通过细胞外囊泡评估LC3-II的释放及其与细胞内LC3阳性囊泡积聚的关系

摘要

本文介绍了通过免疫印迹法简洁评估细胞外囊泡（EVs）中自噬体标志物LC3-II水平的方法。对EVs中LC3-II水平、自噬溶酶体形成以及omegasome形成的分析表明，当自噬体与溶酶体融合受阻时，STX6在释放LC3-II阳性EVs中具有新的作用。

摘要

（大）自噬是一种基本的细胞降解途径。在此过程中，称为自噬体的双层膜囊泡包裹细胞质内容物，随后与溶酶体融合以实现降解。除了经典的降解功能外，自噬相关基因还调控一种分泌途径，涉及炎性分子、组织修复因子和细胞外囊泡（EVs）的释放。值得注意的是，在影响脑和脊髓的神经退行性疾病中，致病性蛋白在细胞间传播的过程凸显了理解这一现象的重要性。最近的研究表明，肌萎缩侧索硬化症和额颞叶变性中的关键蛋白——43 kDa反式激活反应DNA结合蛋白（TDP-43），可通过富含自噬体标志物微管相关蛋白1A/1B轻链3B-II（LC3-II）的细胞外囊泡以自噬依赖的方式释放，尤其是在自噬体与溶酶体融合受阻时更为显著。

为了阐明LC3-II阳性细胞外囊泡（EV）形成与释放的潜在机制，必须建立一种简便且可重复的方法，用于评估细胞内和细胞外的LC3-II阳性囊泡。本研究提供了一种详细的实验方案，通过差速离心法分离细胞和EV组分，并利用免疫印迹法检测其中的LC3-II水平。巴佛洛霉素A1（Baf）作为一种抑制自噬体-溶酶体融合的试剂，被用作阳性对照，以提高细胞内和细胞外LC3-II阳性囊泡的水平。肿瘤易感基因101（TSG101）则作为多泡体的标志物。应用该方案发现，在Baf处理的细胞中，通过siRNA介导的突触融合蛋白6（STX6）基因敲低——该基因是散发性克雅氏病的遗传风险因素——可显著增加EV组分中的LC3-II水平，但对TSG101水平无明显影响。这些结果表明，STX6可能在自噬体-溶酶体融合受损的条件下，负向调控LC3-II通过EV的细胞外释放。结合已有的自噬评估方法，该方案为研究特定分子在LC3-II阳性EV形成与释放过程中的作用提供了重要依据。

引言

TAR DNA结合蛋白43（TDP-43）是一种广泛表达的异质性核核糖核蛋白，参与调控外显子剪接、基因转录和mRNA稳定性，这些功能对细胞存活至关重要^1,2。在肌萎缩侧索硬化症（ALS）和额颞叶变性（FTLD）等神经退行性疾病中，原本位于细胞核内的TDP-43蛋白异常积聚于细胞质中。这种定位改变导致TDP-43在细胞核中功能丧失，同时在细胞质中产生毒性获得性功能。TDP-43的病理性积聚始于脑和脊髓的特定区域，并以类似朊病毒的方式在这些区域间扩散，该过程与疾病进展密切相关³。然而，TDP-43病理在脑和脊髓中扩散的确切机制仍不清楚。

TDP-43 通过细胞外囊泡（EVs）分泌，且在肌萎缩侧索硬化症（ALS）和TDP-43蛋白病相关的额颞叶变性（FTLD-TDP）患者的血浆及脑脊液（CSF）中检测到升高的TDP-43水平^4,5,6。来自确诊为ALS和FTLD患者的脑脊液可诱导人胶质瘤细胞内源性TDP-43的细胞内错误定位和聚集⁷。因此，通过EVs释放到细胞外的TDP-43可能介导了TDP-43病理在细胞间的传播。

自噬是一种高度保守的细胞降解机制，其过程涉及将不需要的物质包裹在双层膜囊泡（即自噬体）中，自噬体以LC3为标志。这些自噬体与溶酶体相关膜蛋白1（LAMP1）阳性的溶酶体融合，形成自噬溶酶体（LC3⁺/LAMP1⁺），从而导致其内容物的降解⁸。组织学分析表明，在散发性肌萎缩侧索硬化症（ALS）患者神经元中，包裹包涵体的自噬体出现积聚⁹。一些家族性ALS和额颞叶变性伴TDP-43蛋白病（FTLD-TDP）的致病基因与自噬调控相关^10,11,12。这些发现提示，ALS和FTLD-TDP患者的自噬功能受到抑制。

