方法文章

在嵌合抗原受体T细胞中进行体外全基因组CRISPR敲除筛选

DOI：

10.3791/67338

⸱

2025年1月31日

 ,  , 
1T Cell Engineering, Mayo Clinic, 2Mayo Clinic Graduate School of Biomedical Sciences, Mayo Clinic, 3Department of Molecular Pharmacology and Experimental Therapeutics, Mayo Clinic, 4Center for Regenerative Biotherapeutics, Mayo Clinic, 5Division of Hematology, Mayo Clinic, 6Department of Immunology, Mayo Clinic

本文内容

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

本文描述了一种应用于 体外 健康供体嵌合抗原受体T细胞中用于耗竭模型的全基因组CRISPR敲除筛选

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

嵌合抗原受体T（CART）细胞疗法是一种创新的靶向免疫治疗形式，已彻底改变了癌症的治疗方式。然而，持久的治疗反应仍然有限。最近的研究表明，输注前CART细胞产品的表观遗传景观可能影响对治疗的反应，因此有人提出基因编辑可作为解决方案。但要确定最佳的基因编辑策略，仍需开展更多工作。全基因组CRISPR筛选已成为研究耐药机制和优化基因编辑策略的常用工具。然而，将其应用于原代细胞仍面临诸多挑战。本文介绍了一种利用健康供体来源的CART细胞进行全基因组CRISPR基因敲除筛选的方法。作为概念验证模型，我们设计该方法用于研究靶向CD19抗原的CART细胞耗竭的形成过程。但我们认为，该方法也可用于探究不同CAR结构和肿瘤模型中多种治疗耐药机制。

引言

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嵌合抗原受体T（CART）细胞疗法在治疗B细胞恶性肿瘤方面已显示出显著疗效；然而，持久应答率仅限于30-40%1,2,3,4,5。尽管研究人员已开发并测试了多种策略以应对CART细胞疗法的耐药机制，包括优化CAR结构设计、基因编辑以及联合治疗方案，但耐药性的发生机制仍 largely 未知。近期越来越多的证据表明，输注前CART细胞产品的基线基因表达谱是决定CART疗法毒性和疗效的重要因素6,7,8,9。因此，在CART细胞制备过程中进行基因编辑已成为提高CART细胞治疗成功率的常用策略。

例如，我们实验室先前的研究表明，利用成簇规律间隔短回文重复序列（CRISPR）Cas9 技术敲除粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）基因，可增强 CART 细胞活性，并减轻 CART 相关毒性的症状10,11,12。此外，基于 CRISPR 技术改造的细胞疗法已在临床试验中得到验证，展现出良好的有效性和安全性13。综上表明，CRISPR 基因编辑技术不仅有助于深入理解 CART 细胞的生物学特性，还可推动具有临床转化潜力的 CART 细胞产品的开发。

全基因组范围的CRISPR敲除筛选已成为癌症生物学研究中日益流行的工具，用于解析治疗耐药性的机制。在该技术中，将数以万计的向导RNA（gRNA）递送至细胞池中，使每个细胞通常仅携带一种gRNA14。随后，细胞经历施加选择压力的条件，其中携带靶向必需基因gRNA的细胞死亡，而携带靶向抑制性基因gRNA的细胞则存活并增殖。通过使用高通量测序技术，我们可以确定在整个CRISPR筛选过程中gRNA丰度的变化情况14。

然而，在原代细胞（如 CART 细胞）中实现全基因组范围的基因扰动，其所需规模和筛选时间可能难以完成。因此，研究团队已采用靶向 CRISPR 筛选策略，以进一步解析治疗耐药的机制15,16靶向筛选在原代细胞中通常更容易完成，因为其文库较小，达到足够文库代表性的细胞数量需求较少。尽管这些研究加深了我们对CAR-T细胞治疗耐药机制的理解，但靶向筛选由于基因靶点的人工选择而引入了偏差。本文旨在描述一种完成全基因组筛选的方法 体外 健康供体来源的CAR-T细胞全基因组CRISPR敲除筛选。该高通量方法可高效、无偏倚地鉴定出可编辑的关键通路和基因，从而改善治疗应答17,18,19.

