建立原位儿童脑瘤模型需要极为精细的操作，需使用立体定位仪精确植入癌细胞。本文所述方法概述了脑瘤细胞制备、颅内注射操作以及术后监测系统实施的各个步骤，以评估脑瘤的移植情况。
本文内容
摘要
摘要
建立具有临床相关性和可靠性的中枢神经系统（CNS）肿瘤模型，对推动神经肿瘤学领域的发展至关重要。其中应用最广泛的技术之一是原位颅内注射法，该方法可在受控条件下研究肿瘤的生长、侵袭和播散过程。该技术将来自特定患者部位的肿瘤细胞移植到动物相应的解剖位置中。通过这种方式，这些原位脑肿瘤模型具有独特优势，能够更准确地模拟人类患者中癌症的生物学行为及其与脑部微环境的相互作用。因此，这类模型在临床前治疗试验中尤为宝贵，因为只有高度贴近临床实际的情境，才能有效评估潜在治疗方法。本实验方案分享了建立儿童脑肿瘤患者来源异种移植（PDX）模型的经验，涵盖弥漫性中线胶质瘤（DMG）、胶质母细胞瘤（GBM）、髓母细胞瘤和室管膜瘤。本方法详细阐述了在小鼠中进行颅内立体定位注射的操作流程，确保准确靶向脑内注射部位。此外，我们还描述了术后监测系统，用于检测肿瘤成功植入的迹象。在肿瘤注射后，实施严格的监测程序，观察动物是否出现神经系统功能障碍、行为改变和/或体重下降等常见肿瘤进展指标。该监测系统有助于及时干预，并提供关于肿瘤生长动态的关键数据。通过优化这些模型和实验方案，我们旨在提高临床前研究的可靠性与转化潜力，从而推动更有效的儿童中枢神经系统肿瘤治疗策略的开发。
引言
儿童中枢神经系统（CNS）肿瘤是儿童中最常见的实体瘤，约占儿童原发性肿瘤的20%–25%，在发病率和治疗反应方面具有不同于成人肿瘤的显著特征1,2。高级别胶质瘤（HGGs），如胶质母细胞瘤（GBM）和弥漫性内生性桥脑胶质瘤/弥漫性中线胶质瘤（DIPG/DMG），具有特别强的侵袭性，预后极差，尽管治疗手段已取得进展，但生存率仍然较低3,4,5。髓母细胞瘤约占儿童中枢神经系统肿瘤的近20%，通过标准治疗已实现较高的5年生存率，但某些亚型仍存在治疗挑战，尤其是在复发情况下6,7。室管膜瘤约占儿童中枢神经系统肿瘤的10%，其预后因分子特征和肿瘤位置不同而有所差异，复发给临床治疗带来重大挑战8,9。深入了解肿瘤的分子图谱并建立原位脑肿瘤（BT）模型，有望为改善儿童患者的治疗效果提供有效疗法。
建立具有临床相关性的脑肿瘤（BT）模型对于推动神经肿瘤学研究和治疗手段的发现至关重要。使用立体定位仪进行原位注射是该方法中的关键步骤，因其能够将肿瘤细胞精确地植入大脑特定位置，从而高度模拟脑肿瘤的自然生长环境10。该技术提高了肿瘤模型的可靠性和可重复性，有助于更准确地研究肿瘤生物学特性及关键特征（如侵袭性和血管生成），并评估治疗干预的效果11。立体定位仪可精确控制细胞注射的位置和深度，确保肿瘤细胞始终被植入目标脑区，从而提升实验结果的可靠性10。皮下模型则为治疗剂的初步筛选提供了更便捷且成本较低的选择。在该类模型中，肿瘤细胞被植入皮肤下方，便于直接监测肿瘤生长及对治疗的反应12。尽管其无法模拟大脑复杂的微环境，皮下模型在高通量药物筛选和初步疗效评估中仍具有重要价值12,13。
多项研究已成功证明，可从脑肿瘤样本（包括尸检或活检样本的直接组织移植以及原代脑肿瘤培养物）建立原位患者来源的异种移植模型（PDXs）11,14,15。然而，必须认识到，将解离的肿瘤组织或肿瘤细胞颅内注射并不总能确保移植成功，失败的原因尚未完全明确15。有趣的是，高级别胶质瘤（HGG）活检样本相较于其他脑肿瘤亚型通常表现出更高的成功率。例如，He 等人报道了 HGG 原位模型的成功率为 56%，而 Brabetz 等人的研究则报告了其他儿童脑肿瘤样本（如室管膜瘤和髓母细胞瘤）的移植率较低，分别为 43% 和 30%11,14,16。值得注意的是，脑肿瘤 PDX 模型表现出广泛的潜伏期，从 1 个月到 11 个月不等，较晚发生的移植会降低其临床前研究的应用价值。尽管这些模型能够在分子水平上重现疾病特征，但在活检样本与已建立的模型之间仍观察到一些基因组差异14,16。