先前的研究表明，当自噬体-溶酶体融合受到抑制时，TDP-43 会通过携带自噬体标志物 LC3-II 的细胞外囊泡（EVs）分泌¹³。自噬-溶酶体通路的失调不仅可能导致 TDP-43 在细胞内积聚，还可能促进 TDP-43 通过 EVs 向细胞外释放¹⁴。然而，目前尚不清楚携带 LC3-II 的 EVs 是如何被释放的，以及这一过程在 TDP-43 病理扩散中的重要性如何。

EVs 分为大 EVs（直径为 100 至 1000 nm），由细胞表面出芽产生；以及小 EVs（直径为 50 至 150 nm），由晚期内体膜向内出芽（即外泌体）和高尔基体产生。为了分别收集大 EVs 和小 EVs，我们进行连续离心，分别在 20,000 × g 和 110,000 × g 条件下离心收集沉淀。P1 EV 组分（20,000 × g 沉淀）用于收集大 EVs，P2 EV 组分（110,000 × g 沉淀）用于收集小 EVs¹⁵。通过免疫印迹检测连续离心获得的大 EVs 和小 EVs 中 LC3-II 水平的方法稳定且可重复¹⁶。除了分析 EVs 中的 LC3-II 水平外，分析自噬溶酶体和 omegasome 的形成有助于理解自噬失调如何导致 LC3-II 阳性 EVs 的释放。本文研究表明，当自噬体-溶酶体融合受阻时，SNARE 蛋白 syntaxin 6（STX6）在 LC3-II 阳性 EVs 释放过程中发挥抑制作用，而 STX6 通常促进转运囊泡向靶膜移动¹⁷。

