方法文章

利用基于琼脂糖凝胶的微流控装置评估神经干细胞迁移能力

DOI:

10.3791/674

2008年2月11日

本文内容

摘要

Loading...
$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

我们利用一种新型的基于琼脂糖凝胶的微流控装置,证明了表皮生长因子受体(EGFR)的过表达可增强神经干细胞(NSCs)的迁移能力。该技术可轻松适用于其他哺乳动物细胞系统,特别是在细胞来源稀少(如人神经干细胞)且实验周期至关重要的情况下。

摘要

Loading...
$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

尽管微流控技术在大分子检测方面已达到新的成熟阶段,基于细胞的检测仍处于初级阶段1。这主要是由于使用传统微加工技术和材料难以构建出适合细胞生存且稳定的微环境。我们通过引入一种新型微加工材料——琼脂糖凝胶,作为微流控装置的基础材料,来解决这一问题。琼脂糖凝胶具有高度可塑性,并且允许气体和细胞存活所必需的营养物质透过,因此是细胞实验的理想材料。我们先前已证明,基于琼脂糖凝胶的装置在研究细菌和中性粒细胞迁移方面已取得成功2。在本报告中,一个约1 mm厚的琼脂糖凝胶膜上构建了三条平行的微流控通道。利用蠕动泵在两侧通道中持续灌注培养基或缓冲液,细胞则被保留在中间通道中以供观察。由于两侧通道中的营养物质和化学物质持续从侧边向中间通道扩散,因此可通过调节侧通道中的流动来轻松控制中间通道的化学环境。利用该装置,我们证明了在不同化学条件下均可方便地通过光学手段监测神经干细胞的运动,实验结果表明表皮生长因子受体(EGFR)的过表达可增强神经干细胞的运动能力。神经干细胞的运动能力是评估细胞侵袭性的重要生物标志物,因而也是肿瘤发生相关因子3。解析神经干细胞运动的潜在机制,将有助于深入理解神经发育障碍以及脑癌干细胞侵袭过程。

方案

Loading...
$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

实验步骤

用纤维连接蛋白包被载玻片

在组装微流控装置之前,使用纤连蛋白对玻璃载玻片进行灭菌处理。在生物安全柜中对载玻片进行包被以维持无菌状态。将无菌的聚二甲基硅氧烷(PDMS)间隔层沿载玻片边缘对齐,并用永久性记号笔标记朝上的面。用移液器将1 ml浓度为5 μg/ml的纤连蛋白(Sigma)溶液加入PDMS间隔层内,使其完全覆盖玻璃载玻片表面。静置载玻片1小时,随后用氮气完全吹干2 枪。载玻片可保存在4o用于后续实验。

组装设备

整个装置组装过程均在生物安全柜中无菌条件下进行,具体操作步骤如下:

  1. 用70%乙醇擦拭带有微通道图案的硅胶母模,并用N2枪吹干,进行清洁。用镊子在母模的凸起结构周围放置一个高度为1 mm的无菌PDMS垫片。
  2. 准备设备中使用的琼脂糖凝胶:在50 ml烧杯中称取0.3 g琼脂糖粉末(Fisher Scientific)和10 ml不含CO2的培养基(Invitrogen)。用刮刀搅拌混合物,并在微波炉中高火加热20秒。若仍有未溶解的颗粒,则再加热10秒,并旋转混匀热溶液以去除残留颗粒。随后分别以8秒和5秒的加热时间重复该过程。
  3. 迅速将琼脂糖溶液倒入由PDMS垫片围成的硅胶母模上,并立即用一块无菌载玻片覆盖琼脂糖混合物。对载玻片施加持续而轻柔的压力约2分钟,以确保琼脂糖凝胶形成的厚度与PDMS垫片一致,均为1 mm。
  4. 琼脂糖凝胶固化后,将带有PDMS垫片的图案化琼脂糖凝胶从硅胶母模上剥离,并转移至经纤连蛋白包被的载玻片上,使琼脂糖凝胶中的微通道面向载玻片。使用16号注射器针头在微通道的储液区打孔,作为进样口和出样口。向载玻片上的图案化琼脂糖凝胶中加入500 μl不含CO2的培养基,以防止微通道干燥。
  5. 用70%乙醇清洗设备中使用的丙烯酸分流装置,并用去离子水冲洗。将分流装置上的孔与琼脂糖凝胶微通道上打好的孔对齐。然后将分流装置、凝胶、PDMS垫片及纤连蛋白载玻片与设备的金属框架对齐。将螺丝插入设备中,并使用螺丝刀拧紧至有阻力为止,以确保不会因过度拧紧而造成琼脂糖中微通道的形变。按顺时针顺序拧紧螺丝,以防止装置内部凝胶发生位移。使用1 ml注射器检测设备中微通道是否存在泄漏或堵塞。注射器连接一段Tygon管路,管路末端装有凝胶加样枪头,用于向微通道中注入不含CO2的培养基。当向某一进样口注入培养基时,仅从对应的出样口观察到液体流出,则认为该微通道成功形成。此时,设备已准备就绪,可供使用。

