利用化学方法结合流式细胞术检测嘌呤霉素掺入以研究淋巴细胞代谢的方法

摘要

该方案展示了一种基于化学方法的流式细胞术，用于研究细胞中的能量代谢。

摘要

抗原刺激后，初始T细胞会迅速增殖并扩增为效应T细胞。代谢在这些快速增殖细胞所需生物大分子的生成以及效应T细胞分化和功能所需分子的产生过程中发挥重要作用，从而影响感染或癌症中适应性免疫应答的结果。初始T细胞在抗原刺激后会重编程其代谢途径，以增加ATP的生成，从而支持其生长、生物合成及效应功能。细胞内的ATP可通过线粒体氧化磷酸化（OXPHOS）途径或糖酵解途径产生。由于分裂和生长中的细胞所产生的大部分ATP被用于蛋白质合成，因此蛋白质合成常被用作ATP水平的替代指标。蛋白质合成可通过嘌呤霉素掺入法进行检测，嘌呤霉素可模拟携带修饰酪氨酸的tRNA的3′腺苷，导致蛋白质翻译的自发终止。代谢抑制剂如2-脱氧葡萄糖（2DG）（可阻断糖酵解途径）和寡霉素（O）（可阻断电子传递链（ETC）复合体5）可与蛋白质合成评估联用，以研究细胞ATP生成对这两种途径的依赖性，该方法称为SCENITH。本文描述了该方法的一种变体，即通过基于化学反应的流式细胞术检测嘌呤霉素的掺入。这种研究代谢的方法相对简便，可用于通过流式细胞术评估稀有细胞群体以及患者样本。

引言

近年来，人们日益认识到代谢在调控T细胞功能中的重要作用。细胞代谢调控淋巴细胞的多种关键功能，包括病原体特异性T细胞的克隆扩增及其向效应细胞亚群的分化，后者可合成多种效应分子，如炎症性细胞因子和杀灭病原体所需的细胞溶解性颗粒酶¹。因此，研究T细胞代谢不仅对评估T细胞正常功能具有重要意义，也为潜在治疗策略的开发提供了基础。

初始T细胞在代谢上处于静息状态，依赖分解代谢和氧化磷酸化（OXPHOS）来满足其能量需求^1,2。当T细胞受体（TCR）被激活后，T细胞会迅速发生代谢重编程，部分原因是细胞表面营养物质转运蛋白的上调，从而增加葡萄糖和多种氨基酸（包括谷氨酰胺）从环境中摄取。这些营养物质作为合成代谢途径的原料，用于合成大分子，促进细胞生长，并满足因细胞生长和分裂增加而提升的能量需求^1,2,3。活化T细胞中的代谢重编程使其对有氧糖酵解和谷氨酰胺分解的依赖性增强，以满足其能量需求^1,2,

方案

动物饲养和实验均依照美国国立卫生研究院（NIH）国家人类基因组研究所动物使用与护理委员会批准的方案G98-3，以及美国国立卫生研究院过敏与传染病研究所动物护理与使用委员会批准的方案LISB 22E进行。本研究使用6至12周龄的雄性C57Bl/6J小鼠，这些小鼠在特定病原体阴性（SPF）条件下繁殖和饲养。使用雌性小鼠也获得了类似结果。人全血来自美国国立卫生研究院临床中心血库，采集依据经该院机构审查委员会（IRB）批准的方案99-CC-0168《健康供者血液成分的采集与分发用于体外研究》。所有受试者均按照《赫尔辛基宣言》的要求签署知情同意书。

1. 小鼠初始型CD4⁺ T细胞的分离与培养

1. 使用磁性细胞分离系统，按照制造商的说明书，从6至12周龄雄性小鼠的脾脏或淋巴结混合单细胞悬液中通过阴性选择法纯化初始型CD4⁺ T细胞。
2. 将细胞在IMDM培养基中培养（如下所述），培养基中含有L-丙氨酰-L-谷氨酰胺二肽，并添加10%胎牛血清、2 mM L-谷氨酰胺、100 U/mL青霉素、100 U/mL链霉素和0.05 mM 2-β-巯基乙醇。
3. 将初始型CD4 T细胞与经丝裂霉素C处理的T细胞耗竭型脾细胞（如下所述）以1:8的比例共同培养，后者作为抗原呈递细胞（APC），在48孔板中分别在非极化条件（1 µg/mL抗CD3抗体[克隆2C11]和3 µg....