特别是，本文所述方案旨在通过完成全基因组范围的CRISPR敲除筛选，以增进领域内对CART细胞耗竭机制的理解 体外 耗竭模型。耗竭是一种功能失调的CART细胞命运，已被证实与CART细胞治疗无应答相关20,21,22这种细胞命运已知受表观遗传调控，其特征表现为CART细胞增殖能力下降、效应细胞因子产生减少以及抑制性受体表达增加。23在以往的研究中，通过上调或下调关键基因，基因编辑已能够阻止耗竭状态的发展。24,25,26鉴于CART细胞在耗竭过程中增殖能力下降，且已有证据表明基因编辑可预防其发生，我们据此建立了模型 体外 全基因组CRISPR敲除筛选该细胞命运。然而，未来可对该方案进行修改，以探索对CART细胞治疗耐药的其他机制。

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方案

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重要的是，以下所述方案遵循并已获得梅奥诊所机构审查委员会（IRB 18-005745）和机构生物安全委员会（IBC HIP00000252.43）的批准。所有细胞培养操作，包括慢病毒的制备，均应在细胞培养生物安全柜中进行，并佩戴适当的个人防护装备。特别是慢病毒相关操作应遵循生物安全二级（BSL-2）防护措施，包括在处理废弃物前使用10%漂白剂对物品进行消毒。

1. CRISPR 文库的扩增

  1. 根据制造商的建议扩增CRISPR文库。简言之，通过完成以下步骤，将CRISPR文库电转化至四份电转感受态细胞中：
    1. 在1.0 mm比色皿中，向25 µL电转感受态细胞加入2 µL浓度为50 ng/µL的CRISPR文库质粒。
    2. 使用以下参数对样品进行电穿孔： 10 µF，600 欧姆，1,800 伏特 和 一个时间常数 介于 3.5 ms 和 4.5 ms.
    3. 在975 µL复苏培养基中重悬，转移至含有额外1 mL复苏培养基的离心管中。
    4. 将所有等份试样在37 °C下以250 RPM转速旋转1小时。
  2. 涂布转化产物：
    1. 将所有电穿孔细胞的等份样品合并并充分混匀。
    2. 将转化混合物400 µL均匀涂布于预热的含100 µg/mL羧苄青霉素的10 cm LB（Luria broth）培养皿中，接种所有电转化细胞。将培养皿置于32 °C培养箱中孵育14 h。
  3. 收集菌落：
    1. 用移液器将1 mL含100 µg/mL羧苄青霉素的LB培养基加至每个平板上。刮下每个平板上的菌落，并收集至50 mL锥形管中。
    2. 向每个平板中再加入 1 mL LB 培养基 + 100 µg/mL 羧苄青霉素，以进行冲洗并确保完全回收。
    3. 按照大提物质粒试剂盒的说明书进行大提质粒操作。
    4. 合并所得的质粒DNA。

2. 通过下一代测序验证CRISPR文库中gRNA的基线代表性

注意：该 CRISPR 文库的 NGS 引物已在先前发表的研究中设计完成27。对每个样本使用不同的反向引物可为各样本添加条形码，从而在测序过程中将多个样本混合合并。

  1. 使用以下反应体系（总体积 = 50 µL）准备PCR样品：高保真PCR预混液（2×）25 µL；混合模板DNA（0.5 µg）1 µL；NGS文库正向引物（10 µM）1.25 µL；NGS文库反向引物（10 µM）1.25 µL；无DNase水21.5 µL。
  2. 按照以下扩增程序进行PCR：第1个循环：98 °C 变性3分钟；第2–23个循环：98 °C 变性10秒，63 °C 退火10秒，72 °C 延伸25秒；第24个循环：72 °C 延伸2分钟。
  3. 将每个样品的PCR反应产物混合后，使用PCR纯化试剂盒，按照制造商说明书纯化PCR产物。
  4. 将每个样品的3 µg PCR产物在2%（w/v）琼脂糖凝胶上电泳。
  5. 使用凝胶回收试剂盒，按照制造商说明书从凝胶中切取并回收PCR产物（约260–270 bp），目标回收DNA量至少为500 ng。
  6. 将提取的样品在-20 °C 保存。
  7. 对样品进行高通量测序（NGS），目标每个gRNA获得100条读长27。
  8. 使用MAGeCK-VISPR分析流程分析测序结果，并确保文库中超过99.5%的gRNA均被检出28。