方案

1. 从 HeLa 细胞培养基中制备细胞、P1 和 P2 EV 组分

1. 从 HeLa 细胞培养基中制备 P1 和 P2 EV 组分
   1. 第 1 天
      1. 使用细胞计数仪计数细胞，并将 1 × 10⁶ 个细胞接种至含有培养基的 6 cm 培养皿中，培养基成分为 DMEM 高糖培养基、10% FBS 和 1% 青霉素/链霉素。将细胞在 37 °C、5% CO₂ 及受控湿度条件下孵育 24 小时。
   2. 第 2 天（可选）
      1. 制备 20 µM 的 siRNA 溶液。
      2. 在低吸附离心管中混合 100 µL 低血清培养基和 3 µL siRNA，制备 溶液 A。
      3. 在低吸附离心管中混合 100 µL 低血清培养基和 5 µL 转染试剂，制备 溶液 B。
      4. 将 溶液 A 与 溶液 B 混合，室温（RT）孵育 5 分钟。
      5. 将 溶液 A 与 溶液 B 的混合物加入 HeLa 细胞培养用培养基中。将细胞在 37 °C、5% CO₂ 及受控湿度条件下孵育 24 小时。
   3. 第 3 天
      1. 用 PBS 洗涤细胞，并在 37 °C、5% CO₂ 及受控湿度条件下，加入 500 µL 0.25% 胰蛋白酶和 1 mM EDTA 溶液处理 5 分钟。
      2. 向细胞中加入 2.5 mL 培养基，使用带有 200 µL 吸头的巴斯德移液管制备单细胞悬液。
      3. 使用细胞计数仪计数细胞，并将 1 × 10⁶ 个细胞接种至 10 cm 培养皿中。将细胞在 37 °C、5% CO₂ 及受控湿度条件下孵育 24 小时。
         注：为进行免疫印迹分析所需的培养基中 EV 的收集，至少需准备 1 × 10⁶ 个细胞。
   4. 第 4 天
      1. 制备培养基（见步骤 1.1.1.1），其中添加溶剂（DMSO）或 100 nM 巴佛洛霉素 A1（Baf）。
      2. 用含溶剂或 100 nM Baf 的培养基处理细胞，并在 37 °C、5% CO₂ 及受控湿度条件下孵育 24 小时。
   5. 第 5 天
      1. 收集 10 cm 培养皿中的全部培养基，转移至 15 mL 离心管中，在 4 °C 条件下以 3,000 × g 离心 10 分钟，以去除细胞碎片。
         注：10 cm 培养皿中剩余的细胞将用于第 1.2.1 节。
      2. 为分离 P1 EV 组分，将 3,000 × g 离心后的上清液转移至离心管中，然后在 4 °C 条件下以 20,000 × g 离心 1 小时。
      3. 为分离 P2 EV 组分，将 20,000 × g 离心后的上清液转移至超速离心管中，然后在 4 °C 条件下以 110,000 × g 离心 1 小时。
      4. 用实验室擦拭纸擦去离心管内壁多余的水分，将沉淀用 50 µL 2x 上样缓冲液 [2.5% SDS、125 mM Tris-HCl 缓冲液（pH 6.8）、30% 甘油、10% 2-巯基乙醇、0.4% 溴酚蓝] 重悬，制备 P1 EV 组分。
      5. 倾去上清液，用实验室擦拭纸擦去超速离心管内壁多余的水分，然后将沉淀用 50 µL 2x 上样缓冲液重悬，制备 P2 EV 组分。
      6. 将 P1 和 P2 EV 组分在金属浴中 100 °C 孵育 10 分钟。
         注：在 20,000 × g 和 110,000 × g 离心后，切勿振荡离心管，以免意外丢弃沉淀。倾倒上清液时倾斜离心管后，应保持管体位置固定，防止沉淀再次浸入残留上清液中。
2. 从培养的 HeLa 细胞中制备细胞组分
   1. 第 5 天
      1. 将 10 cm 培养皿中的培养基转移至 15 mL 离心管后，用 PBS 洗涤 10 cm 培养皿中的细胞，并在 37 °C、5% CO₂ 及受控湿度条件下，加入 2 mL 0.25% 胰蛋白酶和 1 mM EDTA 溶液处理 5 分钟。
      2. 向细胞中加入 8 mL 生长培养基，然后使用带有 200 µL 吸头的巴斯德移液管吹打细胞，制备单细胞悬液。
      3. 将细胞悬液转移至 15 mL 离心管中，在 4 °C 条件下以 1,000 × g 离心 10 分钟。
      4. 用移液器吸除上清液，向细胞沉淀中加入 PBS，然后在 4 °C 条件下以 1,000 × g 离心 5 分钟。
      5. 用移液器吸除 PBS，并在含 1% 萨尔科西尔的 1 mL A68 缓冲液 [10 mM Tris-HCl 缓冲液，pH 7.5，0.8 M NaCl，1 mM 乙二醇双(β-氨基乙基醚)-N,N,N,N-四乙酸（EGTA）] 中超声处理细胞沉淀。
      6. 使用 BCA 蛋白检测试剂盒测定细胞裂解液的蛋白浓度。
      7. 将 300 µL 细胞裂解液与 100 µL 4x 上样缓冲液混合，在金属浴中 100 °C 孵育 10 分钟，制备细胞组分。

2. 免疫印迹分析

1. 通过 SDS-PAGE 分离各样品中的等量蛋白质¹⁸。
2. 将分离后的蛋白质转移至聚偏二氟乙烯（PVDF）膜上。
3. 转移完成后，用封闭剂在室温下封闭膜 20 分钟。
4. 将封闭后的膜在含有 10%（v/v）小牛血清的 Tris 缓冲液中，与指定的一抗在室温下孵育过夜。
5. 用 Tris 缓冲液洗涤膜 5 秒，然后在室温下与生物素标记的二抗孵育 2 小时。
6. 用 Tris 缓冲液洗涤膜 5 秒，然后在室温下与试剂盒中的溶液 A 和溶液 B（各 0.4% v/v）的 Tris 缓冲液孵育 1 小时。
7. 用 PBS 洗涤膜，然后在含有 0.04%（w/v）二氨基联苯胺、0.8%（w/v）NiCl₂·6H₂O 和 0.3%（v/v）H₂O₂ 的 PBS 中孵育，以进行条带的比色检测。
   注意：也可采用化学发光法检测信号。
8. 使用扫描仪对膜图像进行数字化，并使用 Fiji 软件进行密度分析。
   1. 在 Fiji 中打开数字化图像，点击 Image | Type | 8-bit 将 RGB 彩色图像转换为 8 位图像。
   2. 点击 矩形工具，通过拖动调整矩形大小以包围条带区域，然后点击 Analyze | Gels | Select First lane 确定待分析的条带。
   3. 将矩形移至第二条及后续条带位置，并通过点击 Analyze | Gels | Select Next Lane 依次确定待分析条带。
   4. 识别到最后一条带后，点击 Analyze | Gels | Plot Lanes 对矩形区域进行密度扫描测量。
   5. 用直线包围条带的信号区域，点击 魔棒工具，并在区域内点击以计算条带的信号强度。

