长RNA的荧光末端标记与封装用于单分子FRET-TIRF显微镜观察

摘要

本文介绍了在长链RNA的末端位置进行双色标记，并通过将其包裹在磷脂囊泡中实现表面固定，从而应用于单分子FRET全内反射荧光显微镜检测。结合这些技术可实现对RNA动态行为在单分子水平上的精确可视化与分析。

摘要

单分子荧光共振能量转移（smFRET）技术在研究动态生物大分子方面具有显著优势，能够精确观测其随时间发生的构象变化。为了利用smFRET监测RNA的动力学过程，我们开发了一种方法，可在RNA的末端共价标记一对荧光共振能量转移（FRET）荧光染料。这种直接末端标记策略通过碳二亚胺（EDC）/N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）活化靶向5'-磷酸基团，并通过高碘酸盐氧化靶向3'-核糖，该方法可适用于不同大小和序列的其他RNA，从而无需依赖人工修饰即可独立研究其性质。此外，5'-EDC/NHS活化策略对所有含有5'-磷酸基团的核酸均具有普遍应用价值。使用市售化学品即可完成标记，无需合成特定于RNA的探针。

全内反射荧光（TIRF）显微镜要求固定在表面的目标分子位于隐逝场内才能被激发照明。将RNA分子包裹在磷脂囊泡中是一种使其保持在隐逝场内的精巧方法。这种方法兼具双重优势：既将分子锚定在表面，又允许分子自由扩散。我们确保每个囊泡仅包含一个RNA分子，从而实现单分子成像。在对目标RNA进行双端标记并包裹后，单分子FRET（smFRET）测量可提供RNA行为的动态且详细的观察结果。

引言

荧光共振能量转移（FRET）是一种强大且灵敏的技术，可用于在纳米尺度上研究生物分子的分子间和分子内相互作用。该技术基于激发态的供体分子向邻近的受体分子发生非辐射能量转移，其作用距离通常在1 nm至10 nm之间。供体与受体染料之间的距离决定了能量转移的效率，因此FRET成为研究各种生物系统中分子动力学、构象变化和相互作用的宝贵工具^1,2，包括RNA。全内反射荧光（TIRF）显微镜已被证明是进行单分子FRET（smFRET）研究的有力技术，因为它仅选择性地激发靠近表面的分子，从而实现对单个分子FRET动态的高空间和时间分辨率观测。然而，在进行smFRET-TIRF实验之前，必须首先用合适的FRET荧光对对目标分子进行标记，然后将其固定在显微镜载样表面上。本文所描述的smFRET-TIRF实验方案使用来自酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）线粒体的野生型II型内含子Sc.ai5γ（两侧包含其两个外显子序列，共915个核苷酸）进行了验证³。有关II型内含子荧光标记及其在smFRET TIRF显微镜中固定方法的更详细说明，请参阅我们的综述文章⁴。

理想的位点特异性RNA标记策略应能够在预定位置精确地引入供体和受体染料，同时不改变RNA的结构或功能，从而确保FRET测量的准确性和高效性。由于四种碱基在化学性质上具有相似性，实现选择性标记具有挑战性。 末端标记法通过靶向5'-磷酸基团和3'-核糖，将供体和受体染料连接到RNA的两端。该方法具有较低的侵入性，同时仍可提供有关结构动态和分子相互作用的重要信息。II型内含子在Mg²⁺存在下具有自剪接能力，这限制了依赖金属离子的酶的应用。本文介绍了一种对长链且具有催化活性的RNA（核酶）进行双末端标记的方法，该方法无需使用酶或合成特殊的探针。

用于在表面固定RNA分子以进行全内反射荧光（TIRF）显微镜观察的常用方法，是将生物素基团直接共价连接到RNA上，或与携带生物素的反义寡核苷酸（ASO）^5,6,7进行杂交。然而，这种直接固定方法可能因RNA与表面之间的相互作用而引入假象，导致RNA错误折叠⁸。为减轻此类固定假象，一种巧妙的解决方案是将RNA包封于表面附着的纳米级磷脂囊泡中^9,10,11。这些直径约为100 nm的囊泡通过生物素-链霉亲和素连接固定在表面^12,13,14，使RNA可在其内部自由扩散，同时允许离子通过脂质膜进行交换¹⁰。在对一种较大的功能性RNA进行共价标记后³，本文介绍了一种结合已有表面钝化与囊泡包封技术并加以改进的方法，以实现RNA功能的保持^10,11,14，从而将此类RNA包封于磷脂囊泡中。该双端标记与包封策略可实现功能性RNA在单分子FRET TIRF显微镜检测中的高效单分子包封率。

方案

1. RNA 双端标记

注意：以下方案描述了通过将供体荧光染料（sCy3）共价连接至5'-磷酸基团，以及将受体荧光染料（Cy5）连接至3'-核糖，实现RNA的位点特异性FRET荧光对标记。本实验选择具有催化活性的长链RNA——II型内含子核酶作为目标RNA。表1和图1总结了该双端标记方案。所有涉及荧光染料的操作步骤均需在避光条件下进行。

