本氏烟草中胞间连丝蛋白分选的共聚焦显微镜分析

摘要

该方案描述了在病毒-胞间连丝相互作用或胞间连丝运输过程中基于共聚焦显微镜分析蛋白质靶向胞间连丝的最佳胞间连丝标记物的选择。

摘要

胞间连丝是膜状纳米孔，连接相邻植物细胞的细胞质，使营养物质、大分子以及入侵病毒的细胞间运输成为可能。胞间连丝在细胞间通讯的调节中起着重要作用，有助于植物发育、环境反应以及与病毒病原体的相互作用。发现植物或病毒蛋白的胞间连丝定位可以提供有关蛋白质的有用功能信息，并且对于理解植物-病毒相互作用的机制非常重要。为了促进这些研究，我们描述了一种基于共聚焦显微镜分析不同胞质间连丝靶向蛋白的方案，以选择用于研究病毒-胞间连丝相互作用或胞浆连丝转运的最佳胞浆间连丝标记物。具体来说，使用 萝卜静脉清除病毒 （TVCV） 的细胞间运动蛋白 （MP）、 拟南芥 胞间连丝定位蛋白 5 （PDLP5） 和胞间连丝胼胝结合蛋白 1 （PDCB1） 来说明这些事件的分析。使用采样组织的苯胺蓝染色，将蛋白质胞间连丝定位数据与胞间连丝的整体可视化并行分析。这些方法可以很容易地用于分析植物中任何细胞或病原体蛋白的胞间连丝定位。

引言

胞间连丝 （PD） 通过调节细胞间通讯，在控制植物发育、环境反应和与病毒病原体的相互作用中发挥重要作用 ^1,2。PD 最初在胞质分裂过程中形成，数百个 PD 插入两个子细胞之间的新细胞中，从而为细胞间通讯提供通道 ^3,4。PD 是一种富含膜的结构，包含内质网 （ER） 衍生的膜，即反式 PD 桥管，位于质膜衬垫的孔的中央部分 ^3,4。比较蛋白质组学方法鉴定了许多 PD 功能蛋白，包括 β-1,3-葡聚糖酶 （BG）、胼胝质合酶 （CALS）、胞间连丝定位蛋白 （PDLP）、胼胝体结合蛋白 （PDCB）、多个 C2 结构域跨膜区蛋白 （MCTP）³ 和富含亮氨酸的重复受体样激酶 （RLK）⁵。最近，Kirk 等人开发了一种称为计算机蛋白质组胞间连丝 1 （PIP1） 的工具，该工具可以预测 22 种植物物种中的新 PD 蛋白⁶。PD 在植物发育过程中的渗透性和结构以及对各种胁迫的响应中有所不同。Callose（β-1,3-葡聚糖）在 PD 周围的颈部区域沉积和水解是广为人知的 PD 调节机制之一⁷。

许多病原微生物，包括真菌、细菌和病毒，可以在感染过程中操纵 PD 的扩张或结构 ^2,8,9。稻瘟病菌是稻瘟病的病原体，它部署细胞内侵袭性菌丝，通过 PD⁸ 从一个细胞移动到另一个细胞。一种细菌病原体 丁香假单胞菌 pv.番茄需要效应蛋白 HopO1-1 通过与 PDLP7 相互作用和不稳定在寄主植物中进行细胞间运动和传播 7，从而增加拟南芥⁹ 中邻近细胞的分子通量。然而，植物病毒在细胞间传递过程中在调节 PD 方面更通用，病毒运动蛋白 （MP） 促进细胞间运动²。由于其在调节植物发育和生长方面的重要功能，以及与植物病原微生物的相互作用，PD 近年来越来越受到关注。在拟南芥中，PD 功能蛋白主要有两种类型，PDLP （1-8） 和 PDCB （1-5），其中许多，例如 PDLP5 ^1,10,11、PDLP1¹²、PDLP6¹³、PDLP7¹⁴ 和 PDCB1¹⁵，被发现通过调节胼胝质沉积在操纵 PD 通透性中发挥作用。然而，发现一些 PDLP 具有功能冗余，例如，pdlp1 和 pdlp1,2 的敲除突变体不会影响分子运输，尽管 pdlp1,3 和 pdlp2,3 的双重敲除突变体显示胞间连丝通透性增加¹⁶。有趣的是，单独的 PDLP5 下调/敲除或过表达分别导致胞浆连丝通透性增加或降低 ^1,17。最近，Li 等人发现 PDLP5 和 PDLP6 在不同的细胞界面上发挥作用¹³。这些结果表明 PDLP5 可能与其他 PDLP 具有非冗余功能。