3. 自噬体和自噬溶酶体数量的分析

1. 第1天
   1. 使用细胞计数仪对HeLa细胞进行计数，并将1 × 10⁵个表达LAMP1-GFP和mCherry-LC3的HeLa细胞接种至3.5 cm培养皿中。于37 °C、5% CO₂及恒定湿度条件下培养24小时。
2. 第2天（可选）
   1. 在3.5 cm培养皿中执行第1.1.2节所述步骤。
3. 第3天
   1. 弃去3.5 cm培养皿中的培养基。
   2. 用PBS洗涤细胞，加入400 µL含0.25%胰蛋白酶和1 mM EDTA的溶液，于37 °C、5% CO₂及恒定湿度条件下孵育5分钟。
   3. 向细胞中加入1.6 mL生长培养基，使用巴斯德移液管吹打制成单细胞悬液。
   4. 使用细胞计数仪对细胞进行计数，并将1 × 10⁴个细胞接种至8孔腔室盖玻片上。于37 °C、5% CO₂及恒定湿度条件下培养24小时。
      注：根据第3.4.2节所述，分别用DMSO或Baf处理，为对照组和STX6敲低细胞各准备两个腔室孔。
4. 第4天
   1. 准备不含酚红的生长培养基（无酚红DMEM，含10% FBS和1%青霉素/链霉素），其中分别加入溶剂（DMSO）或100 nM Baf（溶于DMSO）。
   2. 将原培养基更换为不含酚红并含有溶剂或100 nM Baf的培养基，孵育4小时。
      注：为评估Baf对自噬体和自噬溶酶体数量的影响，需设置经溶剂处理的细胞作为对照组。
   3. 在观察前，用0.33 µg/mL Hoechst 33342对细胞核染色30分钟。
   4. 使用共聚焦激光显微镜配备60倍物镜进行活细胞成像，并采集十个不同的视野图像。
      1. 在Fiji中打开RGB合并图像，点击图像 | 颜色 | 拆分通道，将其拆分为红、绿、蓝三个独立的图像通道。
      2. 对每张图像的红、绿信号，通过点击图像 | 调整 | 阈值设置固定阈值。
      3. 点击分析 | 分析颗粒，统计红或绿信号阳性的区域数量。勾选汇总框，点击确定，记录计数结果，以识别与自噬体和溶酶体相关的囊泡。
      4. 为将绿色图像叠加到红色图像上，点击编辑 | 粘贴控制，将传输模式设为AND。复制绿色图像并粘贴至红色图像上进行合并，以突出显示红绿信号双阳性的区域。
      5. 为识别自噬溶酶体数量，点击分析 | 分析颗粒，统计红绿信号双阳性区域的数量。勾选汇总框，点击确定，记录计数部分的数值，以识别与自噬体和溶酶体相关的囊泡。
   5. 将自噬溶酶体和自噬体的总数除以细胞总数，计算每个细胞中自噬溶酶体和自噬体的数量。
      注：在三次独立实验中，每组至少计数35个细胞。

4. 成泡沫体形成的分析

1. 第1天
   1. 使用细胞计数器计数HeLa细胞数量，并将1 × 10⁵个细胞接种至3.5 cm培养皿中。在37 °C、5% CO₂及湿度控制条件下培养24小时。
2. 第2天（可选）
   1. 执行第1.1.2节中描述的步骤。
3. 第3天
   1. 按照步骤3.3.1–3.3.2所述方法制备单细胞悬液。
   2. 使用细胞计数器计数细胞，并将1 × 10⁵个细胞接种至3.5 cm培养皿中。在37 °C、5% CO₂及湿度控制条件下培养24小时。
4. 第4天
   1. 在低吸附离心管中混合1 µg pEGFP-C1-hAtg13质粒、3 µL DNA转染试剂和100 µL低血清培养基。将混合物孵育20分钟，然后加入培养基中。
   2. 在37 °C、5% CO₂及湿度控制条件下继续培养细胞24小时。
5. 第5天
   1. 按照步骤3.3.1–3.3.2所述方法对细胞进行胰酶消化处理。
   2. 向细胞中加入2.5 mL完全培养基。使用巴斯德移液管吹打混匀，制备单细胞悬液。
   3. 使用细胞计数器计数细胞，并将1 × 10⁴个细胞接种至 8孔盖玻片中。在37 °C、5% CO₂及湿度控制条件下培养24小时。
6. 第6天
   1. 按照步骤3.4.1–3.4.4，使用共聚焦激光显微镜对第4.5.3步所得细胞进行活细胞成像。采集十个不同的图像帧。
      1. 按照步骤3.4.4.1–3.4.4.3，将RGB合并图像拆分为红色、绿色和蓝色各通道图像，对每张图像中的绿色信号设定统一阈值，并测定GFP信号强度。记录总面积部分的数值，以确定GFP-ATG13的信号强度。
      2. 将总信号强度除以检测的细胞数，计算单个细胞的信号强度。
         注意：在三次独立实验中，每次至少计数34个细胞。