第0天	▪ 将50–75 µg RNA分装至每个1.5 mL离心管中，用ddH2O补至总体积55 µL。
第1天	5′-磷酸基团活化
	▪ 向RNA溶液中加入45 µL新配制的EDC-NHS（pH 6.0）溶液，使终体积为100 μL，充分混匀后于25 °C、500 rpm条件下孵育4小时。
	▪ 纯化步骤1：乙醇沉淀过夜。
第2天	▪ 沉淀5′-活化的RNA，洗涤并干燥。
	5′-染料连接
	▪ 用95 µL 100 mM MOPS缓冲液（pH 7.5）重悬RNA。
	▪ 加入5 μL 2 mM 胺基功能化染料溶液。
	▪ 充分混匀后于25 °C、500 rpm条件下孵育16小时。
第3天	▪ 纯化步骤2：乙醇沉淀。
第4天	▪ 沉淀5′-活化的RNA，洗涤并干燥。
	封闭步骤
	▪ 用100 μL 100 mM Tris–HCl缓冲液（pH 7.5）重悬RNA，于25 °C、500 rpm条件下孵育2小时。
	▪ 纯化步骤3：离心过滤。
	→ 洗脱5′-标记的RNA。
第5天	3′-高碘酸氧化
	▪ 将RNA与20 mM NaIO4在50 mM NaOAc缓冲液（pH 5.5）中混合，终体积为100 μL，于25 °C、500 rpm条件下孵育2小时。
	▪ 猝灭过量高碘酸：加入30 μL 50%甘油，充分混匀后于25 °C、500 rpm条件下孵育30分钟。
	▪ 纯化步骤4：乙醇沉淀过夜。
第6天	▪ 沉淀3′-氧化的RNA，洗涤并干燥。
	3′-染料连接
	▪ 用95 µL 50 mM NaOAc缓冲液（pH 6.0）重悬RNA。
	▪ 加入5 μL 2 mM 肼基功能化染料溶液，充分混匀后于25 °C、500 rpm条件下孵育16小时。
第7天	▪ 纯化步骤5：乙醇沉淀。
第8天	▪ 沉淀标记后的RNA，洗涤并干燥。
	▪ 离心过滤。
	→ 洗脱双端标记的RNA。

表1：RNA双端标记实验方案摘要。 请点击此处下载该表格。

图1：通过靶向5'-磷酸和3'-核糖实现双端标记的实验流程。 在NHS存在下，5'-磷酸通过EDC活化，随后与氨基功能化的染料偶联。RNA的3'-二醇基团被高碘酸氧化为二醛，进一步与酰肼功能化的染料反应。进行双端标记时，为防止交叉标记，应首先进行5'-端标记，接着进行中间阻断步骤，再进行3'-端标记。缩写：EDC = 碳二亚胺；NHS = N-羟基琥珀酰亚胺；MOPS = 3-吗啉丙烷-1-磺酸；NaOAc = 醋酸钠。 请点击此处查看此图的放大版本。

