洗脱的DNA等量分装至若干微量离心管中（200–250 µL）。向每份分装样品中加入以下成分：两倍体积的100% EtOH（250 µL样品加500 µL，200 µL样品加400 µL）；0.1倍体积的3 M醋酸钠（250 µL样品加25 µL，200 µL样品加20 µL）；以及1 µL的20 mg/mL糖原。将样品在-20 °C下孵育过夜。
    3. 第二天，以13,000 × g离心20分钟，使沉淀的DNA形成沉淀物。弃去上清液。用1 mL 70% EtOH洗涤沉淀物，以7,500 × g离心10分钟。
    4. 彻底去除残留的EtOH。将沉淀物在空气中干燥30–45分钟。
    5. 将沉淀物重悬于50 µL无菌水中。
  3. 为下一代测序（NGS）准备gDNA。
    注：用于扩增含Illumina接头序列gRNA的CRISPR文库的NGS引物已在先前发表的研究中设计完成27。对每个样品使用不同的反转录引物可实现样品的条形码标记，从而允许在测序过程中合并多个样品。
    1. 使用以下反应体系（总体积 = 50 µL）准备PCR样品：高保真PCR预混液（2×）：25 µL；混合模板DNA（0.5 µg）：1 µL；NGS文库正向引物（10 µM）：1.25 µL；NGS文库反向引物（10 µM）：1.25 µL；无DNase水：21.5 µL。
    2. 按以下循环条件进行PCR扩增：第1个循环：98 °C变性3分钟；第2–23个循环：98 °C变性10秒，63 °C退火10秒，72 °C延伸25秒；第24个循环：72 °C延伸2分钟。
    3. 合并每个样品的PCR反应产物，并根据试剂盒说明书使用PCR纯化试剂盒纯化PCR产物。
    4. 将每个样品的3 µg PCR产物在2%（w/v）琼脂糖凝胶上电泳。
    5. 使用凝胶回收试剂盒，根据制造商说明书从凝胶中切下PCR产物（约260–270 bp）并回收DNA。将回收的样品储存于-20 °C。
    6. 对样品进行下一代测序（NGS）。目标为文库中每个gRNA获得超过500条测序读长。

9. 测序结果分析

  1. 为分析 NGS 数据，使用 MAGeCK-VISPR 平台28。采用最大似然估计（MAGeCK-MLE）算法的标准参数设置。为准备用于分析的输出文件：
    1. 运行 FASTQC 以评估序列文件质量31。
    2. 使用 bbmerge 合并每个样本的成对末端测序文件32。
    3. 在 MAGeCK-VISPR 平台上使用 MAGeCK-MLE 算法分析样本。在进行 MAGeCK-MLE 分析时，将所有 gRNA 计数归一化至包含 1,000 个非靶向 gRNA 的列表。
    4. 通过评估 GC 含量、碱基质量、测序读段数量及比对读段数量，评估测序文件质量。
    5. 通过评估 Gini 指数变化、主成分分析（PCA）聚类情况以及与负向筛选基因列表相关的通路，评估 CRISPR 筛选中选择压力阶段的成功程度32。
    6. 通过文献检索和通路分析，对排名靠前的候选基因进行深入探究。

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结果

为了以无偏倚的方式探究可被编辑以增强CAR-T细胞活性的基因和通路，我们设计了一项 体外 全基因组CRISPR敲除筛选图1）。该筛选包含两个阶段：CART 细胞生成阶段和选择性压力阶段。在 CART 细胞生成阶段，至少需要 110 × 106 首先从健康供体的外周血单个核细胞（PBMCs）中分离T细胞，并使用CD3激活+/CD28+ 珠粒。次日，于 第1天，以 MOI 为 3.0 加入 CAR 慢病毒，以生成靶向 CD19 抗原的 CAR T 细胞（CART19 细胞）。在 第2天，将CRISPR文库慢病毒以0.3的感染复数（MOI）加入CART细胞中。从 第3天-8，CAR-T 细胞维持在 1 × 10 的浓度6 每毫升 TCM 中加入浓度为 1 µg/mL 用于筛选成功转导CRISPR文库慢病毒的细胞。...

