用于单分子 FRET-TIRF 显微镜的长 RNA 的荧光末端标记和封装

Summary

本文介绍了长 RNA 在末端位置的双色标记，以及通过包埋在磷脂囊泡中实现其表面固定，用于单分子 FRET TIRF 显微镜应用。结合这些技术可以在单分子水平上精确可视化和分析 RNA 动力学。

Abstract

单分子 Förster 共振能量转移 （smFRET） 通过精确观察其构象随时间的变化，在研究动态生物分子方面表现出色。为了用 smFRET 监测 RNA 动力学，我们开发了一种用 FRET 对荧光团在其末端共价标记 RNA 的方法。这种直接末端标记策略通过碳二亚胺 （EDC）/N-羟基琥珀酰亚胺 （NHS） 激活靶向 5'-磷酸盐，通过高碘酸盐氧化靶向 3'-核糖，无论其大小和序列如何，都可以适应其他 RNA，以独立于人工修饰进行研究。此外，5'-EDC/NHS 激活对所有具有 5'-磷酸盐的核酸都具有普遍意义。使用市售化学品无需合成 RNA 特异性探针。

全内反射荧光 （TIRF） 显微镜要求表面固定的目标分子位于要照亮的消逝区域内。将 RNA 分子保持在消逝场内的一种复杂方法是将它们封装在磷脂囊泡中。包埋受益于两全其美的优势，将分子拴在表面，同时实现分子的自由扩散。我们确保每个囊泡仅包含单个 RNA 分子，从而实现单分子成像。在对目标 RNA 进行双端标记和封装后，smFRET 测量可提供 RNA 行为的动态和详细视图。

Introduction

Förster 共振能量转移 （FRET） 是一种强大而灵敏的技术，用于在纳米尺度上研究生物分子的分子间和分子内相互作用。它基于从激发的供体分子到附近受体分子的非辐射能量转移，其距离通常在 1 nm 到 10 nm 之间。供体染料和受体染料之间的距离决定了这种能量转移的效率，使 FRET 成为研究分子动力学、构象变化和各种生物系统（包括 RNA）中相互作用的宝贵工具 ^1,2。全内反射荧光 （TIRF） 显微镜已被证明是 smFRET 研究的强大技术，因为它仅选择性地照亮表面附近的分子，从而允许以高空间和时间分辨率对单个分子进行 FRET 动力学。然而，在进行 smFRET-TIRF 实验之前，必须首先用适当的 FRET 对对目标分子进行荧光标记，然后固定在显微镜表面上。此处描述的 smFRET-TIRF 方案使用来自酿酒酵母线粒体的野生型 II 内含子 Sc.ai5γ 进行验证，其两侧是其两个外显子序列（915 个核苷酸）³。有关荧光标记 II 组内含子及其在 smFRET TIRF 显微镜中固定化的更详细视图，请参阅我们的评论⁴。

理想的位点特异性 RNA 标记策略允许在预定位置精确掺入供体染料和受体染料，而不会改变 RNA 的结构或功能，从而确保准确高效的 FRET 测量。由于四个核碱基之间的化学相似性，这很有挑战性，这使得选择性标记复杂化。末端标记通过靶向 5'-磷酸和 3'-核糖，将供体和受体染料连接到 RNA 末端。这种方法提供了一种微创方法，同时仍能提供对结构动力学和相互作用的宝贵见解。II 组内含子在 Mg²⁺ 存在下自剪接的能力限制了金属离子依赖性酶的使用。在这里，我们提出了一种绕过酶或合成专用探针的双末端标记长 RNA 和催化活性 RNA（核酶）的方法。

在 TIRF 显微镜检查中，将 RNA 分子拴在表面的一种常用方法是将生物素部分直接与 RNA 共价连接，或将携带生物素的反义寡核苷酸 （ASO） 杂交^5,6,7。然而，由于 RNA-表面相互作用，这种直接固定方法可能会引入伪影，可能导致 RNA 错误折叠⁸。减轻这些固定化伪影的一种优雅解决方案是将 RNA 封装在表面附着的纳米级磷脂囊泡中 ^9,10,11。这些囊泡直径约为 100 nm，通过生物素-链霉亲和素键锚定在表面 12,13,14，^允许 RNA 在内部自由扩散，同时允许离子跨脂质膜交换¹⁰。在共价标记大功能性 RNA³ 后，我们提出了一种通过结合已建立的表面钝化和囊泡包封方案将此类 RNA 封装在磷脂囊泡中的方法，以适应保留 RNA 功能 10,11,14。这种双端标记和封装方法实现了 smFRET TIRF 显微镜下功能性 RNA 的高单包埋率。

Protocol

1. RNA 双末端标记

注:以下方案描述了通过将供体染料 （sCy3） 共价连接到5'-磷酸盐和受体染料（Cy5）与3'-核糖共价连接，用FRET荧光团对RNA进行位点特异性标记。选择具有催化活性的长 RNA，即 II 组内含子核酶，作为目标 RNA。 表 1 和 图 1 总结了这种双端标记协议。在黑暗条件下执行涉及荧光团的所有步骤。

