方法文章

糖组学指导的糖蛋白质组学促进复杂肿瘤微环境中糖蛋白质组的全面分析

DOI：

10.3791/67405

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2025年2月7日

 ,  ,  ,  , 
1School of Natural Sciences, Faculty of Science and Engineering, Macquarie University, 2Institute for Glyco-core Research (iGCORE), Nagoya University

本文内容

摘要

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本方案详细介绍了糖组学指导的糖蛋白质组学方法，这是一种整合组学技术，可全面揭示复杂肿瘤微环境中异质性糖蛋白组的特征，有助于深入理解癌症的糖生物学。

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

糖基化是一种常见且结构多样的蛋白质修饰，影响着多种肿瘤发生过程。基于质谱的糖组学和糖蛋白组学已成为分析游离糖链和完整糖肽的有力方法，分别有助于更深入地理解肿瘤微环境（TME）中异质性糖蛋白组的特征。本实验方案详细介绍了糖组学引导的糖蛋白组学方法，这是一种整合型组学技术：首先采用多孔石墨化碳液相色谱-串联质谱（porous graphitized carbon-LC-MS/MS）为基础的糖组学方法，解析待研究的肿瘤组织、细胞群体或体液样本中糖链的结构及其定量分布。该步骤可实现不同患者组别、疾病阶段或条件之间的糖组学比较分析，识别糖基化改变；更重要的是，通过构建已知糖链结构的数据库，可显著提升同一样本后续糖蛋白组学分析的效率，减少数据搜索时间并降低糖蛋白误鉴定率。本方案重点阐述了N-糖蛋白组分析中糖组学引导糖蛋白组学方法的样本制备步骤，并讨论了数据采集与分析的关键环节。该方法可提供TME中糖蛋白的定量信息，包括其糖基化位点、位点占有率以及位点特异性的糖链结构。文中以结直肠癌患者福尔马林固定石蜡包埋的肿瘤组织为例展示了代表性结果，表明该方法具有高灵敏度，并与生物样本库中常见的组织切片兼容。因此，糖组学引导的糖蛋白组学方法为深入解析复杂TME中糖蛋白组的异质性与动态变化提供了全面视角，生成了深入理解癌症糖生物学所必需的可靠生化数据。

引言

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

蛋白质糖基化是一种普遍且复杂的共翻译和翻译后修饰类型，存在于生命系统发育树中各种物种所产生的蛋白质中1,2,3。已知与蛋白质连接的糖链在影响人类健康的重要生物学过程中发挥广泛作用，包括介导和调控细胞间的相互作用及通讯事件4,5。异常的蛋白质糖基化被认为可导致恶性转化、肿瘤进展及扩散6,7,8。这表明糖链在肿瘤微环境（TME）的关键致瘤过程中具有重要作用，并为基于糖链的生物标志物发现和治疗应用提供了巨大且尚未充分开发的潜力。因此，糖生物学在癌症研究及生命科学领域正受到日益增多的关注9。

在过去十年中，糖组学分析和信息学领域的关键进展10,11,12,13,14,15,16,17推动了液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）驱动的糖组学和糖蛋白质组学的发展，使其成为对来自复杂糖蛋白混合物的游离糖链和完整糖肽进行全系统分析的有力工具，这些糖蛋白可直接从多种癌症患者样本（如肿瘤组织、细胞群体、体液）等生物样本来源中提取3,13,18,19,20。

糖组学提供有关聚糖集合（即糖组）结构和数量的信息，这些聚糖由细胞、组织乃至整个生物体动态产生。另一方面，糖蛋白质组学则提供关于蛋白质载体及其糖基化位点、位点占据率（宏观异质性）、位点特异性的聚糖组成及其在位点上的分布模式（微观异质性）的定量信息，但聚糖结构信息较为有限（通常仅限于聚糖组成）15,16,21。因此，糖组学与糖蛋白质组学是研究糖蛋白组生化特征的互补性方法22。

针对不同的糖分析物（例如 N-、O-、C-连接的糖链/糖肽/糖蛋白，标记或未标记的样品）、样品性质（例如细胞、组织、体液）、样品量（纳克/微克/毫克级蛋白含量）以及可用的分析仪器，各实验室已开发并应用了多种多样的糖组学与糖蛋白组学方法设计和分析策略23,24,25,26,27,28,29,30,31,32。尽管联合使用糖组学与糖蛋白组学已被公认具有诸多优势，但由于对分析技术专长和专用仪器的高要求，这两类方法在糖生物学和癌症研究中通常被作为独立的方法单独应用，而非联合使用。