3. CRISPR 文库和 CAR 表达慢病毒的制备

  1. 按照先前所述方法制备慢病毒10,29。
    1. 第1天：取处于对数生长期、融合度为80-90%的293T细胞T175培养瓶，细胞培养于D10培养基中，该培养基包含10%胎牛血清（FBS）（v/v）、1%青霉素-链霉素-谷氨酰胺（PSG）（v/v）以及DMEM高糖培养基。开始实验前，将转染试剂和DNA恢复至室温，并对DNA进行定量。
    2. 为每个293T培养瓶标记两个50 mL锥形管，分别标记为A和B。向管A和管B中各加入4.5 mL低血清培养基。
    3. 在无菌的1.5 mL微量离心管中，混合以下DNA，并静置1分钟：18 µg pCMVR8.74（含gag、pol、tat和rev基因）、7 µg pMD2.G（VSV-G包膜质粒）以及15 µg慢病毒表达载体（CRISPR文库A或CAR19-28ζ载体）。
    4. 向管A中加入129 µL转染试剂。用手指轻轻涡旋充分混匀管A。
    5. 将DNA混合物加入管B中。用手指轻轻涡旋充分混匀管B。
    6. 向管B中加入111 µL中性共脂质试剂。用手指轻轻涡旋充分混匀管B。
    7. 将管A中的内容物加入管B中，用手指轻轻涡旋充分混匀。将管B在室温下孵育30分钟。
    8. 在30分钟孵育即将结束时，吸除293T细胞原有培养基。向每个293T培养瓶中加入16 mL R10培养基，该培养基包含10% FBS（v/v）、1% PSG（v/v）以及RPMI 1640培养基。
    9. 30分钟孵育结束后，将管B中的内容物（约9 mL）逐滴加入293T细胞培养瓶中。将培养瓶平放并轻轻旋转混匀，随后置于37 ˚C、5% CO2培养箱中孵育。
    10. 在第2天（转染后约24小时），按以下步骤收集慢病毒：
      注：预先将所有设备和材料预冷，并在冰上操作，以保持病毒上清液处于低温状态。
      1. 将转染后的293T培养瓶中的上清液转移至预冷的50 mL锥形管中。
      2. 向293T培养瓶中加入30 mL预热的R10培养基。
      3. 使用封闭式转子，在4 ˚C条件下以900 × g离心10分钟，沉淀细胞碎片。
      4. 离心后，用0.45 µm滤器过滤上清液。将滤液在超速离心机中于4 ˚C、112,700 × g条件下离心2小时。
      5. 2小时离心结束后，吸除上清液，保留约5 mL液体。通过轻柔吹打10次重悬病毒颗粒。将病毒悬液于4 ˚C过夜保存。
    11. 在第3天，按以下步骤收集并保存慢病毒：
      1. 将转染后的293T培养瓶中的上清液转移至预冷的50 mL锥形管中。
      2. 向293T培养瓶中加入30 mL 10%次氯酸钠溶液（漂白剂）进行消毒处理。
      3. 使用封闭式转子，在4 ˚C条件下以900 × g离心10分钟，沉淀上清液中的细胞碎片。
      4. 离心后，用0.45 µm滤器过滤上清液。将滤液在超速离心机中于4 ˚C、112,700 × g条件下离心2小时。
      5. 2小时离心结束后，吸除上清液，保留约2 mL液体，通过轻柔吹打10次重悬病毒颗粒。将病毒上清液分装为300–500 µL每管，保存于-80 ˚C。