PDX 模型在探索针对儿童脑肿瘤（BTs）的新型治疗策略中发挥着不可或缺的作用。由于存在血脑屏障（BBB），这些模型在肿瘤生长、症状表现和药物药代动力学方面能够高度模拟人类疾病，因此被视为开展药物疗效研究的金标准。研究表明，在儿童脑干胶质瘤领域，血脑屏障完整性得以维持且药物难以渗透是导致此类肿瘤治疗效果不佳的重要特征17,18,19。然而，对于某些能够实现充分药物渗透的治疗手段（如表观遗传学和代谢抑制剂），已观察到一定的疗效17,20。
本研究介绍了一种在免疫缺陷动物中进行颅内注射脑肿瘤细胞的方法，旨在评估细胞植入效果，以用于患者来源的肿瘤异种移植模型（PDX）的建立和/或治疗药物疗效的评价。同时提供了全面的工具，用于监测肿瘤进展，直至达到伦理实验终点。
方案
以下方案遵循新南威尔士大学规定的动物护理与使用伦理指南，所有操作均经机构动物护理与使用委员会批准。优先考虑动物福利，并尽一切努力减少在颅内注射过程中所用动物的痛苦。
1. 神经球形成性脑肿瘤细胞培养物的扩增培养
注意：具体要求可能因所使用的脑培养物而异。以下步骤概述了原代脑肿瘤细胞以神经球形式进行培养的一般性方案。脑肿瘤培养物可从商业供应商获取，也可通过患者脑肿瘤活检或尸检样本建立原代培养。从患者活检或尸检样本建立原代培养物的步骤已在已发表的文献中有所描述15,21。
- 将冻存的细胞管放入37 °C水浴中，直至内容物完全融化。用70%乙醇擦拭管外表面，以确保无菌。
- 按照Mayoh等人的方法制备原代脑肿瘤细胞的神经球培养基21。在生物安全柜（BSC）中，使用无菌的1 mL移液器将融化的细胞转移至含有5 mL预热神经球培养基的无菌15 mL锥形管中。
- 以300 × g离心3分钟，使细胞沉淀。用10 mL移液器尽可能吸除上清液。
- 将细胞沉淀重悬于10 mL或25 mL神经球培养基中。根据冻存细胞的预期数量，将细胞悬液接种至T25或T75培养瓶中。通常，起始细胞密度为5×105个细胞时，应接种于T25培养瓶中。
- 将培养瓶置于37 °C、5% CO2的培养箱中培养。每周更换新鲜培养基1至2次。或者，可根据细胞生长速率，按需补充生长因子和B27添加剂。
- 当T25培养瓶中形成神经球后，可将其扩增至T75培养瓶中。用10 mL移液器将T25培养瓶中的内容物转移至15 mL锥形管中。在光学显微镜下观察神经球，当其生长至足够大（约500 µm）时，肉眼亦可观察到。
- 以300 × g离心3至5分钟。吸除细胞沉淀上方的培养基，保留约1 mL液体在管中。
- 用1 mL移液器轻柔地将细胞上下吹打12至15次，以解离细胞沉淀。使用40 µm细胞筛网将神经球解离为单细胞悬液。
- 将筛网置于50 mL锥形管上方，用10 mL移液器将解离后的类球体加至筛网上。大多数单细胞将通过筛网进入管中，而团块状物质则留在筛网上。
- 使用细胞计数板进行细胞计数。取等体积的细胞悬液（例如5 µL）与台盼蓝（5 µL）混合，评估细胞活力。在光学显微镜下，死细胞呈蓝色，而活细胞则不着色。
- 按以下公式计算细胞密度：
细胞浓度 = 每网格平均细胞数 × 稀释倍数 / 单个网格体积（mL）。标准细胞计数板的网格体积为0.0001 mL。 - 传代时，将1×106个细胞重悬于25 mL新鲜预热的培养基中，接种至T75培养瓶。将细胞置于37 °C、5% CO2的加湿培养箱中培养，直至神经球生长。
- 冻存脑肿瘤细胞时，将1×106个细胞重悬于1 mL冻存液中，置于程序降温盒中过夜，随后保存于-80 °C。长期储存时应将冻存细胞转移至-180 °C液氮罐中。
注：冻存液由90%胎牛血清和10%二甲基亚砜（DMSO）组成。
2. 颅内注射用脑肿瘤细胞的制备
注意：尽管以下方案概述了从已建立的或短期培养物中制备用于颅内注射的培养细胞的方法，但该方案也可适用于其他细胞类型，包括来自人脑肿瘤的新鲜解离组织22,23。
- 在生物安全柜中，使用血清移液管小心地将组织培养瓶中的细胞和培养基转移至一个 50 mL 圆锥形离心管中。
- 在室温下以 300 × g 离心 5 分钟。使用 25 mL 移液管吸除沉淀上方的培养基，保留约 0.5 mL 在管中。