认识到这一技术空白，十多年前，我们引入了糖组学辅助的糖蛋白质组学方法，该方法能够整合来自复杂生物样本的糖组学和糖蛋白质组学数据33。简而言之，这种糖组学辅助（或如本方案中所述的糖组学引导）糖蛋白质组学技术通过已建立的多孔石墨化碳（PGC）液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）方法对N-和/或O-聚糖进行分析34,35，随后利用这些聚糖信息，通过定义聚糖搜索空间的边界，来分析来自同一样本（或样本集）的完整N-和/或O-糖肽数据36。PGC-LC-MS/MS是一种特别强大的糖组学方法，因其具有高灵敏度和结构分辨能力，可对糖组进行定量分析，即使在复杂混合物中也能提供有关聚糖拓扑结构（单糖序列和分支模式）及糖苷键连接方式的信息35,37,38。糖蛋白质组学工作流程包括肽段生成、可选的肽段标记、多重化、预分级以及在反相液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）分析前的富集步骤，理想情况下应采用不同的碎裂方法，包括阶梯式碰撞能量/高能碰撞解离（sceHCD，用于N-糖肽）和电子转移/高能碰撞解离（EThcD，用于O-糖肽），以实现分析物的鉴定。对于N-糖蛋白质组分析，平行进行的去N-糖基化蛋白质组分析可通过定义蛋白质/肽段搜索空间，并提供有关已占据N-糖基化位点及其位点占据率的更详细信息，从而指导完整N-糖肽数据的分析；同时，对非修饰肽段的平行分析可揭示研究条件下蛋白质水平的变化。

本文提供了一种详细且易于遵循的糖组学指导下的糖蛋白质组学方法的分步实验方案（实验流程概览见图1）。该方案详细描述了样品制备步骤，以及基于液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）的糖组学和糖蛋白质组学实验的具体操作，并展示了该方法应用于结直肠癌（CRC）患者肿瘤切除组织的福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）切片的代表性结果，从而为全球癌症生物样本库中广泛存档的此类珍贵样本的肿瘤微环境（TME）糖生物学研究提供了深入见解。文中也简要讨论了糖组学与糖蛋白质组学数据的分析与整合方法。

糖蛋白质组学工作流程示意图；N-糖链释放、富集、LC-MS/MS分析设置。
图1：糖组学引导的糖蛋白质组学方法概览。该示意图展示了糖组学（左侧）和糖蛋白质组学（右侧）工作流程中的详细实验步骤，以及所获得信息的概要（加粗显示），并说明了如何通过改进的数据分析与解释将两种方法整合。插图：自制固相萃取（SPE）微柱，用于（i）糖组学和（ii-iii）糖蛋白质组学工作流程。请点击此处查看该图的放大版本。

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方案

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该研究已获得澳大利亚悉尼麦考瑞大学人类研究伦理委员会（医学科学）的批准（方案编号 5201800073）。

注意：糖组学指导的糖蛋白质组学方法可应用于从低到极高糖蛋白复杂度的多种生物样本。对于无标记糖蛋白质组学方法（不进行样本混合），为确保在富集后获得较高的糖蛋白组覆盖度，起始材料需使用复杂混合物中约100–200 µg的总蛋白，因为糖肽在全部肽段中可能仅占1%–10% 群体。由于篇幅限制，本文未包含从细胞或组织中进行初始蛋白质提取的步骤，读者可参考其他资源15糖组学进行深度糖组分析时，每个样品保守消耗约10–20 µg蛋白质，从而保留大部分蛋白质提取物用于糖蛋白组学分析。除非另有说明，以下方案中提及的均为终浓度，化学品应溶于超纯水以制备水溶液。

1. 蛋白质制备

  1. 使用已建立的方法（如双辛可宁酸法或Bradford蛋白测定法）测定提取物的蛋白浓度。将蛋白浓度用50 mM TEAB（pH 8.5）调整至10 µg/µL。
  2. 在56 °C下用10 mM DTT孵育样品45分钟，以还原二硫键。随后在避光条件下，于20–25 °C用40 mM IAA孵育样品30分钟，以烷基化游离巯基。用过量DTT（约40 mM）淬灭烷基化反应。
  3. 分装每份蛋白质样品。用于糖组学分析的样品建议保留约10–20 µg总蛋白，用于糖蛋白质组学流程的样品建议保留100–200 µg总蛋白。
    注意：除目标蛋白样品外，应加入已知的模式糖蛋白（如牛胎球蛋白）或蛋白质混合物（如细胞系裂解液、血浆），以评估实验步骤的效率与重复性，并监测LC-MS/MS的性能。