4. 表达CAR的慢病毒病毒滴度的计算

注意：CAR 慢病毒的滴定方法如前所述10,12。

  1. 在 第1天，激活并接种T细胞。
    1. 使用阴性选择试剂盒从健康供体的外周血单个核细胞（PBMCs）中分离出 1 × 106 个T细胞。
    2. 计数T细胞。
    3. 洗涤足够数量的CD3+/CD28+ 磁珠，以3:1的磁珠:细胞比例刺激T细胞。例如，若要刺激 1 × 106 个T细胞，则需洗涤 3 × 106 个磁珠。洗涤步骤如下，重复3次：
      1. 使用磁力分离法将磁珠从悬浮液中分离出来。
      2. 移除上清液。
      3. 加入1000 µL T细胞培养基（TCM），该培养基由10%人血清（v/v）、1% PSG（v/v）和造血细胞培养基组成。
        注：TCM在使用前应通过0.45 µm无菌真空滤器过滤，再用0.22 µm无菌真空滤器过滤，以实现灭菌。
      4. 按3:1的磁珠:细胞比例将磁珠加入T细胞悬浮液中。
      5. 将T细胞重悬于TCM中，使细胞密度为 1 × 106 个细胞/mL。
      6. 将100 µL激活后的T细胞加入96孔板的10个孔中。将培养板置于37 ˚C、5% CO2 条件下孵育。
  2. 在 第2天，通过制备稀释板的方式加入CAR慢病毒的稀释液，步骤如下：
    1. 向96孔板的七个孔中各加入100 µL TCM。
    2. 向第一个孔中加入50 µL目标病毒，充分混匀。
    3. 通过将50 µL液体从第1孔转移至第2孔进行连续稀释，充分混匀。
    4. 将50 µL液体从第2孔转移至第3孔，并依此类推，直至第7孔。
    5. 充分混匀第7孔后，移除50 µL液体。确保所有孔的总体积均为100 µL。
    6. 将稀释板中每孔的50 µL液体分别加入第1天制备的T细胞板的前七个孔中，充分混匀。
    7. 向T细胞板的最后三个孔中各加入50 µL TCM，充分混匀。将培养板置于37 ˚C、5% CO2 条件下的培养箱中孵育。
  3. 在 第3天，向T细胞板所有孔中各加入100 µL TCM以补充营养，充分混匀。
  4. 在 第4天，通过以下步骤进行流式细胞术检测，以抗κ链抗体作为CAR表达的替代标志物，测定表达CAR的细胞百分比：
    1. 将T细胞板在1,000 × g 条件下离心3分钟，弃上清。
    2. 用抗κ链抗体缓冲液（由4%牛血清白蛋白（w/v）溶于PBS中组成）洗涤培养板3次：每孔加入200 µL抗κ链抗体缓冲液，在1,000 × g 条件下离心3分钟，弃上清。
    3. 向每孔加入生物素标记的抗κ链抗体。在4 ˚C条件下于摇床上孵育45分钟。
    4. 按照步骤4.4.2的方法，用抗κ链抗体缓冲液洗涤培养板3次。
    5. 使用荧光染料偶联的链霉亲和素抗体和活/死细胞染色抗体对细胞进行流式染色。样品在室温避光条件下孵育15分钟。
    6. 用流式缓冲液（由2% FBS（v/v）和1%叠氮化钠（v/v）溶于PBS中组成）洗涤样品一次：每孔加入200 µL流式缓冲液，在1,000 × g 条件下离心3分钟，弃上清。
    7. 将细胞重悬于100 µL流式缓冲液中，并上机检测。
    8. 利用三个未转导的孔进行阴性设门分析。

5. CRISPR 文库慢病毒病毒滴度的计算

注意：本方案描述了用于滴定CRISPR文库慢病毒的T细胞最低数量，但可根据需要扩大规模，以容纳更多T细胞，从而使用更大体积的病毒。

  1. 在第0天，通过向6 × 106个T细胞中加入18 × 106个CD3+/CD28+磁珠（磁珠与细胞比例为3:1），并用TCM补足至终体积6 mL，以激活T细胞。将T细胞悬液每0.5 mL分装至48孔板的12个孔中。置于37 ˚C、5% CO2的培养箱中孵育。
  2. 24小时后，即第1天，向每孔加入MOI（感染复数）为3的CAR病毒。通过反复吹打数次充分混匀。置于37 ˚C、5% CO2的培养箱中孵育。
  3. 48小时后，即第2天，向已激活的CART细胞中加入一系列不同体积的CRISPR文库病毒，每孔分别加入以下体积的CRISPR病毒（0 µL、0 µL、6.25 µL、6.25 µL、12.5 µL、12.5 µL、25 µL、25 µL、50 µL、50 µL、100 µL或100 µL）。通过反复吹打数次充分混匀。置于37 ˚C、5% CO2的培养箱中孵育。
  4. 在第3天，向其中一半的孔中加入嘌呤霉素，终浓度为每毫升培养基1 µg，包括分别接受以下CRISPR病毒体积的各一个孔（0 µL、6.25 µL、12.5 µL、25 µL、50 µL和100 µL）。其余孔不加嘌呤霉素。
  5. 从第4天至第8天，每天计数T细胞数量，并将细胞终密度调整为1 × 106个细胞/mL：对于加嘌呤霉素的孔，使用含1 µg/mL嘌呤霉素的TCM；对于未处理的孔，使用TCM。
  6. 在第8天，计数每孔的活细胞数量，并使用以下公式计算病毒上清液的转导单位数/mL：
    计算浓度的公式；公式显示 TU/mL = A/B ÷ V×D；化学分析。
    其中A：病毒转导孔中的活细胞数；B：无抗生素筛选对照孔中的活细胞数；V：每孔感染所用病毒体积；D：稀释倍数。
  7. 根据显示约20%转导效率的孔所计算出的TU/mL值，使用以下公式计算在MOI为0.3时转导1 × 106个细胞所需的病毒体积：
    微流控公式，X=μL=(0.3×(1×10^6))/(TU/(mL×10^-3))，公式计算。