1. 5'端标记：通过EDC/NHS活化靶向5'-磷酸
   注意：该5'-端标记方法不仅适用于RNA，也适用于任何含有5'-磷酸的单链核酸。反应的特异性由pH依赖性控制，尽管RNA骨架中存在多个磷酸基团，但只有5'-磷酸能够被特异性地靶向。在pH 6.0条件下，5'-磷酸对碳二亚胺的独特反应性源于其特定的质子化状态，即两个氧原子去质子化，而一个氧原子仍保持质子化。这一状态使5'-磷酸具有反应活性，而完全去质子化的骨架磷酸基团则保持惰性，从而可通过EDC/NHS化学实现对5'-端的特异性标记。
   1. 配制 EDC-NHS-NaOAc，pH 6.0 溶液。每份取 1.5 mg EDC 和 2.0 mg NHS，溶于 35 µL ddH₂O 中混合。₂O 和 10 µL 0.5 M NaOAc，pH 6.0（用冰乙酸调节 pH）。
   2. 将目标RNA分装，每管约含50–75 µg RNA，溶于55 µL ddH₂O中₂O. 向RNA中加入45 µL EDC-NHS-NaOAc（pH 6.0）混合液，总体积达到100 µL，终浓度为78 mM EDC、174 mM NHS和50 mM NaOAc，pH 6.0。在25 °C下以500 rpm振荡孵育4小时。
      注意：此处，70 µg 对应于 250 pmol 的一种 体外 转录的915 nt RNA，在100 µL的终反应体系中浓度为2.5 µM。
   3. 第一轮纯化：通过乙醇沉淀法纯化5'-磷酸化激活的RNA。
   4. 配制2 mM的磺化氰基3胺（sCy3-胺）水溶液。
   5. 将活化的RNA沉淀重悬于95 µL 100 mM 3-吗啉丙磺酸（MOPS）缓冲液（pH 7.5，用NaOH调节pH）中。向活化的RNA中加入5 µL 2 mM sCy3-胺溶液。在25 °C、500 rpm振荡条件下孵育16小时，使荧光染料与活化的5'-磷酸偶联。
      注意：将 MOPS 缓冲液在 4 °C 避光保存。选择 NaOH 调节 pH 以保持 II 型内含子核酶处于非活性状态。荧光染料的用量应至少为 RNA 的 40 倍过量。
   6. 纯化第二轮：加入 200 µL ddH₂O 以增加体积₂O以提高分离效果。通过乙醇沉淀纯化5'-磷酸标记的RNA，并重复操作直至上清液无色（通常需要两轮）。
   7. 封闭步骤：将RNA重悬于100 µL 100 mM Tris-HCl（pH 7.5）中，于25 °C、500 rpm条件下孵育2 h。若仅进行5'端单标记，则跳过封闭步骤，将RNA重悬于ddH₂O中。₂O，并继续进行步骤 1.1.8。然而，为简便起见，若进行双标记，仅在步骤 1.1.9 之后再分离 5'端单标记对照。
      注意：此步骤旨在通过使用相对较小的伯胺源（如 Tris）与未与胺功能化荧光染料偶联的活化 5'-磷酸基团发生反应，以阻断其活性，从而最大限度降低在后续 3'-末端标记实验中与酰肼功能化荧光染料发生交叉标记的风险。
   8. 纯化第三轮：通过离心过滤，用至少10 mL的ddH₂O洗涤标记的RNA，以去除游离染料。₂然后用 ddH₂O 洗脱₂O.
      注意：滤膜的分子截留量应小于核酸大小的一半。可使用选定的缓冲液代替ddH₂O。₂O. 洗脱步骤应遵循制造商说明书，确保样品未被离心至完全干燥。
   9. 通过紫外-可见光谱法测定RNA和偶联染料的浓度。
2. 3'末端标记：通过高碘酸盐氧化靶向3'-核糖
   1. 将5'-端标记的RNA分装至ddH₂O中₂O，使每管中约含50–75 µg RNA，总体积为90 µL。若上一步洗脱体积过大导致浓度过低，则通过沉淀RNA并将沉淀重悬于ddH₂O中进行浓缩。₂O. 加入5 µL 1.0 M NaOAc缓冲液，pH 5.5（对于100 µL反应体系，相当于50 mM NaOAc，pH 5.5）。
      注意：与5'端单标记RNA类似，我们通常制备3'端单标记RNA作为对照。为此，将未标记的RNA分装至每管约含50–75 µg RNA的量，溶于86 µL ddH₂O中₂O.
   2. 加入 4 µL 新鲜配制的 500 mM 高碘酸钠（NaIO₄）溶液₄) 储备液（相当于 10 mM NaIO₄）₄ 对于100 µL反应体系）。进行3'-端单标记时，加入8 µL NaIO₄ 储备液（相当于 20 mM NaIO）₄ 对于100 µL反应体系）。充分混匀，在避光条件下于25 °C、500 rpm振荡孵育2小时，因为NaIO₄ 对光敏感。
      注意：请勿更改添加顺序或进一步延长孵育时间，因为这可能导致连接的供体染料发生光漂白。NaIO₄的浓度₄ 用于双端标记时，5'端已连接的染料可能会发生淬灭，因此将用量减半以尽量减少淬灭效应。
   3. 加入30 µL 50%甘油终止反应。在25 °C、500 rpm振荡条件下孵育30分钟。
      注意：甘油作为二醇用于淬灭过量的高碘酸盐。
   4. 纯化第4轮：加入400 µL预冷的乙醇-乙酸钠沉淀液，进行乙醇沉淀。
   5. 将氧化的 RNA 沉淀重悬于 95 µL 的 50 mM NaOAc（pH 6.0）中。
   6. 肼-染料连接：通过将少量Cy5肼（Cyanine5 hydrazide，Cy5-hydrazide）晶体溶解于DMSO中，随后用ddH₂O稀释，制备荧光染料溶液。₂O 至 2 mM 的浓度。如果所选荧光染料可溶于水，则用 ddH₂O 配制溶液。₂加入5 µL 2 mM Cy5-酰肼溶液至氧化后的RNA中，充分混匀，在25 °C、500 rpm振荡条件下孵育16 h。
      注意：荧光染料的用量应至少为 RNA 的 40 倍。
   7. 纯化第5轮：通过乙醇沉淀和离心过滤纯化双端标记的RNA（或3'端单标记RNA），分别类似于步骤1.2.6和1.2.8，并用ddH₂O洗脱。₂O.
   8. 通过紫外-可见光谱法计算RNA和偶联染料的浓度。
   9. 使用基于凝胶的分析方法对标记的RNA进行表征，并采用整体荧光光谱法（参见 代表性结果 部分），和/或分析型高效液相色谱（HPLC），如 elsewhere 所示³.