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讨论

基因编辑已成为研究治疗耐药机制以及设计新型CAR-T细胞疗法以提高CAR-T细胞持久性和活性的强大工具16,17,26尽管一些基因编辑策略已在临床前模型和临床试验中显示出对CAR-T细胞活性的改善作用，但仍需进一步优化基因编辑策略。为满足这一需求，研究人员已开始在CAR-T细胞中开展靶向CRISPR筛选15,16然而，这种方法会因依赖先前已发表的策略而引入偏差。在此，我们描述了一种用于完成 体外 在CAR-T细胞中进行全基因组CRISPR敲除筛选。该方法可无偏倚地鉴定出可通过编辑以增强CAR-T细胞活性的基因和信号通路。尽管全基因组CRISPR筛选是一项极具前景的技术工具，但在原代细胞中开展此类筛选仍面临多项挑战。

例如，为了有效构建一个全基因组范围的CRISPR...

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披露

SSK 是嵌合抗原受体（CAR）免疫疗法领域多项专利的发明人，这些专利已授权给诺华公司（通过梅奥诊所、宾夕法尼亚大学与诺华之间的协议）、Humanigen（通过梅奥诊所）、Mettaforge（通过梅奥诊所）、MustangBio（通过梅奥诊所）以及 Chymal Therapeutics（通过梅奥诊所）。CS、CMR 和 SSK 是已授权给 Immix Biopharma 公司的专利的发明人。SSK 收到来自 Kite、Gilead、Juno、BMS、诺华、Humanigen、MorphoSys、Tolero、Sunesis/Viracta、LifEngine Animal Health Laboratories Inc. 和 Lentigen 的研究资助。SSK 参与了与 Kite/Gilead、Calibr、Luminary Therapeutics、Humanigen、Juno/BMS、Capstan Bio 和诺华的顾问会议。SSK 曾在 Humanigen 和 Carisma 的数据安全与监查委员会任职。SSK 曾担任 Torque、Calibr、诺华、Capstan Bio、BMS、Carisma 和 Humanigen 的顾问。CMS 和 SSK 是本方案所产生的知识产权的发明人。

致谢

本研究部分由梅奥诊所个体化医学中心（SSK）和梅奥诊所综合癌症中心资助 癌症中心（SSK）、梅奥诊所再生生物治疗中心（SSK）、美国国立卫生研究院K12CA090628（SSK）和R37CA266344-01（SSK）、美国国防部资助CA201127（SSK）、Predolin基金会（SSK）以及明尼苏达州生物技术与医学基因组学合作项目（SSK）。CMS由梅奥诊所生物医学科学研究生院支持。CRISPR筛选示意图（图1由 BioRender.com 制作（Siegler, L. (2022) https://BioRender.com/k71r054）。 

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
293T 细胞ATCCCRL-3216用于慢病毒生产的细胞
生物素化 ProteinL 抗体GenScriptM00097用于 CAR 检测的抗 kappa 链抗体
牛血清白蛋白Millipore SigmaA7906
羧苄西林二钠盐Millipore SigmaC1389-1G羧苄西林抗生素
CD4 分离磁珠Miltenyi Biotec130-045-101 
CD8 分离磁珠Miltenyi Biotec130-045-201
CTS（细胞治疗系统）Dynabeads CD3/CD28Gibco40203D
CytoflexBeckman CoulterNC2279958
无 DNase 水InvitrogenAM9937
杜氏改良伊格尔培养基（DMEM）Corning10-017-CV
杜氏磷酸盐缓冲液Gibco14190-144
EasySep 人 T 细胞分离试剂盒STEMCELL Technologies17951RF阴性分离试剂盒
Endura 电转感受态细胞 Biosearch Technologies60242-1含复苏培养基的电转感受态细胞
乙醇Millipore SigmaE7023
胎牛血清（FBS）Corning35-010-CV
GeCKO v2 CRISPR 敲除混合文库 AAddGene1000000048CRISPR 文库质粒
Gene Pulser II Bio-Rad165-2105电穿孔仪
糖原Millipore Sigma10901393001
JeKo-1ATCCCRL-3006CD19+ 靶细胞 
Lipofectamine 3000 转染试剂ThermoFisher ScientificL3000075包含转染试剂（Lipofectamine 3000 试剂）和中性共脂质试剂（p3000）的转染试剂盒
LIVE/DEAD AquaInvitrogenL34966
LymphoprepSTEMCELL Technologies7851密度梯度介质
Macherey-Nagel NucleoBond Xtra Maxi 试剂盒ThermoFisher Scientific12748412大提试剂盒
NEBNext 高保真 2X PCR 预混液New England BioLabsM0541S高保真 PCR 预混液
Opti-MEM I 低血清培养基Gibco31985-070低血清培养基
pCMVR8.74AddGene22036慢病毒包装质粒
青霉素-链霉素-谷氨酰胺（100X）Life Technologies10378-016
pMD2.GAddGene12259表达 VSV-G 包膜的质粒
混合人 AB 血清 Innovative ResearchISERABHI
嘌呤霉素Millipore SigmaP8833
QIAquick 凝胶回收试剂盒Qiagen28704凝胶回收试剂盒
Quick-DNA Midiprep Plus 试剂盒Zymo ResearchD4075用于分离基因组 DNA 的试剂盒
RoboSep-SSTEMCELL Technologies21000自动化细胞分离仪
罗斯韦尔帕克纪念研究所 1640 培养基（RPMI）Gibco21870092
SepMate-50STEMCELL Technologies85450密度梯度分离管
乙酸钠InvitrogenAM9740
叠氮化钠Fisher Scientific71448-16
链霉亲和素抗体（PE）BioLegend405203用于 CAR 检测的二抗
T100 梯度 PCR 仪Bio-Rad1861096
超速离心机（Optima XPN-80）BeckmanCoulterA99839
真空滤器系统，0.22 µmThermoFisher Scientific567-0020
真空滤器系统，0.45 µmThermoFisher Scientific165-0045
X-VIVO 15 无血清造血细胞培养基Lonza04-418Q造血细胞培养基