2. N-糖组学工作流程

  1. 聚偏二氟乙烯膜上蛋白质的固定
    1. 使用单孔打孔器切割PVDF膜，孔数与待点样的蛋白质样品数量相对应。
    2. 用乙醇或甲醇润湿切除的膜，然后将膜转移至平底96孔板中。
    3. 当膜接近干燥时，每点最多加入2.5 µL蛋白样品，以最小化蛋白样品的沉积表面积。如有需要，可重复点样。 使每个点上固定的蛋白总量约为 10–20 µg。为此，待点样后让斑点自然风干，再重复点样步骤。
      注意：点样过程中，可能需要用乙醇或甲醇重新润湿膜，以防止膜完全干燥。
    4. 在20-25 °C下风干膜至少3小时，建议过夜。干燥过程中避免膜受到任何污染。
      注意：作为可选的质量控制步骤，可使用先前所述的直接蓝71溶液染色来观察膜上固定的蛋白质34.
  2. 释放蛋白质连接的N-糖链
    1. 加入100 µL 1% (w/v) 的PVP40甲醇溶液 向每个含有点样膜的孔中加入。确保在样品制备过程中，蛋白质样品点样的膜面始终朝上。
    2. 在20-25 °C条件下，将平板置于PVP40溶液中振荡5分钟，然后弃去PVP40溶液。
      注意：PVP40 溶液用于封闭 PVDF 膜和孔，以防止在后续步骤中 PNGase F（以及可能在平行实验中用于获取连接特异性信息的外切糖苷酶；见下文讨论部分）发生非特异性结合。
    3. 用 100 µL 超纯水洗涤每个含有封闭蛋白点的孔，振荡 5 分钟。重复此步骤 3 次。每次洗涤后务必彻底弃去水液。
    4. 向每个孔中加入 15 µL PNGase F 溶液（0.5 U/µL，用超纯水将 10 U/µL 原液稀释而成），假设每份样品已加入 15 µg 蛋白质。
    5. 向周围空置的孔中加入水，以防止后续孵育步骤中样品脱水，并使用透明封板膜小心密封酶标板。将酶标板在37 °C下孵育至少8小时。
    6. 将培养板超声处理5分钟，以促进附着在孔壁上的蒸发液滴回流至孔底。
    7. 将释放的N-糖链样品小心转移至各自的微量离心管（1.5 mL）中。用20 µL超纯水洗涤样品孔2次，每次加入后反复吹打数次。将每个孔中残留的样品全部合并至含有N-糖链样品的微量离心管中。
      注意：N-糖组学样品制备过程中应避免使用低吸附管，因为亲水性糖链可能与涂层管发生不可逆结合。
    8. 加入10 µL 100 mM乙酸铵，pH 5.0，将样品在20–25 °C孵育1小时。
      注意：此步骤可使氨基化产物发生羟基化 N释放的N-糖链还原端上的乙酰氨基葡萄糖残基，从而实现彻底还原 在后续步骤中，将100 mM乙酸铵调节至pH 5.0，因为溶液的弱酸性会影响脱离的N-糖链还原端糖胺与羟基之间的高转化率。
    9. 在真空浓缩系统中干燥N-糖链样品。
  3. 游离N-糖链的还原
    1. 加入 20 µL 新鲜配制的 1 M NaBH4 加入50 mM KOH溶液至干燥的N-糖链样品中，并充分混匀。
      注意：NaBH4 应在使用当天用KOH新鲜配制。
    2. 紧密盖上每支试管的管盖，于 50 °C 孵育样品 3 小时。
      注意：N-糖链会经历还原反应，该反应将还原端的α和β异头物转化为单一的糖醇形式，从而在PGC-LC-MS/MS分析中产生单一的色谱峰。
    3. 孵育后，将样品管在微量离心机中离心，使液体沉降至管底。
    4. 向每个样品中加入 100 µL 超纯水。加入 2 µL 冰醋酸以中和碱性 N-糖链样品。将样品管在微量离心机中离心，使样品沉降至管底。
      注意：冰醋酸可中和碱性样品，从而产生氢气（H₂）。2) 的形成以及反应过程中随之产生的气泡现象。
  4. 使用PGC-C18-SPE对N-糖链进行脱盐
    1. 按照下述方法制备自制PGC-C18-SPE微柱。
      1. 使用合适的注射器，将C18柱塞转移至合适的移液枪头（10 µL）中。
        注意：此处也可使用商用C18-SPE微柱。
      2. 将10 µL悬浮于50%（v/v）甲醇中的PGC树脂悬浊液移液至C18-SPE微柱中。将微柱放入配有微量离心适配器的2 mL离心管中。离心管以形成PGC-C18-SPE微柱，柱高约为0.5 cm（参见 图1i）。为每个样品制备一个PGC-C18-SPE微柱。
        注意：使用适配器可确保微型柱悬浮于管子中央。
      3. 在后续的洗涤和上样步骤中，将台式离心机设定为 6,000 rpm（约 2,000 x g）并离心60秒，以促进流动相通过PGC-C18-SPE微柱。依次用50 µL含0.1%（v/v）TFA的乙腈洗涤和活化每根PGC-C18-SPE微柱三次，随后用50 µL 0.1%（v/v）TFA水溶液重复三次。