2. 微流控芯片的制备

注意：建议每次处理六个或八个腔室。超声处理在室温下进行，除非另有说明。本方案限制使用丙酮等有机溶剂，以防止痕量杂质的溶解。有关替代方法，请参见参考文献^15,16。

1. 清洗
   1. 使用金刚石钻头在石英载玻片上按照 图2A 所示方案钻四个孔，以形成两个通道。
      注意：尽管在钻孔过程中更容易破裂，但对于物镜型全内反射荧光（TIRF）显微镜装置（其中盖玻片为成像表面）而言，玻璃载玻片是比石英载玻片更具成本效益的替代品（图2B）。然而，在棱镜型TIRF装置中，由于背景荧光问题，显微镜载玻片本身为成像表面，因此不能使用玻璃载玻片。
      注意：也可回收利用已使用的微流控腔室¹⁶。具体操作为：将用过的腔室置于通风橱中，浸入丙酮中过夜（用铝箔包裹Copl印染色罐以减少蒸发），随后超声处理5分钟。拆卸腔室后，丢弃盖玻片和贴纸。若拆卸无法立即完成，可将腔室在丙酮中超声处理额外10分钟。然后继续执行步骤2.1.2。
   2. 将钻孔后的石英载玻片以及大约两倍数量的盖玻片（因其易碎）放入带盖的玻璃Copl印染色罐中。用ddH₂O冲洗3次，随后在ddH₂O中超声处理5分钟，再用ddH₂O冲洗3次。
   3. 在10%实验室玻璃器皿清洗液（见材料表）中于50 °C下超声处理30分钟，然后至少用ddH₂O冲洗3次，直至洗涤剂泡沫完全消失。再在ddH₂O中超声处理5分钟，最后用ddH₂O冲洗3次。
   4. 在1 M KOH溶液中超声处理30分钟，然后静置过夜。用ddH₂O冲洗3次，在ddH₂O中超声处理5分钟，再用ddH₂O冲洗3次。
      注意：尽管Chandradoss等¹⁵曾提出长时间孵育可能导致腐蚀问题，但我们仍推荐此长时间孵育步骤，以便避免使用Piranha蚀刻法。
   5. 用N₂(g)吹干载玻片和盖玻片。
   6. 根据制造商说明书，将干燥的载玻片和盖玻片用氧气等离子清洗仪处理30分钟。
2. 氨基硅烷化
   1. 在500 mL锥形瓶中，将288.5 mL无水乙醇（EtOH）、1.5 mL ddH₂O和9 mL (3-氨基丙基)三乙氧基硅烷（APTES）充分混合，配制3% APTES-EtOH溶液。
   2. 将清洁的载玻片和盖玻片放入Copl印染色罐中，浸入3% APTES-EtOH溶液，超声处理1分钟，随后孵育30分钟。
   3. 用无水乙醇冲洗3次，再用ddH₂O冲洗3次。
   4. 在N₂(g)气流下吹干载玻片和盖玻片。
3. 表面钝化与生物素化
   1. 通过在空的移液枪头盒中加入至一半高度的ddH₂O来制备一个保湿盒。将载玻片放入盒中，使待处理面朝上。
   2. 在1.5 mL无菌洁净的微量离心管中，将2 mg生物素-聚乙二醇-琥珀酰亚胺戊酸酯5000（biotin-PEG-SVA）和80 mg甲氧基聚乙二醇-琥珀酰亚胺戊酸酯（mPEG-SVA）溶于640 µL 100 mM碳酸氢钠（NaHCO₃）缓冲液（pH 8.3）中，轻轻混合均匀，新鲜配制bPEG-mPEG混合液。将bPEG-mPEG混合液在16,000 × g下离心1分钟，以去除任何气泡。
   3. 小心移除上清液，并在载玻片中央滴加30 µL液滴，覆盖两个通道。在载玻片一侧额外滴加一滴，用于制备备用的PEG化盖玻片（因其易碎，备用件非常有用）。最后，用洁净的盖玻片覆盖液滴，盖上保湿盒，在避光条件下过夜完成PEG化反应。
   4. 用ddH₂O彻底冲洗PEG钝化并生物素化的载玻片和盖玻片。注意观察处理后表面疏水性的变化。在N₂(g)气流下吹干。
4. 微流控腔室组装
   1. 裁剪双面胶带以形成通道。将胶带粘附到载玻片上，确保覆盖目标区域。小心地将盖玻片放置在上方，对齐位置，使PEG化表面相对。
   2. 将每个组装好的腔室放入50 mL离心管中，向管内充入N₂(g)，并在-20 °C下保存，最长可保存1个月。

图2：单分子FRET-TIRF显微镜技术。（A）用于TIRF成像的微流控腔室。（B）FRET标记的RNA被包裹在生物素化的磷脂囊泡中，并固定在链霉亲和素包被的玻璃表面。这使得目标分子保持在渐逝场（灰色梯度）范围内，该渐逝场由TIRF显微镜中在临界角发生全反射的入射光产生。在此，两种荧光团随后通过ALEX方案被激发。缩写：FRET = Förster共振能量转移；TIRF = 全内反射荧光；ALEX = 交替激光激发。请点击此处查看该图的放大版本。