6. CRISPR 筛选的 CAR-T 细胞生产阶段（第 0 - 8 天）

注意：以下方案描述的是在一个生物学重复中完成CRISPR筛选的过程。然而，本方案此前已在三个生物学重复中得到验证，我们建议其他研究人员在实施本方案时至少使用三个生物学重复30。

  1. 第0天：按照先前描述的方法10，从健康供体血液中分离并刺激T细胞。
    1. 从匿名健康供体血液中分离外周血单个核细胞（PBMCs）。
      1. 向密度梯度分离管中加入15 mL密度梯度介质。
      2. 将1:2稀释的血液加至密度梯度分离管顶部，在室温下以1,200 × g离心10分钟。
        注：血液应用分离缓冲液（含2% FBS (v/v) 的磷酸盐缓冲液 [PBS]）稀释。
      3. 将上层液体小心倾入新的50 mL离心管中，并用分离缓冲液将体积加倍。在4 °C下以300 × g离心8分钟，吸除上清液。
      4. 用分离缓冲液重悬细胞沉淀，并计数PBMCs。
    2. 使用阴性选择试剂盒从PBMCs中分离T细胞。按照试剂盒制造商的说明操作。
      注：假设T细胞从PBMCs中的回收率为10-20%。
    3. 使用CD3+/CD28+磁珠刺激T细胞。
      1. 计数T细胞。
      2. 分装足够数量的CD3+/CD28+磁珠，以3:1的磁珠:细胞比例刺激T细胞。例如，要刺激110 × 106个T细胞，需分装330 × 106个磁珠。通过磁分离将磁珠从悬浮液中分离后，加入1,000 µL TCM，重复洗涤3次。
      3. 将磁珠加入T细胞悬浮液中。用TCM将T细胞重悬至1 × 106 个细胞/mL。
      4. 将T细胞分装至6孔板中以获得最佳转导效率。每孔加入5 × 106个T细胞。在37 °C、5% CO2条件下孵育24小时。
  2. 第1天：在BSL-2+条件下，解冻足够量的CAR慢病毒，以感染复数（MOI）为3.0的条件转导T细胞。轻柔打散T细胞聚集体后，加入适量混合的慢病毒以转导5 × 106个T细胞（MOI为3.0）。在37 °C、5% CO2条件下孵育细胞。
    注：在转导T细胞前，应将多次制备的慢病毒合并至同一管中，以确保所有T细胞接受相同的处理。此外，慢病毒仅可解冻一次。
  3. 第2天：在BSL-2+条件下，解冻足够量的CRISPR慢病毒，以MOI为0.3的条件转导T细胞。轻柔打散T细胞聚集体并重悬细胞后，加入适量混合的慢病毒以转导5 × 106个T细胞（MOI为0.3）。在37 °C、5% CO2条件下孵育细胞。
    注：在转导T细胞前，应将多次制备的慢病毒合并至同一管中，以确保所有T细胞接受相同的处理。
  4. 第3–5天：重悬CART细胞以打散聚集体并计数细胞。用含1 µg/mL嘌呤霉素的TCM将最终细胞浓度调整为1 × 106 个细胞/mL。在37 °C、5% CO2条件下孵育细胞。
  5. 第6天：重悬CART细胞以打散聚集体，通过磁分离去除CD3+/CD28+磁珠，并计数CART细胞。加入含1 µg/mL嘌呤霉素的TCM，将最终细胞浓度调整为1 × 106 个细胞/mL，在37 °C、5% CO2条件下继续孵育。按照步骤4.4所述方法，通过流式细胞术检测CAR表达情况。