参考文献

  1. Neelapu, S. S., et al. 5-year follow-up supports curative potential of axicabtagene ciloleucel in refractory large B-cell lymphoma (zuma-1). Blood. 141 (19), 2307-2315 (2023).
  2. Neelapu, S. S., et al. Axicabtagene ciloleucel CAR T-cell therapy in refractory large B-cell lymphoma. N Engl J Med. 377 (26), 2531-2544 (2017).
  3. Locke, F. L., et al. Long-term safety and activity of axicabtagene ciloleucel in refractory large B-cell lymphoma (zuma-1): A single-arm, multicentre, phase 1-2 trial. Lancet Oncol. 20 (1), 31-42 (2019).
  4. Maude, S. L., et al. Tisagenlecleucel in children and young adults with B-cell lymphoblastic leukemia. N Engl J Med. 378 (5), 439-448 (2018).
  5. Schuster, S. J., et al. Tisagenlecleucel in adult relapsed or refractory diffuse large B-cell lymphoma. N Engl J Med. 380 (1), 45-56 (2018).
  6. Bai, Z., et al. Single-cell antigen-specific landscape of CAR T infusion product identifies determinants of CD19-positive relapse in patients with all. Sci Adv. 8 (23), eabj2820(2022).
  7. Fraietta, J. A., et al. Determinants of response and resistance to CD19 chimeric antigen receptor (CAR) T cell therapy of chronic lymphocytic leukemia. Nat Med. 24, 563-571 (2018).
  8. Gennert, D. G., et al. Dynamic chromatin regulatory landscape of human CAR T cell exhaustion. Proc Natl Acad Sci USA. 118 (30), e2104758118(2021).
  9. Deng, Q., et al. Characteristics of anti-CD19 CAR T cell infusion products associated with efficacy and toxicity in patients with large B cell lymphomas. Nat Med. 26 (12), 1878-1887 (2020).
  10. Sterner, R. M., Cox, M. J., Sakemura, R., Kenderian, S. S. Using CRISPR/CAS9 to knock out GM-CSF in CAR-T cells. J Vis Exp. (149), e59629(2019).
  11. Sterner, R. M., et al. GM-CSF inhibition reduces cytokine release syndrome and neuroinflammation but enhances CAR-T cell function in xenografts. Blood. 133 (7), 697-709 (2019).
  12. Cox, M. J., et al. GM-CSF disruption in CART cells modulates T cell activation and enhances CART cell anti-tumor activity. Leukemia. 36 (6), 1635-1645 (2022).
  13. Ottaviano, G., et al. Phase 1 clinical trial of CRISPR-engineered CAR19 universal T cells for treatment of children with refractory B cell leukemia. Sci Transl Med. 14 (668), eabq3010(2022).
  14. Joung, J., et al. Genome-scale CRISPR-CAS9 knockout and transcriptional activation screening. Nat Protoc. 12, 828-863 (2017).
  15. Mccutcheon, S. R., et al. Transcriptional and epigenetic regulators of human CD8+ T cell function identified through orthogonal CRISPR screens. Nat Genet. 55, 2211-2223 (2023).
  16. Zhu, W., Kelly, C., Dagur, P., Dunbar, C. E., Cordes, S. CRISPR activation screen to optimize chimeric antigen receptor (CAR) T cell immunophenotype. Blood. 142 (Supplement 1), 4820-4820 (2023).
  17. Wang, D., et al. CRISPR screening of CAR T cells and cancer stem cells reveals critical dependencies for cell-based therapies. Cancer Discov. 11 (5), 1192-1211 (2021).
  18. Shifrut, E., et al. Genome-wide CRISPR screens in primary human T cells reveal key regulators of immune function. Cell. 175 (7), 1958-1971.e15 (2018).