3. 磷脂囊泡包封

1. 脂质膜制备
   注意：操作氯仿时务必在通风橱中进行。
   1. 使用无菌针头在无菌洁净的 2.0 mL 微离心管盖上穿孔（从内向外），如图 3A所示。
   2. 通过将至少 2 mg 的 1,2-二棕榈酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-帽状生物素（bPE）溶解于适量氯仿中，配制终浓度为 1 mg/mL 的 bPE 储存液。
   3. 通过将至少 10 mg 的 1,2-二肉豆蔻酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱（DMPC）溶解于适量氯仿中，配制终浓度为 10 mg/mL 的 DMPC 储存液。
   4. 按质量比 1:99 混合 bPE 与 DMPC，取 100 µL bPE 储存液与 990 µL DMPC 储存液混合均匀，每 2 mL 管中分装 109 µL bPE-DMPC 混合液。
   5. 将微量离心管储存盒中的纸板分隔插件放入施伦克烧瓶中，作为管架。使用长镊子将含有脂质混合物的离心管垂直放入管架中，置于 500 mL 施伦克烧瓶内（图 3B）。
      注意：确保离心管直立，不得倾斜。
   6. 在氮气（N₂(g)）低流速条件下过夜（或至少 2 小时）蒸发氯仿，直至溶剂完全挥发。
   7. 用封口膜密封管口以覆盖孔洞。将脂质膜于 -20 °C 保存，最长可保存 1 个月。
2. RNA 封装
   1. 根据目标生物系统的需要，调节 K⁺ 和 Mg²⁺ 浓度，配制以下缓冲液和溶液。
      1. 配制 5 倍标准缓冲液（5x SB）：2.5 M KCl、400 mM MOPS；用 KOH 调节 pH 至 6.9，经无菌过滤后避光保存于 4 °C（对应的 1x SB 为：500 mM KCl、80 mM MOPS，pH 6.9）。
      2. 配制抗荧光闪烁缓冲液（AB）：100 mM MgCl₂、Trolox、1x SB，经无菌过滤后避光保存于 4 °C，最多可保存 1 周。
         注意：每 10 mL 终体积使用微量刮刀尖端的 Trolox，涡旋混匀后重新调节 pH。
   2. 使用 100 nm 聚碳酸酯（PC）膜和 10 mm 聚酯（PE）排水盘组装挤出器，用 AB 缓冲液平衡注射器和膜，并加热至 30 °C（或至少高于 DMPC 玻璃化转变温度 24 °C 的温度）。
   3. 将 5 µL 的 1 µM 双端标记 RNA 与 45 µL AB 缓冲液混合，总体积为 50 µL。
   4. 用该 RNA 溶液水合脂质膜。在 30 °C 条件下，先以 1,400 rpm 振荡混合 5 分钟，再以 700 rpm 混合 15 分钟。在 13,000 g 条件下离心 2 分钟，小心将上清液转移至新管中。
   5. 用 250 µL AB 缓冲液稀释样品。
   6. 将 RNA-脂质悬浮液吸入注射器，在加热块上于 30 °C 条件下挤出 35 次，以将双端标记的 RNA 封装进直径为 100 nm 的磷脂囊泡中。
      注意：使用挤出器后囊泡的粒径分布可通过动态光散射（DLS）进行验证，参见文献¹¹。

图3：脂质膜的制备。（A）刺穿管盖以促进溶剂挥发。（B）将含有脂质混合物的离心管置于施伦克烧瓶中，通过蒸发氯仿获得脂质膜。请点击此处查看该图的放大版本。

4. 单分子FRET-TIRF显微镜技术

1. 表面固定
   1. 配制以下缓冲液和溶液。
      1. 配制糖-抗漂白缓冲液（SAB）：将1% D-葡萄糖（w/v）溶于AB缓冲液中，经无菌滤膜过滤后，于4 °C避光保存，最多可保存1周。
      2. 配制100倍浓缩OSS溶液（100x OSS）：将3 mg葡萄糖氧化酶（相当于1.7 U）和10 µL过氧化氢酶（相当于22 U）溶于90 µL的1x SB缓冲液中，于4 °C避光保存，最多可保存1周。
      3. 使用前新鲜配制成像缓冲液（IB）：将198 µL SAB与2 µL 100x OSS溶液混合均匀。
   2. 使微流控腔室恢复至室温。用200 µL 1x SB缓冲液冲洗腔室2次。
   3. 向腔室内加入50 µL浓度为20 µg/mL的链霉亲和素溶液，孵育5分钟。
   4. 用200 µL 1x SB缓冲液冲洗腔室，随后用100 µL AB缓冲液冲洗。
   5. 加入75 µL囊泡悬浮液，使包裹的RNA固定在表面，孵育10分钟。
   6. 用200 µL新鲜配制的IB缓冲液冲洗腔室，并孵育5分钟。
   7. 此时腔室已准备好进行数据采集（图2B）。为防止长时间测量过程中液体蒸发，应按照图2A所示方式密封进样孔。若担心通道之间发生泄漏，应在开始表面固定实验前密封未使用的通道。
      注意：我们建议进行空白对照测量，以评估微流控腔室和磷脂囊泡是否存在荧光污染，作为质量控制手段。