7. CRISPR 筛选中的 gRNA 选择阶段（第 8 - 22 天）

  1. 第8天：保存样本用于下一代测序（NGS），并开始共培养。
    1. 用 TCM 通过在 300 × g 条件下离心洗涤 CART 细胞 3 次 g 4 °C下离心5分钟，吸除上清液，将样品重悬于20 mL TCM中。
    2. 计数CART细胞。
    3. 通过完成以下步骤保存样本以用于下一代测序（NGS）：
      1. 将足够量的CART细胞分装至50 mL锥形管中，以维持每种gRNA对应500个细胞的gRNA代表性（例如，分装约33 × 10⁶个细胞）6 CART 细胞（若使用含 65,383 个 gRNA 的 CRISPR 文库）。在 300 × g 4 °C 下 5 分钟
      2. 将细胞沉淀重悬于1 mL PBS中，转移至2 mL微量离心管。用1 mL PBS洗涤50 mL锥形管，并将洗涤液转移至2 mL微量离心管。
      3. 将样品在 500 × g 4 °C下离心5分钟。弃去上清液。将细胞沉淀在-20 °C保存。
      4. 通过将CART细胞加入CD19开始共培养+ JeKo-1 细胞按1:1比例混合。例如，加入80 × 106 CART 细胞至 80 × 106 JeKo-1 细胞。用 TCM 将共培养体系总体积补至 160 mL。将样品置于 37 ˚C、5% CO₂ 培养箱中孵育。2.
        注意：我们建议至少从 80 × 10 开始6 为维持文库的代表性，并确保有足够的细胞用于保存第15天和第22天的样本。
  2. 第10天：为了重新刺激CART细胞，将共培养物收集到50 mL锥形管中，以300 × g离心样品 g 4 °C下离心5分钟。将每份样品重悬于80 mL TCM中，并加入80 × 106 80 mL TCM 中的 JeKo-1 细胞。将样品置于 37 ˚C、5% CO₂ 的培养箱中保存。2.
  3. 第12天 和 14：按照步骤 7.2 重新刺激 CART 细胞。
  4. 第15天：将样本用于 NGS 保存，并重新刺激 CART 细胞。
    1. 通过首先计数细胞，然后结合使用CD4阳性选择试剂盒，从共培养物中分离CART细胞+ 使用CD8阳性选择试剂盒的T细胞+ 使用T细胞从CART-JeKo-1共培养物中分离T细胞。计数T细胞。
    2. 通过分装 33 × 10 份样本来保存用于下一代测序（NGS）的样本6 50 mL 圆底管中的 CART 细胞，300 × g 4 ℃下离心5分钟。将样品重悬于1 mL PBS中，并转移至2 mL微量离心管中。用1 mL PBS洗涤50 mL锥形管，并将洗涤液转移至2 mL微量离心管中。将样品在500 × g 4 °C下离心5分钟；弃上清液；将细胞沉淀于-20 °C保存。
    3. 建立共培养体系以继续实验 体外 通过添加 80 × 10 建立耗竭模型6 CART 细胞至 80 × 106 JeKo-1 细胞。然后用 TCM 补充至共培养体系总体积为 160 mL。将样品置于 37 ˚C、5% CO₂ 的培养箱中孵育。2.
  5. 第17天、第19天 和 21：按照步骤 7.2 重新刺激 CART 细胞。
  6. 第22天：将样本保存用于下一代测序（NGS）。
    1. 通过首先计数细胞，从共培养物中分离CART细胞。然后，联合使用CD4阳性选择试剂盒+ 使用CD8阳性选择试剂盒的T细胞+ 使用T细胞分离试剂盒从CART-JeKo-1共培养体系中分离T细胞。计数T细胞。
    2. 为保存用于下一代测序（NGS）的样本，重复步骤 7.4.2。

8. 下一代测序用基因组DNA的制备

注意：为了保持足够的覆盖度，应从至少 33 × 106 个 CART 细胞中分离基因组 DNA（gDNA）。此外，应将来自 33 × 106 个 CART 细胞的全部 gDNA 用于测序制备。

  1. 使用基因组DNA（gDNA）提取试剂盒从冷冻的细胞沉淀中分离gDNA。
  2. 通过乙醇沉淀法纯化gDNA。
    1. 将100%乙醇（EtOH）预冷至-20 °C。
    2. 将洗脱的DNA等量分装至若干微量离心管中（每管200–250 µL）。向每份样品中加入以下成分：两倍体积的100%乙醇（250 µL样品加500 µL，200 µL样品加400 µL）；0.1倍体积的3 M醋酸钠（250 µL样品加25 µL，200 µL样品加20 µL）；以及1 µL的20 mg/mL糖原。将样品在-20 °C孵育过夜。
    3. 第二天，以13,000 × g离心20分钟，使沉淀的DNA成团，弃去上清液。用1 mL 70%乙醇在7,500 × g下离心10分钟洗涤沉淀。
    4. 彻底去除残留的乙醇，将沉淀在室温下干燥30–45分钟。
    5. 将沉淀重悬于50 µL无菌水中。
  3. 为下一代测序（NGS）准备gDNA。
    注：用于扩增含Illumina接头序列的gRNA的CRISPR文库NGS引物已在先前发表的研究中设计完成27。对每个样品使用不同的反向引物可实现样品的条形码标记，从而允许在测序过程中合并多个样品。
    1. 按以下反应体系配制PCR样品（总体积=50 µL）：高保真PCR预混液（2×）25 µL；模板DNA（混合后）0.5 µg：1 µL；NGS文库正向引物（10 µM）：1.25 µL；NGS文库反向引物（10 µM）：1.25 µL；无DNase水：21.5 µL。
    2. 按以下循环条件进行PCR扩增：第1个循环：98 °C变性3分钟；第2–23个循环：98 °C变性10秒，63 °C退火10秒，72 °C延伸25秒；第24个循环：72 °C延伸2分钟。
    3. 合并每个样品的PCR产物，并根据试剂盒说明书使用PCR纯化试剂盒纯化PCR产物。
    4. 将每个样品的3 µg PCR产物在2%（w/v）琼脂糖凝胶上电泳。
    5. 使用凝胶回收试剂盒，按照制造商说明书从凝胶中切取并回收PCR产物片段（约260–270 bp）。将回收的样品储存于-20 °C。
    6. 对样品进行下一代测序（NGS），目标为文库中每个gRNA获得超过500条读长（reads）。