- 使用 1 mL 移液管轻柔地将细胞上下吹打 10 次，以充分解离细胞沉淀。使用台盼蓝染色和血细胞计数板进行细胞计数。
- 当所需数量的细胞被分装至新离心管后，用 PBS 重悬细胞，并在 4 °C 下以 300 × g 离心 5 分钟，重复洗涤两次。
注意：细胞数量可按上述方法确定。例如，若需向 10 只动物注射，每只注射密度为 200,000 个细胞，则至少需要 2 × 106 个细胞。 - 在最后一次洗涤时，尽可能吸除 PBS。将细胞沉淀和 50 µL 细胞外基质（ECM）水凝胶分装液轻柔地置于冰上。
注意：可使用预冷至 4 °C 的移液器将 ECM 水凝胶预先分装成 50 µL 一份置于冰上，并储存于 -80 °C 直至使用。ECM 水凝胶可在冰上缓慢解冻，以备后续实验使用。 - 将细胞沉淀与 ECM 水凝胶混合用于注射，应尽快完成此步骤，随后立即开始颅内注射。标准操作为使用含有 200,000 个细胞悬浮于 ECM 水凝胶中的 2 µL 悬液。
注意：若颅内注射过程超过 2–3 小时，应重新制备一批细胞，因为长时间冰上孵育可能降低细胞活力。可进行最多 1,000,000 个细胞、体积达 10 µL 的颅内注射；但此时需将细胞重悬于 PBS 而非 ECM 水凝胶中，并以极慢的注射速率注入。
3. 立体定位仪与麻醉设备的设置
注意：以下列出的实验步骤可能因体视定位仪的制造商以及所选用的麻醉方式不同而略有差异。
- 启动生物安全柜 先用聚山梨酯20（polysorbate 20）清洁剂对表面进行消毒，并静置10分钟。随后用80%乙醇擦拭表面。在将设备放入生物安全柜前，须用80%乙醇擦拭每一件仪器表面（避免润湿任何电气接口）。
- 根据生物安全柜罩内的要求放置底板 图1，将鼻锥置于右侧（适用于右手使用者）。确保XYZ操纵器已固定在底板上并已紧固。
- 将数字显示控制台连接到基板背面的入口，并将其电源线插入生物安全柜罩内提供的电源（参见 图1）。该控制台记录XYZ操纵器移动的坐标。
- 将碳过滤罐（用于麻醉气体输出）和麻醉气体输入管分别固定到可拆卸鼻部装置的两个阀门上。将鼻锥部件滑入安装部位，并用螺钉将其固定在立体定位仪上。
- 将耳杆安装到固定段两侧各自的支架上，并通过拧紧支架上的螺丝将其固定。耳杆可用纱布垫或电工胶带包裹。
- 将手术床推入设备中，调节其高度，使之与固定动物头部的耳杆齐平。用纱布包裹手术床 垫子以保持动物温暖。
- 将加热垫连接至电源，并置于动物下方，以在麻醉过程中维持其体温。
- 在生物安全柜内，摆放无菌棉签、20 µL移液器吸头、眼膏、独立包装的异丙醇擦拭巾、外科粘合剂和20 µL移液器。用80%乙醇润湿一块纱布，将无菌镊子和手术刀片放置其上。
- 用冷的80%乙醇冲洗玻璃微量注射器5次，随后用冷的0.9%生理盐水溶液冲洗。
- 为钻孔目的，将钻机电机连接至电源，并将钻机安装到XYZ位移操纵器上，通过牢固旋紧确保安装稳固。
- 将钻孔组件更换为用于细胞注射的玻璃微量注射器 holder。通过松开 XYZ 操纵器上的螺丝，取下钻孔组件，并换上注射器 holder。在将玻璃微量注射器与先前钻好的孔对齐之前，确保已拧紧螺丝。
- 使用立体定位仪后，应拆卸所有组件，并用80%乙醇消毒，然后存放于洁净的储存盒或无尘柜中。所有锐器应安全、适当地丢弃至指定的锐器容器中。
4. 颅内注射
注意：颅内注射可在雄性和雌性小鼠中进行，但通常优先选择雌性小鼠，因为它们较少因雄性间的攻击行为而出现伤口并发症。该操作通常在7至10周龄的小鼠中进行，以留出足够时间供肿瘤发育。通常将动物随机分组，每笼饲养4至6只。对于患者来源的异种移植瘤（PDX）模型的建立，常使用免疫缺陷小鼠品系，如BALB/c Nude、NOD-SCID和NSG，因其免疫缺陷状态有利于肿瘤的移植和生长24。虽然本方案指定使用异氟烷进行麻醉诱导，但也可选用其他麻醉剂，如氯胺酮和赛拉嗪25。若不使用异氟烷，则可省略涉及麻醉舱及相关设备的操作步骤。