结果

我们展示了对目标RNA（915个核苷酸的酵母线粒体Sc.ai5γ II型内含子，两侧带有外显子序列）进行位点特异性的单荧光和双荧光标记。通过EDC/NHS活化5'-磷酸基团以及高碘酸盐氧化3'-核糖，将FRET荧光团对分别连接至RNA的两端，随后完成染料的偶联。接着，我们通过荧光凝胶电泳验证了RNA-染料偶联物，结果如图4A所示。RNA与荧光团在琼脂糖凝胶中的共迁移证实了标记成功。接下来，如图4B所示，采用整体荧光光谱法对双标记的II型内含子进行表征。在供体染料被激发时观察到能量转移（即FRET），证明RNA实现了双标记。值得注意的是，与FRET的距离依赖性特征一致，在金属离子存在下II型内含子RNA发生折叠，导致FRET效率升高，表现为供体发射信号降低（绿色箭头）和受体发射信号相应增强（红色箭头）。这表明该FRET标记可有效追踪核酶的构象变化。

图 4：RNA-染料偶联物的表征。（A）基于凝胶的分析显示单荧光和双荧光标记RNA在2%琼脂糖凝胶上的共迁移。在合并图像（底部）中，Cy3（顶部，绿色）和Cy5（中部，红色）通道在532 nm和635 nm激发光照射下，双标记样品中荧光团的共定位表现为黄色条带。第1道：仅5'-sCy3标记的RNA，第2道：仅3'-Cy5标记的RNA，第3道：双端（5'-sCy3和3'-Cy5）标记的RNA。（B）整体荧光光谱法证实了双标记。供体激发（λex = 515 nm，λem = 670 nm）时的能量转移验证了两种染料均成功偶联至RNA。灰色曲线代表前催化状态RNA的发射谱，黑色曲线显示折叠的II型内含子RNA中FRET效率提高（在500 mM KCl中70 °C孵育3分钟，冷却至42 °C保持5分钟，随后加入100 mM MgCl₂）。本图改编自Ahunbay等.³ 请点击此处查看该图的放大版本。

在获得荧光双标记的野生型 II 组内含子后，我们现在能够在其单分子水平上探究其动态行为。将标记后的 RNA 封装于磷脂囊泡中，并以极低的表面密度固定在显微镜载物面上，从而实现单分子分辨率的 smFRET-TIRF 检测。如图 5A所示，可同时追踪多个单个分子。TIRF 显微镜可实时监测 FRET 效率及其随时间的变化。图 5B展示了标记并封装 RNA 的静态与动态单分子 FRET 谱图。典型的动态谱图表现为供体与受体信号之间的反相关关系，导致 FRET 效率发生波动。当供体激发下受体发射增强时，供体发射相应减弱，表明染料间距离发生了动态变化。这种反相关性提示 RNA 分子发生了构象改变。

图5：通过单分子FRET揭示的II型内含子RNA的高度动态行为。双端标记的II型内含子RNA被包裹在磷脂囊泡中，并固定于表面，使用基于物镜的全内反射荧光（TIRF）显微镜进行成像。（A）在532 nm激发下，单个标记RNA分子的合并图像，显示供体发射（sCy3，绿色）和受体发射（Cy5，红色）。（B）典型的单分子FRET轨迹：（左）一个静态RNA分子，其供体和受体荧光强度不随时间波动；（右）一个动态RNA分子，其供体和受体荧光强度呈反相关，FRET效率以黄色表示。单个分子的定位与分析使用MASH-FRET¹⁷完成。已应用直接激发、串扰及γ因子校正。缩写：smFRET = 单分子Förster共振能量转移。请点击此处查看本图的放大版本。

讨论

单分子水平的FRET具有独特性，因为它能够实现对单个分子的观察与分析，揭示样品的异质性，并捕捉在系综测量中可能被掩盖的瞬时状态^1,2。利用单分子FRET观测单个RNA分子，可高分辨率地揭示其折叠路径与动态行为。本实验方案描述了RNA的化学双端标记及其通过磷脂囊泡包封实现的表面固定化方法，从而可通过单分子FRET-TIRF显微镜技术追踪其动态构象变化。

研究RNA动态是一个不断发展的领域，需要开发新的位点特异性荧光标记策略。我们通过碳二亚胺靶向5'-磷酸基团，以及通过高碘酸盐靶向3'-核糖糖基，实现对RNA末端的标记。这些方法此前已有报道（5'-末端^18，19 和 3'-末端^{19，20，21，22}），但尚未应用于与野生型Sc.ai5γ II型内含子核酶大小相似的RNA，因此需要进行条件优化。碳二亚胺（如EDC）对5'-磷酸的活化是可逆的，因此使用咪唑与O-酰基异脲中间体发生不可逆反应，生成高反应活性的磷酸咪唑酯^19，20。然而，目前已有研究表明，在较高pH条件下，碳二亚胺可修饰碱基，特别是鸟嘌呤和尿嘧啶，这一特性最近使其被用作结构探针^23，24。

