该方案展示了一种基于化学方法的流式细胞术，用于研究细胞中的能量代谢。
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摘要
摘要
抗原刺激后，初始T细胞会迅速增殖并扩增为效应T细胞。代谢在这些快速增殖细胞所需生物大分子的生成以及效应T细胞分化和功能所需分子的产生过程中发挥重要作用，从而影响感染或癌症中适应性免疫应答的结果。初始T细胞在抗原刺激后会重编程其代谢途径，以增加ATP的生成，从而支持其生长、生物合成及效应功能。细胞内的ATP可通过线粒体氧化磷酸化（OXPHOS）途径或糖酵解途径产生。由于分裂和生长中的细胞所产生的大部分ATP被用于蛋白质合成，因此蛋白质合成常被用作ATP水平的替代指标。蛋白质合成可通过嘌呤霉素掺入法进行检测，嘌呤霉素可模拟携带修饰酪氨酸的tRNA的3′腺苷，导致蛋白质翻译的自发终止。代谢抑制剂如2-脱氧葡萄糖（2DG）（可阻断糖酵解途径）和寡霉素（O）（可阻断电子传递链（ETC）复合体5）可与蛋白质合成评估联用，以研究细胞ATP生成对这两种途径的依赖性，该方法称为SCENITH。本文描述了该方法的一种变体，即通过基于化学反应的流式细胞术检测嘌呤霉素的掺入。这种研究代谢的方法相对简便，可用于通过流式细胞术评估稀有细胞群体以及患者样本。
引言
近年来，人们日益认识到代谢在调控T细胞功能中的重要作用。细胞代谢调控淋巴细胞的多种关键功能，包括病原体特异性T细胞的克隆扩增及其向效应细胞亚群的分化，后者可合成多种效应分子，如炎症性细胞因子和杀灭病原体所需的细胞溶解性颗粒酶1。因此，研究T细胞代谢不仅对评估T细胞正常功能具有重要意义，也为潜在治疗策略的开发提供了基础。
初始T细胞在代谢上处于静息状态，依赖分解代谢和氧化磷酸化（OXPHOS）来满足其能量需求1,2。当T细胞受体（TCR）被激活后，T细胞会迅速发生代谢重编程，部分原因是细胞表面营养物质转运蛋白的上调，从而增加葡萄糖和多种氨基酸（包括谷氨酰胺）从环境中摄取。这些营养物质作为合成代谢途径的原料，用于合成大分子，促进细胞生长，并满足因细胞生长和分裂增加而提升的能量需求1,2,3。活化T细胞中的代谢重编程使其对有氧糖酵解和谷氨酰胺分解的依赖性增强，以满足其能量需求1,2,3。TCR刺激后，营养物质的摄取还在激活下游分子通路中发挥关键作用3。例如，氨基酸的摄取及局部氨基酸浓度的升高可激活mTORC1信号通路4。相反，降低细胞内氨基酸的可用性会削弱mTORC1信号通路的活性2,3,5,6,7。因此，在效应T细胞中，代谢与细胞功能密切相关。
快速分裂的T细胞所需的大量生物量增加，需要上调蛋白质合成/翻译过程8。通过研究嘌呤霉素的掺入情况，可以量化细胞内的蛋白质合成水平9，嘌呤霉素是一种酪氨酰-tRNA类似物，可通过掺入、标记并释放正在翻译的核糖体上的延伸多肽链，从而阻断翻译过程9。蛋白质翻译是一个高度依赖能量的过程；事实上，分裂和生长中的细胞所产生的大部分ATP都用于蛋白质合成。因此，蛋白质合成已被用作细胞ATP水平的替代性测量指标10。细胞通常依赖糖酵解和/或线粒体氧化磷酸化（OXPHOS）途径来生成ATP11。每分子葡萄糖通过糖酵解可产生2分子ATP。而OXPHOS途径每分子葡萄糖可产生36分子ATP12,13，但糖酵解生成ATP的速度更快14。因此，与癌细胞类似，快速分裂的活化T细胞在ATP生成方面高度依赖糖酵解途径。