- 在进行颅内操作前，称量动物体重并监测其整体健康状况。在开始颅内注射前1小时内，逐笼给予动物镇痛剂（例如，腹腔注射布托啡诺 0.05 mg/kg）。
- 根据仪器提供的指南设置麻醉设备。开始操作前，确保挥发罐至少半满，并确认氧气供应已打开。
- 若动物有毛发，可在颅内手术前一天或同时去除。使用电动剪刀或剃刀去除小鼠头背部或颅骨手术区域的毛发。
- 将动物转移至麻醉诱导室。确保麻醉机的流量计设定为1 L/min的流速，氧气调节器压力维持在40–50 psi。通过检查肌肉是否松弛、反射是否消失，以确保维持中等麻醉深度。
- 监测动物对刺激的反应，并观察胸壁运动以确保呼吸平稳。若颅内注射操作超过10分钟，应使用直肠探头和体温监测系统监测体温，并使用脉搏血氧仪监测脉搏。
- 将动物固定于立体定位仪上，确保门齿固定在门齿 杆中，鼻罩已将动物稳固固定。
- 使用浸有碘液的棉签对小鼠头部进行消毒，随后用异丙醇棉片擦拭。在双眼角膜表面涂抹眼膏，防止手术期间角膜干燥。
- 从 cerebellum 基底部开始切口，沿颅骨背侧延伸至中线，在颅骨顶部做长约1 cm的小切口。
- 拉紧耳间皮肤以暴露颅骨，并通过拧紧耳杆固定头部。用棉签清洁颅骨表面并将其擦干。
- 将钻头固定在立体定位支架上，并使用钻头定位 bregma（或 lambdoid 结构）。
注：立体定位坐标的选择应基于移植研究所需的解剖区域。这些精确坐标可参考已发表文献，或利用《立体定位小鼠脑图谱》（Mouse Brain in Stereotaxic Coordinates）26 等资源确定，以确保准确靶向并实现成功植入。 - 确定坐标后，使用钻头在指定位置小心钻出小骨孔：弥漫性中线胶质瘤（DMG）：X = +0.5，Y = -5.5，Z = -3.1（相对于 bregma）；幕上脑肿瘤（GBM 或室管膜瘤）：X = +1.5，Y = +1，Z = -3（相对于 bregma）；幕下脑肿瘤（髓母细胞瘤、室管膜瘤）：X = +2，Y = -2，Z = -2（相对于 lambdoid 结构）。
- 用移液器反复重悬细胞，避免产生气泡。吸取2 µL细胞悬液至预先清洗并冷却的玻璃微量注射器中。将注射器安装至立体定位支架，并调整针头至颅骨顶端。
- 在30秒内将细胞注入钻孔区域，注射过程中及时吸除反流的细胞悬液。
注：由于细胞悬浮于ECM水凝胶中，注射需足够迅速，以防细胞悬液在注射器内凝固。可使用不同细胞密度以评估不同的移植效率，通常较高细胞密度可加快肿瘤移植速度。 - 注射后保持注射器静置1分钟，防止回流，并使ECM水凝胶充分沉降。随后取出注射器，用异丙醇棉片擦拭伤口。如有必要，使用皮肤胶或伤口夹闭合切口。
- 将动物置于清洁的恢复笼中，保持仰卧位，并使用加热灯或加热垫保温直至苏醒。持续监测动物状态，直至其自主活动，并在之后频繁观察，直至恢复正常行为。
- 若在恢复期间发现先前已闭合的伤口重新裂开，应再次麻醉动物，用异丙醇棉片清洁伤口以去除残留胶水，然后使用缝合钉重新固定。
5. 移植后手术监测
- 颅内注射后，开始每周监测小鼠5天（或根据需要更频繁）。在颅内注射后的最初几周内，提供术后护理，例如种子状食物或软食。密切观察动物是否有伤口裂开的迹象。动物在颅内注射后的最初24–48小时内可额外给予布托啡诺镇痛。
注：如果雌性动物的伤口已夹闭，可继续留在同一笼盒中，因为它们极少表现出攻击性行为。对于雄性动物，我们在笼内提供两个半球形小屋以及额外的环境丰富化物品，以帮助减少攻击行为。在极少数发生攻击行为并导致伤口重新裂开的情况下，应使用钉合器重新闭合伤口，并将攻击者从群体中移除，单独饲养。 - 在监测表中记录动物的一般健康状况参数，如体重减轻、活动水平、姿势、脱水迹象和毛发状况。
- 在监测表中记录间歇性、轻度或重度的神经学症状，例如头部倾斜、共济失调和/或转圈行为。
- 按以下方式识别神经学症状：
- 将下列情况观察并归类为间歇性症状：头部倾斜：在5分钟检查期间观察到1–2次，整体健康状况良好；共济失调：在5分钟检查期间观察到1–2次，整体健康状况良好；转圈行为：在5分钟检查期间观察到1–2次，整体健康状况良好；行为表现：小鼠行为正常，能够自主取食饮水并攀爬。