        注意：PGC-SPE 微柱可提前数小时制备，但必须储存 使用前于室温下水化。
    2. 将N-糖链样品加入PGC-C18-SPE微柱中，上样体积最多为40 µL，于6,000 rpm（约2,000 x g）离心 g每次加入后孵育60秒。重复上样步骤，直至全部N-糖链样品均已被加载至微柱中。
      注意：尽管流穿组分中不应含有糖链，但建议保留这些组分，直至糖组学数据成功获取，以防PGC-C18-SPE微柱出现糖链保留不完全的情况。
    3. 用20 µL超纯水洗涤PGC-C18-SPE微柱。将PGC-C18-SPE微柱转移至新的1.5 mL微量离心管中，以备进行N-聚糖洗脱。
    4. 通过向每个PGC-C18-SPE微柱中加入40 µL含0.1% TFA的50%（v/v）乙腈溶液洗脱N-聚糖，然后离心。重复此步骤，并合并洗脱液。
      注意：每次离心后均需监测微柱，确保溶液已完全离心通过，这将有助于实现高效的洗脱。
    5. 在真空浓缩系统中将脱盐后的N-糖链干燥。
  5. PGC-LC-MS/MS 采集
    1. 按照以下说明配制液相色谱溶剂。
      1. 溶剂A：配制100 mL 100 mM碳酸氢铵（NH₄HCO₃）溶液4HCO3) 储备液溶于超纯水中。使用真空过滤装置，通过0.2 µm尼龙滤膜过滤储备液，以去除颗粒物。随后，配制1 L的10 mM NH4HCO3 溶液（溶剂 A），通过将 100 mL 的 100 mM NH4HCO3 将储备液加入900 mL超纯水中。对溶剂A进行15分钟超声处理以脱气。溶剂A可在20–25 °C下保存1周，而100 mM NH4HCO3 储存液可在 4 °C 下保存 1 个月。
      2. 溶剂B：配制1 L的10 mM NH4HCO3 在超纯水中含70%（v/v）乙腈（溶剂B）中加入100 mL 100 mM NH₄HCO₃4HCO3 将储备液（见前文步骤2.5.1.2）加入700 mL乙腈中，再用超纯水定容至1 L。将溶剂B超声脱气15 min。溶剂B可在20–25 °C下保存2周。
    2. 将脱盐后的N-糖链重悬于10 µL超纯水中，并充分混匀。以14,000 x g 5分钟，然后小心地将上清液转移至质谱样品瓶中，留下约0.5 µL，以避免转移任何可见或不可见的颗粒物和碎片，防止对液相色谱-串联质谱系统造成损害。
    3. 在高效液相色谱系统上，使用PGC-LC毛细管柱（温度维持在50 °C），以溶剂A中0%–70%（v/v）溶剂B的60分钟线性（或其他适当）梯度对N-糖链进行进样和分离。确保高效液相色谱系统连接至质谱仪，并以20 µL/min的恒定流速运行（根据PGC-LC柱的几何结构调整流速）。
    4. 使用配备电喷雾离子源并在负离子模式下运行的线性离子阱四极杆质谱仪（或其他合适的低或高分辨率质谱系统）检测分离的N-糖链。
    5. 将MS1采集扫描范围设置为 m/z 150-2,000，采用缩放扫描，峰宽为 m/z 0.25 全宽半高（FWHM）处 m/z 200. 将源电压设置为 3.2 kV。对于 MS1 扫描，将自动增益控制（AGC）设为 5 x 104 离子累积时间最长为 50 ms（或其他适当设置）。
      注意：起始量较低 m/z 旨在检测常参与N-和O-糖组的单糖和二糖。
    6. 对于 MS/MS，将分辨率设置为 m/z 0.25 FWHM 在 m/z 200，自动增益控制（AGC）设为 2 × 104 离子，最大累积时间设置为 300 ms。启用数据依赖性采集（DDA）模式，选择每次 MS1 全扫描中丰度最高的五个前体离子，通过共振激发（离子阱）碰撞诱导解离（CID）进行碎裂，归一化碰撞能量（NCE）为 33%。关闭动态排除功能，以避免遗漏共洗脱的同量异位 N-聚糖异构体。
  6. LC-MS/MS 糖组学数据的数据分析
    1. 使用适当的软件浏览生成的LC-MS/MS原始数据，在确认液相色谱峰宽较窄、N-糖链异构体有效分离、质谱准确性高、分辨率高、信噪比高以及CID-MS/MS碎裂效率高的基础上，确保数据质量优良。
    2. 根据样品中N-糖链的单一同位素前体离子质量、CID-MS/MS碎裂图谱以及相对和绝对PGC-LC保留时间，手动鉴定N-糖链。
      注意：RawMeat v2.1、GlycoMod 和 GlycoWorkBench v2.1 可辅助鉴定过程，具体方法如所述26已知的生物合成限制以及所观察到的分析物之间的结构相关性，也可进一步提高所鉴定N-糖链的可信度26或者，可使用商业软件进行半自动的聚糖鉴定和质谱注释。
    3. 用于相对N-糖链定量，生成包含单一同位素前体的转换列表 m/z 所有已鉴定的N-糖链异构体，并使用商业软件根据所有N-糖链前体离子的提取离子色谱图（EIC）计算曲线下面积（AUC）值，具体方法如所述26.

