本研究提出了一种利用非线性光学光谱与质谱成像技术对软组织中药物进行关联成像的方法。将高分辨率皮肤成像与高灵敏度药物检测相结合，为研究药物在皮肤中的分布提供了有力手段，这对于开发更优的局部外用产品至关重要。
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本文内容
摘要
摘要
一种新型相关成像方法已得到开发，该方法结合亚微米级空间分辨率与基于光谱学和质谱成像的高灵敏度药物检测技术，用于可视化药物施用后在软组织中的化学物质分布。本示例中，该方法已在切除的皮肤组织上进行测试 体外 局部应用一种市售非甾体抗炎药物产品16小时。首先采用包括受激拉曼散射、二次谐波生成和双光子荧光显微在内的非破坏性光学光谱方法，对皮肤结构和形态进行成像。随后，利用飞行时间二次离子质谱法（ToF-SIMS）分析相同的皮肤组织样本，从而提高在表皮和真皮等最外层皮肤中检测双氯芬酸的灵敏度。通过设计图像配准方法，整合光学成像与质谱数据。该方法结合了无标记、高分辨率的组织结构可视化与高灵敏度的化学检测，为研究药物在皮肤中的分布以及潜在地在其他软生物组织中的分布提供了有力工具。
引言
了解活性药物成分在局部或全身给药后于软性生物组织中分布的速率、程度及其驱动因素，对于阐明组织特异性药物摄取、代谢和清除的机制（即更深入理解药物药代动力学）至关重要。本文介绍一种新型的关联成像方法，将非线性光学光谱技术与质谱成像技术相结合，可在同一样本组织中无需标记即可可视化组织结构及局部药物的分布情况1。
拉曼光谱（RS）已成为一种有价值的工具，可用于在细胞和组织内以高空间分辨率和分子特异性绘制药物分布图2。RS依赖于样品对光的非弹性散射3，通过样品中分子的特征振动模式实现详细的化学表征，且无需使用外源性标记物。然而，生成高分辨率图像所需的长时间采集可能会影响敏感生物样品的完整性。此外，在探测较深组织层时，组织对光的散射和吸收会衰减拉曼信号，进一步限制其灵敏度。受激拉曼散射（SRS）显微技术相较于传统RS是一项重大进步，它利用脉冲激光激发并检测受激拉曼信号4。SRS显微技术能够实现二维和三维快速成像，并具有高空间分辨率；当与二次谐波产生（SHG）和双光子激发荧光（TPEF）显微技术联用时，可提供关于结缔组织、胶原蛋白和弹性蛋白的全面图像1,5,
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方案
伦理声明：人类皮肤样本由查尔斯河实验室（CRL）在英国爱丁堡从英国格拉斯哥的 Tissue Solutions Ltd 公司获得。所有匿名样本均依照采集国的法律和伦理标准获取，并已获得捐赠者或其近亲的伦理批准和知情同意。
1. 皮肤切片
使用冷冻切片机对皮肤组织进行切片。
- 将处理过的皮肤圆片从 -20 °C 冰箱中取出，并从圆片中心切下一小块（约 1.0 cm × 1.0 cm）。
- 将样品置于恒冷切片机的样品头中，覆盖在冷冻水滴上。请勿使用最佳切割温度（OCT）包埋剂或其他包埋介质。
- 将刀片温度和样品温度分别设置为 -20 °C 和 -16 °C。
- 切下 30 µm 厚的切片，并贴附于玻璃盖玻片（#1.5，Fisher Scientific）上。
- 立即进行受激拉曼散射（SRS）和飞行时间二次离子质谱（ToF-SIMS）检测；或者，也可将样品真空封装后于 -80 °C 保存。
- 使用前干燥 20 分钟。
2. SRS 成像
使用相干拉曼显微镜进行SRS、SHG和TPEF显微成像。通过1031.2 nm的斯托克斯光束产生两个皮秒激光脉冲，并与可调谐的泵....