为避免交叉反应，在将pH值升至7.5进行染料偶联步骤之前，必须从EDC中纯化活化的RNA。然而，当我们在活化步骤与染料连接步骤之间引入纯化环节时²⁵，获得的产率极低。类似地，在蛋白质标记中，可利用碳二亚胺活化表面可及的赖氨酸残基。但与防止活化逆转的咪唑不同，通常使用NHS。我们也采用了这一策略，从而将磷酸咪唑中间体替换为NHS-磷酸中间体。通过这种方法，我们不仅实现了pH控制，还在较低温度和较短孵育时间内提高了标记密度，即在25 °C下孵育4小时，而非37 °C下孵育16小时。该5'端标记策略虽为RNA设计，但也可应用于任何具有5'-磷酸的单链核酸。

5'端磷酸活化与3'端核糖氧化是相互排斥的，因为这两种化学反应不具有正交性。为克服这一挑战并避免交叉标记，我们首先从5'端开始标记，随后进行封闭步骤，以抑制已活化但未标记的位点，再进行3'端标记。在氧化3'端二醇的过程中，过量的偏高碘酸钠（NaIO₄）可能会淬灭已连接在5'端的荧光染料。因此，我们将用于单一位点标记的NaIO₄浓度从20 mM降低至10 mM。

建议同时处理多个等分试样，而不是扩大反应体系。本方案需要进行多次乙醇（EtOH）沉淀步骤。当同时处理多个等分试样时，可预先配制沉淀混合液（30 mL 100% 绝对乙醇和 1 mL 3 M NaOAc，pH 5.2）。由于 NaCl 在乙醇中溶解度较低，因此不使用 NaCl。加入 3.1 倍体积的该混合液沉淀 RNA，于 -20 °C 过夜孵育，随后进行离心。用 500 µL 冰冷的 70% 乙醇洗涤 RNA 沉淀物两次，每次洗涤后在 4 °C 下离心，并进行真空干燥。乙醇沉淀法利用了 RNA 在 70% 乙醇中不溶而游离染料可溶的特性。离心过滤法则凭借游离染料与 RNA 之间显著的分子大小差异有效去除游离染料，同时有助于缓冲液置换，从而去除盐分。除乙醇沉淀和离心过滤方法外，也可使用凝胶回收和/或层析技术（如 HPLC）去除游离染料；但应根据具体情况相应调整规模。请勿通过涡旋振荡使长链 RNA 重悬，以免造成机械剪切²⁶。本实验方案最适宜的暂停点是在 RNA 已形成沉淀之后。我们使用低吸附 DNA 离心管以提高核酸回收率。尽管最终反应体积为 100 µL，但仍推荐使用 1.5 mL 管（而非更小体积的管），以便更有效地进行乙醇沉淀纯化。

通过沉淀和离心过滤去除未反应的游离染料后，我们采用荧光凝胶电泳（图4A）、紫外-可见光谱法和分析型高效液相色谱法³确认了标记效果。然而需要注意的是，这些方法无法区分携带两种荧光团的单个RNA分子与每种RNA仅标记单一荧光团的混合物。同样，它们也无法确定某个RNA分子是否携带多个相同颜色的荧光团。由于尺寸限制，质谱法在此不适用。如图4B和图5B所示，整体³和单分子FRET光谱技术验证了双荧光标记的存在。在单分子FRET实验中，0.5的化学计量比（sCy3与Cy5的比例为1:1）证实了两种荧光团的等量偶联。一个需要关注的问题是，可能发生两个醛基均被标记，而非预期的环化反应，从而导致3'端双重标记。而在单分子FRET实验中未观察到化学计量比为0.25（sCy3与Cy5的比例为1:2）的物种，表明染料的连接在空间位阻上阻碍了第二个染料的结合。