结果

如先前研究所示，Baf处理增加了EV富集组分中TSG101（P1：P < 0.01，P2：P = 0.012，通过EZR¹⁹中的双因素方差分析确定）和LC3-II（P1：P < 0.01，P2：P < 0.01，通过EZR¹⁹中的双因素方差分析确定）的水平。值得注意的是，Baf处理还增加了EV组分中STX6的水平（P1：P < 0.01，P2：P < 0.01，通过EZR¹⁹中的双因素方差分析确定）（图1A），提示STX6可能是EV的组分之一。在EV组分中未检测到增殖细胞核抗原（PCNA）。细胞组分中STX6的免疫印迹结果显示，STX6的水平在siRNA敲低后降低了一半（图1B）。STX6敲低在载体处理和Baf处理条件下，对细胞组分和EV组分中的TSG101水平均无影响（图1C）。然而，在载体处理条件下，STX6敲低增加了细胞组分中LC3-II的水平，但在Baf处理条件下则未见此效应。在Baf处理条件下，STX6敲低还增加了EV组分中LC3-II的水平（图1D）。这些结果表明，即使敲低效率并不显著，用于通过免疫印迹检测EV中LC3-II的方法也具有足够的灵敏度。此外，这些结果提示，STX6敲低可增加细胞内自噬小体数量，并在Baf处理条件下增强与自噬小体相关的囊泡的胞外释放。

为了进一步研究STX6基因敲低是否影响细胞内自噬体和自噬溶酶体的数量，使用自噬体标记物mCherry-LC3和溶酶体标记物LAMP1-GFP对自噬体和溶酶体进行可视化观察。共聚焦活细胞成像显示，在表达LAMP1-GFP和mCherry-LC3的HeLa细胞中存在GFP和mCherry阳性囊泡（图2A）。自噬溶酶体被鉴定为GFP和mCherry双阳性囊泡，而自噬体被鉴定为GFP阴性、mCherry阳性囊泡。STX6基因敲低在溶剂处理条件下增加了自噬体和自噬溶酶体的数量（图2B、C）。然而，在Baf处理条件下，STX6基因敲低对自噬体和自噬溶酶体数量无显著影响（图2B、C）。

为了确定由于STX6敲低导致的细胞内自噬体数量增加是否源于自噬体生成增强，我们通过检测omegasome（自噬体形成所必需的过程）标志物GFP-ATG13的信号强度来评估omegasome的形成。共聚焦活细胞成像提供了GFP-ATG13的整合图像，表明omegasome的形成（图3A）。STX6敲低降低了GFP-ATG13的信号强度（经EZR¹⁹中双因素方差分析确定，P = 0.023）。虽然在载体处理条件下，STX6敲低对GFP-ATG13信号强度无显著影响，但在Baf处理条件下显著降低了该信号（图3B）。综上所述，这些结果表明，STX6敲低增加了LC3-II阳性囊泡的释放，从而导致自噬体相关囊泡的积累。

图1：转染对照或STX6 siRNA并在溶剂或Baf处理条件下HeLa细胞的全细胞、P1和P2组分的免疫印迹结果。 HeLa细胞在转染对照或STX6 siRNA后，用溶剂（DMSO）或100 nM Baf处理24小时。分离全细胞、P1（20,000 × g沉淀）和P2（110,000 × g沉淀）组分。(A) 各组分中STX6、TSG101、LC3和PCNA的代表性免疫印迹图像。(B-D) 基于免疫印迹图像对(B) STX6、(C) TSG101和(D) LC3-II进行密度分析。信号强度以经溶剂或Baf处理的对照或STX6 siRNA转染细胞为归一化基准。柱状图表示均值 ± S.E.M.（N = 3）。*表示通过Excel中双尾非配对t检验，P < 0.05。缩写：STX6 = syntaxin 6；Baf = bafilomycin A1；DMSO = dimethyl sulfoxide；TSG101 = tumor susceptibility gene 101；LC3 = microtubule-associated proteins 1A/1B light chain 3B；PCNA = proliferating cell nuclear antigen；S.E.M. = standard error of the mean。请点击此处查看该图的放大版本。