3. N-糖蛋白质组学工作流程

  1. 蛋白质混合物的消化
    1. 消化100–200 µg经还原和烷基化的蛋白质提取物（来自第1部分） 1) 通过向每个样品中加入胰蛋白酶（酶与蛋白质质量比为1:50）和/或其它选择的蛋白酶。
      注意：与糖组学样本制备不同，糖蛋白组学样本制备步骤中应尽可能使用低吸附微量离心管，以实现最大肽段回收率。
    2. 将样品在 37 °C 下孵育 8–12 小时。确保 pH 值约为 8.5，因为弱碱性溶液可提高胰蛋白酶消化效率。
      注意：优先选择能够产生可预测切割模式并使大多数N-糖肽保留单个糖基化位点（sequon）的特异性蛋白酶，例如胰蛋白酶（trypsin）和Lys-C。避免样品孵育时间过长，以减少胰蛋白酶或其他蛋白酶对蛋白质的非特异性切割。
    3. 通过加入1%（v/v）三氟乙酸进行酸化以终止消化反应（避免因消化时间过长导致非特异性切割）。
  2. 多肽脱盐 使用寡核苷酸 R3-C18-SPE
    1. 按如下所述制备自制寡核苷酸R3-C18-SPE微柱。
      1. 使用合适的注射器，将C18盘片装入10 µL移液枪头中。
        注意：此处也可使用商用C18-SPE微柱。
      2. 将悬浮于纯乙腈中的Oligo R3树脂浆液加入C18-SPE微柱中。将微柱置于配有微量离心适配器的2 mL离心管中，确保微柱位于管中央，离心形成柱高约1 cm的Oligo R3-C18-SPE微柱（见 图1ii）。为每个样品准备一个Oligo R3-C18-SPE微柱。
    2. 在后续的洗涤和上样步骤中，将台式离心机调节至6,000 rpm（约2,000 x g) 离心60秒，使流动相通过Oligo R3-C18-SPE微柱。依次用50 µL纯乙腈洗涤并活化每个Oligo R3-C18-SPE微柱，重复3次，随后用50 µL 0.1%（v/v）三氟乙酸（TFA）洗涤并活化，重复3次。
      注意：Oligo R3-C18-SPE 微柱可预先制备，并在室温下以水合状态保存数小时后再使用。
    3. 将预处理的 Oligo R3-C18-SPE 微柱置于新的 1.5 mL 离心管中，并加入微量离心适配器。将胰蛋白酶消化后的肽段混合物上样至 Oligo R3-C18-SPE 微柱，于 2,000 x g 条件下离心 g 60秒。对于超过50 µL的样品体积，可能需要进行多轮上样。
    4. 用 0.1% (v/v) TFA 溶液洗涤 Oligo R3-C18-SPE 微柱，每次 50 µL，重复 3 次。将 Oligo R3-C18-SPE 微柱转移至新的 1.5 mL 离心管中，以备脱盐后肽段的洗脱。
    5. 通过向每个Oligo R3-C18-SPE微柱加入50 µL含0.1% TFA的50%（v/v）乙腈溶液，随后加入50 µL含0.1% TFA的70%（v/v）乙腈溶液，洗脱脱盐后的肽段。每步操作后进行离心。
      注意：每次离心后均需监测微柱，确保溶液已完全离心通过，这将有助于实现高效的洗脱。
    6. 在真空浓缩系统中收集、合并并干燥脱盐后的肽段。
      注意：如果同时进行平行蛋白质组学和去N-糖基化蛋白质组学分析（参见讨论部分），请在干燥前将脱盐后的肽段样品分装，保留独立的样品组。
  3. 使用 ZIC-HILIC-C8-SPE 富集 N-糖肽
    1. 按照下述方法制备自制的ZIC-HILIC-C8-SPE微柱。
      1. 使用合适的注射器，将C8盘片塞入10 µL移液器吸头中。
      2. 将悬浮于甲醇中的ZIC-HILIC树脂浆液加入C8-SPE微柱中。将微柱置于配有微型离心适配器的2 mL离心管中，确保微柱位于管中央，离心后形成ZIC-HILIC-C8-SPE 高度约为1 cm的微柱（参见 图1iii）。制备一个ZIC-HILIC-C8-SPE 每个样品使用一根微柱。
    2. 在后续的洗涤和上样步骤中，将台式离心机调节至6,000 rpm（约2,000 x g) 并离心60秒，使流动相通过ZIC-HILIC-C8-SPE柱 微柱。依次用50 µL甲醇洗涤并活化每个ZIC-HILIC-C8-SPE微柱，重复3次；然后用50 µL超纯水处理，重复3次；最后用50 µL含1% TFA的80%（v/v）乙腈溶液处理，重复3次。
      注意：ZIC-HILIC-C8-SPE 微柱可提前数小时制备，但使用前必须在室温下水化保存。
    3. 将指定用于N-糖肽富集的干燥肽混合物重悬于50 µL含1% TFA的80%（均为v/v）乙腈溶液中，并充分混匀。
      注意：如果肽段在HILIC上样溶剂中难以重新溶解，可先将其溶解于10%（v/v）TFA中，然后迅速用ACN稀释至HILIC上样溶剂的浓度。避免在高浓度TFA条件下加热样品，以防引起水解。
    4. 将预处理的 ZIC-HILIC-C8-SPE 微柱置于新的 1.5 mL 离心管中，并加入微量离心适配器。将重悬的肽段混合物上样至 ZIC-HILIC-C8-SPE 微柱，于 2,000 x g 60秒。对于超过50 µL的样品体积，可能需要进行多轮上样。
    5. 收集穿流组分，并将组分重新上样至同一支 ZIC-HILIC-C8-SPE 微柱。重复上样 2 次，保留每次的穿流液管。
    6. 用 50 µL 含 1% 三氟乙酸（TFA）的 80% 乙腈（ACN）（v/v）溶液洗涤 ZIC-HILIC-C8-SPE 微柱 2 次，离心，将洗脱液与步骤 3.3.4 的洗脱液合并。
      注意：合并的穿流组分通常含有约90%的总肽段物质，实质上构成了未修饰肽段组分，因此可用于独立的下游分析（无需另行开展蛋白质组学类型的实验）。
    7. 将 ZIC-HILIC-C8-SPE 微柱转移至新的 1.5 mL 低吸附微量离心管中。依次用 50 µL 0.1% (v/v) TFA、50 µL 25 mM 碳酸氢铵和 50 µL 50% (v/v) 乙腈进行洗脱，以回收保留的 N-糖肽。在 2,000 x g 每步之后间隔 60 s。