由于 PD 在细胞间通讯中的关键功能，我们开发了一种方案，用于将植物 PD 蛋白 PDLP5 和 PDCB1 以及 萝卜静脉清除病毒 （TVCV） 的病毒细胞间运动蛋白 （MP） 部署为简单、方便和可靠的 PD 标志物用于细胞生物学实验。为了进一步验证，使用采样组织的苯胺蓝染色对 PD 进行可视化。PDLP5、PDCB1 和 TVCV MP 的 PD 定位方案可以很容易地适应分析活植物中任何细胞或病原体衍生蛋白的潜在 PD 定位。

方案

本研究中使用的试剂和设备的详细信息列在 材料表中。

1. 植物生长

1. 在 23°C 的受控环境室中，在 16 小时的光照和 8 小时的黑暗下，在潮湿的土壤中种植 Nicotiana benthamiana 种子。
2. 大约 2 周后，小心地将根部周围带有泥炭颗粒的幼苗转移到更大的花盆中，并在相同条件下继续生长 4-5 周以进行农杆菌渗透实验。
   注意:当植物开始开花时不要使用它们，因为 GFP 积累会在花序阶段¹⁸ 减少。

2. 载体构建

1. 使用 PCR 用 Q5 高保真 DNA 聚合酶扩增目标编码序列，并使用市售的 BP Clonase 试剂盒通过 BP 反应¹⁹ 将它们克隆到入门载体 pDONR207 中。
2. 使用市售的 LR Clonase 试剂盒，通过 LR 反应¹⁹ 将所得进入质粒中的靶基因转移到目标载体 pPZP-RCS2A-nptII-DEST-EGFP-N1 中，以产生带有 EGFP 标签融合到靶蛋白 C 端的质粒。
3. 通过 PCR 和测序验证所有构建体¹⁹.

3. 农艺渗透

1. 在 LB 琼脂平板上含有不同载体的根 癌农杆菌 EHA105 细胞划线，并在 28 °C 下孵育 2 天。
2. 将单个菌落转移到 2 mL LB 肉汤中，并在 28 °C 下搅拌 （250 rpm） 孵育过夜。
3. 从过夜培养物中取出 1 mL，然后加入 4 mL 新鲜 LB 肉汤，并在相同条件下重新培养 1 小时。
4. 用浸润缓冲液（MgCl _2,10 mM;MES，10 mM，pH 5.6）。
5. 以 1:1 （v/v） 的比例混合不同的细菌悬浮液，使最终浓度为 OD₆₀₀ = 0.1。（可选）。
6. 将细菌悬浮液在室温下轻轻搅拌孵育 3 小时。
7. 用 1 mL 无针一次性注射器浸润来自不同植物的完全展开的叶子的背面，并用防水笔标记浸润区域（比周围的非浸润组织颜色更深）。
8. 继续执行本协议的共聚焦显微镜部分（步骤 5）。
   注意:也可以使用其他适用于转化感兴趣植物物种的 根癌农杆菌 菌株。