可通过使用特异性抑制剂来研究细胞对每条代谢通路的依赖性。糖酵解途径抑制剂2-脱氧葡萄糖（2-DG）是一种葡萄糖类似物，可作为糖酵解酶己糖激酶的竞争性抑制剂15。2-DG被己糖激酶磷酸化为2DG-磷酸（2DG-P）。2DG-P不能被磷酸己糖异构酶进一步代谢，而该酶通常将葡萄糖-6-磷酸（G-6-P）转化为果糖-6-磷酸16。因此，2DG-P在细胞内被滞留并积累，导致糖酵解受抑以及细胞ATP耗竭，从而阻断蛋白质合成17。类似地，可通过使用寡霉素（Oligomycin）来研究细胞对线粒体氧化磷酸化（OXPHOS）通路的依赖性，寡霉素可结合电子传递链（ETC）中ATP合酶的质子通道18，从而抑制线粒体ATP的合成（图1）。将这些抑制剂与蛋白质合成评估相结合，可揭示细胞的代谢状态，并已被应用于一种名为SCENITH的强大单细胞方法中，该方法通过流式细胞术检测嘌呤霉素的掺入情况10。然而，SCENITH试剂的可获得性可能受限。其他常用于评估糖酵解和OXPHOS的技术包括Seahorse细胞外通量分析，但该方法需要较多的细胞数量，可能在实验上难以实现。本文中，我们描述了一种利用 commercially available Click-it 化学试剂检测嘌呤霉素掺入的替代方法。该方法操作简便，可快速评估淋巴细胞的代谢状态，包括稀有细胞群体及患者样本。
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方案
动物饲养和实验均依照美国国立卫生研究院（NIH）国家人类基因组研究所动物使用与护理委员会批准的方案G98-3，以及美国国立卫生研究院过敏与传染病研究所动物护理与使用委员会批准的方案LISB 22E进行。本研究使用6至12周龄的雄性C57Bl/6J小鼠，这些小鼠在特定病原体阴性（SPF）条件下繁殖和饲养。使用雌性小鼠也获得了类似结果。人全血来自美国国立卫生研究院临床中心血库，采集依据经该院机构审查委员会（IRB）批准的方案99-CC-0168《健康供者血液成分的采集与分发用于体外研究》。所有受试者均按照《赫尔辛基宣言》的要求签署知情同意书。
1. 小鼠初始型CD4+ T细胞的分离与培养
- 使用磁性细胞分离系统，按照制造商的说明书，从6至12周龄雄性小鼠的脾脏或淋巴结混合单细胞悬液中通过阴性选择法纯化初始型CD4+ T细胞。
- 将细胞在IMDM培养基中培养（如下所述），培养基中含有L-丙氨酰-L-谷氨酰胺二肽，并添加10%胎牛血清、2 mM L-谷氨酰胺、100 U/mL青霉素、100 U/mL链霉素和0.05 mM 2-β-巯基乙醇。
- 将初始型CD4 T细胞与经丝裂霉素C处理的T细胞耗竭型脾细胞（如下所述）以1:8的比例共同培养，后者作为抗原呈递细胞（APC），在48孔板中分别在非极化条件（1 µg/mL抗CD3抗体[克隆2C11]和3 µg/mL抗CD28抗体[克隆37.51]）及Th0条件下（1 µg/mL抗CD3、3 µg/mL抗CD28、以及各10 µg/mL的抗IFNγ抗体[克隆XMG1.2]、抗IL-12抗体[克隆C17.8]和抗IL-4抗体[克隆11B11]）于37 °C培养72小时。每孔使用1 × 106个APC和0.13 × 106个初始型CD4 T细胞进行培养（材料表）。