通过这种双荧光标记，FRET信号的变化可归因于RNA折叠和催化过程中的结构重排。为了在单分子TIRF成像中将荧光标记的RNA保持在衰逝场内，优先选择包封法而非直接表面固定。该方法涉及将单个RNA分子捕获于囊泡的脂双层内，从而构建一个有利于观察其动态行为的受控环境。所描述的方案可富集单分子包封，这一点可通过单步光漂白实验证实¹¹。为了理解RNA的折叠与功能，弥合体外（in vitro）与体内（in vivo）之间的差距至关重要²⁷。分子拥挤剂可模拟细胞内环境，从而增强II型内含子的RNA催化活性^7,28。 Alternatively，包封可形成受限的微环境，促进RNA折叠²⁹，使我们对RNA结构与动态的理解更接近真实的细胞环境。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
RNA标记
1.5 mL DNA LoBind 管	Eppendorf	30108035
盐酸1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺（EDC-HCl 或 EDC）	Thermo Scientific	11844071	Pierce EDC，无需称量形式。于 -20 °C 保存
3-吗啉丙磺酸（MOPS）	Sigma-Aldrich	69947	BioUltra，分子生物学级别，≥99.5%（滴定法）
乙酸（冰醋酸）	Sigma-Aldrich	1.00063	100%，无水，分析纯 EMSURE ACS, ISO, Reag. Ph Eur
离心过滤单元	Sartorius	VS0132	Vivaspin 500，截留分子量 50,000，PES，500 μL
氰基5 肼（Cy5-肼）	Lumiprobe	23070	5 mg，CAS 号 1427705-31-4
二甲基亚砜（DMSO）	New England Biolabs	12611P	分子生物学级别
乙醇	VWR Chemicals	20821.296P	无水乙醇，≥99.8%
甘油	Sigma-Aldrich	G5516	分子生物学级别，≥99.0%
盐酸（HCl）	Sigma-Aldrich	1.00317	发烟盐酸 37%，分析纯 EMSURE ACS, ISO, Reag. Ph Eur
N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）	Sigma-Aldrich	130672	98%
乙酸钠（NaOAc）	Sigma-Aldrich	S8750	无水，ReagentPlus，≥99.0%
偏高碘酸钠（NaIO4）	Thermo Fisher Scientific, Life Technologies	20504	Pierce 产品系列
磺化氰基3 胺（sCy3-胺）	Lumiprobe	213C0	5 mg，CAS 号 2183440-43-7
三（羟甲基）氨基甲烷（Tris）	Biosolve	200923	分子生物学级别
样品室制备
3-氨基丙基三乙氧基硅烷（APTES）	Sigma-Aldrich	440140	99%
丙酮	Sigma-Aldrich	1.00014	分析纯 EMSURE ACS, ISO, Reag. Ph Eur
生物素-聚乙二醇-琥珀酰亚胺戊酸酯（biotin-PEG-SVA，bPEG）和甲氧基聚乙二醇-琥珀酰亚胺戊酸酯（mPEG-SVA）	Laysan Bio, Inc.		BIO-PEG-SVA，分子量 5,000 和 MPEG-SVA，分子量 5,000 - 组合试剂盒
盖玻片	Carl Roth	H876.2	24 x 24 mm，厚度 0.13–0.16 mm
Deconex 11 通用清洗剂	Borer Chemie AG	17416492	实验室玻璃器皿清洗液
金刚石涂层钻头	Crystalite corporation		厚度 1 mm
金刚石钻孔机
乙醇	VWR Chemicals	20821.296P	无水乙醇，≥99.8%
带盖玻璃 Coplin 染色缸
成像间隔片	Grace Bio-Labs	654008	SecureSeal，8 孔， 9 mm × 0.12 mm
氧等离子体清洗仪	Zepto One		Diener
氢氧化钾（KOH）	Sigma-Aldrich	P9541	分子生物学级别，≥99.0%
石英载玻片	G. Finkenbeiner, Inc.		7.5 × 2.5 cm，厚度 1 mm
碳酸氢钠（NaHCO3）	Sigma-Aldrich	S6297	BioXtra，99.5–100.5%
脂质膜制备
16:0 生物素帽PE，bPE（1,2-二棕榈酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-(生物素帽)（钠盐），C53H98N4O11PNaS）	Avanti Polar Lipids	870277P	于 -20 °C 下可稳定保存 1 年
14:0 PC，DMPC（1,2-十四烷酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱 或 1,2-二肉豆蔻酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱，C36H72NO8P）	Avanti Polar Lipids	850345P
2.0 mL 微量离心管，Safe-Lock	Eppendorf	0030120094	高压灭菌以消毒
500 mL 施伦克烧瓶
氯仿	Merck	1.02445	分析纯 EMSURE ACS, ISO, Reag. Ph Eur
Parafilm 封口膜
通过包埋实现表面固定
(±)-6-羟基-2,5,7,8-四甲基色满-2-羧酸（Trolox®）	Thermo Fischer	53188-07-1	97%
3-吗啉丙磺酸（MOPS）	Sigma-Aldrich	69947	BioUltra，分子生物学级别，≥99.5%（滴定法）。于 +4 °C 避光保存。
粘性密封条	Grace Bio-Labs	629200
过氧化氢酶	Sigma-Aldrich	9001-05-2, C30	来源于牛肝，水溶液，10,000–40,000 单位/mg 蛋白质
D-葡萄糖	Sigma-Aldrich	G7528	≥99.5%（GC），BioXtra
挤出器聚碳酸酯（PC）膜	Avanti Polar Lipids	610005-1EA	0.1 μm，19 mm
带加热模块的挤出器套装	Avanti Polar Lipids	610000
葡萄糖氧化酶	Sigma-Aldrich	9001-37-0	来源于黑曲霉，VII 型， 冻干粉末，≥100,000 单位/g 固体（无额外氧气）
氯化镁（MgCl2）	Sigma-Aldrich	7786-30-3, M1028	分子生物学级别，1.00 M ± 0.01 M 溶液
聚酯（PE）排水盘，膜	Whatman, Cytiva	230300	10 mm
氯化钾（KCl）	Sigma-Aldrich	60128	BioUltra，分子生物学级别，≥99.5%（AT）
氢氧化钾（KOH）	Sigma-Aldrich	P9541	分子生物学级别，≥99.0%
链霉亲和素	Thermo Fischer	434301