使用琼脂糖凝胶为基础的微流体装置的评估神经干细胞的运动

摘要

我们表明，表皮生长因子受体（EGFR）的过度表达，增强了神经干细胞使用一种新型的琼脂糖凝胶微设备（神经干细胞）的活力。这项技术可以很容易地适应其他哺乳动物细胞系统细胞来源匮乏，如人类神经干细胞，的，和周围的时间又是至关重要的的。

摘要

微流体技术是成熟的一个新的水平，达到大分子检测细胞为基础的分析是仍处于起步^阶段 1 。这主要是由于哪一个可以创建一个细胞的兼容和稳定的微环境，使用传统的微细加工技术和材料的困难。我们解决这个问题，通过引入一种新型的微细加工的材料，琼脂糖凝胶作为基体材料的微流体装置。琼脂糖凝胶是高度的可塑性，并渗透到细胞存活所必需的气体和营养成分，从而细胞检测的理想材料。我们已经表明以前，琼脂糖凝胶为基础的设备已成功在学习细菌和中性粒^细胞迁移2。在这份报告中，三个平行的微流体通道，在一个约1mm厚度的琼脂糖凝胶膜图案。与媒体/缓冲区的恒定流量均保持在两个侧面采用蠕动泵渠道。细胞均保持在观察的中心通道。由于营养物质和化学品在一旁渠道不断扩散的化学环境的中心通道的中心通道，从侧面很容易通过沿侧渠道流控制。使用这种设备，我们表明，神经干细胞的运动，可以监视各种化学条件下轻松光学，和实验结果表明，表皮生长因子受体（EGFR）的过度表达，增强了神经干细胞的活力。神经干细胞的运动功能是一个重要的生物标志物的评估细胞的侵略性，从 ​​而致瘤^因素 3 。解读国科会蠕动的内在机制，将产生的神经系统发育障碍和洞察到脑肿瘤干细胞的侵袭。

方案

程序

与纤维连接蛋白涂层的幻灯片

微流体装置组装之前，与纤维连接蛋白消毒玻片。外套biohood幻灯片保持无菌。沿幻灯片的边缘对齐无菌硅橡胶垫片和侧面标记，正面临着一个永久性标记。吸取1毫升5微克/ ml的溶液在载玻片上的全部硅橡胶垫片内的纤维连接蛋白（Sigma公司）。离开了一个小时的幻灯片不受干扰，然后完全干燥使用的N ₂枪。幻灯片可以储存在摄氏⁴度，为以后的实验。

组装设备

整个设备组装协议是biohood在无菌条件下，使用下列程序:

1. 清洁与图案抹下来，用70％乙醇和干燥与_N 2枪的微硅主。将一个无菌的PDMS间隔1毫米的高度，围绕主的救济功能使用镊子。
2. 准备琼脂糖凝胶电泳在设备使用重0.3克的琼脂糖粉（尔科技）和10毫升的CO _2，独立媒体（Invitrogen公司）在50毫升的烧杯中。用抹刀和微波炉加热20秒高搅拌均匀的混合物。如果存在不溶性的颗粒，加热10秒和涡流热混合物以获得摆脱最后剩下的颗粒的混合物。重复的过程用了8秒的加热时间，然后5秒。
3. 快速倒到周围的硅橡胶垫片的硅主的琼脂糖溶液，并立即用无菌载玻片盖琼脂糖混合物。套用一个常数，约2分钟的幻灯片温和的压力，以确保该琼脂糖凝胶将相同的常量作为PDMS间隔1毫米的高度。
4. 琼脂糖凝胶电泳后，撕下图案的琼脂糖凝胶与硅橡胶垫片从硅掌握和转移到面临的幻灯片在琼脂糖凝胶微纤维连接蛋白与镀膜玻璃幻灯片。使用16号注射器尖冲水库地区的入口和出口访问的微孔。添加500μL的CO _2，独立媒体，在幻灯片上，以防止干燥的微图案的琼脂糖凝胶。
5. 丙烯酸多方面的设备中使用70％乙醇洗净，并用DI水冲洗。将在用琼脂糖凝胶打了个孔与微气歧管的孔。然后，将凝胶，硅橡胶垫片，纤维连接蛋白与设备的金属框架幻灯片多方面的。放入装置的螺钉，并拧紧用螺丝刀的阻力点。这样做是为了确保该设备是没有收紧，以琼脂糖微变形的程度。按顺时针顺序拧紧螺钉，以确保设备内的凝胶不移位。测试设备的泄漏和堵塞，在使用1ml注射器的微。注射器装有凝胶装枪头在管端与聚乙烯管在微注入CO ₂的独立媒体。被认为是成功的媒体观察时，只从插座的微退出媒体时注入到相应的入口形成一个微。现在，该设备已准备就绪。