- 制备经丝裂霉素C处理的T细胞耗竭型脾细胞作为抗原呈递细胞：简而言之，用FITC标记的CD4和CD8抗体对小鼠脾脏单细胞悬液进行染色。随后使用Anti-FITC Microbeads对细胞进行磁性标记（见材料表）。然后，按照制造商说明书使用磁性细胞分离系统从T细胞中阴性筛选出APC。接着，在37 °C培养箱中用50 µg/mL丝裂霉素C处理APC 40分钟，之后用1×PBS洗涤3次。
2. 人外周血单个核细胞的分离与培养
- 使用淋巴细胞分离液，按照制造商的说明（参见材料表），从全血中分离外周血单个核细胞（PBMCs）。
- 将PBMCs在RPMI培养基中培养，培养基中添加2 mM L-谷氨酰胺、0.01 M HEPES、1 mM丙酮酸钠、1%非必需氨基酸、100 U/mL青霉素和链霉素、0.05 mM 2-β-巯基乙醇以及5%人血清。
- 在37 °C条件下，将1 × 106个PBMCs接种于96孔U型底培养板的每孔中，每孔加入5 µg/mL的植物血凝素-L（PHA-L），培养18–24小时。
3. 代谢检测
注意：所有细胞、抑制剂[寡霉素（O）、2-脱氧葡萄糖（2-DG）、二甲基亚砜（DMSO，对照）]以及O-丙炔基嘌呤霉素（OPP）试剂应尽可能保持在接近37 °C的温度。将细胞、抑制剂和OPP试剂分装至U型底96孔板中，并尽可能将板置于37 °C培养箱内。将抑制剂2-DG和O分装为较小体积，以避免反复冻融。
- 配制2 M（20倍）的2-DG储备液和40 µM（40倍）的O储备液。对于OPP，将1 µL OPP加入49 µL培养基中，使其浓度为400 µM——此即20倍储备液。
- 实验开始前，确保OPP蛋白质合成试剂盒的所有其他组分（参见材料表）均已恢复至室温（RT）。
- 将组分C瓶中的溶液用去离子水按1:10比例稀释，制备1倍OPP反应缓冲液。使用后，将剩余的1倍溶液储存于2–8 °C。
- 每种条件（Co / DG / O / DGO）下，在96孔圆底板的每个孔中接种0.1–2 × 106个细胞，加入100 µL完全IMDM（小鼠CD4 T细胞）或完全RPMI（人外周血单个核细胞），或任何选定的完全培养基。实验过程中应尽可能将培养板置于培养箱内。
- 从储备液中加入1倍抑制剂（5 µL 20倍DG、Co溶液，2.5 µL 40倍O溶液），在37 °C、5% CO2条件下孵育15分钟。细胞最终浓度为100 mM DG和1 µM O。使用移液器小心混匀抑制剂与细胞。为方便操作，可先将抑制剂分装至96孔板中，再将细胞加入含抑制剂的孔中，并通过反复吹打数次充分混匀。
- 在DGO样本中，加入1倍DG（5 µL），用移液器小心混匀，在37 °C、5% CO2条件下孵育10分钟；随后加入1倍O（2.5 µL），吹打数次，继续在37 °C、5% CO2条件下孵育5分钟。
- 无需洗去抑制剂，直接向各样本中加入5 µL来自20倍（400 µM）储备液的OPP，使细胞内终浓度为20 µM，反复吹打混匀，并在37 °C、5% CO2条件下孵育30分钟。为操作方便，可先将OPP分装至96孔板，再将含抑制剂的细胞加入OPP试剂中，充分混匀。
注意：对于代谢活性较低的细胞或直接从ex vivo分离的细胞，应延长加入OPP后的孵育时间。OPP孵育时间需根据不同细胞类型进行优化。 - OPP孵育结束后，向每孔加入100–150 µL预冷的FACS缓冲液（含2% FBS和1 mM EDTA的1倍PBS）。在4 °C下以750 × g离心2分钟，弃上清，重复洗涤一次。