结果

从 小鼠的脾脏和淋巴结中分离出初始型 CD4⁺ T 细胞，并在体外诱导其分化为 Th0 或非极化（NP）细胞系，培养 72 小时。分别在培养 0 小时、48 小时和 72 小时后收集细胞，通过检测 OPP 掺入的平均荧光强度（MFI）来评估蛋白质合成活性。图 3 显示，初始型 CD4⁺ T 细胞的合成活性低于活化 T 细胞，表现为 OPP 的 MFI 较低。初始型细胞对糖酵解有一定依赖性，但更主要依赖氧化磷酸化（OXPHOS）通路，该结论基于 OPP 掺入的 MFI 及其倍数变化得出。若将对照组（Co）设为 100%，则阻断糖酵解使蛋白质合成水平降至对照组的 60%；而阻断 OXPHOS 通路则进一步将其降低至 45%。

活化后，CD4⁺ T 细胞的蛋白质合成增加，这由 MFI 升高所证实（图 3），并且这些细胞对糖酵解途径的依赖性增强；抑制糖酵解可使这些细胞的蛋白质合成水平降低一半。相比之下，在活.......

讨论

本文提供了一种基于SCENITH技术、通过掺入嘌呤霉素的化学标记来利用流式细胞术研究淋巴样细胞代谢的方法。尽管我们主要关注淋巴细胞，但该方案可调整用于研究任何细胞类型的代谢。该方法在研究稀有细胞群体和患者样本的代谢时也具有优势，而其他技术（如Seahorse）则需要更多的细胞数量。

该实验方案中的一个关键步骤是确保细胞、抑制剂及所有使用的试剂均处于室温，除非另有说明。在冰箱中放置过久的细胞应在37 °C孵育，直至细胞达到生理温度。理想情况下，在开始实际实验前，应将细胞、抑制剂及其他试剂提前放入培养箱中孵育一段时间。

该方法也可进行修改，以联合 OPP 染色对细胞内蛋白质进行染色。在本示例中，我们对细胞进行了表面标记以研究 CD4⁺ T 细胞的代谢，但未区分其中存在的不同效应 CD4⁺ T 细胞亚群。若对该方案进行改进，增加更多标记物并可能加入细胞内染色步骤，则可扩大可分析的亚群范围。在此情况下，我们建议在完成 OPP 染色后，使用固定和透化缓冲液进行细胞内染色，随后对特定蛋白进行细胞.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
2-巯基乙醇	Thermo Fisher	21985-023
Alexa Fluor 488 抗嘌呤霉素抗体	Biolegend	381506	使用稀释度：1/100
Alexa Fluor 647 抗人 CD4 抗体	Biolegend	357422	使用稀释度： 1/50
BD Horizon BUV737 大鼠抗小鼠 CD4	BD Biosciences	612761	使用稀释度： 1/200
Click-iT Plus OPP Alexa Fluor 488 蛋白质合成检测试剂盒	Thermo Fisher	C10456
HEPES (1 M)	Thermo Fisher	15630080
人血清	Millipore Sigma	H4522
IMDM，含 GlutaMAX 添加剂，500 ml	Thermo Fisher	31980030
InVivoMAb 抗小鼠 CD28，克隆： 37.51	BioXcell	BE0015-1
InVivoMAb 抗小鼠 CD3ε，克隆： 145-2C11	BioXcell	BE0001-1
InVivoMAb 抗小鼠 IFNγ，克隆： XMG1.2	BioXcell	BE0055
InVivoMAb 抗小鼠 IL-12 p40，克隆： C17.8	BioXcell	BE0051
InVivoMAb 抗小鼠 IL-4，克隆： 11B11	BioXcell	BE0045
L-谷氨酰胺 (200 mM)	Thermo Fisher	25030081
LIVE/DEAD 可固定 Aqua 死细胞染色试剂盒（适用于 405 nm 激发）	Thermo Fisher	L34966	使用稀释度： 1/600
LSM 淋巴细胞分离液	MP Biomedicals	50494X
MEM 非必需氨基酸溶液 (100X)	Thermo Fisher	11140050
来自棘孢小单孢菌的丝裂霉素 C	Sigma	M0503-10X2MG
小鼠初始 CD4+ 细胞分离试剂盒	Miltenyi Biotec	130-104-453
16% 电子显微镜级水溶液甲醛	Electron Microscopy Sciences	15710
PBS (1X)，pH 7.4，500 mL	Quality Biologicals	114-058-101
青霉素-链霉素 (10,000 U/mL)，100 mL	Thermo Fisher	15140122
植物血凝素-L (PHA-L)	Millipore Sigma	11249738001
优质胎牛血清 (FBS)	Avantor	97068-085
RPMI 1640 培养基，不含谷氨酰胺	Thermo Fisher	21870076
皂苷	Thermo Fisher	A18820.22
丙酮酸钠 (100 mM)	Thermo Fisher	11360070