9. 测序结果分析

  1. 为分析 NGS 数据，使用 MAGeCK-VISPR 平台28。对最大似然估计（MAGeCK-MLE）算法采用标准设置。为准备用于分析的输出文件：
    1. 运行 FASTQC 以评估序列文件质量31。
    2. 使用 bbmerge 将每个样本的成对末端测序文件合并32。
    3. 在 MAGeCK-VISPR 平台上使用 MAGeCK-MLE 算法分析样本。对于 MAGeCK-MLE 分析，将所有 gRNA 计数归一化至包含 1,000 个非靶向 gRNA 的列表。
    4. 通过评估 GC 含量、碱基质量、测序读段及比对读段来评估测序文件质量。
    5. 通过评估 Gini 指数的变化、主成分分析（PCA）聚类以及与负向选择基因列表相关的通路，评估 CRISPR 筛选中选择压力阶段的成功程度32。
    6. 通过对文献进行检索并开展通路分析，进一步验证排名靠前的候选基因。

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结果

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为了以无偏倚的方式探究可编辑以增强CART细胞活性的基因和通路，我们设计了一项 体外 全基因组CRISPR敲除筛选图1）。该筛选包含两个阶段：CART细胞生成阶段和选择性压力阶段。在CART细胞生成阶段，至少需要110 × 106 首先从健康供体的外周血单个核细胞（PBMCs）中分离T细胞，并使用CD3激活+/CD28+ 珠子。次日，于 第1天，以3.0的感染复数（MOI）加入CAR慢病毒，以生成靶向CD19抗原的CAR-T细胞（CART19细胞）。在 第2天，以 MOI 为 0.3 将 CRISPR 文库慢病毒加入 CART 细胞中。从 第3天-8，CAR-T细胞维持在1 × 10的浓度6 每毫升TCM中加入1 µg/mL嘌呤霉素，以筛选成功转导CRISPR文库慢病毒的细胞。在 第6天

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讨论

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基因编辑已成为研究治疗耐药机制以及设计新型CAR-T细胞疗法以提高CAR-T细胞持久性和活性的强大工具16,17,26尽管一些基因编辑策略已在临床前模型和临床试验中显示出对CAR-T细胞活性的改善作用，但仍需进一步优化基因编辑策略。为满足这一需求，研究人员已开始在CAR-T细胞中开展靶向CRISPR筛选15,16然而，这种方法会因依赖先前已发表的策略而引入偏差。在此，我们描述了一种用于完成 体外 在CAR-T细胞中进行全基因组CRISPR敲除筛选。该方法可无偏倚地鉴定出可通过编辑以增强CAR-T细胞活性的基因和信号通路。尽管全基因组CRISPR筛选是一项极具前景的技术工具，但在原代细胞中开展此类筛选仍面临多项挑战。

例如，为了有效构建一个全基因组范围的CRISPR...

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披露

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SSK 是嵌合抗原受体（CAR）免疫疗法领域多项专利的发明人，这些专利已授权给诺华公司（通过梅奥诊所、宾夕法尼亚大学与诺华之间的协议）、Humanigen（通过梅奥诊所）、Mettaforge（通过梅奥诊所）、MustangBio（通过梅奥诊所）以及 Chymal Therapeutics（通过梅奥诊所）。CS、CMR 和 SSK 是已授权给 Immix Biopharma 公司的专利的发明人。SSK 收到来自 Kite、Gilead、Juno、BMS、诺华、Humanigen、MorphoSys、Tolero、Sunesis/Viracta、LifEngine Animal Health Laboratories Inc. 和 Lentigen 的研究资助。SSK 参与了与 Kite/Gilead、Calibr、Luminary Therapeutics、Humanigen、Juno/BMS、Capstan Bio 和诺华的顾问会议。SSK 曾在 Humanigen 和 Carisma 的数据安全与监查委员会任职。SSK 曾担任 Torque、Calibr、诺华、Capstan Bio、BMS、Carisma 和 Humanigen 的顾问。CMS 和 SSK 是本方案所产生的知识产权的发明人。