第 0 天	▪ 将 50-75 μg RNA 分装至每 1.5 mL 试管总体积为 55 μL。
第 1 天	5′-磷酸盐活化
	▪ 将 45 μL 新鲜制备的 EDC-NHS，pH 6.0 溶液添加到 ddH2O 中的 RNA 中，最终体积为 100 μL，充分混合并在 25 °C 和 500 rpm 下孵育 4 小时。
	▪ 纯化第 1 轮:过夜 EtOH 沉淀。
第 2 天	▪ 沉淀 5′ 活化的 RNA，洗涤并干燥。
	5′-染料附件
	▪ 重悬于 95 μL 的 100 mM MOPS，pH 7.5 中。
	▪ 加入 5 μL 2 mM 胺官能化染料溶液。
	▪ 充分混合并在 25 °C 和 500 rpm 下孵育 16 小时。
第 3 天	▪ 纯化第 2 轮:EtOH 沉淀。
第 4 天	▪ 沉淀 5′ 活化的 RNA，洗涤并干燥。
	阻塞步骤
	▪ 重悬于 100 μL 的 100 mM Tris-HCl（pH 值为 7.5）中，并在 25 °C 和 500 rpm 下孵育 2 小时。
	▪ 净化第 3 轮:离心过滤。
	→ 洗脱 5′ 标记的 RNA。
第 5 天	3′-高碘酸盐氧化
	▪ 将 RNA 与 20 mM NaIO4 在 50 mM NaOAc 缓冲液（pH 值为 5.5，终体积为 100 μL）中在 25 °C 和 500 rpm 下孵育 2 小时。
	▪ 淬灭过量的高碘酸盐:加入 30 μL 50% 甘油，充分混合，并在 25 °C 和 500 rpm 下孵育 30 分钟。
	▪ 纯化第 4 轮:过夜 EtOH 沉淀。
第 6 天	▪ 沉淀 3′-氧化的 RNA，洗涤并干燥。
	3′-染料附件
	▪ 重悬于 95 μL 的 50 mM NaOAc（pH 6.0）中。
	▪ 加入 5 μL 2 mM 酰肼官能化染料溶液。充分混合并在 25 °C 和 500 rpm 下孵育 16 小时。
第 7 天	▪ 纯化第 5 轮:EtOH 沉淀。
第 8 天	▪ 沉淀标记的 RNA，洗涤并干燥。
	▪ 离心过滤。
	→ 洗脱双端标记的 RNA。

表 1:RNA 双端标记的方案摘要。请点击此处下载此表格。

图 1:靶向 5'-磷酸和 3'-核糖的双端标记实验流程。 在 NHS 存在下使用 EDC 激活 5'-磷酸盐，随后与胺官能化染料偶联。RNA 的 3'-二醇部分被高碘酸盐活性氧化成二醛，二醛进一步与酰肼官能化染料反应。对于双端标记，重要的是从 5' 标记开始以防止交叉标记，然后是带有中间封闭步骤的 3' 标记。缩写:EDC = 碳二亚胺;NHS = N-羟基琥珀酰亚胺;MOPS = 3-吗啉代丙烷-1-磺酸;NaOAc = 乙酸钠。 请单击此处查看此图的较大版本。

