本方案描述了在病毒与胞间连丝相互作用或胞间连丝运输过程中，针对蛋白质靶向胞间连丝的共聚焦显微镜分析，如何选择最优的胞间连丝标记物。
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摘要
摘要
胞间连丝是连接相邻植物细胞胞质的膜性纳米通道，可介导营养物质、大分子以及侵入性病毒在细胞间的运输。胞间连丝在调控细胞间通讯中发挥基础性作用，参与植物发育、环境响应以及与病毒病原体的相互作用。发现植物或病毒蛋白在胞间连丝的定位，可为该蛋白的功能提供有价值的线索，对于理解植物-病毒互作机制也具有重要意义。为促进相关研究，本文描述了一种基于共聚焦显微镜的实验方案，用于分析不同靶向胞间连丝的蛋白，以筛选最适合研究病毒-胞间连丝互作或胞间连丝运输过程的胞间连丝标记蛋白。具体而言，本方案以病毒的细胞间移动蛋白（MP）为例，展示了上述分析过程。 芜菁脉明病毒 (TVCV)，该 拟南芥 质体连接蛋白5（PDLP5）和质体连接钙调结合蛋白1（PDCB1）。质体连接蛋白的定位数据与利用苯胺蓝染色对取样组织中质体连接进行的整体可视化分析平行进行。这些方法可轻松适用于分析任何细胞内或病原体蛋白在植物体内的质体连接定位。
引言
胞间连丝（plasmodesmata, PD）通过调控细胞间通讯，在控制植物发育、环境响应以及与病毒病原体的相互作用中发挥着基础性作用1,2。PD最初形成于细胞质分裂过程中，数百个PD被插入两个子细胞之间的新细胞壁中，从而为细胞间的通讯提供通道3,4。PD是一种富含膜结构的复合体，其中央区域包含由内质网（endoplasmic reticulum, ER）衍生而来的膜结构——穿胞间连丝连丝微管（trans-PD desmotubule），其周围由质膜衬覆3,4。比较蛋白质组学方法已鉴定出大量PD功能蛋白，包括β-1,3-葡聚糖酶（β-1,3-glucanases, BGs）、胼胝质合酶（callose synthases, CALSs）、定位于胞间连丝的蛋白（plasmodesmata-located proteins, PDLPs）、胼胝质结合蛋白（callose-binding proteins, PDCBs）、含多个C2结构域的跨膜区蛋白（multiple C2 domains transmembrane region proteins, MCTPs）3，以及富含亮氨酸重复序列的类受体蛋白激酶（leucine-rich repeat receptor-like kinases, RLK）5。最近，Kirk 等人开发了一种名为“胞间连丝体外蛋白质组1”（plasmodesmata in silico proteome 1, PIP1）的工具，使得在22种植物物种中预测新的PD蛋白成为可能6。PD的通透性和结构在植物发育过程及应对各种胁迫过程中会发生动态变化。在PD周围颈区部位胼胝质（β-1,3-葡聚糖）的沉积与水解，是调控PD功能最为广泛认知的机制之一7。
许多病原微生物，包括真菌、细菌和病毒，可在感染过程中操控胞间连丝（plasmodesmata, PD）的扩张或结构2,8,9。Magnaporthe oryzae 是水稻稻瘟病的致病菌，其通过在细胞间穿行的胞内侵入性菌丝经由胞间连丝实现细胞间的转移8。细菌病原体 Pseudomonas syringae pv. tomato 需要效应蛋白 HopO1-1 与 PDLP7 相互作用并使其不稳定，从而破坏胞间连丝结构，促进其在寄主植物中的细胞间移动与扩散，增加拟南芥（Arabidopsis）邻近细胞的分子通量9。然而，植物病毒在调控胞间连丝以实现细胞间传播方面更具多样性，其病毒运动蛋白（MP）可促进细胞间的移动2。由于胞间连丝在调控植物发育与生长方面具有重要功能，并且与植物病原微生物存在相互作用，近年来受到越来越多的关注。在拟南芥（Arabidopsis thaliana）中，存在两类主要的胞间连丝功能蛋白：PDLPs（1-8）和 PDCBs（1-5），其中许多成员如 PDLP51,10,11、PDLP112、PDLP613、PDLP714 和 PDCB115 被发现可通过调控胼胝质沉积来影响胞间连丝的通透性。然而，部分 PDLPs 被发现具有功能冗余性，例如 pdlp1 和 pdlp1,2 的敲除突变体对分子运输无明显影响，而 pdlp1,3 和 pdlp2,3 的双敲除突变体则表现出胞间连丝通透性增强16。有趣的是，单独下调/敲除或过表达 PDLP5 分别导致胞间连丝通透性升高或降低1,17。最近，Li 等人发现 PDLP5 与 PDLP6 在不同的细胞界面上发挥作用13。这些结果表明，PDLP5 可能与其他 PDLPs 具有非冗余的功能。