      注意：洗脱液通常含有约总肽段材料的10%，其中大部分应为N-若实现高富集效率，则可获得糖肽。每次离心后需监测微柱，确保溶液已完全离心通过，这将有助于实现高效的洗脱。
    8. 在真空浓缩系统中收集、合并并干燥富集的N-糖肽以及（如有需要）未修饰肽的穿流组分。
  4. 完整N-糖肽的反相液相色谱-串联质谱分析
    1. 按照下述方法配制液相色谱溶剂。
      1. 溶剂A：在1 L超纯水中加入0.1%（v/v）甲酸，混匀。超声处理15分钟以脱气。溶剂A可在20–25 °C下保存一个月。
      2. 溶剂B：配制1 L含0.1%甲酸的99.9%乙腈溶液（均为v/v）。超声15分钟以脱气。溶剂B可在20–25 °C下保存一个月。
    2. 将干燥的肽段组分重悬于0.1%（v/v）甲酸中，肽浓度约为0.2–0.5 µg/µL，并充分混匀。以14,000 x g 5分钟，然后小心地将上清液转移至质谱样品瓶中，留下约0.5 µL，以避免转移任何不需要的颗粒和碎片。
    3. 每个样品在C18-LC捕获柱上进样约0.5–1 µg总肽段，使用连接至质谱仪的UPHLC系统，在C18-LC分析柱上以250 nL/min的恒定流速进行分离。采用梯度洗脱程序：0–100 min内溶剂B从2%升至30%（v/v），100–118 min内从30%升至50%，118–119 min内从50%升至95%，并在95% B（v/v）条件下维持9 min，溶剂A为起始缓冲液（或采用其他适当配置）。
    4. 使用高分辨率检测肽段 配备纳米电喷雾离子源并以正离子模式运行的纳米液相色谱系统联用质谱仪。
    5. 对于 MS1，使用质谱扫描范围为 m/z 350-1,800，分辨率在60,000-120,000 FWHM时达到高分辨 m/z 200 和约 2.5 kV 的源电压。将 AGC 设为 3 × 106 离子累积时间最长为50 ms（或其它适当设置）。
    6. 对于MS/MS，采用DDA模式，从每次MS1全扫描中选择丰度最高的20个前体离子，使用HCD-MS/MS（归一化碰撞能量固定为35%）或sceHCD（归一化碰撞能量分别为25%、35%和45%）进行碎裂。重要的是，固定较低的 m/z 值设为110（例如，扫描范围 m/z 110 - 1,800 范围内以观察每个碎片谱图中的所有低质量氧化翁离子。
    7. 选择带两个以上电荷（Z ≥ 2）的前体离子进行碎裂。在30,000–45,000 FWHM分辨率下采集（sce）HCD-MS/MS谱图 m/z 200，AGC为1 × 105 离子，使用 ±1.0 Th 的前体离子隔离窗口，累积时间为 90 ms。在对特定前体离子进行单次隔离和碎裂后，启用 30 s 的动态排阻。
      注意：如果具备电子转移解离（ETD）条件，可同时考虑采用产物依赖性离子触发模式，对完整的N-糖肽样品进行电子转移高能碰撞解离（EThcD-MS/MS）分析。当出现特征性的糖链氧化铵离子（例如， m/z 138.0545、204.0867 和 366.1396 是各 HCD-MS/MS 谱图中前 20 个碎片离子中的成员39. 在 30,000–45,000 FWHM 分辨率下检测 EThcD-MS/MS 碎片 m/z 200，AGC为4 × 105 离子，250 ms的注入时间，HCD NCE为15%，前体离子隔离宽度为1.6 Th。
  5. LC-MS/MS 糖蛋白质组学数据的数据分析
    1. 通过检查大多数HCD-MS/MS谱图中是否含有糖链氧鎓离子（如 m/z 138.0545、204.0867 和 366.1396），以及（用于标记策略）低质量TMT报告离子具有基线分离、MS/MS谱图中高碎裂效率、窄的液相色谱峰宽，以及高质谱准确度、分辨率和信噪比。
    2. 使用搜索引擎（有多种可用工具，见下文），将质谱/质谱（MS/MS）数据与针对待研究样品的合适蛋白质/肽段数据库进行比对，以鉴定完整的N-糖肽（例如，来自去N-糖蛋白组学实验的数据），或与所有经人工审阅的人类UniProtKB蛋白质数据库进行比对。为针对肽段的N-糖基化特性优化搜索，应设置条件以检索含有位于序列基序（sequon）中天冬酰胺（Asn）的肽段。重要的是，应选择基于糖组学信息的N-糖链数据库，即步骤2中通过糖组学数据鉴定出的糖链结构，以限制搜索范围，仅包含已知存在于样品中的糖链。
      注意：可考虑使用广谱预定义N-糖链数据库进行平行搜索，以排除数据中存在其他N-糖链组成的可能性。
    3. 根据所研究的样本类型、具体的样品处理流程以及所使用的质谱设置和仪器，调整其余的搜索参数。N-糖蛋白质组学数据分析中常见的搜索设置包括：
      前体离子和产物离子质量容差：10 ppm 和 20 ppm
      蛋白酶特异性：完全特异性及/或半特异性（N端不规则）
      允许的漏切位点：2
      固定修饰：Cys 羰氨甲基化（+57.021 Da）
      可变修饰：甲硫氨酸氧化（+15.994 Da）（常见1）
      每条肽段允许的可变修饰数：1 或 2
      聚糖修饰：糖组学指导的聚糖数据库（稀有 1）
      ​蛋白诱饵与污染物数据库：已启用
    4. 筛选所有搜索结果 <蛋白质水平和肽段水平的1%错误发现率（FDR）。仅考虑高置信度鉴定的N-糖肽（例如，PEP 2D评分） < 0.001）并对过滤后的结果进行人工注释/审校，以进一步降低N-糖肽鉴定错误率，具体讨论如下36,40,41.
      注意：糖肽具有 唾液酸化且多重岩藻糖基化的N-糖链及除糖链外还携带其他可变修饰（如甲硫氨酸氧化以及天冬酰胺/谷氨酰胺脱酰胺）的糖肽，尤其容易被搜索算法误判41应特别注意验证 在报告之前对这些候选对象进行筛选。

