本实验方案为生物信息学初学者提供了一个入门级的CUT&RUN分析流程，帮助用户完成CUT&RUN测序数据的初步分析与验证。完成此处描述的分析步骤，并结合后续的峰注释分析，用户可深入理解染色质调控的分子机制。
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本文内容
摘要
摘要
CUT&RUN 技术有助于检测全基因组范围内的蛋白质-DNA 相互作用。CUT 的典型应用&RUN 包括组蛋白尾部修饰变化的分析或转录因子染色质占位的定位。CUT 的广泛应用&RUN 的应用在一定程度上得益于其相较于传统 ChIP-seq 的技术优势，包括更低的细胞起始量需求、更低的测序深度要求，以及由于无需使用交联剂（此类试剂可能遮蔽抗体表位）而带来的背景信号降低和灵敏度提升。CUT 的广泛应用&RUN 还得益于 Henikoff 实验室慷慨分享试剂，以及商业试剂盒的开发，从而加快了初学者对该技术的采用。随着 CUT&RUN 增加，CUT&RUN测序分析与验证已成为主要瓶颈，必须克服这些障碍才能实现以湿实验为主的团队对CUT的全面采用&RUN分析通常从对原始测序读长进行质量控制检查开始，以评估测序深度、读长质量及潜在的偏差。随后将读长比对至参考基因组序列组装，再利用多种生物信息学工具对蛋白质富集的基因组区域进行注释，确认数据的可解释性，并得出生物学结论。尽管存在多种 计算机模拟 分析流程已开发用于支持 CUT&RUN 数据分析中，由于其复杂的多模块结构以及使用多种编程语言，这些平台对于缺乏多种编程语言背景但希望理解 CUT 的生物信息学初学者而言较为困难&RUN 分析流程并自定义其分析流程。在此，我们提供一种单语言逐步的 CUT&适用于各种生物信息学经验水平用户的RUN分析流程方案。本方案包括完成关键的质量控制检查，以验证测序数据是否适合进行生物学解释。我们预期，结合本文提供的入门级方案及后续的峰注释分析，用户能够从自身的CUT&RUN 数据集
引言
测量蛋白质与基因组DNA之间相互作用的能力，对于理解染色质调控的生物学机制至关重要。能够有效检测特定蛋白质在染色质上占据情况的实验方法，至少可提供两方面的关键信息：i）基因组定位位置；ii）特定基因组区域中该蛋白质的丰度。追踪目标蛋白质在染色质上的招募过程及其定位变化，有助于揭示该蛋白质的直接靶位点，并阐明其在基于染色质的生物学过程中（如转录调控、DNA修复或DNA复制）所发挥的分子机制作用。目前可用的蛋白质-DNA相互作用分析技术，使研究人员能够以前所未有的分辨率探索基因调控机制。这些技术进步得益于新型染色质分析技术的出现，其中包括Henikoff实验室开发的“靶位切割与核酸酶释放技术”（Cleavage Under Targets and Release Using Nuclease, CUT&RUN）。与传统的染色质免疫沉淀（ChIP）技术相比，CUT&RUN具有多项技术优势，包括更低的细胞用量需求、更低的测序深度要求，以及更高的灵敏度和更低的背景信号——这主要归因于该方法无需使用交联剂，从而避免了交联剂对抗体表位的遮蔽效应。采用该技术研究染色质调控，需要深入理解其技术原理，并掌握CUT&RUN数据的分析、验证与解读方法。
CUT&RUN 实验流程首先将细胞与刀豆球蛋白A（Concanavalin A）偶联的磁珠结合，从而在整个实验过程中实现对少量细胞的操作。分离的细胞通过温和去污剂进行通透化处理，以促进靶向目标蛋白的抗体进入。随后，利用与微球菌核酸酶（MNas....
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方案
注意：GSE126612 中 CUT&RUN fastq 文件的信息见表1。本研究中所用软件的相关信息列于材料表中。
1. 从其 Github 页面下载 Easy-Shells_CUTnRUN 流程
- 从操作系统中打开终端。
注意：如果用户不确定如何在 macOS 和 Windows 中打开终端，请查阅此网页（https://discovery.cs.illinois.edu/guides/System-Setup/terminal/）。对于 Linux 系统，请查阅此网页（https://www.geeksforgeeks.org/how-to-open-terminal-in-linux/）。 - 在终端中输入以下命令，从 Github 下载压缩的分析流程：wget https://github.com/JunwooLee89/Easy-Shells_CUTnRUN/archive/refs/heads/main.zip -O ~/Desktop/Easy-Shells_CUTnRUN.zip。
- 下载完成后，在终端中输入以下命令解压下载的 zip 文件：unzip ~/Desktop/Easy-Shells_CUTnRUN.zip -d ~/Desktop....
