我们利用一种新型的基于琼脂糖凝胶的微流控装置，证明了表皮生长因子受体（EGFR）的过表达可增强神经干细胞（NSCs）的迁移能力。该技术可轻松适用于其他哺乳动物细胞系统，特别是在细胞来源稀少（如人神经干细胞）且实验周期至关重要的情况下。
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本文内容
摘要
摘要
尽管微流控技术在大分子检测方面已达到新的成熟水平，但基于细胞的检测仍处于初级阶段1。这主要是由于使用传统微加工技术和材料难以构建出适合细胞生存且稳定的微环境。我们通过引入一种新型微加工材料——琼脂糖凝胶，作为微流控装置的基础材料，来解决这一问题。琼脂糖凝胶具有高度可塑性，并且允许气体和细胞存活所必需的营养物质透过，因此是细胞实验的理想材料。我们先前已证明，基于琼脂糖凝胶的装置在研究细菌和中性粒细胞迁移方面已取得成功2。在本报告中，一个约1 mm厚的琼脂糖凝胶膜上构建了三条平行的微流控通道。利用蠕动泵在两侧通道中持续灌注培养基或缓冲液，细胞则被保留在中间通道中以供观察。由于两侧通道中的营养物质和化学物质持续从侧边向中间通道扩散，因此可通过调节侧通道中的流动来轻松控制中间通道的化学环境。利用该装置，我们证明了在不同化学条件下均可方便地通过光学手段监测神经干细胞的运动，实验结果表明表皮生长因子受体（EGFR）的过表达可增强神经干细胞的运动能力。神经干细胞的运动能力是评估细胞侵袭性的重要生物标志物，因而也是肿瘤发生相关因子3。解析神经干细胞运动的潜在机制，将有助于深入理解神经发育障碍以及脑癌干细胞的侵袭过程。
方案
步骤
用纤连蛋白包被载玻片
在组装微流控装置之前，使用纤连蛋白对玻璃载片进行灭菌处理。在生物安全柜中对载片进行包被以保持无菌状态。将无菌的PDMS间隔层沿载片边缘对齐，并用永久性记号笔标记朝上的面。用移液器加入1 ml的 5 μg/ml 将纤连蛋白（Sigma）溶液加入PDMS垫片内，使其完全覆盖玻璃片表面。静置1小时后，用氮气彻底吹干。2 枪。载玻片可在4o用于后续实验。
组装设备
整个装置组装过程均在生物安全柜中以无菌条件进行，具体操作步骤如下：
- 用70%乙醇擦拭带有微通道图案的硅胶母版，再用N₂吹干以进行清洁2 枪。使用镊子在母版的浮雕特征周围放置一个高度为1 mm的无菌PDMS垫片。
- 称取0.3 g琼脂糖粉末（Fisher Scientific）和10 ml CO₂-2-独立培养基（Invitrogen）置于50 ml烧杯中。用刮勺搅拌混合物，并在微波炉中高火加热20秒。若仍有未溶解的颗粒，再加热10秒，并旋转摇动热混合物以消除残留颗粒。随后依次以8秒和5秒的加热时间重复该过程。
- 迅速将琼脂糖溶液倒入由PDMS垫片包围的硅胶母模上，并立即用一片无菌玻璃盖片覆盖琼脂糖混合....
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讨论
图1显示了三种NSC细胞株的运动轨迹：亲本细胞、wtEGFR细胞和ΔEGFR细胞（对照）。每组轨迹数据均来自一段持续5小时的录像。对于亲本细胞，当EGF浓度约为10 ng/mL时，细胞运动性达到峰值；对于wtEGFR细胞，细胞运动性的峰值则转移至100 ng/mL或更高浓度；而对于ΔEGFR细胞，细胞运动性不依赖于EGF浓度，符合预期结果。
表达wtEGF且浓度为100 ng/ml的细胞运动性最强，其移动速度约为亲本细胞（含10 ng/ml EGF）的1.5倍。这表明：（1）EGFR的过表达可增强细胞运动性；（2）EGF配体-受体结合事件的数量对细胞运动性具有直接影响。ΔEGFR细胞系是一种组成型激活的EGFR突变体，该突变体出现在约60%的人类胶质母细胞瘤中。其胞外域发生截短，形成一种不依赖配体、持续激活的激酶。与配体激活的野生型EGFR（wtEGFR）相比，其自磷酸化强度较弱（约10%）4。这解释了为何在无EGF的情况下，ΔEGFR细胞的运动性略高于亲本细胞和wtEGFR细胞，且其运动性在不同EGF浓度下保持恒定。
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致谢
本工作由纽约州科学、技术和学术研究办公室（NYSTAR）（以先进技术中心资助形式）以及纳米生物技术中心（NBTC）资助，NBTC 是美国国家科学基金会协议号为 ECS-9876771 的科学与技术中心（STC）项目，同时获得美国脑肿瘤协会和纽约医学院（JAB）的资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 | |
|---|---|---|---|---|
| Dulbecco’s 改良伊格尔培养基 (DMEM) (1X) | 试剂 | Invitrogen | 11971-025 | |
| CO2非依赖性培养基 | 试剂 | Invitrogen | 18045-088 | 一种不含HEPES的专有培养基，适用于在大气条件下支持多种上皮细胞、成纤维细胞和淋巴样细胞系的生长，不含L-谷氨酰胺 |
| 胰蛋白酶-EDTA | 试剂 | Invitrogen | 25200-072 | |
| PBS | 试剂 | Invitrogen | 14190-144 | 磷酸盐缓冲液，不含钙或镁 |
| 青霉素/链霉素 (Pen/Strep) | 试剂 | Invitrogen | 15140-122 | 每毫升含10,000单位青霉素（碱基）和10,000 µg链霉素（碱基），使用青霉素G（钠盐）和硫酸链霉素溶于0.85%生理盐水中 |
| FBS | 试剂 | Invitrogen | 10437-028 | 胎牛血清，经鉴定合格 |
| 马血清 | 试剂 | Invitrogen | 16050-130 | 马血清，经EIA检测为阴性 |
| 纤连蛋白 | 试剂 | Sigma-Aldrich | F0895 | 来源于人血浆的纤连蛋白，亦称冷不溶性球蛋白 |
| EGF | 试剂 | Sigma-Aldrich | E4127 | 来自小鼠下颌下腺的表皮生长因子，冻干粉 |
| 琼脂糖 | 试剂 | Fisher Scientific | BP1356-500 |
参考文献
- Blow, N. Microfluidics: in search of a killer application. Nature Methods. 4, 665-670 (2007).
- Shing-Yi Cheng, S. H., Wassweman, M. ax, Archer, S. hivaun, Shuler, M. ichael L., Wu, M. ingming A hydrogel-based microfluidic device for the studies of directed cell migration. Lab-o....
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