在装置中制备并接种细胞

当细胞达到70%融合度(细胞密度约为100,000个细胞/ml)时,即可准备接种到装置中。

用两轮 DPBS(Invitrogen)洗涤细胞。加入 200 μl 胰蛋白酶-EDTA(Invitrogen)使细胞脱离。将细胞转移至含有 5 ml 含血清 M2 培养基的 15 ml 离心管中,以中和胰蛋白酶活性。在 1000 RPM 条件下离心 5 分钟,收集细胞与培养基。吸除上清液,将细胞沉淀重悬于 5 ml DPBS 中。在相同条件下再次离心 DPBS 中的细胞。再次吸除上清液,将细胞沉淀重悬于 500 μl 无 CO2 培养基中。

通过重力驱动流,将所得的细胞悬液接种至装置的中心微通道中。分别在中心微通道的入口和出口处加入60 μl细胞悬液和20 μl不含CO2的培养基。在明场显微镜下观察中心微通道,检查细胞是否发生黏附。细胞通常在10分钟后开始黏附。当细胞以适当的密度黏附至通道底部后,用移液器吸出入口中的剩余细胞悬液以及出口中的培养基。在中心通道的入口和出口均加入60 μl不含CO2的培养基。在中心通道的入口和出口上方覆盖PDMS盖片,以减少培养基的蒸发。

在装置中对细胞进行成像

在组装装置之前,将无菌的蠕动泵管穿过显微镜(Olympus X81)的环境舱,并连接至蠕动泵(Watson-Marlow 205U/CA)。以4 RPM的速度用PBS冲洗管路。装置组装完成后,在15 ml离心管中,用不含CO2的培养基配制适当浓度的表皮生长因子(EGF)(Sigma)溶液。将EGF溶液涡旋混匀5秒,然后连接至管路。将标记有相应EGF浓度的管路连接至装置。EGF需要约1小时扩散通过通道脊,形成稳定的化学浓度梯度。

在一次实验运行中,使用成像软件 Slidebook 每 10 分钟采集一组图像,持续约 5 小时。程序控制 x-y 自动载物台,使得在每个时间点对同一中心通道中的两个子区域(每个子区域面积为 400μm × 400μm)进行成像,且总共对三个中心通道进行成像。不同中心通道中的细胞(通常一次运行中为三个)具有不同的 EGF 浓度,浓度值标记在管路上。

材料与设备

细胞系:C17.2 细胞是来源于出生后小鼠小脑外颗粒层的神经干细胞(NSCs)6, 7。利用该细胞系,我们通过逆转录病毒转染方法建立了另外两种稳定转染的小鼠干细胞系:(1)wtEGFR——过表达人野生型 EGFR;(2)ΔEGFR——一种组成性激活的 EGFR 突变体。为了便于检测,逆转录病毒载体携带一个包含目的基因的骨架序列,其后接内部核糖体结合位点(IRES)和绿色荧光蛋白(GFP)基因。

细胞培养: 小鼠C17.2神经干细胞(NSCs)及其变异株在6孔板中使用M2培养基(DMEM(Invitrogen)添加10%胎牛血清(FBS)(Invitrogen)、5%马血清(HS)(Invitrogen)和1%青霉素/链霉素(Invitrogen))进行培养。细胞培养条件为37oC、80%空气和5% CO2

微流控装置:一种由塑料歧管、PDMS垫片和不锈钢框架组成的装置,用于固定设备位置。

成像

使用倒置荧光显微镜(Olympus IX-81)并结合增强型CCD相机(Orca,Hamamatsu)。微流控装置安装在自动化的x-y-z载物台上,载物台被封闭在环境培养箱中,以维持37oC的温度。通常在同一芯片上有3-4个装置,通过自动化的x-y-z载物台在同一时间点进行成像。

维持流速

使用带有8个平行管路的蠕动泵(Watson-Marlow 205U/CA)自动维持所有汇流通道和源通道中的流体流动。

 

EGF条件下细胞迁移路径示意图;亲本细胞、wtEGF细胞和ΔEGF细胞的实验数据。
图1 三种NSC细胞系(亲本型、wtEGFR和ΔEGFR)在不同EGF浓度下的运动性 所有轨迹均来自5小时电影的追踪结果(除wtEGF 100 ng/mL组为4小时),为便于比较,所有轨迹的起点均被重新定位至(0,0)。

 

 细胞迁移轨迹;eGFR弱/强荧光显微镜图像,轨迹图分析。


图2 EGFR表达水平与运动性的相关性 (a) 在含有100 ng/ml EGF的微流控通道表面培养的wtEGF神经干细胞的两张图像。 左侧图像为荧光图像,右侧为透射明场图像。 比例尺为100µm,且 通道宽度为 400 µm。 细胞根据表达的GFP荧光强度被分为两个群体。 细胞 蓝色圆圈中的细胞较暗,因此EGFR表达水平较低;红色圆圈中的细胞较亮,因此EGFR表达水平较高。(b)低EGFR表达水平与高EGFR表达水平细胞的运动轨迹。这些轨迹来自一段持续四小时的录像.