- 将下列情况观察并归类为轻度症状：头部倾斜：在5分钟检查期间频繁出现，整体健康状况良好；共济失调：在5分钟检查期间频繁出现，整体健康状况良好；转圈行为：在5分钟检查期间频繁出现，整体健康状况良好；行为表现：小鼠可能出现毛发蓬乱或皮肤干燥，但仍能表现出正常行为，自主进食并攀爬。
- 将下列情况观察并归类为重度症状：头部倾斜：检查期间持续存在，头部倾斜接近90°，毛发蓬乱，活动减少；共济失调：检查期间持续存在，表现为醉酒样步态，毛发蓬乱，活动减少；转圈行为：检查期间持续存在，毛发蓬乱，活动减少；行为表现：小鼠可能出现明显毛发蓬乱或皮肤干燥，体重减轻可能超过15%。在此阶段应为动物提供种子状食物或软食。
- 当小鼠出现以下任一临床体征，提示肿瘤生长已影响其健康状况时，应确定为安乐死终点：体重减轻达到或超过初始体重的20%、重度头部倾斜、重度共济失调、重度转圈行为、嗜睡或呼吸困难。在此阶段，应使用CO2窒息法对小鼠实施人道安乐死。
6. 脑组织的采集
- 通过 CO2 窒息或颈椎脱位的方法人道处死动物。
- 使用剪刀或手术刀沿头皮正中线做一个 2 cm 的切口。小心分离并掀开皮肤，暴露颅骨。
- 使用精细剪刀或手术刀沿颅骨正中线小心地做 2 cm 切口。用镊子从头部后方开始向前方轻轻撬开颅骨。
- 继续沿颅骨两侧剪开，确保不损伤下方的脑组织。颅骨完全打开后，使用镊子和剪刀小心地将脑组织从颅神经和血管上分离。
- 从后向前轻轻将脑组织从颅腔中取出。根据后续实验步骤的要求，将脑组织保存在适当的条件下，例如速冻或固定。不同实验室对脑组织的免疫组织化学分析可能存在差异。增殖细胞标志物 KI67 的典型实验流程已在发表文献中描述20。
结果
使用立体定位仪进行原位注射已成为建立脑肿瘤模型的关键技术。该技术能够精确且可重复地将肿瘤细胞植入特定位置，对于神经肿瘤学研究中获得一致且可靠的数据至关重要。成功实施原位注射在很大程度上依赖于立体定位设备的准确设置，此类设备通常包括立体定位仪框架、用于精确移动的数字显微操作器、注射器以及用于固定动物的麻醉系统（图1A，B）。使用玻璃微量注射器可实现小体积的颅内注射，通常为2–5 µL。为防止生物材料积聚导致注射堵塞，必须对注射器进行妥善维护并频繁清洗（图1C）。
使用立体定位设备在小鼠中进行颅内注射脑肿瘤细胞的步骤包括以下几个关键环节。首先，需对小鼠实施麻醉，以确保其在整个操作过程中保持静止且舒适。判断动物是否已进入麻醉状态的典型征象包括：脚趾受夹时无运动反应和反射消失，以及呼吸节律规则。随后，将小鼠固定于立体定位仪中，使其头部保持稳定位置（图2A）。利用颅骨上的解剖标志点（如前囟bregma和后囟lambda）确定注射的精确坐标。在头皮上做一小切口，并在选定坐标处钻出颅骨孔（图2B）。将连接至立体定位臂的微量注射针经颅骨孔插入，将肿瘤细胞注入目标脑区（如大脑皮层、小脑或脑干；图2C）。通过仔细监测和调整注射针的位置，确保靶向准确。注射完成后，缓慢撤出针头并缝合切口（图2D）。预计颅内注射后的封闭伤口将在两周内愈合。
颅内注射后，需密切监测动物的整体健康状况及神经系统症状的出现，后者常提示肿瘤进展（补充表1）。通常，动物在注射后的第一周内可能会出现轻微的体重下降（最高体重的10%以内），一旦注射部位在第二周末完全愈合，体重通常会趋于稳定nd 周。通常，动物体重稳定增加，整体健康状况良好，直至肿瘤进展。神经学症状的表现因脑肿瘤类型、注射部位和动物品系等因素而异。例如，皮质胶质瘤或室管膜瘤可能出现进行性体重减轻及前脑扩大；而脑干胶质瘤和髓母细胞瘤则可能表现为共济失调和头倾斜，尤其在免疫缺陷动物中更为明显（图3A）。此外，患有脑干肿瘤的动物可能会出现转圈行为，尤其是在NSG或NOD/SCID品系中。神经症状的进展通常伴随逐渐的体重下降。适当的事后护理措施对于保障动物福利至关重要，例如提供带有长管嘴的饮水瓶，或给予软质食物（糊状食物颗粒）及种子。当达到实验终点并对动物实施人道安乐死后，可能观察到脑部的潜在改变，包括注射部位的肿大和/或出血区域的存在（图3B).