准备和播种设备中的细胞

当细胞到达（大约10万细胞/ ml细胞密度）70％汇合，他们准备到器件的种子。

细胞受到两个DPBS（Invitrogen）的清洗。加入200μL胰蛋白酶- EDTA（Invitrogen）的分离细胞。细胞转移到15 mL离心管中含药血清灭活胰蛋白酶的M2媒体5毫升。离心5分钟，在1000转速细胞的生长介质。吸气关闭上清和细胞悬浮颗粒的DPBS 5毫升。在同等条件下，再次离心DPBS细胞。再次吸入关闭上清，悬浮颗粒细胞中的CO _500μL2独立媒体。

种子的细胞产生的悬浮微设备进入中心通过重力驱动流。新增的入口和出口的中心，与60μL的细胞悬液20μL的_CO 2独立的中型微分别。观察中心的下一个明显微镜看细胞粘附微。这些细胞通常坚持10分钟后。细胞后坚持在一个适当的密度通道底部，pipeted在入口的剩余细胞悬液，在插座的媒体。将60μL的CO _2，独立媒体中心通道入口和出口。广场的PDMS占地面积超过日e中央入口和出口，以尽量减少蒸发媒体中心通道。

成像设备中的细胞

之前，组装设备，无菌蠕动管穿过显微镜的气象站（奥林巴斯X81），和连接蠕动泵（沃森-马洛205U/CA）。通过油管冲洗，PBS在4 RPM的速度。设备的组装后，准备适当的浓度表皮生长因子（EGF）（Sigma公司）在15 mL离心管中的_CO 2独立媒体的解决方案。涡EGF的解决方案，持续5秒，并与管材连接。标有相应的表皮生长因子浓度的装置连接的油管。它需要大约一个小时的EGF内传播的通道脊，并建立一个稳定的化学梯度。

Slidebook，成像软件，用来在实验运行约5小时，每10分钟的图像。 XY自动化阶段是编程的两个子领域相同的中心通道，共有三个中心通道（每个面积400μmx400μm）是在某一特定时间点的成像。在不同的中心通道（通常在一个运行3）细胞有不同的表皮生长因子的浓度，油管标记。

材料和设备

从外部产后小鼠小脑^6，7生发层的细胞株:C17.2细胞的神经干细胞。使用该细胞系，我们已经制定了其他两个小鼠的干细胞系，采用逆转录病毒转染法。这两个稳定转染的细胞系（1）wtEGFR - 过度表达人野生型EGFR，和（2）ΔEGFR - 这是一个组成性激活的EGFR突变。为了便于检测，逆转录病毒进行基因与核糖体结合（IRES）和绿色荧光蛋白（GFP）的内部网站的利益的骨干。

细胞培养:鼠标C17.2神经干细胞及其变种生长在M2中的媒体6孔板（10％小牛血清（FBS）（Invitrogen公司），5％马血清（HS）（Invitrogen公司的DMEM（Invitrogen公司） ），和1％青霉素/链霉素（Invitrogen公司）。）的细胞保持在^37℃80％的空气和5％的_{CO 2} 。

微流体装置:一个塑料歧管，硅橡胶垫片，不锈钢框架和设备到位。

成像

一个倒置荧光显微镜（奥林巴斯IX - 81）使用，强化CCD相机（ORCA，滨松市）的连接。微流体装置被安装在自动化XYZ阶段，并保持37 ^摄氏度的温度环境室封闭的阶段是通常有3-4设备在同一芯片上，将在同一时间点使用自动XYZ阶段拍摄。