- 在Fc阻断剂（使用稀释比例为1/200）存在下，使用适当的表面标记物对细胞进行染色：抗小鼠CD4抗体（使用稀释比例为1/200）或抗人CD4抗体（使用稀释比例为1/50），以及活/死细胞染料（使用稀释比例为1/600），在4 °C避光孵育25–30分钟。
- 用150–200 µL FACS缓冲液洗涤培养板，在4 °C下以750 × g离心2分钟。轻弹培养板弃去上清，重复洗涤一次。此时细胞已完成表面染色。
- 将细胞重悬于含1%多聚甲醛（PFA）的PBS中，充分混匀，在4 °C避光孵育10–15分钟。
- 用FACS缓冲液洗涤，在4 °C下以750 × g离心2分钟，重复洗涤一次。
- 将细胞沉淀重悬于200 µL冷的1倍皂苷透化缓冲液（含0.1% (wt/vol) 皂苷和3% FBS的1倍PBS）中，在室温下避光孵育5–15分钟。此时细胞已完成固定和透化。
- 将10倍OPP反应缓冲液添加剂（组分E）用去离子水按1:10稀释，制备1倍溶液。该溶液需现配现用，并于当日使用完毕。
- 根据表1配制OPP反应混合液。配制后15分钟内使用。
- 将步骤3.13 的样品在4 °C下以750 × g离心2分钟，弃上清。用200 µL 1倍皂苷透化缓冲液洗涤细胞两次，离心后弃上清。
- 向每孔加入50–100 µL步骤3.12中配制的OPP反应混合液，充分混匀，在室温下避光孵育30分钟。随后在4 °C下以750 × g离心2分钟，弃上清。
- 将沉淀重悬于200 µL 1倍皂苷透化缓冲液中，在4 °C下以750 × g离心2分钟，弃上清。
- 每孔加入50 µL反应清洗缓冲液（组分F），在4 °C下以750 × g离心2分钟。将染色后的细胞重悬于200 µL FACS缓冲液中。
- 当天通过流式细胞术分析样本（参见补充图1），或在4 °C避光保存，次日分析。
4. 代谢检测分析
- 在以下条件下，通过检测嘌呤霉素（OPP）的掺入量来评估其作为蛋白质合成的替代指标：1）对照条件（Co）；2）使用2-DG阻断糖酵解途径的细胞；3）使用O阻断线粒体氧化磷酸化（OXPHOS）途径的细胞；以及4）同时使用抑制剂阻断糖酵解和线粒体途径的细胞（DGO），通过分析OPP的平均荧光强度（MFI）进行评估（图2）。
- 通过比较各条件下OPP的MFI，分析细胞对特定代谢途径的依赖性。直接将MFI作为蛋白质合成的衡量指标。根据文献10计算葡萄糖依赖性、糖酵解能力、脂肪酸氧化（FAO）和氨基酸氧化（AAO）能力，以及线粒体依赖性。
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结果
从 小鼠的脾脏和淋巴结中分离出初始型 CD4+ T 细胞，并在体外诱导其分化为 Th0 或非极化（NP）细胞系，培养 72 小时。分别在培养 0 小时、48 小时和 72 小时后收集细胞，通过检测 OPP 掺入的平均荧光强度（MFI）来评估蛋白质合成活性。图 3 显示，初始型 CD4+ T 细胞的合成活性低于活化 T 细胞，表现为 OPP 的 MFI 较低。初始型细胞对糖酵解有一定依赖性，但更主要依赖氧化磷酸化（OXPHOS）通路，该结论基于 OPP 掺入的 MFI 及其倍数变化得出。若将对照组（Co）设为 100%，则阻断糖酵解使蛋白质合成水平降至对照组的 60%；而阻断 OXPHOS 通路则进一步将其降低至 45%。
活化后，CD4+ T 细胞的蛋白质合成增加，这由 MFI 升高所证实（图 3），并且这些细胞对糖酵解途径的依赖性增强；抑制糖酵解可使这些细胞的蛋白质合成水平降低一半。相比之下，在活...