1. 5'-末端标记:通过 EDC/NHS 激活靶向 5'-磷酸盐
   注:这种 5'-标记方法不仅适用于 RNA，也适用于任何含有 5'-磷酸盐的单链核酸。反应的特异性受 pH 依赖性控制，尽管 RNA 骨架中存在多个磷酸盐，但仅允许 5'-磷酸盐成为位点特异性靶向。在 pH 值为 6.0 时，5'-磷酸盐对碳二亚胺的独特反应性是由于其特定的质子化状态，其中两个氧被去质子化，一个氧保持质子化。这使得 5'-磷酸盐具有反应性，而完全去质子化的骨架磷酸盐保持无反应性，从而能够通过 EDC/NHS 靶向选择性标记 5'-末端。
   1. 制备 EDC-NHS-NaOAc，pH 6.0 溶液。将 1.5 mg EDC 和 2.0 mg NHS 每等分试样混合在 35 μL ddH₂O 和 10 μL 0.5 M NaOAc，pH 6.0（用冰醋酸调节 pH 值）中。
   2. 将目标 RNA 分装，在 55 μL ddH₂O 中每管含有约 50-75 μg RNA。向 RNA 中加入 45 μL EDC-NHS-NaOAc，pH 6.0 混合物，总体积达到 100 μL，终浓度为 78 mM EDC、174 mM NHS 和 50 mM NaOAc，pH 6.0。在 25 °C 下孵育 4 小时，同时以 500 rpm 摇动。
      注:此处，70 μg 对应于 250 pmol 的 体外 转录的 915 nt RNA 和 2.5 μM，最终反应体积为 100 μL。
   3. 纯化第 1 轮:通过 EtOH 沉淀纯化 5'-磷酸活化的 RNA。
   4. 在水中制备 2 mM 磺化 Cyanine3 胺 （sCy3-amine） 溶液。
   5. 将活化的 RNA 沉淀重悬于 95 μL 100 mM 3-吗啉代丙烷-1-磺酸 （MOPS） 缓冲液中，pH 值为 7.5（用 NaOH 调节 pH 值）。向活化的 RNA 中加入 5 μL 的 2 mM sCy3-胺溶液。通过在 25 °C 下孵育 16 小时，同时以 500 rpm 振荡，将荧光团偶联到活化的 5'-磷酸盐上。
      注意:将 MOPS 缓冲液在 4 °C 下避光储存。选择 NaOH 进行 pH 调节，以保持 II 组内含子核酶无活性。荧光团应至少比 RNA 高 40 倍。
   6. 第 2 轮纯化:通过添加 200 μL ddH₂O 来增加体积以改善分离。通过 EtOH 沉淀纯化 5'-磷酸标记的 RNA，并重复直到上清液无色（通常需要两轮）。
   7. 封闭步骤:将 RNA 重悬于 100 μL 100 mM Tris-HCl（pH 7.5）中，并在 25 °C 和 500 rpm 下孵育 2 小时。仅对于 5'-末端单标记，跳过封闭步骤，将 RNA 重悬于 ddH₂O 中，然后继续步骤 1.1.8。但是，为简单起见，如果是双标记，请仅在步骤 1.1.9 之后分离 5 端单标记对照。
      注:此步骤通过与相对较小的伯胺源（例如 Tris）反应来阻断尚未偶联到胺官能化荧光团的活化 5'-磷酸盐，以最大限度地降低与用于 3'-末端标记方案的酰肼官能化荧光团交叉标记的风险。
   8. 第 3 轮纯化:用总共至少 10 mL 的 ddH₂O 离心过滤洗涤标记的 RNA，去除游离染料，然后在 ddH₂O 中洗脱。
      注意:过滤器的分子截留值应小于核酸大小的一半。可以使用所选缓冲液代替 ddH₂O。洗脱应遵循制造商的说明，确保样品不会旋转至完全干燥。
   9. 通过紫外-可见光谱法测定 RNA 和偶联染料浓度。
2. 3'-末端标记:通过高碘酸盐氧化靶向 3'-核糖
   1. 将 ddH₂O 中的 5' 端标记的 RNA 分装，使 90 μL 中每管含有约 50-75 μg RNA。如果上一步的洗脱体积高，导致浓度低，则通过在 ddH₂O 中沉淀和重悬沉淀来浓缩 RNA。加入 5 μL 1.0 M NaOAc 缓冲液，pH 5.5（相当于 50 mM NaOAc，pH 5.5,100 μL 反应体积）。
      注:与 5' 端单标记 RNA 类似，我们通常制备 3' 端单标记 RNA 作为对照。为此，将未标记的 RNA 分装，使每管在 86 μL ddH₂O 中含有约 50-75 μg RNA。
   2. 加入 4 μL 新鲜制备的 500 mM 间高碘酸钠 （NaIO₄） 储备液（相当于 100 μL 反应体积的 10 mM NaIO₄ ）。对于 3' 端单标记，加入 8 μL NaIO₄ 储备液（相当于 100 μL 反应体积的 20 mM NaIO₄ ）。充分混合并在 25 °C 下孵育 2 小时，同时在黑暗条件下以 500 rpm 摇动，因为 NaIO₄ 对光敏感。
      注:请勿更改添加顺序或进一步增加孵育时间，因为这可能会导致附着的供体染料发生光漂白。对于双端标记，使用的 NaIO₄ 浓度降低了一半，以最大限度地减少 5' 端已经连接的染料的淬灭。
   3. 加入 30 μL 50% 甘油终止反应。在 25 °C 下孵育 30 分钟，同时以 500 rpm 振荡。
      注意:甘油用作二醇以淬灭过量的高碘酸盐。
   4. 第 4 轮纯化:加入 400 μL 冰冷的 EtOH-NaOAc 沉淀混合物并进行乙醇沉淀。
   5. 将氧化的 RNA 沉淀重悬于 95 μL 50 mM NaOAc（pH 6.0）中。
   6. 酰肼染料附件:通过在 DMSO 中溶解一些 Cyanine5 酰肼（Cy5-酰肼）晶体，然后用 ddH₂O 稀释至 2 mM 浓度来制备荧光团溶液。如果所选荧光团是水溶性的，则在 ddH₂O 中制备溶液。向氧化的 RNA 中加入 5 μL 2 mM Cy5-酰肼溶液。充分混合并在 25 °C 下孵育 16 小时，同时以 500 rpm 摇动。
      注:荧光团应至少比 RNA 高 40 倍。
   7. 纯化第 5 轮:通过 EtOH 沉淀和离心过滤纯化双端标记的 RNA（或 3'-端单标记的 RNA），分别类似于步骤 1.2.6 和 1.2.8，并在 ddH₂O 中洗脱。
   8. 通过紫外-可见光谱法计算 RNA 和偶联染料浓度。
   9. 使用基于分析凝胶的分析、集成荧光光谱（参见 代表性结果 部分）和/或分析型 HPLC 表征标记的 RNA，如其他地方所示³。

2. 微流体室制备

注意:我们建议一次处理 6 或 8 个腔室。除非另有说明，否则超声处理应在室温下进行。该协议限制了有机溶剂（如丙酮）的使用，以防止痕量杂质溶解。有关替代方案，请参阅参考文献^15,16。