流量保持

一个8平行线（沃森​​马洛205U/CA）自动蠕动泵是用来保持在所有的水槽和来源渠道的流动。

图1活动力三个株国科会在不同的表皮生长因子浓度（父母，wtEGFR，D表皮生长因子受体），所有的轨迹跟踪5个小时的影片（wtEGF 100ng/ml，4小时除外） ，所有曲目的由来在（0,0）重新定位，以作比较 。

图2 EGFR表达水平的相关性和活力 （一）100ng/ml表皮生长因子与微流体通道表面上的两个wtEGF神经干细胞的图像。 左边的图像是一个荧光图像，右边是一个传播的亮场图像 。 比例尺是100微米，和 通道宽度为400微米。 细胞被分为两个种群表达GFP的亮度 。 细胞 在蓝色圆圈调光器，因此较少有表皮生长因子受体的表达水平;在红色圆圈中的细胞brigher，因而有较高的表皮生长因子受体的表达水平。 （二）低和高的EGFR表达水平与细胞的轨迹。 这些轨迹是从4个小时长的电影 。

讨论

图1显示了三个国科会菌株，亲代细胞，wtEGFR和ΔEGFR（控制）的轨迹。每个设定的轨迹，从5个小时长的电影。父母的细胞，细胞运动达到顶峰时，表皮生长因子的浓度是〜在10ng/ml; wtEGFR细胞，细胞的运动高峰期转移到100ng/ml或以上;ΔEGFR细胞，细胞运动是独立的表皮生长因子浓度如预期。

与100ng/ml wtEGF细胞最能动的细胞，他们移动了约1.5倍的速度比用在10ng/ml亲代细胞。这表明:（1）对EGFR的表达，增强细胞活力;（2）表皮生长因子受体配体的招投标活动的数量，细胞运动的一个直接影响。 ΔEGFR细胞系是一个组成性激活的EGFR突变。这种突变出现在人脑胶质瘤的〜60％。它有一个被截断，成为构的积极配独立激酶的胞外域。自身磷酸化的强度小（约10％）相比，与配体活化的野生型^{EGFR（wtEGFR）} 4。这是基础的观察，ΔEGF细胞略高于蠕动的父母和wtEGFR（表皮生长因子的情况下），但蠕动是在不同的表皮生长因子浓度保持恒定。

由于wtEGFR细胞进行GFP（绿色荧光蛋白）和表皮生长因子受体的相同副本，wtEGFR细胞的荧光强度，揭示了EGFR的表达水平。这使我们能够直接关联的表皮生长因子受体蛋...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
Dulbecco’s 改良伊格尔培养基（DMEM）(1X)	试剂	Invitrogen	11971-025
CO2-非依赖性培养基	试剂	Invitrogen	18045-088	一种非HEPES的专有培养基，适用于在大气条件下支持多种上皮细胞、成纤维细胞和淋巴样细胞系的生长，不含L-谷氨酰胺
胰蛋白酶-EDTA	试剂	Invitrogen	25200-072
PBS	试剂	Invitrogen	14190-144	磷酸盐缓冲液，不含钙或镁
青霉素/链霉素（Pen/Strep）	试剂	Invitrogen	15140-122	每毫升含青霉素（碱）10,000 单位和链霉素（碱）10,000 g，使用青霉素G（钠盐）和硫酸链霉素溶于0.85%生理盐水中
FBS	试剂	Invitrogen	10437-028	胎牛血清，经鉴定合格
马血清	试剂	Invitrogen	16050-130	马血清，经EIA检测为阴性
纤连蛋白	试剂	Sigma-Aldrich	F0895	来源于人血浆的纤连蛋白，亦称冷不溶性球蛋白
EGF	试剂	Sigma-Aldrich	E4127	小鼠下颌下腺来源的表皮生长因子，冻干粉
琼脂糖	试剂	Fisher Scientific	BP1356-500