图2：在载体处理和Baf处理条件下，共表达Lamp1-GFP和mCherry-LC3的HeLa细胞经对照或STX6 siRNA转染后的共聚焦图像分析。（A）稳定表达LAMP1-GFP和mCherry-LC3的HeLa细胞转染对照或STX6 siRNA 48小时后，再分别用DMSO或400 nM Baf处理4小时。比例尺 = 20 µm。（B,C）使用Fiji软件对（B）自噬体（LAMP1-GFP阴性、mCherry-LC3阳性点状结构）和（C）自噬溶酶体（LAMP1-GFP与mCherry-LC3双阳性点状结构）进行定量分析。柱状图数据以均值 ± 标准误（S.E.M.）表示（N = 3）。* 表示 P < 0.05，基于Excel中双尾非配对t-检验结果。缩写：Lamp1 = 溶酶体相关膜蛋白1；LC3 = 微管相关蛋白1A/1B轻链3B；STX6 = 突触融合蛋白6；Baf = 巴佛洛霉素A1；GFP = 绿色荧光蛋白；S.E.M. = 均值标准误。请点击此处查看该图的放大版本。

图3：表达GFP-ATG13的HeLa细胞经对照或STX6 siRNA转染后，在溶剂或Baf处理条件下的共聚焦成像。（A）HeLa细胞先转染对照或STX6 siRNA，随后转染pEGFP-C1-hAtg13，并用DMSO或400 nM Baf处理4小时。比例尺 = 20 µm。（B）通过将各实验条件下的信号强度归一化至经Baf处理的对照siRNA转染细胞的信号强度，计算相对信号强度。柱状图显示三次独立实验的结果，以均值±标准误（S.E.M.）表示（N = 3）。* 表示通过Excel中双尾非配对t检验分析，P < 0.05。缩写：hAtg13 = 人自噬相关基因13；STX6 = syntaxin 6；Baf = bafilomycin A1；DMSO = dimethyl sulfoxide；S.E.M. = standard error of the mean。 请点击此处查看本图的放大版本。

补充图 S1：转染对照 siRNA 并经 Baf 处理的 HeLa 细胞的全细胞、P1 和 P2 组分的免疫印迹分析。 HeLa 细胞转染对照 siRNA 后，用 100 nM Baf 处理 24 小时。随后制备各组分：全细胞组分、P1 组分（20,000 × g 沉淀）和 P2 组分（110,000 × g 沉淀）。代表性免疫印迹图像显示了 ULK1 和 PCNA 在各组分中的表达水平，用于比较。缩写：Baf = bafilomycin A1；ULK1 = unc-51 like autophagy activating kinase 1；PCNA = proliferating cell nuclear antigen。 请点击此处下载该文件。

讨论

免疫印迹研究揭示了细胞组分、富含微囊泡的P1细胞外囊泡（EV）组分以及富含外泌体的P2 EV组分中LC3-II和TSG101的水平。活细胞成像用于观察自噬体、自噬溶酶体和omegasomes，以探究STX6基因敲低是否影响自噬过程。这些综合结果表明，STX6基因敲低会影响LC3-II阳性EV的释放，可能与自噬通路的失调有关。该方法的一个关键优势在于能够区分来源于不同途径的大、小EV。利用针对微囊泡、外泌体或高尔基体的特异性标志物进行流式细胞术分析，可进一步阐明STX6基因敲低如何影响LC3-II阳性囊泡的释放。

然而，免疫印迹研究的一个局限性在于，尚不清楚在Baf处理条件下，STX6 敲低后EV组分中LC3-II水平的升高是由于释放的LC3-II阳性囊泡数量增加，还是每个EV中LC3-II水平升高所致。为了区分这两种可能性，可通过纳米颗粒追踪分析或流式细胞术分析对囊泡进行计数，以确定LC3-II阳性囊泡的数量是否增加，或每个囊泡中的LC3-II水平是否升高。