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结果

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本节提供了采用糖组学指导的糖蛋白质组学方法对一名处于 II 期结直肠癌（CRC）患者福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）组织切片进行分析的代表性结果。

为了获得本方案所需的足够蛋白质起始材料，根据已发表的方案，将来自同一FFPE组织块的两个切片（z堆栈）的蛋白质提取物合并，并采用TMT标记方法以提高糖蛋白质组学实验的灵敏度（见下文可选步骤）42。

首先，基于FFPE结直肠癌（CRC）组织的PGC-LC-MS/MS N-糖组学数据分析共鉴定出76种N-糖链异构体，涵盖59种糖链组成（图2）。与先前关于CRC组织N-糖组谱的研究结果一致43，其中复杂型/杂合型N-糖链含量最高（约70%），其次是高甘露糖型（约20%）和低甘露糖型（约10%）N-糖链。

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讨论

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方案中的关键步骤
在本方案论文中，我们逐步阐述了糖组学指导的糖蛋白质组学方法，该方法可全面揭示复杂肿瘤微环境中糖蛋白质组的异质性与动态变化。

该方案中的一个关键步骤是确保蛋白质混合物完全消化，同时避免过度消化。蛋白质的非特异性切割会固有地增加肽段搜索空间，导致更长的搜索时间以及更高的糖肽错误鉴定率50。

在样品制备步骤中避免引入其他修饰（例如烷基化副反应）也至关重要，因为非预期的衍生化会使数据分析更加复杂（并减慢分析速度），从而再次导致更高的错误鉴定率15。来自福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）组织的蛋白质可能携带由组织制备（石蜡包埋）和蛋白质提取过程（脱蜡等）所诱导的异常肽段修饰44。然而，如本文及此前其他针对FFPE组织切片的糖蛋白质组学研究42,