由于胞间连丝（PD）在细胞间通讯中具有关键作用，我们开发了一种实验方案，将植物胞间连丝蛋白PDLP5和PDCB1，以及芜菁脉明病毒（Turnip vein-clearing virus，TVCV）的病毒细胞间运动蛋白（MP），作为简单、便捷且可靠的胞间连丝标记物用于细胞生物学实验。为进一步验证结果，同时平行采用苯胺蓝染色法对取样组织进行胞间连丝的可视化观察。本文所述的PDLP5、PDCB1和TVCV MP在胞间连丝定位的实验方案，可轻松适用于分析任何细胞来源或病原体来源蛋白在活体植物中是否可能定位于胞间连丝。
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方案
本研究中所用试剂和设备的详细信息见材料表。
1. 植物生长
- 在受控环境培养室中，将Nicotiana benthamiana种子种植于湿润土壤内，于23 ˚C条件下，采用16小时光照和8小时黑暗的光周期进行培养。
- 约2周后，将幼苗连同根部周围的泥炭颗粒小心移栽至较大的花盆中，并在相同条件下继续培养4至5周，用于农杆菌浸润实验。
注意：当植株开始开花时请勿使用，因为在花序形成阶段GFP的积累会减少18。
2. 载体构建
- 使用 Q5 高保真 DNA 聚合酶通过 PCR 扩增目的编码序列，并利用市售的 BP Clonase 试剂盒通过 BP 反应19将其克隆至入门载体 pDONR207 中。
- 利用市售的 LR Clonase 试剂盒通过 LR 反应19，将所得入门质粒中的目标基因转移至目的载体 pPZP-RCS2A-nptII-DEST-EGFP-N1 中，以构建在目标蛋白C端融合EGFP标签的质粒。
- 通过 PCR 和测序验证所有构建的质粒19。
3. 农杆菌浸润
- 将含有不同载体的农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）EHA105 单菌落划线接种于 LB 琼脂平板上，于 28 ˚C 培养 2 天。
- 挑取单菌落接种至 2 mL LB 液体培养基中，于 28 ˚C 振荡培养过夜（250 rpm）。
- 取 1 mL 过夜培养物，加入 4 mL 新鲜 LB 液体培养基，相同条件下继续培养 1 小时。
- 用浸润缓冲液（MgCl2，10 mM；MES，10 mM，pH 5.6）将菌液浓度调节至 OD600 = 0.1（若共表达两种蛋白，则调节至 OD600 = 0.2）。
- 按 1:1（v/v）比例混合不同的菌液，使终浓度为 OD600 = 0.1（可选步骤）。
- 将菌液于室温下轻柔振荡孵育 3 小时。
- 使用 1 mL 无针一次性注射器将菌液浸润至不同植物完全展开叶片的远轴面，并用防水笔标记浸润区域（浸润区域颜色较周围未浸润组织更深）。
- 继续进行本实验方案的共聚焦显微镜部分（步骤 5）。
注意：也可使用其他适用于目标植物物种转化的农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）菌株。
4. 苯胺蓝染色
- 取200 µL 1% 茴香蓝溶液（溶于50 mM磷酸钾缓冲液，pH 8.0）加入载玻片上20。
- 用刀片切取约0.5 cm × 0.5 cm的浸润区域（避开叶脉），将叶片组织样本转移至载玻片上的茴香蓝溶液中（背面朝上），确保组织样本完全浸没于茴香蓝溶液中，然后盖上盖玻片（22 mm × 50 mm）。
- 将带有样本的载玻片置于连接真空泵的干燥器中，抽真空2分钟（<0.8 Pa），随后缓慢释放压力，并在室温下避光孵育30分钟。
- 使用配备兼容软件的激光扫描共聚焦显微镜观察茴香蓝的荧光信号。
注意：本实验采用Huang等20报道的茴香蓝染色方法。对该技术的一种改进是省略2分钟的抽真空步骤，结果相似，表明真空处理对于茴香蓝染色并非必需。此外，茴香蓝染色剂的浓度和染色时间可根据叶片组织来源等因素进行调整。
5. 共聚焦显微镜
- 在侵染后的不同时间点，从两株植物上各采集两片叶片。用刀片将侵染区域切成约 0.5 cm × 0.5 cm 的小片，避开叶脉。
- 将组织样本置于载玻片中央的一滴无菌水中（背面朝上），然后盖上盖玻片（22 mm × 50 mm），注意避免产生气泡。
- 确保检测 CFP、GFP 和 RFP 信号的激发波长分别为 405 nm、488 nm 和 561 nm，发射滤光片检测范围分别为 CFP：410–602 nm，EGFP 和 RFP：400–602 nm，针孔设为 1 AU，主增益设为 769 V。
- 使用配备相应软件的激光共聚焦显微镜，在侵染后第 1 天、第 2 天、第 3 天、第 5 天、第 7 天和第 10 天观察侵染区域中自发荧光标签的荧光信号。
- 先使用 10× 物镜和 GFP 滤光片定位具有荧光信号的细胞，然后切换至 40× 物镜观察亚细胞定位并采集图像。
- 每种条件下采集 20 张图像，并至少进行两次独立的生物学重复实验。
- 根据细胞边缘出现特征性点状信号的形态，判断被测蛋白在胞间连丝（PD）中的定位21,22。
注意：在检测未知蛋白的亚细胞定位时，建议至少使用三株植物。
6. 数据分析
- 使用 Fiji 软件拆分通道，并为图像添加比例尺以供可视化。