致谢

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

本研究部分由梅奥诊所个体化医学中心（SSK）和梅奥诊所综合癌症中心资助 癌症中心（SSK）、梅奥诊所再生生物治疗中心（SSK）、美国国立卫生研究院K12CA090628（SSK）和R37CA266344-01（SSK）、美国国防部资助CA201127（SSK）、Predolin基金会（SSK）以及明尼苏达州生物技术与医学基因组学合作项目（SSK）。CMS由梅奥诊所生物医学科学研究生院支持。CRISPR筛选示意图（图1由 BioRender.com 制作（Siegler, L. (2022) https://BioRender.com/k71r054）。 

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
293T 细胞ATCCCRL-3216用于慢病毒生产的细胞
生物素化 ProteinL 抗体GenScriptM00097用于 CAR 检测的抗 kappa 链抗体
牛血清白蛋白Millipore SigmaA7906
羧苄西林二钠盐Millipore SigmaC1389-1G羧苄西林抗生素
CD4 分离磁珠Miltenyi Biotec130-045-101 
CD8 分离磁珠Miltenyi Biotec130-045-201
CTS（细胞治疗系统）Dynabeads CD3/CD28Gibco40203D
CytoflexBeckman CoulterNC2279958
无 DNase 水InvitrogenAM9937
杜氏改良伊格尔培养基（DMEM）Corning10-017-CV
杜氏磷酸盐缓冲液Gibco14190-144
EasySep 人 T 细胞分离试剂盒STEMCELL Technologies17951RF阴性分离试剂盒
Endura 电转感受态细胞 Biosearch Technologies60242-1含复苏培养基的电转感受态细胞
乙醇Millipore SigmaE7023
胎牛血清（FBS）Corning35-010-CV
GeCKO v2 CRISPR 敲除混合文库 AAddGene1000000048CRISPR 文库质粒
Gene Pulser II Bio-Rad165-2105电穿孔仪
糖原Millipore Sigma10901393001
JeKo-1ATCCCRL-3006CD19+ 靶细胞 
Lipofectamine 3000 转染试剂ThermoFisher ScientificL3000075包含转染试剂（Lipofectamine 3000 试剂）和中性共脂质试剂（p3000）的转染试剂盒
LIVE/DEAD AquaInvitrogenL34966
LymphoprepSTEMCELL Technologies7851密度梯度介质
Macherey-Nagel NucleoBond Xtra Maxi 试剂盒ThermoFisher Scientific12748412大提试剂盒
NEBNext 高保真 2X PCR 预混液New England BioLabsM0541S高保真 PCR 预混液
Opti-MEM I 低血清培养基Gibco31985-070低血清培养基
pCMVR8.74AddGene22036慢病毒包装质粒
青霉素-链霉素-谷氨酰胺（100X）Life Technologies10378-016
pMD2.GAddGene12259表达 VSV-G 包膜的质粒
混合人 AB 血清 Innovative ResearchISERABHI
嘌呤霉素Millipore SigmaP8833
QIAquick 凝胶回收试剂盒Qiagen28704凝胶回收试剂盒
Quick-DNA Midiprep Plus 试剂盒Zymo ResearchD4075用于分离基因组 DNA 的试剂盒
RoboSep-SSTEMCELL Technologies21000自动化细胞分离仪
罗斯韦尔帕克纪念研究所 1640 培养基（RPMI）Gibco21870092
SepMate-50STEMCELL Technologies85450密度梯度分离管
乙酸钠InvitrogenAM9740
叠氮化钠Fisher Scientific71448-16
链霉亲和素抗体（PE）BioLegend405203用于 CAR 检测的二抗
T100 梯度 PCR 仪Bio-Rad1861096
超速离心机（Optima XPN-80）BeckmanCoulterA99839
真空滤器系统，0.22 µmThermoFisher Scientific567-0020
真空滤器系统，0.45 µmThermoFisher Scientific165-0045
X-VIVO 15 无血清造血细胞培养基Lonza04-418Q造血细胞培养基

参考文献

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CAR T T DNA CD19 T

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