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

讨论

Loading...
$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

图1显示了三种NSC细胞株的运动轨迹:亲本细胞、wtEGFR细胞和ΔEGFR细胞(对照)。每组轨迹数据均来自一段持续5小时的录像。对于亲本细胞,当EGF浓度约为10 ng/mL时,细胞运动性达到峰值;对于wtEGFR细胞,细胞运动性的峰值则转移至100 ng/mL或更高浓度;而对于ΔEGFR细胞,细胞运动性不依赖于EGF浓度,符合预期结果。

在100 ng/ml浓度下,wtEGF细胞的运动性最强,其移动速度比在10 ng/ml浓度下的亲本细胞快约1.5倍。这表明:(1)EGFR的过表达可增强细胞运动性;(2)EGF配体-受体结合事件的数量对细胞运动性具有直接影响。ΔEGFR细胞系是一种组成型激活的EGFR突变体,该突变体出现在约60%的人类胶质母细胞瘤中。该突变体具有截短的细胞外结构域,可形成一种不依赖配体的组成型活性激酶。其自磷酸化强度与配体激活的野生型EGFR(wtEGFR)相比很小(约10%)4。这解释了为何ΔEGFR细胞在无EGF存在时的运动性略高于亲本细胞和wtEGFR细胞,但在不同EGF浓度下其运动性保持恒定。

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

致谢

Loading...
$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

本工作由纽约州科学、技术和学术研究办公室(NYSTAR)(以先进技术创新中心资助形式)以及国家科学基金会协议号ECS-9876771下的纳米生物技术中心(NBTC)(国家科学基金会STC项目)、美国脑肿瘤协会和纽约医学院(JAB)的资助支持。

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
Dulbecco’s 改良伊格尔培养基(DMEM)(1X)试剂Invitrogen11971-025
CO2-非依赖性培养基试剂Invitrogen18045-088一种非HEPES的专有培养基,适用于在大气条件下支持多种上皮细胞、成纤维细胞和淋巴样细胞系的生长,不含L-谷氨酰胺
胰蛋白酶-EDTA试剂Invitrogen25200-072
PBS试剂Invitrogen14190-144磷酸盐缓冲液,不含钙或镁
青霉素/链霉素(Pen/Strep)试剂Invitrogen15140-122每毫升含青霉素(碱)10,000 单位和链霉素(碱)10,000 g,使用青霉素G(钠盐)和硫酸链霉素溶于0.85%生理盐水中
FBS试剂Invitrogen10437-028胎牛血清,经鉴定合格
马血清试剂Invitrogen16050-130马血清,经EIA检测为阴性
纤连蛋白试剂Sigma-AldrichF0895来源于人血浆的纤连蛋白,亦称冷不溶性球蛋白
EGF试剂Sigma-AldrichE4127小鼠下颌下腺来源的表皮生长因子,冻干粉
琼脂糖试剂Fisher ScientificBP1356-500

参考文献

Loading...
$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Blow, N. Microfluidics: in search of a killer application. Nature Methods. 4, 665-670 (2007).
  2. Shing-Yi Cheng, S. H., Wassweman, M. ax, Archer, S. hivaun, Shuler, M. ichael L., Wu, M. ingming A hydrogel-based microfluidic device for the studies of directed cell migration. Lab-on-a-chip. 7, 763-769 (2007).
  3. Pedersen, M. W., Tkach, V., Pedersen, N., Berezin, V., Poulsen, H. S. Expression of a naturally occurring constitutively active variant of the epidermal growth factor receptor in mouse fibroblasts increases motility. Int J Cancer. 108, 643-653 (2004).
  4. Ayuso-Sacido, A., Graham, C., Greenfield, J. P., Boockvar, J. A. The duality of EGFR signaling and neural stem cell phenotype: Cell enhancer or cell transformer. Current Stem Cell Research and Therapy. 1, 231-238 (2006).
  5. Eisenbach, M., Constantinou, C., Aloni, H., Shinitzky, M. Repellents for Escherichia coli operate neither by changing membrane fluidity nor by being sensed by periplasmic receptors during chemotaxis. J Bacteriol. 172, 5218-5224 (1990).
  6. Snyder, E. Y., Deitcher, D. L., Walsh, C., Arnold-Aldea, S., Hartwieg, E. A., Cepko, C. L. Multipotent neural cell lines can engraft and participate in development of mouse cerebellum. Cell. 68, 33-51 (1992).
  7. Snyder, E. Y., Yoon, C., Flax, J. D., Macklis, J. D. Multipotent neural precursors can differentiate toward replacement of neurons undergoing targeted apoptotic degeneration in adult mouse neocortex. Proc Natl Acad Sci U S A. 94, 11663-11668 (1997).

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

重印与许可

申请许可以重复使用本 JoVE 文章的文本或图表

申请许可

标签

EGF CO2 PDMS EGFR

相关文章