该实验方案中的一个关键步骤是对培养基进行分级分离，以制备细胞外囊泡（EV）组分。EVs 在离心管中表现为微小的沉淀物。为了制备可比的 EV 组分，离心后必须仔细转移或弃去上清液，以避免稀释 EV 沉淀物中的蛋白质浓度。为检测细胞组分对 EV 组分的污染情况，本研究比较了细胞质蛋白 unc-51 样自噬激活激酶 1（ULK1）和核蛋白 PCNA 在不同组分间的表达水平（补充图 S1）。细胞组分中的蛋白质浓度通常反映细胞数量，但细胞内蛋白质浓度会受到细胞周期阶段²⁰或蛋白质稳态失衡²¹的影响。自噬对于维持蛋白质稳态至关重要²²。通过 STX6 沉默或 Baf 处理导致的自噬失调可能会影响蛋白质浓度，且该影响与细胞数量无关。

通过siRNA转染实现STX6基因的敲低，通过DNA转染实现GFP-ATG13的过表达。转染效率受细胞类型、密度和数量的影响。siRNA序列的有效匹配也可能影响敲低效率。当转染效率较低时，需进行相应调整。

目前的结果表明，在巴佛洛霉素（Baf）处理条件下，STX6 敲低增加了EV组分中自噬小体标志物LC3-II的水平，但不影响TSG101的水平。这提示当自噬小体-溶酶体融合受到抑制时，STX6抑制来源于自噬小体的囊泡释放，但不影响来源于多泡体（MVBs）的囊泡释放。

STX6 敲低在生长条件下也增加了细胞内 LC3-II 水平，表明 STX6 调控自噬过程。事实上，STX6 敲低增加了自噬小体和自噬溶酶体的数量，但并未促进omegasome的形成。自噬溶酶体的成熟可引发自噬性溶酶体重建²³。STX6 可能介导了自噬溶酶体的成熟过程，其功能缺失可能导致未成熟自噬溶酶体数量增加，从而因抑制自噬性溶酶体重建而扰乱自噬小体与溶酶体的融合。

Baf处理增加了EV组分中的STX6水平，即使其表达被下调。先前的研究表明，当溶酶体功能受到抑制时，与自噬体相关的囊泡会以EV形式释放^13,14。已知STX6定位于与自噬体相关的囊泡，例如含有A族链球菌（GAS）的类似自噬体的空泡²⁴。因此，当自噬体-溶酶体融合受到抑制时，STX6可能定位于作为EV释放的自噬体相关囊泡上。