Kaplan-Meier 曲线常用于描绘脑肿瘤动物模型的生存结果。它们能够直观展示在颅内注射或抗癌治疗后随时间推移的生存概率。这些曲线是临床前研究中分析和呈现生存数据的关键工具15,27。我们在小鼠小脑中以不同细胞密度进行髓母细胞瘤细胞系 D425 的颅内注射。所有接受颅内注射的动物均成功形成肿瘤。实验结果表明，较高细胞密度（每只小鼠 50,000 和 100,000 个细胞）的成瘤速度明显快于每只小鼠 10,000 个细胞的组别（图 4）。此外，我们将来源于患者的高级别胶质瘤（HGG）细胞分别注射至大脑皮层和脑干，以比较在不同解剖位置中总体生存期、肿瘤生长模式以及免疫组织化学特征。无论注射部位如何，所有接受颅内注射的动物均形成了肿瘤。HGG 细胞的培养按照步骤 1.1 至 1.10 中详述的方案进行。细胞用于颅内注射前的准备操作见步骤 2.1 至 2.6，而颅内注射过程则遵循步骤 4.1 至 4.16 所述方法27。当 HGG 细胞被注射至皮层时，动物的中位生存期约为颅内注射后 25 天（图 5A）。动物的监测按照步骤 5.1 至 5.4 进行。这些动物未表现出任何神经系统症状，但出现进行性体重下降。当动物达到步骤 5.5 所述的人道终点时，实施安乐死。脑组织按照步骤 6.1 至 6.5 所述方案采集，并送后续分析27。免疫组织化学分析显示，存在一个体积较大、核密集的肿瘤团块，伴有血管生成增加的证据（图 5B），以及大量增殖性 Ki67 阳性细胞（图 5C）。当 HGG 细胞被注射至脑干时，动物的中位生存期约为颅内注射后 26 天（图 5D）。免疫组织化学分析显示，在第四脑室/脑桥上部区域存在较大的肿瘤团块，并伴有向侧脑室的软脑膜浸润（图 5E）。进一步的免疫组织化学分析显示，在脑干及其他浸润区域存在大量增殖性细胞（图 5F）。本实验表明，将相同的肿瘤细胞注射至不同的解剖位置，并不会显著影响肿瘤的生长速率，尽管在生长模式上可观察到一些差异。
图1：脑内注射脑肿瘤细胞的立体定位装置示意图。（A）麻醉装置通常放置在生物安全柜旁，需同时向诱导室和立体定位仪输送麻醉气体。（B）玻璃微量注射器清洗站及立体定位夹持器；每次脑内注射后，注射器需依次用生理盐水、乙醇和水冲洗。（C）置于生物安全柜内的立体定位装置，显示了麻醉室、钻孔机、立体定位仪、立体定位坐标控制台、棉签、手术刀、镊子、移液器及吸头。请点击此处查看该图的放大版本。
图2：对免疫缺陷小鼠进行颅内注射的代表性图像。（A）动物被麻醉后置于麻醉罩中。（B）皮肤切口后，使用耳杆将皮肤固定于两侧。（C）玻璃微量注射器位于钻孔上方，准备注射。（D）皮肤粘合后形成莫霍克发型样外观。请点击此处查看该图的放大版本。
图3：脑肿瘤细胞移植后观察到的潜在神经系统症状。（A）在脑干注射弥漫性中线胶质瘤（DMG）细胞后出现头部倾斜的小鼠。（B）右侧大脑皮层半球增大，注射侧可见肿瘤形成，该动物被注射了室管膜瘤细胞。请点击此处查看该图的放大版本。
图 4：不同细胞密度下髓母细胞瘤 D425 细胞系的移植成瘤情况。 使用立体定位仪将髓母细胞瘤细胞以 10,000 个细胞/2 µL ECM 水凝胶、50,000 个细胞和 100,000 个细胞的密度颅内注射。动物体重持续监测，当体重下降至其记录最高体重的 20% 以下时，实施人道安乐死。注射 10,000 个细胞组动物的中位生存期为 29 天，而注射 50,000 和 100,000 个细胞组的中位生存期分别为 17.5 天和 15 天。本研究中所有注射动物均成功形成肿瘤。请点击此处查看该图的放大版本。
图 5：在大脑皮层和脑干内颅内注射HGG细胞的NSG动物的代表性生存曲线及组织学分析。约100,000个HGG细胞（第3代）使用立体定位设备注入2 µL ECM水凝胶中。动物被持续监测是否出现进行性体重下降，并在其体重降至最高记录值以下20%时实施人道安乐死。该脑肿瘤亚型未观察到神经系统症状。（A）注射HGG细胞至大脑皮层的动物中位生存期约为注射后25天（N=2）。（B）大脑皮层的H&E染色显示高密度细胞核区域，并伴有血管化增加，表现为红细胞的存在。（C）大脑皮层的肿瘤移植区域显示出高水平的增殖细胞，KI67染色结果证实了这一点。（D）注射HGG细胞至脑干的动物中位生存期约为注射后26天（N=2）。本研究中所有注射动物均成功形成肿瘤。（E）脑干的H&E染色显示高密度细胞核区域，且在侧脑室的软脑膜中观察到肿瘤浸润。（F）脑干的肿瘤移植区域显示出高水平的增殖细胞，如KI67染色所示。主图中的黑色标尺表示2 mm，放大插图中的标尺表示20 µm。 请点击此处查看该图的放大版本。