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结果
图1展示了基于特征的图像配准结果，显示了两个皮肤样本的SRS、SHG和SIMS配准叠加图像——其中一个样本使用安慰剂处理（图1a），另外两个样本分别使用Voltaren凝胶处理4小时（图1b）和16小时（图1c）。在该图像中，药物强度信号总和（来自ToF-SIMS测量）以蓝色表示，富含脂质的组织结构（特别是由SRS在2850 cm-1处CH2伸缩振动对比识别的角质层）以红色显示，富含胶原蛋白的组织区域（由SHG信号识别）以绿色表示。对感兴趣区域获取高分辨率图像的典型采集时间分别为：SRS最长240秒，SIMS最长800秒。然而，这些时间会根据所选区域的大小和像素驻留时间而变化。该方法可对双氯芬酸在后续皮肤层中的渗透进行直接且灵敏的可视化。应用4小时后，双氯芬酸出现在皮肤表层约50 µm深度范围.......
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讨论
该方法结合非线性光学光谱与质谱成像，可在亚微米空间分辨率和高灵敏度下检测药物在软组织中的分布。重要的是，该成像过程无需使用可能产生干扰的标记物，而基于荧光的显微技术通常需要此类标记物。该工作流程的进一步验证包括对组织切片进行常规苏木精和伊红（H&E）染色，以阐明皮肤结构，并实现所得的受激拉曼散射（SRS）与二次离子质谱（SIMS）图像的配准1。通过对光学光谱数据应用聚类分析，可清晰区分皮肤形态，表明这种非靶向方法在区分皮肤层次方面优于传统的H&E染色组织学成像。这种新型的关联成像方法首次证实了局部使用扶他林凝胶后皮肤中双氯芬酸储库的存在，并首次实现了对其形成与生长动力学的监测。
飞行时间二次离子质谱（ToF-SIMS）此前已被用于高灵敏度、高特异性地独立可视化人皮肤和重建表皮中渗透的药物以及内源性脂质18,19。将ToF-SIMS与受激拉曼散射（SRS）及二次谐波生成（SHG）联用，可进.......
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披露
MBB 是本研究资助机构 Haleon CH SARL 的雇员。
致谢
本研究由 Haleon CH SARL 资助。NAB 和 RHG 的部分工作得到了美国卫生与公共服务部（HHS）食品药品监督管理局（FDA）通过财政援助奖项（1-U01-FD006533）的支持。本研究还由英国商业、能源与产业战略部通过英国国家测量系统项目 NMS/ID74 和 NMS/ST18 提供资助。本文内容仅代表作者观点，不一定代表 FDA/HHS 或美国政府的官方立场，亦不构成其认可。NAB 对分析测量科学社区（Community for Analytical Measurement Science）通过分析化学信托基金（Analytical Chemistry Trust Fund）资助的 2020 年 CAMS 研究员奖所提供的支持表示感谢。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 相干拉曼显微镜 | Leica Microsystems | https://www.leica-microsystems.com/products/confocal-microscopes/p/leica-tcs-sp8-cars/ | |
| 人皮肤样本 | Tissue Solutions Ltd, Glasgow | ||
| Leica CM 1850 冷冻切片机 | Leica Biosystems | https://www.leicabiosystems.com/en-fr/histology-equipment/cryostats/leica-cm1850/ | 已停产 |
| PicoEmerald-S 激光系统 | APE Berlin | https://www.ape-berlin.de/en/cars-srs/ | |
| 飞行时间二次离子质谱仪 5（ToF SIMS 5） | IONToF GmbH | https://spectral.se/products/tof-sims-5 |
参考文献
- Belsey, N. A., et al. Visualisation of drug distribution in skin using correlative optical spectroscopy and mass spectrometry imaging. J Control Release. 364, 79-89 (2023).
- Pudlas, M., et al.
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重印与许可