TDP-43 病理的扩散与肌萎缩侧索硬化症（ALS）和TDP-43蛋白病相关的额颞叶变性（FTLD-TDP）的进展密切相关³。尽管目前尚不清楚 TDP-43 病理如何在脑和脊髓中扩散，但细胞外囊泡（EV）通路可能介导了这一过程。先前的研究表明，自噬-溶酶体通路的失调会导致含有 TDP-43 的 LC3-II 阳性细胞外囊泡的释放¹³。本研究提示，当自噬体-溶酶体融合受到抑制时，STX6 在调控细胞外囊泡释放中发挥一定作用。通过免疫印迹法检测细胞及细胞外囊泡组分中 LC3-II 水平的方法，将在未来的研究中具有重要参考价值。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
0.25 % 胰蛋白酶 EDTA	Fujifilm Wako	201-16945
10 cm 培养皿	Thermo Fisher Scientific	150464
15 mL 离心管	Thermo Fisher Scientific	339650
200 μL 移液枪头	Nippon Genetics	FG-301	移液
2-巯基乙醇	Nacalai Tesque	21417-52	用于 样品缓冲液的试剂
3,3'-二氨基联苯胺四盐酸盐	Nacalai Tesque	11009-41	用于 DAB 溶液的试剂
3.5 cm 培养皿	Thermo Fisher Scientific	150460
6 cm 培养皿	TrueLine	TR4001
铝块恒温浴（干式恒温仪）	EYELA	273860
抽滤器	SANSYO	SAP-102	吸取溶液
Avanti JXN-30	Beckman Coulter	B34193
巴佛洛霉素 A1	Adipogen	BVT-0252
生物素标记的山羊抗兔 IgG 抗体	Vector Laboratories	BA-1000	免疫印迹二抗
生物素标记的马抗小鼠 IgG 抗体	Vector Laboratories	BA-2000	免疫印迹二抗
Blocking One	Nacalai Tesque	03953-95	用于免疫印迹的封闭剂
溴酚蓝	Nacalai Tesque	05808-61	用于 样品缓冲液的试剂
小牛血清	cytiva	SH30073.03
CanoScan LiDE 220	Canon	CSLIDE220	扫描仪
Centrifuge 5702 R	eppendolf	5703000039
双腔计数板	Bio-Rad	1450015J	细胞计数
Digital Sonifier 450	BRANSON
二甲基亚砜	nacalai tasque	09659-14	溶剂
DMEM 高糖培养基	Nacalai Tesque	08458-45	培养基
无酚红 DMEM 培养基	Nacalai Tesque	08489-45	培养基
EGTA	Dojindo	348-01311	用于 A68 溶液的试剂
Excel	Microsoft	version 16.16.27	统计分析
EZR	Reference No. 24	version 1.68	统计分析
FBS	Sigma	173012	培养基
Fiji	NIH		图像分析工具
甘油	Nacalai Tesque	09886-05	用于 样品缓冲液的试剂
Hoechst33342	Dojindo	H342
过氧化氢	Fujifilm Wako	080-0186	用于 DAB 溶液的试剂
Kimwipe S-200	NIPPON PAPER CRECIA	62011	清洁擦拭纸
低吸附离心管	Nippon Genetics	FG-MCT015CLB	siRNA 和 DNA 转染
LSM780 共聚焦激光显微镜	Carl Zeiss
单克隆小鼠抗 LC3 抗体	MBL	M186-3	免疫印迹一抗
氯化镍(II)六水合物	Fujifilm Wako	149-01041	用于 DAB 溶液的试剂
N-月桂酰肌氨酸钠盐	Nacalai Tesque	20117-12
Optima XE-90 超速离心机	Beckman Coulter	A94471
Opti-MEM I 减血清培养基	Thermo Fisher Scientific	31985-070	siRNA 和 DNA 转染
pEGFP-C1-hAtg13	Addgene	22875
青霉素/链霉素	Nacalai Tesque	26253-84	培养基
Pierce BCA 蛋白检测试剂盒	Thermo Fisher Scientific	23225
多克隆兔抗 PCNA 抗体	BioAcademia	70-080	免疫印迹一抗
多克隆兔抗 syntaxin 6 抗体	ProteinTech	10841-1-AP	免疫印迹一抗
多克隆兔抗 TSG101 抗体	ProteinTech	28283-1-AP	免疫印迹一抗
多克隆兔抗 ULK1 抗体	ProteinTech	20986-1-AP	免疫印迹一抗
聚偏二氟乙烯膜	Milliore	IPVH00010	用于免疫印迹的试剂
R	R development core team	version 4.4.1	统计分析
RNAiMAX	Thermo Fisher Scientific	13778	siRNA 转染试剂
siRNA STX6	Thermo Fisher Scientific	HSS115604	用于转染的 siRNA
氯化钠	Nacalai Tesque	31320-05	用于 Tris 缓冲液和 A68 溶液的试剂
十二烷基硫酸钠	Fujifilm Wako	192-13981	用于 样品缓冲液的试剂
SPARK 微孔板读板仪	TECAN
Stealth RNAi 阴性对照双链体，Med GC	Thermo Fisher Scientific	12935300	siRNA 转染
蔗糖	Fujifilm Wako	193-00025	用于 A68 溶液的试剂
TC20 自动细胞计数仪（带热敏打印机）	Bio-Rad	1450109J1	细胞计数
恒温仪	TOKYO RIKAKIKAI	MG-3100	孵育
TransIT-293	Mirus Bio	MIR 2700	DNA 转染试剂
TransIT-LT1	Mirus Bio	MIR2300	DNA 转染试剂
三羟甲基氨基甲烷	Nacalai Tesque	35406-75	用于 Tris 缓冲液、样品缓冲液和 A68 溶液的试剂
0.40% 台盼蓝染液	Bio-Rad	1450021	细胞计数
超透明开口离心管，16 x 96 mm	Beckman Coulter	361706	用于收集 P1 EV 组分
超透明离心管，14 x 89 mm	Beckman Coulter	344059	用于收集 P2 EV 组分
Vectastain ABC 标准试剂盒	Vector Laboratories	PK-4000	免疫印迹
洗瓶	As One	1-4640-02	洗涤膜
μ-Slide 8 孔高壁板	ibidi	80806