补充表 1：用于监测颅内注射后动物状况及潜在抗癌药物治疗的检查记录表。请点击此处下载该表格。
讨论
尽管本研究中详述的颅内注射技术为建立儿童脑肿瘤的原位患者来源异种移植（PDX）模型提供了一种可靠的方法，但仍有一些方面需要改进。其中一种改进技术的方法是优化肿瘤细胞的制备过程，包括改进用于肿瘤细胞移植的材料。虽然ECM水凝胶被认为是金标准，但使用成分更接近脑组织或肿瘤ECM的水凝胶可能有助于提高脑肿瘤（BT）细胞的存活率和移植成功率。这种方法尤其有利于移植周期较长的肿瘤类型，例如髓母细胞瘤和室管膜瘤。例如，已有研究表明胶原蛋白在3型髓母细胞瘤的生长中起关键作用，而层粘连蛋白则支持SHH型髓母细胞瘤28。此外，ECM的刚度也可能影响肿瘤的生长。例如，高级别胶质母细胞瘤的核心区域比正常脑组织更坚硬，这种较高的刚度可能促进肿瘤的生长与存活29。通过根据不同类型肿瘤的特定需求定制ECM的成分和刚度，有望显著改善PDX模型的移植效率和生长特性。
最近几项研究为患者肿瘤样本的处理以及PDX模型的建立提供了宝贵的见解。Tsoli等人指出，与原代培养相比，DMG组织的直接移植通常具有更高的成瘤率15。Smith等人通过将脑肿瘤活检或尸检样本进行颅内注射，成功建立了37个PDX模型，总体成功率为43%，其中高级别胶质瘤（HGG）的成瘤率最高（100%），其次是髓母细胞瘤（45%）和室管膜瘤（25%）。肿瘤潜伏期差异较大，从1至11个月不等，更具侵袭性的肿瘤成瘤更快11。相比之下，Brabetz等人报告的总体成功率为30%，其中HGG的成瘤率为31%，髓母细胞瘤为37%，室管膜瘤为17%16。尽管存在这些差异，Smith等人和Brabetz等人最近的两项研究均证实，PDX模型在免疫组织化学和分子水平上总体上能够再现患者原发肿瘤的特征，尽管在原始肿瘤样本与所建立的模型之间观察到轻微的基因组差异。这些发现强调了构建代表性PDX模型所面临的挑战，并凸显了不同类型肿瘤在移植成功率上的变异性11,16。
原位移植方法的一个显著局限性在于，除非使用成像系统（例如Xenogen成像系统，在肿瘤细胞标记了荧光素酶的情况下）或磁共振成像（MRI），否则无法准确测量肿瘤大小。通过用荧光素酶标记肿瘤细胞，可实现生物发光成像，从而非侵入性地确认移植成功并监测肿瘤进展，这可能提供一种解决方案。该方法将增强动态追踪治疗反应的能力，从而更精确地评估治疗效果17,30。另一种方法是利用MRI技术；然而，肿瘤的可检测性取决于其大小。较大的肿瘤更容易被识别，而这通常出现在实验终点。此外，检测效果也可能因肿瘤亚型而异，胶质母细胞瘤（GBM）比弥漫性胶质瘤更容易被检测到27,31。特别是对于弥漫性胶质瘤，血脑屏障（BBB）的完整性导致缺乏对比增强效应。然而，在GBM中，渗漏的血管结构和水肿的存在可增强肿瘤组织与周围健康脑组织之间的对比度，从而可能有助于检测过程。通常，需要使用对比剂来提高检测灵敏度30,31,32。有时也采用其他成像技术，如扩散加权成像（DWI）和液体衰减反转恢复（FLAIR），以改善对无强化区域肿瘤的检测。然而，这些方法同样存在局限性，可能无法始终精确界定肿瘤边界33。酰胺质子转移加权（APTw）成像是一个非侵入性的MRI技术，通过追踪蛋白质-水之间的质子交换来检测弥漫性胶质瘤，有助于肿瘤分级。尽管该技术前景良好，但仍面临易受伪影干扰等挑战，且尚未适用于小动物成像，限制了其更广泛的应用34。
在利用原位脑肿瘤PDX模型进行药物疗效研究时，另一个需要考虑的关键因素是所用PDX模型中血脑屏障（BBB）的完整性。BBB的通透性显著影响药物在脑肿瘤治疗中的递送效率和疗效。例如，脑干胶质瘤中维持完整的BBB通常导致药物穿透性差，从而限制了全身性治疗的效果17。相反，在3型髓母细胞瘤中，MRI成像显示BBB完整性具有异质性，且在患者来源的异种移植（PDX）模型中也发现其具有类似的渗漏特征35。因此，明确每个PDX模型中BBB的状态——即其是否完整或渗漏——对于制定合理的治疗策略以及准确解读药物疗效研究结果至关重要。
总体而言，文中所述的颅内注射方法为建立儿童脑肿瘤患者来源的异种移植模型以及开展治疗药物的药效学研究提供了一种可靠的手段。随着技术的不断优化，并结合对这些模型的深入理解，将进一步提升其应用价值，推动针对儿童脑肿瘤患者的治疗干预措施的开发。