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结果
质量过滤与接头修剪可保留高测序质量的读段
高通量测序技术容易产生测序错误，例如读段中的序列“突变”。此外，由于文库构建过程中接头去除不充分，测序数据中可能富集接头二聚体。过多的测序错误，如读段突变、产生短于有效比对所需长度的读段，以及接头二聚体的富集，会增加读段比对时间，并可能导致假阳性比对结果，从而干扰下游生物信息学分析。因此，必须进行质量过滤和接头修剪，以保留高质量读段用于后续分析与解读。
为了在分析中保留高质量的测序读段，本 CUT&RUN 分析流程（图2）采用了 FastQC26 和 Trim Galore27。shell 脚本“Script_03_fastQC.sh”会对工作目录中的所有 fastq 文件运行 FastQC。使用来自 GSE126612（SRR8581589）的公开 CTCF CUT&RUN 数据集进行该步骤的结果（
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讨论
绘制蛋白质在染色质上占据情况的能力对于开展染色质生物学领域的机制研究至关重要。随着实验室采用新的湿实验技术对染色质进行分析，对这些湿实验产生的测序数据进行分析的能力已成为湿实验科研人员常见的瓶颈。因此，我们描述了一项入门级的分步操作方案，旨在帮助生物信息学初学者克服分析瓶颈，启动对其自身CUT&RUN测序数据的分析及质量控制检查。
本CUT&RUN分析方案描述了多个步骤的应用，以确保对真实信号进行定量。从原始测序数据中去除低质量读段和接头序列是质量控制的首要步骤之一，也是获得准确分析结果最关键的步骤之一。因此，本分析流程包含了使用Trim-galore程序进行简便的质量和接头序列修剪的步骤27。鉴于该步骤的重要性，本分析流程还包含了在修剪处理前（步骤4.3）和修剪处理后（步骤5.3）比较结果质量的步骤（步骤5.5）。除了质量与接头序列修剪外，本分析流程还去除了非典型染色体读段、TA重复区域以及黑名单区域，这些因素可能引入GC含量偏差或导致假阳性峰（称为峰）。这些过滤步骤为生物信息学初学者提供了一个合适的入门流程，有助于.......
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披露
作者声明无利益冲突。
致谢
所有插图均使用 BioRender.com 制作。CAI 感谢卵巢癌研究联盟早期职业研究者奖、Forbeck 基金会加速器资助以及明尼苏达卵巢癌联盟国家早期检测研究奖提供的支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| bedGraphToBigWig | ENCODE | https://hgdownload.soe.ucsc.edu/admin/exe/ | 将读取计数 bedGraph 压缩并转换为 bigWig 的软件 |
| bedtools-2.31.1 | 犹他大学 Quinlan 实验室 | https://bedtools.readthedocs.io/en/latest/index.html | 用于处理 bam/bed/bedGraph 文件的软件 |
| bowtie2 2.5.4 | 约翰斯·霍普金斯大学 | https://bowtie-bio.sourceforge.net/bowtie2/index.shtml | 用于构建bowtie索引并执行比对的软件 |
| CollectInsertSizeMetrics（Picard） | 布罗德研究所 | https://github.com/broadinstitute/picard | 用于插入片段大小分布分析的软件 |
| Cutadapt | NBIS | https://cutadapt.readthedocs.io/zh/stable/index.html | 用于执行接头序列修剪的软件 |
| Deeptoolsv3.5.1 | 马克斯·普朗克研究所 | https://deeptools.readthedocs.io/en/develop/index.html | 用于执行皮尔逊相关系数分析、主成分分析以及热图/平均值图分析的软件 |
| FastQC 版本 0.12.0 | 巴布拉汉生物信息学 | https://github.com/s-andrews/FastQC | 检查 fastq 文件质量的软件 |
| Intervene v0.6.1 | 计算生物学 &基因调控 - Mathelier 小组 | https://intervene.readthedocs.io/en/latest/index.html | 用于使用峰文件进行维恩图分析的软件 |
| MACSv2.2.9.1 | 陈-扎克伯格倡议 | https://github.com/macs3-project/MACS/tree/macs_v2 | 用于识别峰的软件 |
| MACSv3.0.2 | 陈-扎克伯格倡议 | https://github.com/macs3-project/MACS/tree/master | 用于识别峰的软件 |
| Samtools-1.21 | 威康桑格研究所 | https://github.com/samtools/samtools | 处理 sam/bam 文件的软件 |
| SEACRv1.3 | 霍华德·休斯医学研究所 | https://github.com/FredHutch/SEACR | 用于识别峰的软件 |
| SRA Toolkit 版本 3.1.1 | NCBI | https://github.com/ncbi/sra-tools | 从 GEO 下载 SRR 的软件 |
| Trim_Galore v0.6.10 | 巴布拉汉生物信息学 | https://github.com/FelixKrueger/TrimGalore | 用于执行质量控制和接头序列修剪的软件 |
参考文献
- Hainer, S. J., Fazzio, T. G. High-resolution chromatin profiling using CUT&RUN. Curr Protoc Mol Biol. 126 (1), e85(2019).
- Zhang, Y., et al. Model-based analysis of ChiP-Seq (MACS). Genome Biology. 9 (9), R137(2008).
- Xu, S., Grullon, S., Ge, K., Peng, W.
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重印与许可