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讨论
本文提供了一种基于SCENITH技术、通过掺入嘌呤霉素的化学标记来利用流式细胞术研究淋巴样细胞代谢的方法。尽管我们主要关注淋巴细胞，但该方案可调整用于研究任何细胞类型的代谢。该方法在研究稀有细胞群体和患者样本的代谢时也具有优势，而其他技术（如Seahorse）则需要更多的细胞数量。
该实验方案中的一个关键步骤是确保细胞、抑制剂及所有使用的试剂均处于室温，除非另有说明。在冰箱中放置过久的细胞应在37 °C孵育，直至细胞达到生理温度。理想情况下，在开始实际实验前，应将细胞、抑制剂及其他试剂提前放入培养箱中孵育一段时间。
该方法也可进行修改，以联合 OPP 染色对细胞内蛋白质进行染色。在本示例中，我们对细胞进行了表面标记以研究 CD4+ T 细胞的代谢，但未区分其中存在的不同效应 CD4+ T 细胞亚群。若对该方案进行改进，增加更多标记物并可能加入细胞内染色步骤，则可扩大可分析的亚群范围。在此情况下，我们建议在完成 OPP 染色后，使用固定和透化缓冲液进行细胞内染色，随后对特定蛋白进行细胞...
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披露
作者声明无利益冲突。
致谢
感谢徐勤博士和Avik Dutta博士提供外周血单个核细胞样本以及宝贵的实验建议。本研究部分得到了美国国立卫生研究院（NIH）国家过敏与传染病研究所（NIAID）所内研究部的支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 2-巯基乙醇 | Thermo Fisher | 21985-023 | |
| Alexa Fluor 488 抗嘌呤霉素抗体 | Biolegend | 381506 | 使用稀释度：1/100 |
| Alexa Fluor 647 抗人 CD4 抗体 | Biolegend | 357422 | 使用稀释度： 1/50 |
| BD Horizon BUV737 大鼠抗小鼠 CD4 | BD Biosciences | 612761 | 使用稀释度： 1/200 |
| Click-iT Plus OPP Alexa Fluor 488 蛋白质合成检测试剂盒 | Thermo Fisher | C10456 | |
| HEPES (1 M) | Thermo Fisher | 15630080 | |
| 人血清 | Millipore Sigma | H4522 | |
| IMDM，含 GlutaMAX 添加剂，500 ml | Thermo Fisher | 31980030 | |
| InVivoMAb 抗小鼠 CD28，克隆： 37.51 | BioXcell | BE0015-1 | |
| InVivoMAb 抗小鼠 CD3ε，克隆： 145-2C11 | BioXcell | BE0001-1 | |
| InVivoMAb 抗小鼠 IFNγ，克隆： XMG1.2 | BioXcell | BE0055 | |
| InVivoMAb 抗小鼠 IL-12 p40，克隆： C17.8 | BioXcell | BE0051 | |
| InVivoMAb 抗小鼠 IL-4，克隆： 11B11 | BioXcell | BE0045 | |
| L-谷氨酰胺 (200 mM) | Thermo Fisher | 25030081 | |
| LIVE/DEAD 可固定 Aqua 死细胞染色试剂盒（适用于 405 nm 激发） | Thermo Fisher | L34966 | 使用稀释度： 1/600 |
| LSM 淋巴细胞分离液 | MP Biomedicals | 50494X | |
| MEM 非必需氨基酸溶液 (100X) | Thermo Fisher | 11140050 | |
| 来自棘孢小单孢菌的丝裂霉素 C | Sigma | M0503-10X2MG | |
| 小鼠初始 CD4+ 细胞分离试剂盒 | Miltenyi Biotec | 130-104-453 | |
| 16% 电子显微镜级水溶液甲醛 | Electron Microscopy Sciences | 15710 | |
| PBS (1X)，pH 7.4，500 mL | Quality Biologicals | 114-058-101 | |
| 青霉素-链霉素 (10,000 U/mL)，100 mL | Thermo Fisher | 15140122 | |
| 植物血凝素-L (PHA-L) | Millipore Sigma | 11249738001 | |
| 优质胎牛血清 (FBS) | Avantor | 97068-085 | |
| RPMI 1640 培养基，不含谷氨酰胺 | Thermo Fisher | 21870076 | |
| 皂苷 | Thermo Fisher | A18820.22 | |
| 丙酮酸钠 (100 mM) | Thermo Fisher | 11360070 |
参考文献
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