- 在测量每张图像的平均灰度值以评估不同时间点的 GFP（用于 MP、PDCB1 和 PDLP5）或 CFP（用于苯胺蓝染色）荧光强度之前，先使用 Fiji 软件拆分通道。
- 在对 GFP（用于 MP、PDCB1 和 PDLP5）或 CFP（用于苯胺蓝染色）图像进行归一化处理之前，使用 Fiji 软件拆分通道。测量图像区域面积，并手动计数 PD 点状结构的数量，计算每 100 µm2 内的 PD 点状结构数量。
- 使用双因素方差分析（two-way ANOVA）结合 Tukey 多重比较检验23，通过统计与绘图软件确定不同样本及不同时间点之间的 P 值。
注意：对于单通道荧光图像，每个像素的灰度值代表该点的荧光强度24。本实验中采用平均灰度值来评估各样本在不同时间点的荧光强度。
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结果
为了促进对胞间连丝（PD）在植物生理学中功能及其与病原体相互作用的研究，开发了三种简单且可靠的用于PD定位的参考蛋白。选取了两种细胞内的PD蛋白，以及由植物烟草花叶病毒TVCV编码的病原体来源的运动蛋白（MP）。通过将自荧光报告蛋白EGFP融合至各蛋白的C末端，可视化这些蛋白的亚细胞定位。在另一种方法中，通过苯胺蓝染色标记与PD相关的胼胝质沉积物来观察PD。实验结果显示，PDLP5和MP均表现出点状的PD定位，其中MP还定位于细胞核内（图1A），这与先前报道一致25。相比之下，PDCB1似乎在PD和内质网（ER）之间分布（图1A）。对于在解读GFP标记蛋白亚细胞定位方面经验较少的研究人员，图1A还展示了EGFP在植物细胞中表达时典型的核质共分布模式。为验证PDCB1的ER信号，我们将PDCB1与一个ER标记蛋白共表达，发现PDCB1信号与ER标记信号重叠（图1B
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讨论
在植物正常发育和形态发生过程中，以及在植物与病原体互作期间，对植物细胞间通讯和细胞间运输进行任何细胞生物学研究，都需要检测并监测蛋白质（包括内源性蛋白和病原体编码的蛋白）向植物细胞间连接结构——胞间连丝（plasmodesmata, PD）的分选过程。若能使用可靠且稳定定位于PD的参考蛋白（无论是内源性蛋白还是病原体来源的蛋白），用以标记和可视化这些结构，则将极大促进上述实验的开展。本研究选取了三种已知定位于PD的蛋白来满足这一需求：拟南芥的PDLP5和PDCB1，以及烟草花叶病毒类病原体TVCV的运动蛋白MP。这些蛋白在其C末端融合了自荧光报告蛋白EGFP，通过在本氏烟草（Nicotiana benthamiana）叶片中瞬时表达这些融合蛋白，并结合共聚焦显微镜对表达组织进行分析，以确定其是否能够正确分选至PD。为了在这些组织中常规可视化PD结构，采用了标准的苯胺蓝染色法。
根据对胞间连丝（PD）结构和完整性的不同影响，植物病毒运动蛋白（MP）可分为两大类：一类是可逆地增加PD通透性，但不引起PD结构改变的MP；另一类则是通过改变PD结构来调控其通透性的MP。烟...
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披露
作者声明无竞争利益。
致谢
VC 实验室的工作得到了美国国立卫生研究院（NIH，项目号 R35GM144059）、美国国家科学基金会（NSF，项目号 MCB 1913165 和 IOS 1758046）以及美以双边农业研究与发展基金（BARD，项目号 IS-5276-20）向 VC 提供的资助。资助机构在研究设计、数据收集和解释，以及发表决定方面均未参与。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| ABT 单相电机 | BRANDTECH | ABF63/4C-7RQ | |
| Agrobacterium tumefaciens EHA105 | |||
| 污染控制 | CCI | ||
| Gateway BP Clonase II 酶混合物 | Invitrogen | #11789020 | |
| Gateway LR Clonase II 酶混合物 | Invitrogen | #11791020 | |
| GraphPad Prism 8.0.1. | GraphPad Software Inc. | ||
| Image J | 美国国立卫生研究院与光学和计算仪器实验室 | ||
| 激光扫描共聚焦显微镜 | Zeiss | LSM 900 | |
| Nicotiana benthamiana | 植物物种 | ||
| pDONR207 | Invitrogen | #12213013 | |
| Q5 高保真 DNA 聚合酶 | NEB | #M0491S |
参考文献
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