4. 苯胺蓝染色

1. 将 200 μL 1% 苯胺蓝（在 50 mM 磷酸钾缓冲液中，pH 8.0）等分试样添加到显微镜载玻片²⁰ 中。
2. 用刀片切除远离静脉约 0.5 cm × 0.5 cm 的浸润区域，并将叶组织样品转移到显微镜载玻片上的苯胺蓝溶液（背面朝上）中，并确保叶组织样品浸没在苯胺蓝溶液中，然后用盖玻片（22 mm x 50 mm）覆盖。
3. 将装有样品的显微镜载玻片放入连接到真空泵的干燥器中，抽真空 2 分钟 （<0.8 Pa），然后缓慢释放压力并在室温下在黑暗中孵育 30 分钟。
4. 使用兼容软件在激光扫描共聚焦显微镜下可视化苯胺蓝的荧光信号。
   注意:这里使用了 Huang 等人 ²⁰ 的苯胺蓝染色方法。在该技术的修改中，在没有 2 分钟真空步骤的情况下进行了相同的实验，产生了类似的结果，并表明真空干燥对于苯胺染色不是必需的。此外，苯胺蓝染色剂的浓度和染色时间可能会根据叶组织的来源等而变化。

5. 共聚焦显微镜

1. 渗透后，在不同时间点从两株植物上收获两片叶子。用刀片将浸润区切成距离静脉约 0.5 厘米× 0.5 厘米的切片。
   1. 将组织样品放入显微镜载玻片中央部分的一滴无菌水中（正轴朝上），并用盖玻片 （22 mm x 50 mm） 盖住，注意避免气泡。
2. 确保检测 CFP、GFP 和 RFP 信号的激发波长分别为 405 nm、488 nm 和 561 nm，用于检测的发射滤光片为 CFP 为 410-602 nm，EGFP 和 RFP 为 400-602 nm，针孔 1 AU 和主增益设置为 769 V。
3. 在浸润后 1 天、 2 天、 3 天、 5 天、 7 天和 10 天，使用带有兼容软件的激光扫描共聚焦显微镜可视化浸润区域中自发荧光标签的荧光信号。
   1. 使用 10 倍物镜和 GFP 滤光片定位具有荧光信号的细胞，然后切换到 40 倍物镜进行亚细胞定位和图像记录的可视化。
4. 为每种条件收集 20 张图像，至少使用两个独立的生物学重复。
5. 根据细胞外围信号的诊断点状外观对测试蛋白质的 PD 定位进行评分^21,22。
   注:当检测未知蛋白质的亚细胞定位时，建议使用至少三种植物。

6. 数据分析

1. 使用 Fiji 软件拆分通道并将比例尺添加到图像中以进行可视化。
2. 在测量每个图像的平均灰度值之前，使用斐济软件拆分通道，以评估不同时间点的 GFP（对于 MP、PDCB1 和 PDLP5）或 CFP（对于苯胺蓝染色）荧光强度。
3. 在对 GFP（对于 MP、PDCB1 和 PDLP5）或 CFP（用于苯胺蓝染色）的图像进行归一化之前，使用斐济软件分割通道。测量图像面积，并手动计数 PD 点。计算每 100 μm² 的 PD 点数。
4. 使用双向方差分析和 Tukey 的多重比较检验²³ ，通过统计和绘图软件确定不同样本和不同时间点之间的 P 值。
   注:对于单通道荧光图像，每个像素的灰度值表示该点的荧光强度²⁴。在这里，平均灰度值用于评估每个样品在不同时间点的荧光强度。

结果

为了促进 PD 在植物生理学中的功能以及与病原体相互作用的研究，开发了三种简单可靠的参比蛋白用于 PD 定位。筛选出植物生育病毒 TVCV 编码的 2 种细胞 PD 蛋白和 1 种病原体来源的 MP 蛋白。使用融合到每种蛋白质的 C 端的自发荧光报告基因 EGFP 观察这些蛋白质的亚细胞定位。在另一种方法中，使用 PD 相关胼胝质沉积物的苯胺蓝染色来可视化 PD。实验表明，PDLP5 和 MP 都表现出点状 PD 定位，MP 也定位于细胞核（图 1A），如前所述²⁵。相比之下，PDCB1 似乎在 PD 和 ER 之间分配（图 1A）。对于在解释 GFP 标记蛋白的亚细胞定位方面经验不足的研究人员， 图 1A 还说明了植物细胞中表达的 EGFP 的特征性核质模式。为了确认 PDCB1 的 ER 信号，我们将 PDCB1 与 ER 标志物共表达，发现 PDCB1 信号与 ER 标志物的信号重叠（图 1B）。为了评估测试蛋白质的 PD 定位效率，计算了表达荧光信号的细胞百分比，这些细胞表现出该信号的 PD 定位（表 1）。