1. 清洗
   1. 根据 图 2A 中给出的方案，用金刚石钻孔机在石英载玻片上钻四个孔，形成两个通道。
      注意:尽管它们在钻孔过程中可能更容易破裂，但对于基于物镜的 TIRF 显微镜设置，其中盖玻片是成像表面，载玻片是石英载玻片的一种经济高效的替代方案（图 2B）。对于基于棱镜的 TIRF 设置，这不是一个选项，其中由于背景荧光，显微镜载玻片是成像表面。
      注意:或者，回收用过的微流体室¹⁶。为此，将用过的腔室浸入通风橱中的丙酮中过夜（将 Coplin 染色罐包裹在铝箔中以尽量减少蒸发），然后超声处理 5 分钟。拆卸腔室，丢弃盖玻片和贴纸。如果拆卸不能立即工作，请在丙酮中对腔室进行超声处理 10 分钟以上。继续执行步骤 2.1.2。
   2. 将钻孔的石英载玻片和大约两倍数量的盖玻片（因为它们很容易破裂）放入带盖的玻璃 Coplin 染色罐中。用 ddH₂O 冲洗 3 次。在 ddH₂O 中超声处理 5 分钟，然后用 ddH₂O 冲洗 3 次。
   3. 在 50 °C 下在 10% 实验室玻璃器皿清洁溶液（参见 材料表）中超声处理 30 分钟。 用 ddH₂O 冲洗至少 3 次，直到洗涤剂气泡消失。在 ddH₂O 中超声处理 5 分钟。用 ddH₂O 冲洗 3 次。
   4. 在 1 M KOH 溶液中超声处理 30 分钟，然后放置过夜。用 ddH₂O 冲洗 3 次，在 ddH₂O 中超声处理 5 分钟。用 ddH₂O 冲洗 3 次。
      注意:尽管 Chandradoss 等人之前提出了一个问题¹⁵，但我们建议进行这种长时间孵育，以避免食人鱼蚀刻。
   5. 用 N₂（g） 干燥载玻片和盖玻片。
   6. 根据制造商的说明，用氧气等离子清洁剂处理干燥的载玻片和盖玻片 30 分钟。
2. 氨基硅烷化
   1. 通过在 500 mL 锥形瓶中充分混合 288.5 mL 无水乙醇、1.5 mL ddH₂O 和 9 mL （3-氨丙基）三乙氧基硅烷 （APTES） 来制备 3% APTES-EtOH 溶液。
   2. 将干净的载玻片和盖玻片放入 Coplin 染色罐中，浸入 3% APTES-EtOH 溶液中，超声处理 1 分钟，然后孵育 30 分钟。
   3. 用无水乙醇冲洗 3 次，然后用 ddH₂O 冲洗 3 次。
   4. 在 N₂（g） 流下干燥载玻片和盖玻片。
3. 表面钝化和生物素化
   1. 准备一个潮湿的盒子，用 ddH₂O 装满空移液器吸头盒的一半。将载玻片放入盒子内，待处理的一面朝上。
   2. 在 640 μL 100 mM 碳酸氢钠 （NaHCO₃） 缓冲液（pH 8.3）中，轻轻混合 2 mg 生物素-聚乙二醇-琥珀酰亚胺戊酸酯 5000 （生物素-PEG-SVA） 和 80 mg 甲氧基聚乙二醇-琥珀酰亚胺戊酸酯 （mPEG-SVA），在 1.5 mL 无菌清洁微量离心管中新鲜制备 bPEG-mPEG 混合物。将 bPEG-mPEG 混合物以 16,000 × g 离心 1 分钟以去除任何气泡。
   3. 小心去除上清液，在玻片中心加入 30 μL 液滴以覆盖两个通道。在载玻片的一侧放置一个额外的液滴，以获得额外的聚乙二醇化盖玻片，因为它们很容易破裂，并且有一个备用的很有用。最后，用干净的盖玻片盖住液滴，关闭潮湿的盒子，并在黑暗条件下进行聚乙二醇化过夜。
   4. 用 ddH₂O 彻底冲洗 PEG 钝化和生物素化的载玻片和盖玻片。注意处理过的表面疏水性的变化。在 N₂（g） 流下干燥。
4. 微流体室组件
   1. 剪切双面贴纸以创建通道。将贴纸贴在载玻片上，确保它覆盖感兴趣的区域。小心地将盖玻片放在顶部，对齐，使聚乙二醇化表面彼此相对。
   2. 将每个组装好的腔室放入 50 mL 离心管中，用 N₂（g） 填充管，并在 -20 °C 下储存长达 1 个月。

图 2:单分子 FRET-TIRF 显微镜。 （A） 用于 TIRF 成像的微流体室。（B） FRET 标记的 RNA 封装在生物素化的磷脂囊泡中，并固定在阶梯亲和素包被的玻璃表面上。这使得感兴趣的分子保持在消逝场（灰色梯度）内，这是由 TIRF 显微镜中以临界角完全反射的入射光产生的。在这里，两个荧光团随后都被 ALEX 方案激发。缩写:FRET = Förster Resonance Energy Transfer;TIRF = 全内反射荧光;ALEX = 替代激光激发。 请单击此处查看此图的较大版本。