  19. Belk, J. A., et al. Genome-wide crispr screens of T cell exhaustion identify chromatin remodeling factors that limit T cell persistence. Cancer Cell. 40 (7), 768-786.e7 (2022).
  20. Jiang, P., et al. Single-cell ATAC-seq maps the comprehensive and dynamic chromatin accessibility landscape of CAR-T cell dysfunction. Leukemia. 36 (11), 2656-2668 (2022).
  21. Rossi, J., et al. Preinfusion polyfunctional anti-CD19 chimeric antigen receptor T cells are associated with clinical outcomes in NHL. Blood. 132 (8), 804-814 (2018).
  22. Beider, K., et al. Molecular and functional signatures associated with CAR T cell exhaustion and impaired clinical response in patients with B cell malignancies. Cells. 11 (7), 1140(2022).
  23. Wherry, E. J. T. cell exhaustion. Nat Immunol. 12, 492-499 (2011).
  24. Prinzing, B., et al. Deleting DNMT3A in CAR T cells prevents exhaustion and enhances antitumor activity. Sci Transl Med. 13, eabh0272(2021).
  25. Lynn, R. C., et al. C-jun overexpression in CAR T cells induces exhaustion resistance. Nature. 576, 293-300 (2019).
  26. Tang, N., et al. TGF-beta inhibition via CRISPR promotes the long-term efficacy of CAR T cells against solid tumors. JCI Insight. 5 (4), e133977(2020).
  27. Joung, J., et al. Genome-scale CRISPR-CAS9 knockout and transcriptional activation screening. Nat Protoc. 12 (4), 828-863 (2017).
  28. Li, W., et al. Quality control, modeling, and visualization of CRISPR screens with MAGeCK-VISPR. Genome Biol. 16, 281(2015).
  29. Sakemura, R., et al. Targeting cancer-associated fibroblasts in the bone marrow prevents resistance to CART-cell therapy in multiple myeloma. Blood. 139 (26), 3708-3721 (2022).
  30. Stewart, C. M., et al. IL-4 drives exhaustion of CD8+ CART cells. Nat Commun. 15 (1), 7921(2024).
  31. FastQC: A quality control tool for high throughput sequence data. , Babraham Bioinformatics. https://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/ (2010).
  32. Bbmerge. , https://github.com/BioInfoTools/BBMap/blob/master/sh/bbmerge.sh (2019).
  33. Pattanayak, V., et al. High-throughput profiling of off-target DNA cleavage reveals RNA-programmed CAS9 nuclease specificity. Nat Biotechnol. 31 (9), 839-843 (2013).
  34. Doench, J. G., et al. Rational design of highly active sgRNAs for CRISPR-CAS9-mediated gene inactivation. Nat Biotechnol. 32 (12), 1262-1267 (2014).
  35. Dong, M. B., et al. Systematic immunotherapy target discovery using genome-scale in vivo CRISPR screens in CD8 T cells. Cell. 178 (5), 1189-1204.e23 (2019).
  36. Zhou, P., et al. Single-cell CRISPR screens in vivo map T cell fate regulomes in cancer. Nature. 624 (7990), 154-163 (2023).
  37. Sutra Del Galy, A., et al. In vivo genome-wide CRISPR screens identify SOCS1 as intrinsic checkpoint of CD4+ TH1 cell response. Sci Immunol. 6 (66), eabe8219(2021).
  38. Ramos, A., et al. Leukemia-intrinsic determinants of CAR-T response revealed by iterative in vivo genome-wide CRISPR screening. Nat Commun. 14 (1), 8048(2023).

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CAR T细胞全基因组筛选癌症免疫治疗基因编辑T细胞耗竭下一代测序基因组DNA提取CD19抗原T细胞培养基
在嵌合抗原受体T细胞中进行体外全基因组CRISPR敲除筛选
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