对于通过使用参考蛋白鉴定亚细胞定位，了解参考蛋白表达的时间尺度及其定位的潜在变化是有用的。 图 2 显示了 MP、PDLP5 和 PDCB1 的这种动力学，当 PD 本身通过苯胺蓝染色可视化时。MP 和 PDLP5 在浸润后 1 天 （dpi） 就开始在 PD 处积累，并且这种积累在 2 dpi 时达到明显最大值，再保持稳定 5 天，之后信号强度降低，很可能是由于蛋白质降解。PDCB1 亚细胞分选的时间过程更为复杂:对于前 3 dpi，PDCB1 表现出相当强的 ER 信号，这几乎完全掩盖了 PD 特异性信号定位，而在 5 dpi 时，后一个信号变得更加明显（图 2），尽管细胞较少。有趣的是，PDCB1 在 5 dpi 后出现清晰的 PD 定位模式，同时显示 EGFP 信号的细胞明显减少（补充图 1）。因此，PDLP5 和 MP 可以作为 PD 参考蛋白发挥作用，在大多数其他细胞区室中几乎没有背景，最佳可视化时间窗口为 2-5 dpi。另一方面，PDCB1 不如 PD 标志物合适。

然后验证 PD 标志物在其他 PD 蛋白存在下保持其亚细胞定位特异性。为此，MP-EGFP 或 PDLP5-EGFP 与另一种植物病毒的 PD 定位²⁶ MP 共表达，即用 CFP 标记的烟草花叶病毒 （TMV）。 图 3 显示，在这两种情况下，共表达的蛋白质都表现出明显的 PD 定位模式。同样，表达 MP-EGFP 或 PDLP5-EGFP 的组织 PD 特异性组织学苯胺蓝染色检测到对 EGFP 的 PD 定位和苯胺蓝信号没有干扰（图 3）。

PD 定位研究通常受益于对参考蛋白总体表达和 PD 信号的更定量估计。这种定量方法如图 4 和 图 5 所示。为了定量一般表达，测量 PDLP5 和 MP 的信号强度。在 10 dpi 期间，两种蛋白质在所有可视化时间点都显示出强信号，PDLP5 在 3 dpi 和 MP 在 2 dpi 时信号强度最大（图 4）。在任何可视化时间点，PDLP5 和 MP 之间的信号强度均无统计学意义差异。PDCB1 信号强度在时间点之间表现出更大的波动，在 7 dpi 处观察到最强的信号（图 4），尽管由于表达细胞的稀缺性，在这个时间点很难收集具有统计学意义的数据。因此，前 3 dpi 代表检测 PDCB1 表达的最佳时间。正如预期的那样，苯胺蓝染色样品表现出比瞬时表达蛋白更稳定的信号（图 4）。

然后对 PDLP5 和 MP 形成的 PD 点进行定量。PDLP5 在整个观察期间显示稳定数量的 PD 点，任何两个测试时间点之间没有统计学上的显着差异（图 5）。MP 形成的 PD 点数在 2 dpi 时检测到最高数量，并且它们保持相对稳定，直到观察期结束。比较 PDLP5 和 MP 之间的 PD 点数显示，在大多数采样时间没有统计学上的显着差异（图 5）。苯胺蓝染色的 PD 点数也保持稳定，尽管在 10 dpi 时略有下降。由苯胺蓝、 PDLP5 或 MP 修饰的 PD 点的数量彼此相似，具有统计学意义（图 5），与这些标志物的 PD 特异性一致。未分析 PDCB1 的 PD 点数，因为在较早的时间点，PD 信号被 ER 信号掩盖，而在较晚的时间点，仅在相对较少的细胞中观察到（参见 图 2）。