3. 磷脂囊泡包膜

1. 脂饼制备
   注意:始终在通风橱下处理氯仿。
   1. 使用无菌针头在无菌清洁的 2.0 mL 微量离心管的盖子上（从内到外）戳孔，如图 3A 所示。
   2. 通过将至少 2 mg bPE 溶于适量的氯仿中至终浓度为 1 mg/mL，制备 1,2-二棕榈酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-cap 生物素 （bPE） 储备液。
   3. 通过将至少 10 mg DMPC 溶于适量的氯仿中至终浓度为 10 mg/mL，制备 1,2-二肉豆蔻酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱 （DMPC） 储备液。
   4. 通过混合 100 μL bPE 和 990 μL DMPC 储备溶液来制备 bPE-DMPC 混合物（保持 1:99 w/w 比率）。每 2 mL 试管分配 109 μL bPE-DMPC 混合物。
   5. 将微管储存盒的纸板细胞隔板插入物放入 Schlenk 烧瓶中，用作试管架。使用长镊子，将含有脂质混合物的试管放入 500 mL Schlenk 烧瓶中的试管架中（图 3B）。
      注意: 确保它们是直立的，没有倾斜的。
   6. 在低流量 N₂ （g） 下蒸发氯仿过夜（或至少 2 小时，直到溶剂完全蒸发）。
   7. 用 Parafilm 密封管子以覆盖孔。将脂质饼在 -20 °C 下储存长达 1 个月。
2. RNA 封装
   1. 通过根据感兴趣的生物系统调整 K ⁺ 和 Mg^{2 +} 浓度来制备以下缓冲液和溶液。
      1. 准备 5x 标准缓冲液 （5x SB）:2.5 M KCl，400 mM MOPS;用KOH将pH调节至6.9，无菌过滤器，并在4°C下避光储存（分别为1x SB:500mM KCl，80mM MOPS，pH 6.9）。
      2. 准备抗闪烁缓冲液 （AB）:100 mM MgCl₂、Trolox、1x SB、无菌过滤器，并在 4 °C 下避光储存长达 1 周。
         注:使用 Trolox 的刮刀尖端测定 10 mL 的最终体积，涡旋混合，然后重新调整 pH 值。
   2. 使用 100 nm 聚碳酸酯 （PC） 膜和 10 mm 聚酯 （PE） 排流盘组装挤出机，用 AB 平衡注射器和膜，然后加热至 30 °C（或基本上高于 24 °C 的 DMPC 玻璃化转变温度）。
   3. 混合 5 μL 1 μM 双端标记 RNA 和 45 μL AB（总体积为 50 μL）。
   4. 用这种 RNA 溶液水合脂质饼。在 30 °C 下，以 1,400 rpm 振荡混合 5 分钟，然后以 700 rpm 摇动混合 15 分钟。以 13,000 g 离心 2 分钟，然后小心地将上清液转移到新管中。
   5. 用 250 μL AB 稀释样品。
   6. 用 RNA-脂质悬浮液填充注射器。在加热块上于 30 °C 下挤出 35 次，以将双端标记的 RNA 封装在直径为 100 nm 的磷脂囊泡中。
      注意:使用挤出机后囊泡的粒度分布可以通过动态光散射 （DLS） 进行验证，如参考文献¹¹ 所示。

图 3:脂饼制备。 （A） 戳戳管盖以使溶剂蒸发。（B） 将含有脂质混合物的试管放入 Schlenk 烧瓶中，蒸发氯仿以获得脂质饼。 请单击此处查看此图的较大版本。

4. smFRET-TIRF 显微镜

1. 表面固定
   1. 准备以下缓冲液和溶液。
      1. 制备糖抗闪烁缓冲液 （SAB）:AB 中的 1% D-葡萄糖 （w/v），无菌过滤器，并在 4 °C 下避光储存长达 1 周。
      2. 准备 100x OSS:100x 除氧系统 （OSS）:3 mg 葡萄糖氧化酶（相当于 1.7 U），10 μL 过氧化氢酶（相当于 22 U）在 90 μL 1x SB 中，在 4 °C 下避光储存长达 1 周。
      3. 通过混合 198 μL SAB 和 2 μL 100x OSS 溶液新鲜制备成像缓冲液 （IB）。
   2. 让微流体室达到室温。用 200 μL 的 1x SB 冲洗腔室 2 次。
   3. 用 50 μL 的 20 μL/mL 链霉亲和素溶液填充腔室，并孵育 5 分钟。
   4. 用 200 μL 的 1x SB 冲洗腔室，然后用 100 μL 的 AB 冲洗腔室。
   5. 通过添加 75 μL 囊泡悬液将封装的 RNA 固定在表面并孵育 10 分钟。
   6. 用 200 μL 新鲜制备的 IB 冲洗腔室并孵育 5 分钟。
   7. 腔室现在已准备好进行数据采集（图 2B）。为防止长时间测量期间蒸发，请密封孔，如图 2A 所示。如果担心通道之间的泄漏，请在开始表面固定方案之前密封未使用的通道。
      注:我们建议进行空白测量，以检查微流体室和磷脂囊泡的清洁度是否受到荧光污染。