披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
作者感谢悉尼儿童医院网络、悉尼儿童肿瘤库网络以及零儿童癌症项目中的患者、临床医生和研究人员，他们慷慨提供了建立本方法所需的关键样本。澳大利亚儿童癌症研究所隶属于新南威尔士大学悉尼校区和悉尼儿童医院网络。本方案的研究工作获得了澳大利亚国家卫生与医学研究委员会（协同资助项目 #2019056，DZ 获得的领导力资助项目 APP2017898）以及新南威尔士癌症研究所项目资助（TPG2037，由 DZ 和 MT 获得）的支持，同时也得到了 Levi’s Project、The Kids Cancer Project、The Cure Starts Now、DIPG Collaborative、Cure Brain Cancer Foundation、The Robert Connor Dawes Foundation 和 The Benny Wills Foundation 的资助。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 麻醉剂（例如异氟烷） | Merck | 792632 | |
| 100% 乙醇 | Merck | 459844 | |
| 70% 乙醇 | NA | NA | 用无菌水稀释100%乙醇制备70%乙醇 |
| 80% 乙醇 | NA | NA | 用无菌水稀释100%乙醇制备80%乙醇 |
| 粘附性显微镜载玻片 | Merck | Z681156 | |
| 镇痛剂（布托啡诺 0.3 mg/mL） | Jurox | NA | |
| 碳过滤罐 | Vet Equip | 931401 | |
| 15 mL 锥形管（Falcon） | Fisher Scientific | 14-959-53A | |
| 50 mL 锥形管（Falcon） | Fisher Scientific | 14-432-22 | |
| DMSO | Merck | 472301 | |
| 耳杆 | Kopf | 1921 | |
| ECM水凝胶（Matrigel，Corning） | Merck | E1270 | |
| 眼膏（Poly Visc） | ChemistDirect | 719986 | |
| 胎牛血清 | Merck | F0926 | |
| 玻璃微量注射器 | Hamilton | 7002 | |
| 异丙醇擦拭巾 | Medisa | SUL_LWMS-1 | |
| KI67 抗体 | Abcam | ab209897 | |
| 微量离心管 | Eppendorf | 211-2130 | |
| 微型钻头 0.028” | Kopf | 8170 | |
| 微量注射装置 | Kopf | 5004 | |
| PBS | Merck | P4474 | |
| 10 mL 移液器 | Corning | CLS4488 | |
| 1 mL 移液器 | Eppendorf | 3123000063 | |
| 200 μL 移液器 | Eppendorf | 3123000055 | |
| 20 μL 移液器 | Eppendorf | 3123000098 | |
| 25 mL 移液器 | Corning | CLS4489 | |
| 1 mL 移液器吸头 | Corning | CLS4868 | |
| 200 μL 移液器吸头 | Corning | CLS4860 | |
| 聚山梨酯20洗涤剂（F10SC） | Health and Hygiene | G3070 | |
| 脉搏血氧仪（MouseSTAT） | Kent Scientific | SPO2-MSE | |
| 碘伏（聚维酮碘） | Merck | Y0000466 | |
| 手术刀（一次性） | Medisa | SUL_SCALPEL | |
| 皮肤胶 Vetbond | Medisa | 3M_1469SB | |
| 带数字显示控制台的小动物立体定位仪 | Kopf | 940 | |
| 立体定位钻 | Kopf | 1474 | |
| 体温监测系统 | Harvard Apparatus | 55-7020 | |
| 台盼蓝 | Merck | 93595 |
参考文献
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