图 1:TVCV MP、PDLP5 和 PDCB1 的胞间连丝 （PD） 定位在本 氏烟草 中瞬时表达和 PD 的苯胺蓝染色。 （A） MP-EGFP、PDLP5-EGFP 和 PDCB1-EGFP 的 PD 定位和苯胺染色。EGFP 信号为绿色，苯胺蓝信号为蓝色，质体自发荧光为红色。（B） MP-EGFP、PDLP5-EGFP 和 PDCB1-EGFP 与用 mRFP 标记的内质网 （ER） 标志物共表达。在浸润后 2 天 （dpi） 记录图像，并且是代表两个独立实验的单个共聚焦切片（N = 来自 2 个植物的 20 张图像）。EGFP 信号为绿色，mRFP 信号为紫色，质体自发荧光为红色。黄色箭头表示 PDCB1 定位于 ER。比例尺 = 5 μm。 请点击此处查看此图的较大版本。

图 2:TVCV MP、PDLP5 和 PDCB1 在本 氏烟草 中瞬时表达的 PD 定位时间进程以及 PD 苯胺蓝染色的时间进程。 图像以 2 dpi 记录，并且是代表两个独立实验的单个共聚焦切片（所有系统的 N = 来自 2 个工厂的 20 张图像，除了 PDCB1-EGFP 的 7 dpi 和 10 dpi，其中显示信号的细胞较少）。EGFP 信号为绿色，苯胺蓝色信号为蓝色。比例尺 = 5 μm。 请点击此处查看此图的较大版本。

图 3:TVCV MP 和 PDLP5 在与 PD 定位的 TMV MP 共表达并与苯胺蓝共染色后保留其 PD 定位。 图像以 2 dpi 记录，是代表 N ≥ 4-6 株植物的 10 张图像的单个共聚焦切片。EGFP 信号为绿色，CFP 信号和苯胺蓝色信号为蓝色，质体自发荧光为红色。比例尺 = 5 μm。 请点击此处查看此图的较大版本。

图 4:TVCV MP、PDLP5 和 PDCB1 荧光强度的时间进程在本 氏烟草 和苯胺蓝 PD 染色中瞬时表达。 从 图 2 中描述的实验中收集定量数据。误差线表示多个试验的平均值的标准差。各个数据点表示为每次测量的平均值。通过双向方差分析和 Tukey 多重比较检验评估的平均值之间的差异对于 P 值具有统计学意义。*P < 0.05，**P < 0.01，***P < 0.001，****P < 0.0001;NS 的 n，无统计学意义。蓝色条，苯胺染色;浅绿色条形，MP-EGFP，深绿色条形，PDLP5-EGFP;黄色条，PDCB1-EGFP。 请单击此处查看此图的较大版本。

图 5:TVCV MP 和 PDLP5 在本氏 烟草 中瞬时表达和 PD 苯胺蓝染色形成 PD 点的时间过程。 从 图 2 中描述的实验中收集定量数据。误差线表示多个试验的平均值的标准差。各个数据点表示为每次测量的平均值。通过双向方差分析和 Tukey 多重比较检验评估的平均值之间的差异对于 P 值具有统计学意义。*P < 0.05， **P < 0.01， ***P < 0.001， ****P < 0.0001.蓝色条，苯胺染色;浅绿色条，MP-EGFP，深绿色条，PDLP5-EGFP。 请单击此处查看此图的较大版本。

	实验 I
	总细胞数	PD 定位的细胞	具有混合信号的细胞	PD 定位的细胞 （%）
苯胺蓝	40	40	4	100
MP-EGFP 系列	40	40	4	100
PDCB1-EGFP 蛋白	40	3	38	7.5
PDLP5-EGFP 蛋白	40	40	0	100
	实验 II
	总细胞数	PD 定位的细胞	具有混合信号的细胞	PD 定位的细胞 （%）
苯胺蓝	40	40	8	100
MP-EGFP 系列	40	39	8	97.5
PDCB1-EGFP 蛋白	40	12	31	30
PDLP5-EGFP 蛋白	40	39	2	97.5