Results

我们提出了感兴趣的 915-nt RNA、酵母线粒体 Sc.ai5γ 第 II 组内含子的位点特异性单荧光和双荧光标记，两侧是外显子序列。FRET 荧光团对通过 5'-磷酸的 EDC/NHS 激活和 3'-核糖的高碘酸盐氧化定位在 RNA 末端，然后是相应的染料附着。然后，我们通过荧光凝胶电泳验证了 RNA 染料偶联物，如图 4A 所示。RNA 和琼脂糖凝胶上的荧光团的共迁移证实了标记成功。接下来，如图 4B 所示，使用集成荧光光谱来表征双标记的 II 组内含子。在供体染料激发时观察到能量转移，即 FRET，证明 RNA 的双重标记。值得注意的是，与 FRET 的距离依赖性性质一致，在金属离子存在下 II 组内含子 RNA 的折叠导致 FRET 效率增加，供体发射（绿色箭头）的减少和受体（红色箭头）发射的相应增加证明了这一点。这表明这种 FRET 标记跟踪核酶的构象变化。

图 4:RNA 染料偶联物的表征。 （A） 基于分析凝胶的单荧光和双荧光标记 RNA 分析显示染料与 RNA 在 2% 琼脂糖凝胶上的共迁移。双标记样品中荧光团的共定位由 Cy3（顶部，绿色）和 Cy5（中间，红色）通道的合并图像（底部）中的黄色条带表示，分别在 532 nm 和 635 nm 照明下可见。泳道 1:仅 5'-sCy3 标记的 RNA，泳道 2:仅 3'-Cy5 标记的 RNA，泳道 3:双端（5'-sCy3 和 3'-Cy5）标记的 RNA。（B） 集成荧光光谱证实双重标记。供体激发时的能量转移（λex = 515 nm，λem = 670 nm）验证两种染料均已成功偶联至 RNA。灰色曲线表示催化前 RNA 的发射曲线，而黑色曲线表示折叠的 II 组内含子 RNA 的 FRET 效率增加（与 500 mM KCl 在 70 °C 下孵育 3 分钟，冷却至 42 °C 5 分钟，然后加入 100 mM MgCl₂）。该图改编自 Ahunbay 等人。³ 请单击此处查看此图的较大版本。

有了荧光双标记的野生型 II 组内含子，我们现在就可以在单分子水平上探索其动力学。一旦封装在磷脂囊泡中，标记的 RNA 以非常低的表面密度固定在显微镜表面上，以实现 smFRET-TIRF 的单分子分辨率。如图 5A 所示，可以同时跟踪多个单独的分子。TIRF 显微镜能够实时监测 FRET 效率及其随时间的变化。 图 5B 举例说明了标记和封装 RNA 的静态和动态单分子 FRET 痕迹。典型的动态轨迹表现出供体和受体信号之间的反相关，这些信号会波动 FRET 效率。当供体激发时的受体发射增加时，供体发射也相应减少，表明染料间距离发生动态变化。这种反相关表明 RNA 分子的构象变化。

图 5:smFRET 揭示的 II 族内含子 RNA 的高动态行为。 双端标记的 II 组内含子 RNA 封装在磷脂囊泡中，并固定在表面，以便使用基于物镜的 TIRF 显微镜进行成像。（A） 在 532 nm 激发下表现出供体发射（sCy3，绿色）和受体发射（Cy5，红色）的单个标记 RNA 分子的合并图像。（B） 静态 RNA 分子的典型 smFRET 轨迹（左），其中供体和受体强度不随时间波动，（右）动态 RNA 分子，供体和受体强度呈反相关，FRET 效率为黄色。使用 MASH-FRET¹⁷ 定位和分析单分子。应用直接激发、渗出和 γ 因子校正。缩写:smFRET = 单分子 Förster 共振能量转移。 请单击此处查看此图的较大版本。

Discussion

单分子水平的 FRET 是独一无二的，因为它允许观察和分析单个分子，揭示样品异质性并捕获在集成测量中可能被掩盖的瞬态 ^1,2。使用 smFRET 观察单个 RNA 分子可提供对其折叠途径和动力学的高分辨率见解。该方案描述了 RNA 的化学双端标记及其通过磷脂囊泡封装的表面固定，它们共同实现了通过 smFRET-TIRF 显微镜跟踪动态构象变化。

研究 RNA 动力学是一个不断发展的领域，需要新的位点特异性荧光标记策略。我们通过用碳二亚胺靶向 5'-磷酸盐和用高碘酸盐靶向 3'-核糖来标记 RNA 末端。这些方法之前已经描述过（5'-端^18,19 和 3'-端 19,20,21,22），但以前没有应用于与野生型 Sc.ai5γ 组 II 内含子核酶大小相似的 RNA，这需要优化。碳二亚胺（例如 EDC）对 5'-磷酸盐的活化是可逆的。因此，使用咪唑与 O-酰基异脲中间体发生不可逆反应，形成高反应性咪唑化磷酸酯^19,20。然而，现在已知在较高的 pH 值下，碳二亚胺可以修饰核碱基，特别是鸟嘌呤和尿嘧啶，这最近导致它们被用作结构探测剂^23,24。