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披露

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作者声明无利益冲突。

致谢

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

THC 获得了由澳大利亚政府资助的国际研究培训项目奖学金的支持。NB 获得了由麦考瑞大学资助的国际麦考瑞大学研究卓越奖学金的支持。AC 获得了由澳大利亚政府资助的研究培训项目奖学金的支持。RK 获得了新南威尔士州癌症研究所（ECF181259）的支持。MTA 是澳大利亚研究理事会未来奖学金（FT210100455）的获得者。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
化学试剂
乙酸铵 Sigma AldrichA1542可使用替代品
碳酸氢铵，纯度 ≥99.0%Sigma AldrichA6141可使用替代品
无水乙腈（ACN），LC-MS级Sigma Aldrich34851可使用替代品
牛胎球蛋白Sigma AldrichF3004可使用替代品
二硫苏糖醇（DTT）Sigma AldrichD0632可使用替代品
乙醇Sigma AldrichE7023可使用替代品
甲酸，LC-MS级Sigma Aldrich00940可使用替代品
冰乙酸Sigma AldrichA6283可使用替代品
碘乙酰胺（IAA）Sigma AldrichI1149可使用替代品
甲醇Sigma AldrichM1775可使用替代品
肽-N-糖苷酶F（PNGase F）PromegaV4831源自中国台湾伊丽莎白金菌（Elizabethkingia miricola）的PNGase F（10 U/μL），在大肠杆菌（Escherichia coli）中重组表达 
聚乙烯吡咯烷酮40（PVP）Sigma AldrichPVP40可使用替代品
氢氧化钾（KOH）Sigma Aldrich484016可使用替代品
测序级猪胰蛋白酶 PromegaV5113可使用替代品
硼氢化钠（NaBH4）Sigma Aldrich213462可使用替代品
三乙基碳酸氢铵（TEAB），LC-MS级Sigma AldrichT7408可使用替代品
三氟乙酸（TFA），LC-MS级Sigma AldrichT6508可使用替代品
工具/材料
C18圆盘Empore66883-U
C8圆盘Empore66882-U
平底聚丙烯96孔板 Corning3364
Immobilon-PSQ聚偏二氟乙烯（PVDF）膜MilliporeIPVH20200孔径：0.45 μm 
微量离心机Eppendorf5452000069可使用替代品
微量离心机适配器 The Nest Group, Inc., MASS18VMiniSpin柱套环，随微柱一同提供
Oligo R3树脂Thermo1133903粒径：30 μm
Parafilm封口膜Parafilm MPM996
1.5 mL蛋白LoBind离心管Eppendorf0030108450
2.0 mL蛋白LoBind离心管Eppendorf0030108442
1.5 mL防漏离心管Eppendorf0030120086
2.0 mL防漏离心管Eppendorf0030120094
振荡器Eppendorf5382000066可使用替代品
单孔打孔器Swingline74005
SpeedVac浓缩仪Martin ChristRVC 2-25 CDplus可使用替代品
Supelclean ENVI-Carb SPE树脂Supelco57088粒径：120-400目。树脂可手动从柱中取出，并可长期保存于含50%（v/v）甲醇的MilliQ水中
5 mL注射器Sigma AldrichZ116866可使用替代品
温控培养箱ThermolineE7.30可使用替代品
超声波清洗仪UnisonicsFXP可使用替代品
ZIC-HILIC树脂Merck150455粒径/孔径：5 μm/200 Å。树脂可手动从液相色谱柱中取出，并可长期保存于含50%（v/v）甲醇的MilliQ水中
ZipTip C18固相萃取（SPE）微柱 MilliporeZTC18S096也可使用自制C18-SPE微柱替代商品化产品
LC-MS/MS分析
1260 Infinity毛细管HPLC系统 Agilent可使用替代品
预装ReproSil-Pur C18 AQ树脂的分析型液相色谱柱Dr Maisch, Ammerbuch-Entringen, Germanyr13.aq.s2570粒径/孔径：3 μm/120 Å，长度/内径：25 cm/75 μm。商业化的C18纳米液相色谱柱也可获得/ 
Dionex UltiMate 3000 RSLCnano液相色谱系统 Thermo可使用替代品
HyperCarb KAPPA PGC毛细管液相色谱柱 Thermo已停产粒径/孔径：3 μm/250 Å；柱长：30 mm；内径：0.180 mm。具有相似数据质量的更大规格HyperCarb PGC液相色谱柱可商业化获得（例如Thermo #35003-031030）。默克（Merck）的SupelTMCarb液相色谱柱，粒径/孔径为2.7 μm/200，具有不同柱长和内径，也可获得（例如Merck #59994-U）。 
LCMS级乙腈LiChrosolv100029可使用替代品
线性离子阱（LTQ）Velos Pro离子阱质谱仪（糖组学） Thermo可使用替代品
Orbitrap Fusion Lumos Tribrid质谱仪（糖蛋白质组学）Thermo其他高分辨质谱系统，无论是否具备电子转移解离（ETD）功能（仅O-糖蛋白质组学需要）均可使用（例如Q-Exactive HF-X Hybrid Quadrupole-Orbitrap，Thermo；TIMS-ToF-MS，Bruker；或其他厂商的类似高性能质谱仪）
0.9 mL全回收透明玻璃螺口小瓶ThermoTHC11093563可使用替代品
与上述小瓶匹配的全回收透明玻璃螺口盖ThermoTHC09150869可使用替代品
自制填充ReproSil-Pur C18 AQ树脂的捕集液相色谱柱 Dr Maisch, Ammerbuch-Entringen, Germanyr15.aq.s0202粒径/孔径：5 μm/120 Å，长度/内径：2 cm/100 μm。商业化的C18捕集液相色谱柱也可获得。 
软件
ByonicProtein Metrics Incv2.6.46或更高版本商业化的糖肽和翻译后修饰搜索引擎，可接受大多数质谱仪厂商的LC-MS/MS原始数据
ByosProtein Metrics Incv3.9-7或更高版本商业软件，用于手动检查糖肽候选物及自动注释糖链MS/MS谱图
GlycoModExpasy开放获取软件，辅助糖组学数据的注释（https://web.expasy.org/glycomod/）
GlycoWorkBenchEUROCarbDBv2.1开放获取软件，辅助糖组学数据注释及糖链结构图绘制
RawMeatVAST Scientificv2.1开放获取软件，用于从原始质谱数据中提取糖链前体离子的m/z值
SkylineBrendan X. MacLeanv21.2或更高版本开放获取软件，用于糖链的相对定量分析
XcaliburThermov2.2或更高版本用于浏览原始LC-MS/MS数据

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