表 1:PD 定位的效率。

补充图 1:TVCV MP、PDLP5 和 PDCB1 在本 氏烟草中瞬时表达的 PD 定位。 图像以 5 dpi （A）、7 dpi （B） 和 10 dpi （C） 录制。EGFP 信号为绿色，质体自发荧光为红色。比例尺 = 20 μm。 请单击此处下载此文件。

讨论

在正常的植物发育和形态发生以及植物与病原体相互作用期间，对植物细胞间通讯和细胞间运输的任何细胞生物学研究都需要检测和监测蛋白质的分选 - 内源性和病原体编码的 - 植物细胞间连接，胞间连丝 （PD）。通过使用忠实且一致地定位于 PD 的参考蛋白（无论是内源性还是病原体来源的）来极大地促进这些实验，从而装饰和可视化这些结构。通过选择三种已知的 PD 定位蛋白来解决这一需求:拟南芥 PDLP5 和 PDCB1，以及来自生育病毒病原体 TVCV 的 MP。这些蛋白质在其 C 末端用自发荧光报告基因 EGFP 标记，并且在它们在本 氏烟草 叶中瞬时表达和表达组织的共聚焦显微镜分析后确定所得融合蛋白分选为 PD 的能力。为了在这些组织中对 PD 进行一般可视化，使用了标准的苯胺蓝染色方法。

就植物病毒 MP 对 PD 结构和完整性的影响而言，被认为分为两大类:可逆性增加 PD 通透性且 PD 中没有任何结构改变的 MP，以及通过改变其结构来限制 PD 的 MP。弓形病毒的 MP，如 TVCV，属于第一组 MP 组，将它们定位为亚细胞定位研究的有吸引力的 PD 标志物^27,28。

这些实验将 PDLP5-EGFP 和 MP-EGFP 定位为 PD 可靠且可重复的生物标志物，PD 检测效率与苯胺蓝染料相当。在 10 dpi 的整个观察期内检测到 PDLP5-EGFP 和 MP-EGFP 的 PD 定位，观察特征性 PD 定位模式的最佳时间在 2 dpi 和 3 dpi 之间。尽管 35S 启动子的表达可能导致表达基因的转录后沉默，但这通常发生在稳定转化的转基因植物中长时间表达后。另一方面，使用这种强组成型启动子对于标记蛋白的轻松检测很重要。如果参考蛋白表达在 7-10 dpi 后下降，则应使用更短的周期，即 2-3 dpi。这里未检测到 PDLP5 和 MP 之间总体亚细胞定位模式的显著差异，除了 MP 除了 PD 之外还积累在细胞核中。相反，由于其亚细胞定位模式的复杂性，不建议将 PDCB1 本身用作 PD 标志物，其中包括对 ER 的大量定位。

EGFP 荧光信号的检测难易程度也取决于植物的生长阶段;具体来说，在本 氏猪笼草中，EGFP 信号积累最低，位于花序阶段¹⁸。

本研究旨在开发最特定于其他亚细胞区室的 PD 定位标志物。因此，它们用作具有额外亚细胞定位能力的目标蛋白质定位的参考应与其他亚细胞标志物的表达相结合，例如对 ER、线粒体、质膜等具有特异性的那些。在这种情况下，在计算农杆菌渗透培养物的最终浓度时，应考虑包含额外的 农杆菌 细胞来表达这些标记物，即液体培养物的 OD₆₀₀ 。显然，细胞浓度和植物生长时间应适应其他植物物种的最大表达和 PD 定位模式检测。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
ABT 交流 1 相电动机	BRANDTECH&	nbsp;ABF63/4C-7RQ
根癌农杆菌 EHA105
污染控制	CCI
Gateway BP Clonase II 酶混合物	Invitrogen	#11789020
Gateway LR Clonase II 酶混合物	Invitrogen	#11791020
GraphPad Prism 8.0.1。	GraphPad 软件公司
图片 J	美国国立卫生研究院和光学与计算仪器
激光扫描共聚焦显微镜	蔡司	LSM 900
Nicotiana benthamiana	植物物种
pDONR207	Invitrogen	#12213013
Q5 高保真 DNA 聚合酶	NEB	#M0491S