为避免交叉反应性，在将染料偶联步骤的 pH 值升高到 7.5 之前，从 EDC 中纯化活化的 RNA 至关重要。然而，当我们在活化和染料附着²⁵ 之间引入纯化步骤时，我们获得了非常低的产量。类似地，在蛋白质标记中，表面可接近的赖氨酸残基可以用碳二亚胺激活。然而，常规使用 NHS 来代替防止激活逆转的咪唑。我们也采用了这种策略，从而用 NHS-磷酸盐中间体取代了磷酸咪唑化物中间体。通过这种方式，我们实现了 pH 控制以及在较低温度和更短孵育时间下增加标记密度，即 25 °C 4 小时，而 37 °C 16 小时。这种 5'-标记策略专为 RNA 开发，可应用于任何其他具有 5'-磷酸盐的单链核酸。

5'-磷酸活化和 3'-核糖氧化是互斥的，因为化学成分不是正交的。为了克服这一挑战并避免交叉标记，我们从 5'-末端开始，然后进行封闭步骤以抑制已激活但未标记的位点，然后再进行 3'-末端标记。在氧化 3'-二醇的同时，过量的间高碘酸钠 （NaIO₄） 可以淬灭 5'-末端已经连接的荧光团。因此，我们将用于单次标记的 NaIO₄ 浓度从 20 mM 降低到 10 mM。

我们建议并行使用多个等分试样，而不是按比例放大反应。该方案需要多个乙醇 （EtOH） 沉淀步骤。当平行使用多个等分试样时，制备沉淀混合物（30 mL 100% 绝对 EtOH 和 1 mL 3 M NaOAc，pH 5.2）。由于 NaCl 在 EtOH 中的溶解度低，因此不使用 NaCl。通过在 -20 °C 下孵育过夜，然后离心，用 3.1 体积的该混合物沉淀 RNA。用 500 μL 冰冷的 70% 乙醇洗涤 RNA 沉淀两次，每次后在 4 °C 下旋转，并在真空下干燥。EtOH 沉淀利用了 RNA 的不溶性和游离染料在 70% 乙醇中的溶解性。离心过滤可有效去除游离染料，因为它们与 RNA 的尺寸存在显著差异，并促进缓冲液交换，去除盐。除了 EtOH 沉淀和离心过滤方法外，还可以使用凝胶提取和/或色谱技术（例如 HPLC）去除游离染料;但是，应相应地调整量表。不要涡旋长 RNA 以重悬，因为这可能会导致机械剪切²⁶。暂停实验方案的最佳时间是 RNA 沉淀时。我们使用 DNA 低结合管来改善核酸回收率。虽然最终反应体积为 100 μL，但首选 1.5 mL（而不是更小体积）试管，以便通过 EtOH 沉淀更好地纯化。

通过沉淀和离心过滤去除未反应的游离染料后，我们通过荧光凝胶电泳（图 4A）、紫外-可见光谱、分析 HPLC³ 确认标记。然而，需要注意的是，这些方法无法区分同时携带荧光团的 RNA 分子和 RNA 混合物，每种分子都用单一颜色标记。同样，它们不能用于确定 RNA 分子是否携带相同颜色的多个荧光团。由于尺寸限制，不能使用质谱法。集成³ 和单分子 FRET 光谱证实了双荧光标记，如图 4B 和 5B 所示。在 smFRET 实验中，0.5 （sCy3 与 Cy5 的比率为 1:1） 的化学计量证实了两个荧光团的相等偶联。一个问题是 3' 端的双重标记，即标记两种醛，而不是建议的环化。在 smFRET 实验中缺乏化学计量为 0.25 （sCy3 与 Cy5 比为 1:2） 的物质，这表明染料附着在空间上阻碍并阻止了第二种染料的附着。

通过这种双荧光标记，FRET 信号变化可归因于整个 RNA 折叠和催化过程中的结构重排。为了将荧光标记的 RNA 保持在消逝场内以进行单分子 TIRF 成像，封装优于直接表面栓系。这种方法涉及将单个 RNA 分子捕获在囊泡的脂质双层中，创造一个有利于观察其动态行为的受控环境。所描述的方案丰富了单囊化，如单步光漂白所示¹¹。要了解 RNA 折叠和功能，弥合体外和体内差距是必不可少的²⁷。分子拥挤剂可以模拟细胞内的条件，以增强 II 组内含子对 RNA 的催化 ^7,28。或者，封装会创建促进 RNA 折叠的受限微环境²⁹，使我们对 RNA 结构和动力学的理解更接近真实的细胞环境。

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
RNA标记
1.5 mL DNA LoBind 试管	Eppendorf 埃彭多夫
1-乙基-3-（3-二甲基氨基丙基）碳二亚胺盐酸盐（EDC-HCl 或 EDC）	Thermo Scientific	11844071	Pierce EDC，无重量规格。商店位置 -20 °C
3-吗啉代丙烷-1-磺酸 （MOPS）	Sigma-Aldrich	69947	BioUltra，用于分子生物学，≥99.5%（滴定法）
乙酸（冰期）	Sigma-Aldrich	1.00063	100%，无水分析用 EMSURE ACS，ISO，Reag.Ph Eur
离心过滤装置	赛多利斯	VS0132	Vivaspin 500， MWCO 50.000， PES， 500 μL
花青素 5 酰肼 （Cy5-hydrazide）	Lumiprobe	23070	5 mg，CAS号 1427705-31-4
二甲基亚砜 （DMSO）	New England Biolabs	12611P	分子生物学级
乙醇	VWR 化学品	20821.296P	绝对 ≥99,8%
甘油	Sigma-Aldrich	G5516	用于分子生物学，≥99.0%
盐酸 （HCl）	Sigma-Aldrich	1.00317	发烟 37%，用于分析 EMSURE ACS，ISO，Reag.欧洲药
< >N-羟基琥珀酰亚胺 （NHS）	Sigma-Aldrich	130672	98%
乙酸钠 （NaOAc）	Sigma-Aldrich	S8750	无水物、ReagentPlus 和 ge;99.0%
间高碘酸钠 （NaIO4）	Thermo Fisher Scientific， Life Technologies	20504	Pierce 产品线
磺基-花青3胺（sCy3-胺）	Lumiprobe	213C0	5 mg，CAS号 2183440-43-7
三（羟甲基）氨基甲烷 （Tris）	Biosolve	200923	分子生物学级
<强>腔室制备
3-氨基丙基）三乙氧基硅烷 （APTES）	Sigma-Aldrich	440140	99%
丙酮	Sigma-Aldrich	1.00014	用于分析 EMSURE ACS，ISO，Reag.Ph Eur
生物素-聚乙二醇-琥珀酰亚胺戊酸酯（生物素-PEG-SVA，bPEG）和甲氧基聚乙二醇-琥珀酰亚胺戊酸酯 （mPEG-SVA）	Laysan Bio， Inc.		BIO-PEG-SVA， MW 5,000 和 MPEG-SVA， MW 5,000 - 组合套件
盖玻片	Carl Roth	H876.2	24 x 24 mm， 0.13-0.16 mm 厚度
Deconex 11 通用	钻孔器 Chemie AG	17416492	实验室玻璃器皿清洁液
金刚石涂层取芯钻头	Crystalite corporation		1 mm 厚度
金刚石钻孔机
乙醇	VWR Chemicals	20821.296P	绝对 ≥99.8%
玻璃 Coplin 染色罐，带盖
成像垫片	Grace Bio-Labs	654008	SecureSeal，8 孔，  9 毫米和时间;0.12 mm
氧气等离子清洗剂	Zepto One		Diener
氢氧化钾 （KOH）	Sigma-Aldrich	P9541	用于分子生物学，≥99.0%
石英滑轨	G. Finkenbeiner， Inc.		7.5 x 2.5 cm，1 mm 厚
碳酸氢钠 （NaHCO3）	Sigma-Aldrich	S6297	BioXtra，99.5-100.5%
<强>脂饼制备
16：0生物素帽PE，bPE（1,2-二棕榈酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-（帽生物素）（钠盐），C53H98N4O11PNaS）	Avanti极性脂质	870277P	在-20下稳定1年>C
14：0 PC，DMPC（1,2-二十四酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱或 1,2-二肉豆蔻酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱，C36H72NO8P）	Avanti Polar Lipids	850345P
2.0 mL 微量离心管，Safe-Lock	Eppendorf	0030120094	高压灭菌器，可对
500 人进行灭菌 mL Schlenk 培养瓶
Chloroform	Merck	1.02445	用于分析 EMSURE ACS， ISO， Reag.Ph Eur
Parafilm
通过封装进行表面固定
（±）-6-羟基-2,5,7,8-四甲基色-2-羧酸（Trolox®）	Thermo Fischer	53188-07-1	97%
3-吗啉代丙烷-1-磺酸 （MOPS）	Sigma-Aldrich	69947	BioUltra，用于分子生物学，≥99.5%（滴定）。储存在 +4 °C 在黑暗中。
粘性密封片	Grace Bio-Labs	629200
过氧化氢酶	Sigma-Aldrich	9001-05-2，	来自牛肝的 C30，水性悬浮液，10,000-40,000 单位/mg 蛋白质
D-葡萄糖	Sigma-Aldrich	G7528	≥99.5% （GC），BioXtra
挤出机聚碳酸酯 （PC） 膜	Avanti 极性脂质	610005-1EA	0.1 &μ;m， 19 mm
挤出机套装，带加热块	Avanti Polar Lipids	610000
葡萄糖氧化酶	Sigma-Aldrich	9001-37-0	来自 黑曲霉，VII 型，  冻干粉，≥100,000 单位/g 固体（无添加氧）
氯化镁 （MgCl2）	Sigma-Aldrich	7786-30-3，M1028	用于分子生物学，1.00 M 及以上; 0.01 M 溶液
聚酯 （PE） 排水盘，膜	Whatman，Cytiva	230300	10 mm
氯化钾 （KCl）	Sigma-Aldrich	60128	BioUltra，用于分子生物学，≥99.5% （AT）
氢氧化钾 （KOH）	Sigma-Aldrich	P9541	用于分子生物学，≥99.0%
链霉亲和素	Thermo Fischer	434301